TWI699210B - 工程化之嵌合聚乙二醇化ａｄｉ及使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供嵌合精胺酸脫亞胺酶(包括聚乙二醇化嵌合精胺酸脫亞胺酶)及其相關組合物及使用方法(包括治療癌症之方法)。

Description

工程化之嵌合聚乙二醇化ADI及使用方法 相關申請案之交叉引用

本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)主張2014年3月18日提交之美國申請案第61/954,929號的權利，該美國申請案以全文引用的方式併入。

關於序列表之說明

與本申請案相關之序列表係以文字格式而非紙印複本提供且係以藉此引用之方式併入本說明書中。含有序列表之正文檔案之名稱為TDWG_002_02TW_ST25.txt。正文檔案為約200KB，且創建於2015年3月11日。

本發明大體上係關於工程化之ADI，特定言之經改造以降低抗原性之重組嵌合ADI蛋白質。此類工程化之嵌合ADI蛋白質適用於治療精胺酸依賴性疾病，諸如癌症。

胺基酸去除療法可為一些形式之癌症之有效治療。迄今為止，存在與此方法相關之一個已知臨床實例，其利用天冬醯胺酶來減少天冬醯胺之循環量且抑制蛋白質合成。此治療尤其對急性淋巴母細胞白血病有效(Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004)。急性淋巴母細胞白血 病細胞需要胺基酸天冬醯胺用於生長及增殖。相反，大多數正常人類細胞能夠合成天冬醯胺，且不受天冬醯胺耗竭影響。因此，用天冬醯胺酶減少血清天冬醯胺可在不損害正常細胞、組織及宿主之情況下選擇性殺死癌細胞。已批准來源於大腸桿菌之天冬醯胺酶形式用於人類。然而，天冬醯胺酶僅見於微生物中；此使其在人類中具有高度免疫原性，且亦在注射之後具有較短血清半衰期(Avramis 2005)。為使天冬醯胺酶成為更有效之藥物，藉由將來源於大腸桿菌之天冬醯胺酶與聚乙二醇(PEG)一起調配以降低此酶之免疫原性及相關過敏性反應來使此等缺點減至最少。此外，PEG大大延長天冬醯胺酶之循環半衰期，其降低治療之頻率及療法之總成本。批准使用PEG調配之天冬醯胺酶且在商標名Oncaspar®下(Oncaspar® 2011,Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004,Fu 2007,Zeidan 2008)出售。

精胺酸為用於人類及小鼠之另一種非必需胺基酸(綜述參見Rogers 1994)。在人類中，精胺酸可藉助於Krebs(脲)循環酶精胺基丁二酸鹽合成酶(ASS，L-瓜胺酸：L-天冬胺酸鹽接合酶[AMP-形成]，EC 6.3.4.5)及精胺基丁二酸鹽裂解酶(ASL，L-精胺基丁二酸鹽精胺酸裂解酶，EC 4.3.2.)以兩個步驟自瓜胺酸合成(Haines 2011，Wu 2009，Morris 2006，Husson 2003，Tapiero 2002，Rogers 1994)。ASS催化瓜胺酸及天冬胺酸轉化為精胺基丁二酸鹽，接著其藉由ASL轉化為精胺酸及反丁烯二酸。

ADI-PEG 20治療需要歷時一段時間之多個劑量。多個治療之後，可能出現可限制治療之持續有效性之抗ADI-PEG 20抗體。因此，在此項技術中對經工程化以提高且擴展精胺酸耗竭治療功效之ADI存在需要。

參考文獻：Oncaspar FDA Label, Revised 7, 2006；2011年4月5日自FDA網站下載；Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393；Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984；Haines RJ等人. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23；Husson A等人. 2003. Eur J Biochem 270:1887-1899；Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S-512S；Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125: 117-127；Wu G等人. 2009. Amino Acids 37:153-168；Zeidan A等人. 2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119；Rogers QR. Special Publication 86, Agriculture Experiment Station, University of Illinois, April 4-5, 1994:9-21；Tapiero H, Mathe G, Couvreur P, Tew KD (2002) I. Arginine. Biomed Pharmacother 56: 439-445；Wheatley DN (2004) Anticancer Drugs 15(9): 825-833；Feun LG 等人，British Journal of Cancer, 2012, 106, 1481-1485；Dillon BJ等人，Cancer, 2004, 100(4), 826-33。

本發明之一個態樣提供重組嵌合精胺酸脫亞胺酶(ADI)，其包含來源於第一微生物之ADI蛋白質催化區及來源於第二微生物之ADI蛋白質α-螺旋區。在一個實施例中，第一微生物係選自黴漿菌屬(Mycoplasma)、梭菌屬(Clostridium)、桿菌屬(Bacillus)、疏螺旋體屬(Borrelia)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)及梨形鞭毛蟲屬(Giardia)。在另一實施例中，第一微生物係選自由以下組成之群：肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumonia)、人型黴漿菌(Mycoplasma hominis)、精胺酸黴漿菌(Mycoplasma arginini)、關節炎黴漿菌(Mycoplasma arthritidis)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、腸梨形鞭毛蟲(Giardia intestinalis)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)及糞 腸球菌(Enterococcus faecalis)。在另一實施例中，第一微生物係選自由以下組成之群：精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌、人型黴漿菌、肺炎黴漿菌、海豹腦黴漿菌(Mycoplasma phocicerebrale)、口腔黴漿菌(Mycoplasma orale)、貓黴漿菌(Mycoplasma gateae)、海豹黴漿菌(Mycoplasma phocidae)、鴿黴漿菌(Mycoplasma columbinum)、愛阿華黴漿菌(Mycoplasma iowae)、鱷黴漿菌(Mycoplasma crocodyli)、醱酵黴漿菌(Mycoplasma fermentans)、雞黴漿菌(Mycoplasma gallinarum)、惰性黴漿菌(Mycoplasma iners)、穿刺黴漿菌(Mycoplasma penetrans)、雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)、短吻鱷黴漿菌(Mycoplasma alligatoris)、運動黴漿菌(Mycoplasma mobile)及山羊黴漿菌(Mycoplasma capricolum)。在一個實施例中，第二微生物視情況與第一微生物不同且係選自黴漿菌屬、梭菌屬、桿菌屬、疏螺旋體屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬及梨形鞭毛蟲屬。在另一實施例中，第二微生物視情況與第一微生物不同且係選自由以下組成之群：肺炎黴漿菌、人型黴漿菌、精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、腸梨形鞭毛蟲、產氣莢膜梭菌、地衣芽孢桿菌及糞腸球菌。在另一實施例中，第二微生物視情況與第一微生物不同且係選自由以下組成之群：精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌、人型黴漿菌、肺炎黴漿菌、海豹腦黴漿菌、口腔黴漿菌、貓黴漿菌、海豹黴漿菌、鴿黴漿菌、愛阿華黴漿菌、鱷黴漿菌、醱酵黴漿菌、雞黴漿菌、惰性黴漿菌、穿刺黴漿菌、雞敗血性黴漿菌、短吻鱷黴漿菌、運動黴漿菌及山羊黴漿菌。

在一個實施例中，第一微生物係選自由雞黴漿菌、惰性黴漿菌及鴿黴漿菌組成之群且第二微生物係選自由雞黴漿菌、惰性黴漿菌及鴿黴漿菌組成之群，其中第一與第二微生物視情況為不同微生物。

在另一實施例中，第一微生物為精胺酸黴漿菌且第二微生物為關節炎黴漿菌，且在其他特定實施例中，第一微生物為精胺酸黴漿菌且第二微生物為人型黴漿菌或第一微生物為關節炎黴漿菌且第二微生物為精胺酸黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為貓黴漿菌且第二微生物為關節炎黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為貓黴漿菌且第二微生物為鴿黴漿菌。在一些實施例中，第一微生物為貓黴漿菌且第二微生物為海豹腦黴漿菌。在一些實施例中，第一微生物為貓黴漿菌且第二微生物為海豹黴漿菌。在特定實施例中，第一微生物為海豹腦黴漿菌且第二微生物為精胺酸黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為海豹腦黴漿菌且第二微生物為貓黴漿菌。在特定實施例中，第一微生物為海豹腦黴漿菌且第二微生物為海豹腦黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為海豹黴漿菌且第二微生物為精胺酸黴漿菌。在一些實施例中，第一微生物為海豹黴漿菌且第二微生物為關節炎黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為海豹黴漿菌且第二微生物為鴿黴漿菌。在特定實施例中，第一微生物為海豹黴漿菌且第二微生物為貓黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為海豹黴漿菌且第二微生物為海豹腦黴漿菌。在一些實施例中，第一微生物為雞黴漿菌且第二微生物為鴿黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為雞黴漿菌且第二微生物為惰性黴漿菌。在一些實施例中，第一微生物為惰性黴漿菌且第二微生物為鴿黴漿菌。在某些實施例中，第一微生物為惰性黴漿菌且第二微生物為雞黴漿菌。

說明性重組嵌合ADI分子包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO：4-13或22-59中之任一者中所列舉之胺基酸序列或其與SEQ ID NO：4-13或22-59中之任一者具有至少80%或90%序列一致性之變異體。

在本文所述之重組嵌合ADI之某些實施例中，重組嵌合ADI已經 修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。在本文所述之重組嵌合ADI之另一實施例中，至少一個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。在本文所述之重組嵌合ADI之某些實施例中，至少5個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾，至少10個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾，至少15個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾，或至少20個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。如本文所述之說明性重組嵌合ADI分子包含SEQ ID NO：10-13中之任一者中所列舉之胺基酸序列。

在本文所述之重組嵌合ADI之另一實施例中，ADI經由生物相容性連接子共價連接至聚乙二醇。就此而言，精胺酸脫亞胺酶可共價結合至一個以上聚乙二醇分子，且在某些實施例中可共價結合至約1個至約10個聚乙二醇分子，且在一個特定實施例中結合至5±3個PEG分子。如本文所述之共價結合至ADI之PEG分子可為直鏈或分支鏈PEG分子且可具有約1,000至約40,000且在一個實施例中約10,000至約30,000之總重量平均分子量。

在本文所述之重組嵌合ADI之某些實施例中，生物相容性連接子包含丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基其任何組合。在一個實施例中，丁二醯基之來源為丁二醯亞胺丁二酸酯。

本發明之其他態樣提供編碼本文所述之重組嵌合ADI之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體及包含此類載體之分離宿主細胞。

可選擇或建構含有適當調節序列之適合載體，該等序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及需要之其他序列。按需要，載體可為質體、病毒(例如噬菌體)或噬菌粒。其他細節參見例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第2版，Sambrook等人，1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。舉例而 言，核酸結構製備、突變誘發、定序、DNA導入細胞中及基因表現以及蛋白質分析中之許多操控核酸之已知技術及方案詳細地描述於Molecular Biology，第二版，Ausubel等人編，John Wiley及Sons,1992或其後續更新中。

如熟習此項技術者將理解，在一些情況下宜產生具有非天然存在密碼子之編碼多肽之核苷酸序列。舉例而言，可選擇特定原核或真核宿主偏好之密碼子以提高蛋白質表現率或產生具有所要特性之重組RNA轉錄物，該等特性諸如與自天然存在之序列產生之轉錄物半衰期相比較長之半衰期。此類聚核苷酸通常稱為「密碼子優化」的。可以密碼子優化形式利用本文所述之聚核苷酸中之任一者。在某些實施例中，聚核苷酸可經密碼子優化用於特異性細菌(諸如大腸桿菌)或酵母(諸如釀酒酵母)(參見例如Burgess-Brown等人，Protein Expr Purif.59：94-102,2008)。

多種不同宿主細胞中用於選殖及蛋白質表現系統為吾人所熟知。適合宿主細胞包括哺乳動物細胞、細菌、酵母及桿狀病毒系統。用於異源多肽表現之此項技術中可利用之哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、HEK-293細胞、人類纖維肉瘤細胞株HT-1080(參見例如Moran,Nat.Biotechnol.28：1139-40,2010)、NSO小鼠黑素瘤細胞及許多其他細胞。可用哺乳動物宿主細胞株之其他實例包括由SV40轉型之獼猴腎CV1株系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚腎株系(在懸浮培養液中生長之293或次選殖293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠睾丸支持細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；獼猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠獼猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝 細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠***腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株系(Hep G2)。其他可用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，PNAS USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如NSO及Sp2/0。適於多肽產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,N.J.,2003)，第255頁-第268頁。某些較佳哺乳動物細胞表現系統包括基於CHO及HEK293細胞之表現系統。在此項技術中之已知者中，哺乳動物表現系統尤其可利用例如T燒瓶、輥瓶或細胞廠中之附著細胞株；或例如1L及5L旋轉器，5L、14L、40L、100L及200L攪拌槽生物反應器或20/50L及100/200L WAVE生物反應器中之懸浮培養液。

常見細菌宿主為大腸桿菌。原核細胞(諸如大腸桿菌)中之蛋白質表現在此項技術中為明確的。綜述參見例如Pluckthun,A.Bio/Technology.9：545-551(1991)。熟習此項技術者亦可獲得作為多肽重組產生之選擇的培養液中真核細胞中之表現(參見Ref,Curr.Opinion Biotech.4：573-576,1993；及Trill等人，Curr.Opinion Biotech.6：553-560,1995)。在特定實施例中，蛋白質表現可由T7 RNA聚合酶(例如pET載體系列)控制。此等及相關實施例可利用表現宿主菌株BL21(DE3)，即支持T7介導之表現且缺乏具有改良之靶蛋白穩定性之lon及ompT蛋白酶的BL21之λDE3溶源。亦包括攜載編碼很少用於大腸桿菌之tRNA之質體的表現宿主菌株，諸如Rosetta^TM(DE3)及Rosetta 2(DE3)菌株。亦可使用諸如Benzonase®核酸酶及BugBuster®蛋白質提取試劑之試劑改善細胞裂解及樣品處理。對於細胞培養，自體誘導培 養基可提高許多表現系統之效率，包括高產量表現系統。此類型培養基(例如Overnight Express^TM自體誘導系統)經由不添加人造誘導劑(諸如IPTG)之代謝轉移而逐漸引發蛋白質表現。特定實施例採用六組胺酸標記(諸如His‧Tag®融合物)，後接固定金屬親和力層析(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)純化或相關技術。然而，在某些態樣中，臨床級蛋白質可使用或不使用親和力標記自大腸桿菌包括體分離(參見例如Shimp等人，Protein Expr Purif.50：58-67,2006)。作為另一實例，某些實施例可採用冷震誘導之大腸桿菌高產率產生系統，因為低溫下大腸桿菌中蛋白質之過度表現提高其溶解度及穩定性(參見例如Qing等人，Nature Biotechnology.22：877-882,2004)。

此外，宿主細胞菌株可針對其調節***序列之表現或以所要方式加工所表現蛋白質之能力來選擇。此類多肽修飾包括(但不限於)轉譯後修飾，諸如乙醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂質化及醯化。分解蛋白質「前原」形式之轉譯後加工亦可用於促成恰當***、摺疊及/或功能。可選擇具有或甚至缺乏針對此類轉譯後活動之特異性細胞機構及特徵機制的除細菌細胞以外之不同宿主細胞，諸如酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293及W138以確保所關注蛋白質之恰當修飾及加工。

為長期高產率產生重組蛋白，穩定表現一般為較佳的。舉例而言，穩定表現所關注聚核苷酸之細胞株可使用可含有複製病毒來源及/或內源性表現元素之表現載體及相同或分離載體上之可選標記基因來轉型。引入載體之後，可使細胞在增殖培養基中生長約1-2天，隨後換至選擇性培養基。可選標記物之目的為向選擇賦予抵抗性，且其存在使得成功表現經引入序列之細胞生長及回收。可使用適於細胞類型之組織培養技術增殖穩定轉型細胞之抗性純系。亦可採用諸如藉由 短暫轉染或感染之短暫產生。適於短暫產生之例示性哺乳動物表現系統包括基於HEK293及CHO之系統。

用所關注之聚核苷酸序列轉型之宿主細胞可在適於自細胞培養物表現及回收蛋白質之條件下培養。某些特定實施例利用不含血清之細胞表現系統。實例包括可在不含血清之培養基上生長之HEK293細胞及CHO細胞(參見例如Rosser等人，Protein Expr.Purif.40：237-43,2005；及美國專利第6,210,922號)。

由重組細胞產生之蛋白質可根據此項技術中已知之多種技術純化及特性化。進行蛋白質純化及分析蛋白質純度之例示性系統包括快速蛋白質液相層析(FPLC)(例如AKTA及Bio-Rad FPLC系統)、高壓液相層析(HPLC)(例如Beckman及Waters HPLC)。在此項技術中之已知者中，純化之例示性化學反應尤其包括離子交換層析(例如Q、S)、尺寸排阻層析、鹽梯度、親和力純化(例如Ni、Co、FLAG、麥芽糖、麩胱甘肽、蛋白質A/G)、凝膠過濾、逆相、陶瓷HyperD®離子交換層析及疏水相互作用管柱(HIC)。亦包括諸如SDS-PAGE(例如庫馬斯(coomassie)、銀染色)、免疫墨點、Bradford及ELISA之分析方法，其通常可在產生或純化製程之任何步驟期間利用以量測蛋白質組合物之純度。

亦包括濃縮以重組方式產生之蛋白質(例如嵌合ADI蛋白質)之方法。實例包括凍乾，其通常在溶液含有極少除所關注蛋白質以外之可溶組分時採用。凍乾常常在HPLC操作之後進行，且可自混合物移除大部分或所有揮發性組分。亦包括超過濾技術，其通常採用一或多種選擇性滲透膜以濃縮蛋白質溶液。該膜允許水及小分子通過且保留蛋白質；在其他技術中，該溶液尤其可藉由機械泵、氣壓或離心相對於該膜加壓。

在某些實施例中，如根據此項技術中之常規技術所量測，嵌合 ADI蛋白質之純度為至少約90%。在某些實施例中，諸如診斷組合物或某些治療組合物，嵌合ADI蛋白質之純度為至少約95%。在特定實施例中，諸如治療或醫藥組合物，嵌合ADI蛋白質之純度為至少約97%或98%或99%。在其他實施例中，諸如當用作參考或研究試劑時，蛋白質可具有較低純度，且可具有至少約50%、60%、70%或80%之純度。可整體上或關於諸如其他蛋白質之選擇組分量測純度，例如蛋白質基礎上之純度。

在某些實施例中，本文所述之組合物實質上大致不含內毒素，包括例如不含約95%內毒素，較佳不含約99%內毒素，且更佳不含約99.99%內毒素。如本文所述，可根據此項技術中之常規技術偵測內毒素之存在。在特定實施例中，嵌合ADI蛋白質由實質上不含血清之培養基中之真核細胞(諸如哺乳動物或人類細胞)製造。

本發明之另一態樣提供包含本文所述之一或多種重組嵌合ADI及生理上可接受載劑之組合物。在一個實施例中，組合物可進一步包含自體吞噬調節劑。自體吞噬調節劑包括(但不限於)氯奎(chloroquine)、3-甲基腺嘌呤、羥基氯奎、巴弗洛黴素A1(bafilomycin A1)、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖苷(AICAR)、岡田酸(okadaic acid)、N6-巰嘌呤核糖苷、長春鹼、渥曼青黴素、雷帕黴素、依維莫司(everolimus)、二甲雙胍、哌立福新(perifosine)、白藜蘆醇及他莫昔芬(tamoxifen)。在另一實施例中，包含本文所述之重組嵌合ADI之組合物可進一步包含化學治療劑，諸如(但不限於)多烯紫杉醇、卡鉑、環磷醯胺、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)或依維莫司(everolimus)或其組合。

本發明之另一態樣提供治療癌症、改善癌症症狀或抑制癌症發展之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量的包含本文所述之 一或多種重組嵌合ADI之組合物及生理學上可接受之載劑，藉此治療癌症、改善癌症症狀或抑制癌症發展。就此而言，癌症可包括(但不限於)黑素瘤、胰臟癌、***癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓性白血病、復發性急性骨髓性白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌及胃癌(stomach cancer)。

序列簡單說明

SEQ ID NO：1為野生型人型黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：2為野生型精胺酸黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：3為野生型關節炎黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：4為DS1重組嵌合ADI蛋白質之胺基酸序列。

SEQ ID NO：5為DS2重組嵌合ADI蛋白質之胺基酸序列。

SEQ ID NO：6為DS3重組嵌合ADI蛋白質之胺基酸序列。

SEQ ID NO：7為DS4重組嵌合ADI蛋白質之胺基酸序列。

SEQ ID NO：8為來源於人型黴漿菌Phoenix(參見SEQ ID NO：14；加離胺酸取代)(催化區)及精胺酸黴漿菌(α-螺旋區)之重組嵌合ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：9為來源於人型黴漿菌Phoenix(參見SEQ ID NO：14)(催化區)及精胺酸黴漿菌(α-螺旋區)之重組嵌合ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：10為重組嵌合ADI蛋白質之DS1-1離胺酸刪減突變體之胺基酸序列(參見表E3)。

SEQ ID NO：11為重組嵌合ADI蛋白質之DS1-2離胺酸刪減突變體 之胺基酸序列(參見表E3)。

SEQ ID NO：12為重組嵌合ADI蛋白質之DS1-3離胺酸刪減突變體之胺基酸序列(參見表E3)。

SEQ ID NO：13為重組嵌合ADI蛋白質之DS1-4離胺酸刪減突變體之胺基酸序列(參見表E3)。

SEQ ID NO：14為ADI Phoenix序列之胺基酸序列。此ADI序列與人型黴漿菌ADI一致，不同之處在於K112E及P210S取代。

SEQ ID NO：15為短吻鱷黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：16為鴿黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：17為雞黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：18為貓黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：19為惰性黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：20為海豹腦黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：21為海豹黴漿菌ADI之胺基酸序列。

SEQ ID NO：22-59為嵌合ADI蛋白質之胺基酸序列。

本發明大體上係關於嵌合ADI蛋白質，其與相應野生型ADI分子相比例如經工程化以具有降低之抗原性。本發明亦係關於用嵌合ADI且特定言之嵌合ADI-PEG 20治療癌症及其他病症之方法。

正常細胞不需要精胺酸用於生長，因為其可自瓜胺酸以由ASS及ASL催化之兩步製程合成精胺酸。相反，某些癌症不表現ASS。某些癌症不表現ASL，而其他癌症可減少ASS及/或ASL之表現或可不表現ASS及/或ASL。因此，此等癌症對於精胺酸為營養缺陷型的。可利用此代謝差異以研發治療此等形式之癌症之安全及有效療法。ADI經由精胺酸水解酶路徑催化精胺酸轉化為瓜胺酸，且其因此可用於去除精胺酸。

除非明確相反地指出，否則本發明之實踐將採用本領域技術內之病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組DNA技術之習知方法，其中許多出於說明之目的而描述於下文。此類技術充分解釋於文獻中。參見例如Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley及Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley及Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Maniatis等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach，第一卷及第二卷(D.Glover編)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames及S.Higgins編，1985)；Transcription and Translation(B.Hames及S.Higgins編，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney編，1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及其他類似參考文獻。

除非內容另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。

在本說明書通篇中，除非本文另有規定，否則字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所陳述之要素或整數或要素或整數之群，但不排除任何其他要素或整數或要素或整數之群。

「約」意謂相對於參考之數量、水準、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多至30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之數量、水準、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。

「統計學上顯著」意謂結果不太可能偶然發生。統計學上之顯著 性可藉由此項技術中已知之任何方法來測定。顯著性之常用量測值包括p值，其為若虛無假設為真則所觀測事件將發生之頻率或機率。若獲得之p值小於顯著性水準，則駁回虛無假設。在簡單情況下，顯著性水準界定為p值為0.05或0.05以下。

除非另外明確說明，否則本說明書中之各實施例在加以必要修正後應用於每一其他實施例。

重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)可使用標準技術。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如此項技術中通常所實現或如本文中所述來進行。此等及相關之技術及程序一般可根據此項技術中熟知之習知方法及如在本說明書通篇中所引用及論述之多種一般及更特定參考中所述來進行。除非提供特定界定，否則本文所述之結合分子生物學、分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學所利用之命名法及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等者。標準技術可用於重組技術、分子生物學、微生物學、化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者治療。

「患者」係指動物，在某些實施例中係指哺乳動物，且在一特定實施例中係指人類。

「生物相容性」係指材料或化合物一般而言對生物功能無害，且不會產生任何程度之不可接受之毒性，包括過敏原性及疾病病況。

術語「參考序列」一般係指與另一序列進行比較之核酸編碼序列或胺基酸序列。以參考序列之形式包括本文所述之所有多肽及聚核苷酸序列，包括藉由名稱所描述之彼等序列及描述於表及序列表中之彼等序列。

在本發明通篇中，可使用以下縮寫：PEG，聚乙二醇；ADI，精胺酸脫亞胺酶；SS，丁二醯亞胺丁二酸酯；SSA，丁二醯亞胺基丁二 醯亞胺；SPA，丙酸丁二醯亞胺酯；NHS，N-羥基-丁二醯亞胺；ASS1或ASS，精胺基丁二酸鹽合成酶；ASL，精胺基琥珀酸鹽裂解酶。

在某些實施例中，將如本文所述之嵌合ADI酶與來源於人型黴漿菌之基準ADI-PEG 20分子相比。如本文所用，「ADI-PEG 20」係指此項技術中已知且例如描述於US6183738、US6635462中之ADI分子；Ascierto PA等人.(2005) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma：results from phase I and II studies.J Clin Oncol 23(30)：7660-7668；Izzo F等人.(2004) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma：results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10)：1815-1822；Holtsberg FW等人.(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase：effects of PEG formulations on its pharmacological properties.J Control Release 80(1-3)：259-271；Kelly等人，(2012)British Journal of Cancer 106,324-332。如熟習此項技術者將公認，此分子為聚乙二醇化(PEG 20,000)之來源於人型黴漿菌之ADI酶，且其相對於野生型人型黴漿菌ADI酶具有兩個取代(K112E；P210S)。

術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」及「酶」可互換使用，且意謂不限於任何特定長度之胺基酸聚合物。術語不排除修飾，諸如豆蔻醯化、硫酸化、糖基化、磷酸化及信號序列之添加或缺失。術語「多肽」或「蛋白質」或「酶」意謂一或多個胺基酸鏈，其中各鏈包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸，且其中該多肽或蛋白質可包含複數個藉由肽鍵非共價及/或共價連接之鏈(該等鏈具有天然蛋白質(亦即藉由天然產生且特定言之非重組細胞產生之蛋白質)或基因工程化或重組細胞之序列)，且包含具有天然蛋白質胺基酸序列之分子或具有對一或多 個天然序列胺基酸進行之缺失、添加及/或取代的分子。術語「多肽」及「蛋白質」特定言之涵蓋本發明之嵌合ADI酶或具有對一或多個嵌合ADI酶之胺基酸進行之缺失、添加及/或取代之序列。在某些實施例中，多肽為「重組」多肽，其由包含一或多個重組DNA分子之重組細胞產生，該等重組DNA分子通常由異源聚核苷酸序列或聚核苷酸序列之組合(其不應另外發現於細胞中)製成。

本文所提及術語「分離蛋白質」意謂個體蛋白質(1)不含通常將與其一起見於自然界之至少一些其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已自自然界中與其結合之至少約50%聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質中分離，(5)不與自然界中與「分離蛋白質」結合之蛋白質部分結合(藉由共價或非共價相互作用)，(6)與自然界中不與其結合之多肽以可操作方式結合(藉由共價或非共價相互作用)，或(7)不出現於自然界中。該分離蛋白質可由可為合成來源或其任何組合之基因體DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼。在某些實施例中，分離蛋白質實質上不含見於將干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)之其自然環境的蛋白質或多肽或其他污染物。

在本發明中，嵌合ADI或編碼嵌合ADI之聚核苷酸可來源於、選殖於或由包括例如微生物、重組生物技術或其任何組合之任何來源生產。舉例而言，精胺酸脫亞胺酶可選殖於黴漿菌屬、梭菌屬、桿菌屬、疏螺旋體屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬及/或梨形鞭毛蟲屬之微生物。在某些實施例中，精胺酸脫亞胺酶選殖於肺炎黴漿菌、人型黴漿菌、精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌、海豹腦黴漿菌、口腔黴漿菌、貓黴漿菌、海豹黴漿菌、鴿黴漿菌、愛阿華黴漿菌、鱷黴漿菌、醱酵黴漿菌、穿刺黴漿菌、雞敗血性黴漿菌、雞黴漿菌、惰性黴漿菌、短吻鱷黴漿菌、運動黴漿菌及山羊黴漿菌、釀膿鏈球菌、肺 炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、腸梨形鞭毛蟲、產氣莢膜梭菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、米酒乳酸桿菌或其任何組合。某些此等精胺酸脫亞胺酶之胺基酸序列提供於下表A1中。

因此，在一些實施例中，用於嵌合ADI之ADI可包含來自表A1之胺基酸序列(SEQ ID NO：1-3或15-21中之任一者)或具有ADI活性之其變異體(例如能夠將精胺酸代謝成瓜胺酸及氨)或具有ADI活性之其片段或具有ADI活性之其工程化嵌合體。

例示性嵌合ADI之序列提供於下表A2中。

因此，在一些實施例中，嵌合ADI包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：來自表A2之說明性嵌合序列(SEQ ID NO：4-13或22-59)或具有ADI活性之其變異體或片段。

某些實施例包括本文所述之參考ADI多肽序列之變異體，不論藉由名稱或參考序列標識符描述(例如表A1-A2)。作為本文所用之術語，「變異體」序列係指藉由一或多個取代、缺失(例如截斷)、添加及/或***而與本文揭示之參考序列不同之多肽或聚核苷酸序列。因此，某些變異體包括本文所述之參考序列之片段。變異體多肽具有生物活性，亦即其繼續具有參考多肽之酶或結合活性。此類變異體可由例如遺傳多形現象及/或由人類操控產生。

在許多情況下，生物活性變異體將含有一或多個保守取代。「保守取代」為一個胺基酸經取代為另一個具有相似特性之胺基酸，使得熟習肽化學技術者將預期多肽之二級結構及親水性質實質上不變的取代。如上所述，修飾可在本發明之聚核苷酸及多肽之結構中進行，且仍獲得編碼具有所要特徵之變異體或衍生多肽之功能性分子。若需要改變多肽之胺基酸序列以產生等效或甚至改良之本發明多肽之變異體或部分，熟習此項技術者通常將改變一或多個編碼DNA序列之密碼子。

舉例而言，在蛋白質結構中某些胺基酸可經取代為其他胺基酸，而與諸如抗體之抗原結合區或受質分子上之結合位點之結構的相互結合能力無明顯損失。由於蛋白質之相互作用能力及性質界定該蛋白質之生物功能活性，因此可在蛋白質序列及(當然)其基本DNA編碼 序列中進行某些胺基酸序列取代，而仍然獲得具有類似特性之蛋白質。因此，預期可在所揭示組合物之肽序列或編碼該等肽之相應DNA序列中進行多種變化，而其效用無明顯損失。

進行此類變化時，可考慮胺基酸之親水指數。在此項技術中一般理解親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中之重要性(Kyte及Doolittle,1982，其以引用之方式併入本文中)。公認胺基酸之相對親水特徵促成所得蛋白質之二級結構，其又界定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵而指定親水指數(Kyte及Doolittle,1982)。此等值為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；***酸(+2.8)；半胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。此項技術中已知某些胺基酸可由具有相似親水指數或得分之其他胺基酸取代，且仍產生具有相似生物活性之蛋白質，亦即仍獲得生物功能等效之蛋白質。進行此類變化時，用親水指數在±2內之胺基酸取代較佳，用±1內之彼等胺基酸取代尤其較佳，且用±0.5內之彼等胺基酸取代甚至尤其更佳。

在此項技術中亦應理解，可基於親水性有效地進行類似胺基酸取代。美國專利4,554,101(特定地以全文引用之方式併入本文中)陳述蛋白質之最大局部平均親水性(如由其相鄰胺基酸之親水性所調控)與該蛋白質之生物學特性相關。如美國專利第4,554,101號中所詳述，已對胺基酸殘基指定以下親水值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)； 組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；***酸(-2.5)；色胺酸(-3.4)。應理解一個胺基酸可經取代為另一個具有相似親水值之胺基酸，且仍獲得生物等效且特定言之免疫等效之蛋白質。在此類變化中，用親水值在±2內之胺基酸取代較佳，用±1內之彼等胺基酸取代尤其較佳，且用±0.5內之彼等胺基酸取代甚至尤其更佳。

如上文所概述，胺基酸取代因此一般基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小及其類似者。呈多種前述特徵之例示性取代為熟習此項技術者所熟知，且包括：精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺酸及天冬醯胺；以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。

胺基酸取代可進一步基於殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩性中之相似性來進行。舉例而言，帶負電之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電之胺基酸包括離胺酸及精胺酸；且具有親水值相似之不帶電極性頭基之胺基酸包括白胺酸、異白胺酸及纈胺酸；甘胺酸及丙胺酸；天冬醯胺及麩醯胺酸；以及絲胺酸、蘇胺酸、***酸及酪胺酸。可代表保守變化之其他胺基酸基團包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；及(5)phe、tyr、trp、his。

變異體亦可(或替代地)含有非保守變化。在一較佳實施例中，變異體多肽藉由取代、缺失或添加少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2個胺基酸或甚至1個胺基酸而與天然或參考序列不同。變異體亦可(或替代地)由例如缺失或添加胺基酸來修飾，該等胺基酸對多肽之免疫原性、二級結構、酶活性及/或親水性影響最小。

在某些實施例中，多肽序列為約、至少約或至多約5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000個或1000個以上長度上鄰近之胺基酸(包括其間之所有整數)，且其可包含參考序列(參見例如序列表)之全部或一部分。

在其他特定實施例中，多肽序列由約或不超過約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000個或1000個以上鄰近胺基酸組成(包括其間之所有整數)，且其可包含 參考序列(參見例如序列表)之全部或一部分。

在其他特定實施例中，多肽序列為約10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400或200-300個鄰近胺基酸(包括其間之所有範圍)，且其包含參考序列之全部或一部分。在某些實施例中，任何參考多肽之C端或N端區可由約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800個或800個以上胺基酸，或由約10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800個或750-800個以上胺基酸截斷(包括其間之所有整數及範圍，例如101、102、103、104、105個)，只要截斷之多肽保留參考多肽之結合特性及/或活性即可。通常，生物活性片段具有不低於約1%、約5%、約10%、約25%或約50%之其所來源於之生物活性參考多肽的活性。

一般而言，變異體將顯示與參考多肽序列之至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之相似性或序列一致性或序列同源性。此外，涵蓋藉由添加(例如C端添加、N端添加、 兩者)、缺失、截斷、***或取代(例如保守取代)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸(包括其間之所有整數及範圍)而與天然或親代序列不同但保持父代或參考多肽序列之特性或活性之序列。

在一些實施例中，變異體多肽有至少一個但少於50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個胺基酸殘基與參考序列不同。在其他實施例中，變異體多肽有至少1%但少於20%、15%、10%或5%殘基與參考序列不同。(若此比較需要比對，則序列應對最大相似性進行比對。來自缺失或***之「環狀(looped)」外序列或錯配視為差異。)如下進行序列之間的序列相似性或序列一致性(該等術語在本文中可互換使用)計算。為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的比對序列(例如可將間隙引入第一及第二胺基酸或核酸序列中之一或兩者中用於最佳比對且出於比較目的可忽略非同源序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之參考序列長度為參考序列長度之至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、60%且甚至更佳至少70%、80%、90%、100%。接著比較相應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置與第二序列中之相應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據，則分子在彼位置處一致。

兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有之相同位置數目之函數，考慮到間隙之數目及各間隙之長度，需要引入該等間隙以便最佳比對兩個序列。

可使用數學算法實現序列比較及確定兩個序列之間的一致性百 分比。在一較佳實施例中，使用已併入GCG套裝軟體之GAP程式中之Needleman及Wunsch,(J.Mol.Biol.48：444-453,1970)算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。在另一較佳實施例中，使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或80之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。一種尤其較佳參數集(及除非另外說明，否則應使用者)為Blossum 62計分矩陣，其具有間隙罰分12、間隙擴展罰分4及讀框轉移間隙罰分5。

可使用E.Meyers及W.Miller(Cabios.4：11-17,1989)算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4來測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。

本文所述之核酸及蛋白質序列可作為「查詢序列」用於對照公共資料庫執行搜尋，例如以鑑定其他家族成員或相關序列。此類搜尋可使用Altschul等人，(1990,J.Mol.Biol.215：403-10)之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)執行。BLAST核苷酸搜尋可用NBLAST程式(得分=100，字長=12)執行以獲得與本發明之核酸分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(得分=50，字長=3)執行以獲得與本發明之蛋白質分子同源之胺基酸序列。為獲得間隙比對用於對比目的，可如Altschul等人，(Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997)中所述利用有間隙之BLAST。當利用BLAST及有間隙之BLAST程式時，可使用對應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。

在一個實施例中，如上所指出，可使用BLAST比對工具評估聚核苷酸及/或多肽。局部比對僅由一對序列片段組成，其來自各個所比較序列。Smith-Waterman或Sellers算法之改良將發現所有不可藉由 擴展或削減而提高得分之片段對，稱為高分片段對(high-scoring segment pairs，HSP)。BLAST比對結果包括統計量測以指示BLAST得分可僅偶然預期之可能性。

原始得分S自與各比對序列結合之間隙及取代數目計算，其中較高相似性得分指示較顯著比對。取代得分由查找表(參見PAM,BLOSUM)給出。

間隙得分通常計算為G(間隙開放罰分)及L(間隙擴展罰分)之總和。對於長度n之間隙，間隙成本應為G+Ln。間隙成本、G及L之選擇為經驗的，但習慣選擇高G值(10-15，例如11)及低L值(1-2，例如1)。

位得分(bit score)S'來源於原始比對得分S，其中已考慮所用計分系統之統計特性。位得分根據計分系統標準化，因此其可用於比較來自不同搜尋之比對得分。術語「位得分」及「相似性得分」可互換使用。位得分提供比對良好程度之示度；得分愈高，比對愈佳。

E值或期望值描述具有相似得分之序列將偶然出現於資料庫中之可能性。其為對預期偶然出現於資料庫搜尋中的得分相當於或比S較佳之不同比對數目之預測。E值愈小，比對愈顯著。舉例而言，E值為e^-117之比對意謂具有相似得分之序列不太可能僅偶然出現。另外，比對無規胺基酸對之預期得分需要為負，否則長比對將傾向於具有獨立於不論比對之片段是否相關之高分。另外，BLAST算法使用適當取代矩陣、核苷酸或胺基酸且有間隙之比對使用間隙形成及擴展罰分。舉例而言，BLAST比對及多肽序列之比較通常使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1來進行。

在一個實施例中，自使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1進行之BLAST分析報道序列相似性得分。

在一特定實施例中，本文提供之序列一致性/相似性得分係指使 用GAP 10版(GCG,Accelrys,San Diego,Calif.)，使用以下參數獲得之值：使用間隙權數50及長度權數3以及nwsgapdna.cmp計分矩陣之針對核苷酸序列之一致性%及相似性%；使用間隙權數8及長度權數2以及BLOSUM62計分矩陣(Henikoff及Henikoff,PNAS USA.89：10915-10919,1992)之針對胺基酸序列之一致性%及相似性%。GAP使用Needleman及Wunsch(J Mol Biol.48：443-453,1970)算法以發現使配對數目最大且間隙數目最小之兩個完整序列之比對。

在一個特定實施例中，變異體多肽包含可與參考多肽序列(參見例如序列表)最佳比對之胺基酸序列以產生至少約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或1000以上(包括其間之所有整數及範圍)之BLAST位得分或序列相似性得分，其中BLAST比對使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1。

如上所指出，可以多種方式改變參考多肽，包括胺基酸取代、缺失、截斷、添加及***。此類操控方法一般為此項技術中已知的。舉例而言，可藉由DNA中之突變製備參考多肽之胺基酸序列變異體。突變誘發及核苷酸序列改變之方法在此項技術中為吾人所熟知。參見例如Kunkel(PNAS USA.82：488-492,1985)；Kunkel等人，(Methods in Enzymol.154：367-382,1987)，美國專利第4,873,192號，Watson,J.D. 等人，(「Molecular Biology of the Gene」，第四版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)且該等參考文獻引用於本文中。關於不影響所關注蛋白質之生物活性的適當胺基酸取代之指導可見於Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)之模型中。

篩檢由此類修飾製造之組合庫之基因產物及篩檢具有所選擇特性之針對基因產物之cDNA庫的方法為此項技術中已知的。此類方法適合於快速篩檢由參考多肽之組合突變誘發產生之基因庫。作為一個實例，遞歸集合突變誘發(recursive ensemble mutagenesis，REM)(促進庫中功能突變體頻率之技術)可與篩檢分析組合使用以鑑定多肽變異體(Arkin及Yourvan,PNAS USA 89：7811-7815,1992；Delgrave等人，Protein Engineering.6：327-331,1993)。

天然ADI可見於微生物中，且具有免疫原性且自患者體內之循環快速清除。此等問題可藉由工程化ADI解決以降低其抗原性，諸如藉由工程化嵌合ADI分子。在一個實施例中，藉由使用標準分子生物或蛋白質合成技術組合來自不同ADI蛋白質之不同區(例如催化區及α-螺旋區)來構建嵌合ADI。在一個實施例中，來自精胺酸黴漿菌或關節炎黴漿菌之催化區與人型黴漿菌之α-螺旋區組合。在另一實施例中，精胺酸黴漿菌之催化區與關節炎黴漿菌之α-螺旋區組合。在另一實施例中，關節炎黴漿菌之催化區與精胺酸黴漿菌之α-螺旋區組合。如熟習此項技術者將公認，催化及α-螺旋區之其他組合可自來源於其他物種之ADI蛋白質構建，諸如肺炎黴漿菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體、腸梨形鞭毛蟲、產氣莢膜梭菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌及米酒乳酸桿菌。

亦可藉由修飾嵌合ADI解決抗原性問題。因此，本發明提供藉由修飾劑修飾之嵌合ADI，該修飾劑包括(但不限於)大分子聚合物、蛋 白質、肽、多醣或其他化合物。如本文所述之精胺酸脫亞胺酶或其嵌合體及修飾劑可藉由共價或非共價相互作用連接以形成穩定結合物或穩定組合物來達成所要效果。在某些實施例中，經修飾嵌合ADI保留未修飾嵌合ADI之生物活性且具有較長活體內半衰期及比未修飾嵌合ADI低之抗原性。在某些實施例中，經修飾嵌合ADI保留至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之未修飾嵌合ADI之生物活性。

在一個實施例中，修飾劑可為具有生物相容性且可提高血液中嵌合ADI半衰期之聚合物或蛋白質或其片段。修飾劑可以化學方式與嵌合ADI偶合或在適用情況下經由融合蛋白質表現連接至嵌合ADI。

大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物，其在某些實施例中可具有其自身生物活性。適合聚合物包括(但不限於)聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯啶酮、聚胺基酸、二乙烯醚與順丁烯二酸酐之共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、多醣、聚氧乙烯化多元醇、肝素或其片段、聚烷基-乙二醇及其衍生物、聚烷基-乙二醇及其衍生物之共聚物、聚(乙烯基***)、a,P-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺]、聚羧酸酯、聚氧化乙烯-氧化甲烯、聚丙烯醯嗎啉、胺基化合物與氧化烯烴之共聚物、聚玻尿酸、聚環氧乙烷、乙二酸與丙二酸之共聚物、聚(1,3-二氧雜戊環)、乙烯與順丁烯二醯肼共聚物、聚唾液酸、環糊精等。在某些實施例中，聚合物為聚乙二醇。

如本文所用之聚烯醇化合物包括(但不限於)聚乙二醇(包括單甲氧基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚丁烯醇及其類似物及其衍生物(諸如脂質)。

聚醚化合物包括(但不限於)聚烷二醇(HO((CH₂)_xO)_nH)、聚丙二醇、聚氧乙烯(HO((CH₂)₂O)_nH)、聚乙烯醇((CH₂CHOH)_n)。

聚胺基酸包括(但不限於)一種胺基酸之聚合物或兩種或兩種以上胺基酸之共聚物，例如聚丙胺酸或聚離胺酸或其嵌段共聚物。

多醣包括(但不限於)聚葡萄糖及其衍生物(例如硫酸葡聚糖)、纖維素及其衍生物(包括甲基纖維素及羧甲基纖維素)、澱粉及其衍生物、聚蔗糖等。

在本發明之一個特定實施例中，藉由與蛋白質或肽偶合來修飾嵌合ADI，其中一或多個蛋白質或肽直接或間接連接至嵌合ADI。蛋白質可為天然存在之蛋白質或其片段，包括(但不限於)天然存在之人類血清蛋白質或其片段，諸如甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、a1-酸醣蛋白、運鐵蛋白、血纖維蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc區、白蛋白及其片段。「片段」意謂小於整個蛋白質但保留蛋白質所要功能之蛋白質之任何部分。工程化之嵌合ADI可經由共價鍵直接或間接連接至蛋白質。直接連接意謂嵌合ADI之一個胺基酸經由肽鍵或二硫橋鍵直接連接至修飾用蛋白質之一個胺基酸。間接連接係指嵌合ADI與修飾用蛋白質之間經由其間原先存在之化學基團或經由生物學或化學手段添加之特定化學基團而連接，或上述連接之組合。

在一個特定實施例中，藉由與PEG共價附接修飾嵌合ADI。與PEG共價修飾之嵌合ADI(有或無連接子)在下文可稱為嵌合「ADI-PEG」。與未修飾之嵌合ADI相比，嵌合ADI-PEG保留其大部分酶活性，抗原性低得多，循環半衰期大大延長，且在腫瘤治療中更加有效。

「聚乙二醇」或「PEG」係指環氧乙烷與水之縮合聚合物(呈分支鏈或直鏈形式)之混合物，由通式H(OCH₂CH₂)_nOH表示，其中n為至少4。「聚乙二醇」或「PEG」與數字後綴組合使用以指示其大致重量平均分子量。舉例而言，PEG5,000係指總重量平均分子量為約5,000之PEG；PEG12,000係指總重量平均分子量為約12,000之PEG；而 PEG20,000係指總重量平均分子量為約20,000之PEG。

在本發明之一個實施例中，PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000；在一個實施例中為約3,000至約40,000，且在另一實施例中為約5,000至約30,000；在某些實施例中為約8,000至約30,000；在其他實施例中為約11,000至約30,000；在其他實施例中為約12,000至約28,000；在其他實施例中為約16,000至約24,000；且在其他實施例中為約18,000至約22,000；在另一實施例中為19,000至約21,000，且在一個實施例中PEG之總重量平均分子量為約20,000。一般而言，分子量為30,000或30,000以上之PEG難以溶解，且調配產物之產率可降低。PEG可為分支鏈或直鏈。一般而言，增加PEG之分子量降低ADI或嵌合ADI之抗原性。具有此實施例中所述之分子量之PEG可與嵌合ADI及視情況選用之生物相容性連接子結合使用以治療癌症，包括例如急性骨髓性白血病(諸如復發性急性骨髓性白血病)、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌、胃癌(stomach cancer)及食道癌。

在本發明之另一實施例中，PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000；在某些實施例中為約3,000至約30,000；在其他實施例中為約3,000至約20,000；在一個實施例中為約4,000至約12,000；在其他實施例中為約4,000至約10,000；在其他實施例中為約4,000至約8,000；在其他實施例中為約4,000至約6,000；且在另一實施例中為約5,000。PEG可為分支鏈或直鏈，且在某些實施例中為直鏈。具有此實施例中所述之分子量之PEG可與嵌合ADI及視情況選用之生物相容性連接子結合使用以治療移植物抗宿主疾病(GVHD)或癌症。

儘管嵌合ADI-PEG為本文所述之說明性經修飾嵌合ADI，但如熟習此項技術者將公認，嵌合ADI可用其他聚合物或適當分子修飾以達 成所要效果，特定言之抗原性降低且血清半衰期提高。

嵌合ADI可在有或無連接子之情況下共價結合至修飾劑(諸如PEG)上，但一較佳實施例利用連接子。

用於將嵌合ADI共價附接至修飾劑(例如PEG)之連接子可為任何生物相容性連接子。如上所述，「生物相容性」指示化合物或基團無毒性且可在活體外或活體內利用而不引起損傷、不適(sickness)、疾病(disease)或死亡。修飾劑(諸如PEG)可例如經由醚鍵、硫醇鍵或醯胺鍵結合至連接子。連接基團包括例如丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基及其組合。在一個實施例中，生物相容性連接子之來源為丁二醯亞胺丁二酸酯(SS)。連接子之其他適合來源可包括氧基羰基咪唑基(包括例如羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、三氟乙基磺酸酯基(trysylate group)、醛基、異氰酸酯基、乙烯基碸基或一級胺。在另一實施例中，連接子來源於SS、SPA、SCM或NHS；在某些實施例中，使用SS、SPA或NHS，而在其他實施例中，使用SS或SPA。因此，在某些實施例中，潛在連接子可由以下形成：甲氧基-PEG丁二醯亞胺丁二酸酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸丁二醯亞胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸丁二醯亞胺酯(SC)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基羧甲酯(SCM)、甲氧基-PEG2 N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸丁二醯亞胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸丁二醯亞胺酯(SPA)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基戊二醯胺及甲氧基-PEG丁二醯亞胺基丁二醯亞胺。

或者，嵌合ADI可經由胺基、硫氫基、羥基或羧基直接偶合至修飾劑(諸如PEG)(亦即無連接子)。

嵌合ADI可使用此項技術中已知之方法經由生物相容性連接子共價結合至PEG，該等方法例如由Park等人，Anticancer Res.,1：373-376 (1981)；及Zaplipsky及Lee,Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris編，Plenum Press,NY，第21章(1992)所描述，其揭示內容在此以全文引用之方式併入本文中。

PEG與嵌合ADI之附接提高嵌合ADI之循環半衰期。一般而言，PEG附接至嵌合ADI之一級胺。如熟習此項技術者應已知，對嵌合ADI上PEG或其他修飾劑之附接位點之選擇由蛋白質活性區內各位點之作用確定。PEG可附接至嵌合ADI之一級胺而酶活性無實質性損失。舉例而言，選殖於精胺酸黴漿菌、關節炎黴漿菌及人型黴漿菌之ADI具有多個可由此程序修飾之離胺酸殘基。換言之，離胺酸中之一或多者或全部為如本文所述之ADI及ADI之嵌合形式可經由生物相容性連接子(諸如SS、SPA、SCM、SSA及/或NHS)附接至PEG之可能點。如熟習此項技術者鑒於本發明應顯而易知，PEG亦可附接至如本文所述之ADI及ADI之嵌合形式上之其他位點。

1至約30個PEG分子可共價結合至嵌合ADI。在某些實施例中，用一個PEG分子修飾嵌合ADI。在其他實施例中，用一個以上PEG分子修飾嵌合ADI。在一個實施例中用約1至約10個PEG分子，在一個實施例中用約2至約8個PEG分子且在另一實施例中用約9至約12個PEG分子修飾嵌合ADI。在另一實施例中，用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個PEG分子修飾嵌合ADI。在一個特定實施例中，用每ADI 4.5-5.5個PEG分子修飾嵌合ADI。在另一實施例中，用5±1.5個PEG分子修飾嵌合ADI。

在另一實施例中，用PEG修飾嵌合ADI中約15%至約70%，在一個實施例中約20%至約65%、約25%至約60%，或在某些實施例中約30%至約55%或45%至約50%之一級胺基，且在其他實施例中用PEG修飾精胺酸脫亞胺酶中約20%或30%或40%或50%之一級胺基。如熟習 此項技術者應理解，一級胺基之範圍視成功移除之離胺酸數量而定。在某些實施例中，可移除所有離胺酸且分子之N端經聚乙二醇化。當PEG共價結合至嵌合ADI之末端時，可能僅需要利用1個PEG分子。增加嵌合ADI上PEG單元之數量提高酶之循環半衰期。然而，增加嵌合ADI上PEG單元之數量降低酶之比活性。因此，熟習此項技術者鑒於本發明應顯而易知，需要在兩者之間達成平衡。

在本發明中，生物相容性連接子之共同特徵為其經由丁二醯基附接至精胺酸脫亞胺酶之一級胺。與嵌合ADI偶合後，SS-PEG具有緊鄰PEG之酯鍵，其可使此位點對血清酯酶敏感，此可將PEG自嵌合ADI釋放於體內。SPA-PEG及PEG2-NHS不具有酯鍵，因此其對血清酯酶不敏感。

在某些實施例中，在本發明中使用生物相容性連接子。附接至蛋白質上之PEG可為直鏈，如同SS-PEG、SPA-PEG及SC-PEG，或可使用PEG之分支鏈，如同PEG2-NHS。

在某些實施例中，本發明之嵌合ADI可如美國專利第6,635,462號中所述來修飾。特定言之，可對較易於複性及調配之酶提供ADI及ADI嵌合分子(特定言之來源於人型黴漿菌、關節炎黴漿菌及精胺酸黴漿菌)之一或多個天然存在之胺基酸殘基的修飾，藉此提高製造嵌合ADI及包含其之治療組合物之現有技術。在一個實施例中，本發明之嵌合ADI經修飾以移除一或多個離胺酸殘基(例如，離胺酸可經另一胺基酸或其類似物或一個非天然胺基酸取代)。特定言之，在一個實施例中，嵌合ADI經修飾以去除SEQ ID NO：1(人型黴漿菌ADI)之位置112、374、405或408或一或多個此等位置之組合的離胺酸。在另一實施例中，嵌合ADI經修飾以去除一或多個離胺酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個或21個以上離胺酸殘基(其若存在)可經另一胺基酸或其類似物或 非天然胺基酸取代。在一個實施例中，嵌合ADI之5個離胺酸例如在SEQ ID NO：4之位置7、88、137、209及380經取代。在另一實施例中，嵌合ADI之10個離胺酸例如在SEQ ID NO：4之位置7、9、59、88、115、116、137、178、209及380經取代。在另一實施例中，嵌合ADI之15個離胺酸例如在SEQ ID NO：4之位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279及位置380經取代。在一個實施例中，嵌合ADI包含21個離胺酸例如在SEQ ID NO：4之位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380及406經取代。離胺酸經取代之說明性嵌合ADI分子列舉於SEQ ID NO：10-13中。

在某些實施例中，位於或鄰接於酶之催化區之與ADI結合之聚乙二醇化位點經修飾。出於本發明之目的，片語「聚乙二醇化位點」可定義為可用聚乙二醇共價修飾之ADI或嵌合ADI之任何位點或位置。「聚乙二醇化位點」可視為位於或鄰接於酶之催化區，其中位點之聚乙二醇化使得酶之催化活性顯著降低。此類位點之聚乙二醇化已傳統地導致酶不活化。舉例而言，來自人型黴漿菌之ADI具有可視為位於或鄰接於酶之催化區的112位置之離胺酸。PEG與此112位置之離胺酸之附接可使酶不活化。另外，來自人型黴漿菌之ADI具有可視為位於或鄰接於酶之催化區的397位置之半胱胺酸。對397位置之半胱胺酸進行胺基酸取代可使酶不活化。特定言之，用丙胺酸、組胺酸、精胺酸、絲胺酸、離胺酸或酪胺酸取代397位置之半胱胺酸可導致所有可檢測酶活性之損失。來自人型黴漿菌之ADI亦具有三個位於靠近此保守半胱胺酸處之離胺酸，特定言之Lys374、Lys405及Lys408。PEG與Lys374、Lys405、Lys408或其組合之附接可使酶不活化。

應理解，來源於其他有機體之ADI亦可具有與來自人型黴漿菌之ADI之112位置對應的聚乙二醇化位點。舉例而言，來自釀膿鏈球菌 之ADI具有104位置之離胺酸，來自肺炎黴漿菌之ADI具有106位置之離胺酸，且來自腸梨形鞭毛蟲之ADI具有114位置之離胺酸。另外，來自一些有機體之ADI可具有同與來自人型黴漿菌之ADI之112位置相同之一般位置對應的離胺酸。來自此類有機體之ADI中之離胺酸位置為熟習此項技術者已知的，且描述於美國專利第6,635,462號中。

因此，在一個實施例中，本發明提供ADI之多肽鏈中之某些胺基酸取代。此等胺基酸取代提供在由修飾劑修飾時(例如，在聚乙二醇化後)活性損失較少之經修飾ADI。藉由去除位於或鄰接於酶之催化區之聚乙二醇化位點或其他已知修飾位點，可在不損失活性之情況下達成最佳修飾(例如聚乙二醇化)。

應理解，本發明之其他實施例係基於以下理解：精胺酸脫亞胺酶之某些結構特徵可阻止或干擾經由重組技術產生時之恰當及快速複性。特定言之，此等結構特徵妨礙或阻止酶在重組產生期間採取活性構形。出於本發明之目的，片語「活性構形」可定義為允許藉由未修飾或修飾之精胺酸脫亞胺酶或嵌合精胺酸脫亞胺酶達成酶活性之三維結構。特定言之，活性構形對催化精胺酸轉化成瓜胺酸可為必需的。片語「結構特徵」可定義為由特定胺基酸或胺基酸組合產生之多肽鏈之任何特點、品質或特性。舉例而言，精胺酸脫亞胺酶可含有導致正常肽鏈中之彎曲或扭結且因此阻礙酶在酶複性期間採取活性構形之胺基酸。特定言之，來自人型黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶具有210位置之脯胺酸，其可導致肽鏈中之彎曲或扭結，使得重組產生期間之酶複性較困難。應理解，來源於其他有機體之精胺酸脫亞胺酶亦可具有與來自人型黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶之210位置對應的位點。

因此，本發明又提供野生型精胺酸脫亞胺酶及來源於其之嵌合精胺酸脫亞胺酶之多肽鏈中的某些胺基酸取代。此類胺基酸取代可去除精胺酸脫亞胺酶之肽鏈中之成問題結構特徵。此類胺基酸取代提供 經修飾精胺酸脫亞胺酶之複性改良。此等胺基酸取代使得可能使用減少之緩衝劑量進行經修飾精胺酸脫亞胺酶之快速複性。此等胺基酸取代亦可提供經複性之經修飾嵌合精胺酸脫亞胺酶之產率提高。在本發明之一個實施例中，經修飾嵌合精胺酸脫亞胺酶具有P210或等效殘基處之胺基酸取代。如上所述，來源於人型黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶具有210位置之胺基酸脯胺酸。儘管不限制本發明，但目前咸信位置210之胺基酸脯胺酸之存在導致正常多肽鏈中之彎曲或扭結，該彎曲或扭結提高使精胺酸脫亞胺酶複性(亦即再摺疊)之難度。位置210之脯胺酸之取代使得可能使用減少之緩衝劑量進行經修飾精胺酸脫亞胺酶及來源於其之嵌合體之快速複性。對位置210之脯胺酸之取代亦可提供經複性之經修飾嵌合精胺酸脫亞胺酶之產率提高。在一個實施例中，位置210之脯胺酸經絲胺酸取代。應理解，根據本發明之此態樣，可進行位置210之其他取代。其他取代之實例包括Pro210取代為Thr210、Pro210取代為Arg210、Pro210取代為Asn210、Pro210取代為Gln210或Pro210取代為Met210。藉由去除彼等與野生型精胺酸脫亞胺酶及來源於其之嵌合體結合的位置210之胺基酸之結構特徵，可達成酶之恰當再摺疊。

本發明之方法可涉及活體外或活體內應用。在活體外應用(包括細胞培養應用)之情況下，本文所述之化合物可添加培養物中之細胞中，接著培育。本發明之化合物亦可用於使用此項技術中熟知之抗體產生技術來促進單株及/或多株抗體之產生。如熟習此項技術者應顯而易知，單株及/或多株抗體可接著用於多種診斷應用。

本發明化合物之活體內投藥方式將視預期應用而變化。以純形式或適當醫藥組合物形式投與本文所述之嵌合ADI組合物可經由投與用於相似效用之藥劑的任一已接受模式來進行。可藉由使嵌合ADI(例如嵌合ADI-PEG、嵌合ADI-PEG 20)與適當之生理學上可接受之載 劑、稀釋劑或賦形劑組合來製備醫藥組合物，且其可調配成固體、半固體、液體或氣體形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球粒及霧劑。此外，其他醫藥學上活性之成分(包括如本文其他地方所述之其他抗癌劑)及/或適合賦形劑(諸如鹽、緩衝劑及穩定劑)可(但不必)存在於組合物內。投藥可藉由多種不同途徑來達成，包括經口、非經腸、經鼻、靜脈內、皮內、皮下或局部。投藥模式視待治療或預防之病狀性質而定。因此，嵌合ADI-PEG(例如嵌合ADI-PEG 20)可經口、鼻內、腹膜內、非經腸、靜脈內、淋巴內、瘤內、肌肉內、組織間、動脈內、皮下、眼內、滑膜內、經上皮及經皮投與。投藥之後，減輕、抑制、預防或延遲癌症之進展及/或癌轉移之量視為有效。在某一實施例中，本文之嵌合ADI組合物使患者存活時間中值增加統計學上顯著之量。在一個實施例中，本文所述之嵌合ADI治療使患者之存活時間中值增加4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、15週、20週、25週、30週、40週或40週以上。在某些實施例中，嵌合ADI治療使患者存活時間中值增加1年、2年、3年或3年以上。在一個實施例中，本文所述之嵌合ADI治療使無癌症進展之存活期增加2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週或10週以上。在某些實施例中，本文所述之嵌合ADI治療使無癌症進展之存活期增加1年、2年、3年或3年以上。

在某些實施例中，如由活腫瘤量之統計學上顯著之減少(例如，腫瘤塊減少至少50%)或由改變(例如，統計學顯著性降低)之掃描尺寸所指示，投藥量足以引起腫瘤消退。在某些實施例中，投藥量足以使疾病穩定。在其他實施例中，投藥量足以使熟練臨床醫師已知之特定疾病示度之症狀在臨床上相應減輕。

在某些實施例中，投藥量足以抑制NO合成、抑制血管生成及/或 足以誘發腫瘤細胞中之凋亡或其任何組合。NO合成、血管生成及凋亡可使用此項技術中已知之方法量測，參見例如Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley及Sons,New York,N.Y.(2009及其更新)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley及Sons,1995；及其他類似參考文獻。在一個特定實施例中，投藥量抑制NO合成且抑制黑素瘤生長且與如本文所述之其他化學療法(諸如順鉑)協同作用。因此，本發明之一個實施例提供藉由與順鉑組合投與嵌合ADI-PEG 20治療黑素瘤之方法，其中該治療使內源性氧化氮(NO)耗竭。

治療之精確劑量及持續時間隨所治療之疾病而變化，且可使用已知測試方案憑經驗確定，或藉由測試此項技術中已知之模型系統中之組合物且自其推斷來確定。亦可進行對照臨床試驗。劑量亦可隨待緩解病狀之嚴重性而變化。醫藥組合物一般經調配及投與以在使非非所要副作用最小之同時發揮治療學上有用之效果。組合物可一次投與，或可分成多個較小劑量於時間間隔投與。對於任何特定個體，可根據個人需要隨時間調節特定劑量方案。

嵌合ADI組合物可單獨或與其他已知癌症治療(諸如放射療法、化學療法、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等)組合投與。組合物亦可與抗生素組合投與。

因此，投與此等及相關醫藥組合物之典型途徑包括(但不限於)經口、局部、經皮、吸入、非經腸、舌下、經頰、經直腸、經***及鼻內。如本文中所使用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、胸骨內注射或輸注技術。調配根據本發明之某些實施例之醫藥組合物以使得含於其中之活性成分在向患者投與該組合物後為生物可用的。將向個體或患者投與之組合物可呈一或多種劑量單位形式，其中舉例而言，錠劑可為單一劑量單位，且本文所述霧劑形式之嵌合 ADI組合物之容器可容納複數個劑量單位。製備此類劑型之實際方法對熟習此項技術者為已知的或應顯而易知；例如參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。在任何情況下，待投藥之組合物將含有治療有效量之本發明嵌合ADI-PEG(諸如嵌合ADI-PEG 20)用於治療根據本文中之教示所關注之疾病或病狀。

醫藥組合物可呈固體或液體形式。在一個實施例中，載劑為微粒，以便組合物例如呈錠劑或散劑形式。載劑可為液體，而組合物為例如口服油、可注射液體或可用於例如吸入投與之霧劑。當意欲經口投藥時，醫藥組合物一般為固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文中視為固體或液體之形式內。

作用用於經口投藥之固體組合物，醫藥組合物可調配成散劑、顆粒、壓縮錠劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片或其類似物。該固體組合物通常應含有一或多種惰性稀釋劑或可食載劑。此外，可存在一或多種以下物質：黏合劑，諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如褐藻酸、海藻酸鈉、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)、玉米澱粉及其類似者；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotex；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如胡椒薄荷、柳酸甲酯或橙味調味劑；及著色劑。當醫藥組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時，除上述類型之物質外，其還可含有諸如聚乙二醇或油之液體載劑。

醫藥組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩個實例，液體可用於經口投藥或藉由注射傳遞。當意欲經口投藥時，除本發明之化合物以外，較佳組合物還含有一或多種甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及香味增強劑。在意欲藉由注射投與之 組合物中，可包括一或多種界面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑。

液體醫藥組合物不論其為溶液、懸浮液或其他類似形式，均可包括一或多種以下佐劑：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液(在某些實施例中，生理鹽水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉、不揮發性油(諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調節張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、可棄式注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水為較佳佐劑。可注射醫藥組合物較佳為無菌的。

意欲非經腸或經口投與之液體醫藥組合物應含有本文所揭示之嵌合ADI(諸如嵌合ADI-PEG 20)之量，以便將獲得適合劑量。通常，此量為組合物中含至少0.01%嵌合ADI。當意欲經口投藥時，此量可變化為組合物重量之0.1%與約70%之間。某些經口醫藥組合物含有約4%與約75%之間的嵌合ADI-PEG。在某些實施例中，製備本發明之醫藥組合物及製劑以使得非經腸劑量單位在稀釋之前含有0.01重量%與10重量%之間的嵌合ADI-PEG。

醫藥組合物可意欲局部投藥，在此情況下載劑可適合地包含溶液、乳液、軟膏或凝膠基底。基底例如可包含一或多種以下物質：石蠟油、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑(諸如水及酒精)及乳化劑及穩定劑。醫藥組合物中可存在增稠劑用於局部投藥。若意欲經皮投藥，則組合物可包括經皮貼片或離子導入療法(iontophoresis)裝置。醫藥組合物可意欲以例如栓劑形式經直腸投與，該栓劑將在直腸中熔融且釋放藥物。用於經直腸投與之組合物可含有油性基底作為 適合之無刺激性賦形劑。此類基底包括(但不限於)羊毛脂、可可脂及聚乙二醇。

醫藥組合物可包括多種物質，該等物質調節固體或液體劑量單位之物理形式。舉例而言，組合物可包括在活性成分周圍形成塗層殼之物質。形成塗層殼之物質通常為惰性的，且可選自例如糖、蟲膠及其他腸溶性塗佈劑。或者，活性成分可封入明膠膠囊中。呈固體或液體形式之醫藥組合物可包括結合至嵌合ADI-PEG且藉此幫助傳遞化合物之試劑。可起此能力作用之適合試劑包括單株或多株抗體、一或多種蛋白質或脂質體。醫藥組合物可基本上由可以霧劑形式投與之劑量單位組成。術語霧劑係用於表示膠態性質之彼等系統至由加壓封裝組成之系統範圍內之多種系統。可由液化或壓縮氣體或由分配活性成分之適合泵系統傳遞。霧劑可以單相、雙相或三相系統傳遞以傳遞活性成分。霧劑之傳遞包括必需容器、活化劑、閥門、亞容器及其類似物，其可一起形成套組。一般熟習此項技術者在不進行過度實驗之情況下即可確定較佳霧劑。

醫藥組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法來製備。舉例而言，意欲藉由注射投與之醫藥組合物可藉由使包含如本文所述之嵌合ADI-PEG之組合物及視情況選用之一或多種鹽、緩衝劑及/或穩定劑與無菌蒸餾水組合來製備以便形成溶液。可添加界面活性劑以促進形成均勻溶液或懸浮液。界面活性劑為化合物，其與嵌合ADI-PEG組合物非共價相互作用以便促進嵌合ADI-PEG在含水傳遞系統中溶解或均勻懸浮。

組合物可以治療有效量投與，該治療有效量其將視多種因素而變化，包括所採用特定化合物(例如嵌合ADI-PEG)之活性；化合物活動之代謝穩定性及持續時間；患者之年齡、體重、總體健康狀況性別及飲食；投藥模式及時間；***率；藥物組合；特定病症或病狀之嚴 重性；及進行治療之個體。

本發明化合物中之一者之治療有效量為可有效抑制腫瘤生長之量。一般而言，以小劑量啟動治療，該等劑量可以小增量增加，直至達成該等情形下之最佳效果。一般而言，本發明化合物之治療劑量可為一週兩次至約每兩週一次，每次約1至約200mg/kg。舉例而言，劑量可為呈2ml靜脈內注射形式一週一次約1mg/kg至每3天一次約20mg/kg。在另一實施例中，劑量可為約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與約50IU/m²至約8,000IU/m²。在某些實施例中，劑量可為約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與約50IU/m²、60IU/m²、70IU/m²、80IU/m²、90IU/m²、100IU/m²、110IU/m²、120IU/m²、130IU/m²、140IU/m²、150IU/m²、160IU/m²、170IU/m²、180IU/m²、190IU/m²、200IU/m²、210IU/m²、220IU/m²、230IU/m²、240IU/m²、250IU/m²、260IU/m²、270IU/m²、280IU/m²、290IU/m²、300IU/m²、310IU/m²、約320IU/m²、約330IU/m²、340IU/m²、約350IU/m²、360IU/m²、370IU/m²、380IU/m²、390IU/m²、400IU/m²、410IU/m²、420IU/m²、430IU/m²、440IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、620IU/m²、630IU/m²、640IU/m²、650IU/m²、660IU/m²、670IU/m²、680IU/m²、690IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、850IU/m²、900IU/m²、950IU/m²、1,000IU/m²、1,100IU/m²、1,200IU/m²、1,300IU/m²、1,400IU/m²、1,500IU/m²、1,600IU/m²、1,700IU/m²、1,800IU/m²、1,900IU/m²、2,000IU/m²、2,100IU/m²、2,200IU/m²、2,300IU/m²、2,400IU/m²、2,500IU/m²、2,600IU/m²、2,700IU/m²、2,800IU/m²、2,900IU/m²、3,000IU/m²、3,100IU/m²、3200IU/m²、3,300IU/m²、3,400IU/m²、3,500IU/m²、3,600IU/m²、3,700IU/m²、3,800IU/m²、3,900IU/m²、4000IU/m²、4,100 IU/m²、4,200IU/m²、4,300IU/m²、4,400IU/m²、4,500IU/m²、4,600IU/m²、4,700IU/m²、4,800IU/m²、4,900IU/m²、5,000IU/m²、5,100IU/m²、5,200IU/m²、5,300IU/m²、5,400IU/m²、5,500IU/m²、5,600IU/m²、5,700IU/m²、5,800IU/m²、5,900IU/m²、6,000IU/m²、6,100IU/m²、6,200IU/m²、6,300IU/m²、6,400IU/m²、6,500IU/m²、6,600IU/m²、6,700IU/m²、6,800IU/m²、6,900IU/m²、7,000IU/m²、7,100IU/m²、7,200IU/m²、7,300IU/m²、7,400IU/m²、7,500IU/m²、7,600IU/m²、7,700IU/m²、7,800IU/m²、7,900IU/m²或約8,000IU/m²。

在一些實施例中，劑量可為約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。

在某些實施例中，劑量可由熟練臨床醫師按需要調節。在一些實施例中，嵌合ADI-SS-PEG5,000之最佳劑量可為約一週兩次，而嵌合ADI-SS-PEG20,000之最佳劑量可為約一週一次至約每兩週一次。在某些實施例中，chimeric ADI-SS-PEG20,000之最佳劑量可為約一週兩次。

嵌合ADI-PEG可在注射之前與磷酸鹽緩衝鹽水溶液或熟習此項技術者已知之任何其他適當溶液混合。在一個實施例中，包含嵌合ADI-PEG之液體組合物包含：約10至約12mg嵌合ADI，約20至約40mg聚乙二醇，1.27mg +5%單鹼磷酸鈉，USP；約3mg +5%二鹼磷酸鈉，USP；7.6mg +5%氯化鈉，USP；在約6.6至約7之pH下；於適量注射用水(例如約1ml或約2ml)中。在一個實施例中，包含嵌合ADI-PEG之液體組合物包含組胺酸-HCl，且在某些實施例中，組合物緩衝劑為約0.0035M組胺酸-HCl至約0.35M組胺酸-HCl。在一個特定實施例中， 在包含0.035M pH值為6.8之組胺酸-HCl與0.13M氯化鈉之緩衝劑中調配組合物。在另一實施例中，在包含0.02M pH值為6.8之磷酸鈉緩衝劑與0.13M氯化鈉之緩衝劑中調配組合物。

在一個實施例中，包含嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之組合物之pH為約5至約9、約6至約8或約6.5至約7.5。在一些實施例中，包含嵌合ADI之組合物之pH為約6.8±1.0。

在一個實施例中，包含嵌合ADI-PEG之組合物中之游離PEG為1-10%之間，且在另一實施例中為少於總PEG之7%、少於6%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%或小於1%。在某些實施例中，包含嵌合ADI-PEG之組合物中之未修飾嵌合ADI為少於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或小於0.1%。一般而言，包含嵌合ADI-PEG之組合物之總雜質小於或等於約4%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%。在一個實施例中，內毒素極限滿足USP中所述之要求，亦即

50EU/mL。

在一個實施例中，包含嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之組合物中之游離硫氫基大於約90%。在一些實施例中，包含嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之組合物中之游離硫氫基為約91%、約92%、約93%、約94%或約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或99%以上。

在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Km為約0.5μM至約15μM，且在另一實施例中為約1μM至約12μM、約1μM至約10μM、約1.5μM至約9μM、約1.5μM至約8μM或約1.5μM至約7μM。在某些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Km為約1.5μM至約6.5μM。在一些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Km為約1.5μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM或約7μM。在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI- PEG之Km與組合物中之野生型ADI或野生型ADI-PEG相比較少。

在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Kcat為約0.5sec^-1至約15sec^-1，且在另一實施例中為約1sec^-1至約12sec^-1、約1sec^-1至約10sec^-1、約1.5sec^-1至約9sec^-1、約2sec^-1至約8sec^-1或約2.5sec^-1至約7sec^-1。在某些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Kcat為約2.5sec^-1至約7.5sec^-1。在一些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Kcat為約2.5sec^-1、約3sec^-1、約3.5sec^-1、約4sec^-1、約4.5sec^-1、約5sec^-1、約5.5sec^-1、約6sec^-1、約6.5sec^-1、約7sec^-1、約7.5sec^-1或約8sec^-1。在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之Kcat比組合物中之野生型ADI或野生型ADI-PEG高。

在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之電導率(在此項技術中亦稱為比電導率)為約5mS/cm至約20mS/cm，且在其他實施例中為約5mS/cm至約15mS/cm、約7mS/cm至約15mS/cm、約9mS/cm至約15mS/cm或約10mS/cm至約15mS/cm。在一些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之電導率為約9mS/cm、約10mS/cm、約11mS/cm、約12mS/cm或約13mS/cm、約14mS/cm或約15mS/cm。在某些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之電導率為約13mS/cm±1.0mS/cm。

在一個實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之重量莫耳滲透濃度為約50mOsm/kg至約500mOsm/kg、約100mOsm/kg至約400mOsm/kg、約150mOsm/kg至約350mOsm/kg、約200mOsm/kg至約350mOsm/kg或約250mOsm/kg至約350mOsm/kg。在某些實施例中，組合物中之嵌合ADI或嵌合ADI-PEG之重量莫耳滲透濃度為約300±30mOsm/kg。

在一個實施例中，蛋白質濃度為約11.0±1.0mg/mL。在某些實 施例中，蛋白質濃度在約8與約15mg/mL之間。在另一實施例中，蛋白質濃度為約8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14或15mg/mL。

在一個實施例中，酶比活性在5.0與150IU/mg之間，其中1IU定義為在37℃下於一分鐘內將1μmol精胺酸轉化成1μmol瓜胺酸及1μmol氨的酶之量，且該活性為100±20IU/mg。在另一實施例中，酶比活性為約5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或約150±2.0IU/mg。在一個特定實施例中，酶比活性為100±10.0IU/mg。

包含本發明之嵌合ADI-PEG之組合物亦可與一或多種其他治療劑之投與同時、在其之前或在其之後投與。該組合療法可包括投與含有本發明化合物及一或多種其他活性劑之單一醫藥劑型，以及以其獨立醫藥劑型投與包含本發明之嵌合ADI-PEG(例如嵌合ADI-PEG 20)及各活性劑之組合物。舉例而言，如本文所述之嵌合ADI-PEG及其他活性劑可以單一經口劑量組合物(諸如錠劑或膠囊)一起向患者投與，或各藥劑以獨立經口劑型投與。同樣，如本文所述之嵌合ADI-PEG及其他活性劑可以單一非經腸劑量組合物(諸如以鹽水溶液或其他生理學上可接受之溶液)一起向患者投與，或各藥劑以獨立非經腸劑型投與。若使用獨立劑型，則包含嵌合ADI-PEG及一或多種其他活性劑之組合物可在基本上相同之時間(亦即並行地)或在分別錯開之時間(亦即依序及以任何次序)投與；組合療法理解為包括所有此等方案。

因此，在某些實施例中，亦涵蓋與一或多種其他治療劑組合投與本發明之嵌合ADI組合物。此項技術中可接受此類治療劑作為標準 治療用於如本文所述之特定疾病病況，諸如特定癌症或GVHD。涵蓋之例示性治療劑包括細胞激素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗發炎劑、化學治療劑、放射線治療劑、自體吞噬調節劑或其他活性及輔助劑。

在某些實施例中，本文所揭示之嵌合ADI組合物可與任何數目之化學治療劑結合投與。化學治療劑之實例包括：烷基化劑，諸如噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸鹽，諸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷醯胺、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氮芥氧化物、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素、表柔比星、依索比星(esorubicin)、艾達黴素、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素、黴酚酸、諾拉黴素 (nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；鍺 螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；尿烷；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；***糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多烯紫杉醇(TAXOTERE®.,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊甙；柔紅黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸衍生物，諸如Targretin^TM(貝瑟羅汀)、Panretin^TM(亞利崔托寧)；ONTAK^TM(地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox))；埃斯波黴素(esperamicins)；卡培他濱；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括起作用以調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗***劑，包括例如他莫昔芬、雷諾昔酚、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮及托瑞米芬(toremifene，Fareston)；及抗雄激素劑，諸如氟他胺、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林。其他化學治療劑包括索拉非尼(sorafenib)及其他蛋白激酶抑制劑，諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗、西妥昔單抗、克卓替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼、拉帕替尼(lapatinib)、蘭瓦替尼(lenvatinib)、 木利替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕尼單抗、帕佐泮尼(pazopanib)、派加替尼(pegaptanib)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、蘆可替尼(ruxolitinib)、曲妥珠單抗、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)及舒尼替尼；西羅莫司(雷帕黴素)、依維莫司及其他mTOR抑制劑。亦涵蓋上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物以用於本文。

在某些實施例中，本文所揭示之嵌合ADI組合物可與任何數目之自體吞噬抑制劑結合投與。在一些較佳實施例中，自體吞噬抑制劑選自由以下組成之群：氯奎、3-甲基腺嘌呤、羥基氯奎(Plaquenil.TM.)、巴弗洛黴素A1、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖苷(AICAR)、岡田酸、自體吞噬抑制性藻類毒素(其抑制2A型或1型蛋白質磷酸酶)、cAMP類似物及增加cAMP量之藥物、腺苷、N6-巰基嘌呤核糖苷、渥曼青黴素及長春鹼。另外，亦可使用調節自體吞噬必需之蛋白質之表現的反義RNA或siRNA，諸如ATG5。

在一個實施例中，嵌合ADI-PEG與一或多種治療劑之組合相加或協同地起作用。就此而言，本文描述協同劑，其包括能夠與如本文所提供之嵌合ADI-PEG協同起作用之治療劑(例如本文所述之化學治療劑、自體吞噬抑制劑、mTOR抑制劑或用於治療癌症、GVHD或發炎性腸病之任何其他治療劑)，其中該協同作用顯示之可偵測效果之量值比當化學治療劑存在但ADI-PEG組合物不存在及/或當ADI-PEG存在但化學治療劑不存在時可偵測之效果高(亦即，以相對於適當對照條件之統計學上顯著之方式)。量測協同作用之方法為此項技術中已知的(參見例如Cancer Res January 15,2010 70；440)。

如本文所述之包含嵌合ADI及視情況選用之其他治療劑的組合物可用於治療癌症之治療方法及預防癌症癌轉移之方法。因此，本發明提供治療多種不同癌症、改善癌症症狀或抑制癌症進展或預防癌症之 方法。在另一實施例中，本發明提供治療GVHD、改善其症狀或抑制其進展之方法。特定言之，本發明提供治療患者體內之癌症或GVHD、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與治療有效量之如本文所述之嵌合ADI組合物，藉此治療癌症或GVHD、改善其症狀或抑制其進展。因此，本文所述之嵌合ADI組合物可向罹患發炎性腸病(例如克隆氏症(Crohn's disease)；潰瘍性結腸炎)、GVHD或以下癌症之個體投與：包括(但不限於)白血病(例如急性骨髓性白血病及復發性急性骨髓性白血病)、黑素瘤、肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、***癌(諸如(但不限於)激素頑抗性***癌)、間皮瘤、淋巴白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(包括(但不限於)胃腺癌)、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括(但不限於)腎細胞癌)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌(包括(但不限於)頭頸部之鱗狀細胞癌；舌癌)、子宮頸癌、睾丸癌、膽囊癌、膽管癌及胃癌(stomach cancer)。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療骨髓性白血病(諸如(但不限於)急性骨髓性白血病(AML))、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，諸如AML之骨髓性白血病缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療AML之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20。在某些實施例中，投與用於治療AML之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750 IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在特定實施例中，投與用於治療AML之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其他實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療AML之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療AML之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含嵌合ADI-PEG 20之組合物治療AML之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤)、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，肉瘤缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療肉瘤之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20。在某些實施例中，投與用於治療肉瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400 IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m2、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在特定實施例中，投與用於治療肉瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其他實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療肉瘤之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療AML之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含嵌合ADI-PEG 20之組合物治療肉瘤(包括轉移性肉瘤)之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療胰臟癌、改善其症狀或抑制其進展之方法，該嵌合ADI-PEG 20視情況與自體吞噬抑制劑組合，諸如(但不限於)氯奎、3-甲基腺嘌呤、羥基氯奎、巴弗洛黴素A1、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖苷(AICAR)、岡田酸、N6-巰嘌呤核糖苷、渥曼青黴素及長春鹼。在某些實施例中，胰臟癌缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本 發明提供治療胰臟癌之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與ADI-PEG 20；該ADI-PEG 20視情況與治療有效量之自體吞噬抑制劑(諸如氯奎)組合。就此而言，氯奎之治療上有效劑量可為連續兩天中每天約600mg鹼之初始劑量後接另外300mg鹼及每天300mg鹼之單一劑量。此表示三天內2.5g氯奎磷酸鹽或1.5g鹼之總劑量。在其他實施例中，劑量可為約300mg鹼。氯奎或其他自體吞噬抑制劑之劑量可視需要由熟練臨床醫師使用此項技術中已知之給藥調節。如熟習此項技術者應理解，自體吞噬抑制劑可在包含ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療胰臟癌之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在特定實施例中，投與用於治療胰臟癌之ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其他實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療胰臟癌之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療胰臟癌之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌 合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含視情況與氯奎或其他適當自體吞噬抑制劑組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療胰臟癌之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與視情況與自體吞噬抑制劑組合的治療有效量之ADI-PEG 20治療小細胞肺癌、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，小細胞肺癌缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療小細胞肺癌之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20；該嵌合ADI-PEG 20視情況與治療有效量之自體吞噬抑制劑(諸如氯奎)組合。就此而言，氯奎之治療上有效劑量可為連續兩天中每天約600mg鹼之初始劑量後接另外300mg鹼及每天300mg鹼之單一劑量。此表示三天內2.5g氯奎磷酸鹽或1.5g鹼之總劑量。在其他實施例中，劑量可為約300mg鹼。氯奎劑量可視需要由熟練臨床醫師使用此項技術中已知之給藥調節。如熟習此項技術者應理解，自體吞噬抑制劑可在包含嵌合ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療小細胞肺癌之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、 7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在特定實施例中，投與用於治療小細胞肺癌之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其他實施例中為約1mg/m²至約80mg/m²，且在其他實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療小細胞肺癌之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療小細胞肺癌之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含視情況與氯奎組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療小細胞肺癌之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與視情況與自體吞噬抑制劑組合的治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤)、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，肉瘤缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療肉瘤之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20；該嵌合ADI-PEG 20視情況與治療有效量之自體吞噬抑制劑(諸如氯奎)組合。就此而言，氯奎之治療上有效劑量可為連續兩天中每天約600mg鹼之初始劑量後接另外300mg鹼及每天300mg鹼之單一劑量。此表示三天內2.5g氯奎磷酸鹽或1.5g鹼之總 劑量。在其他實施例中，劑量可為約300mg鹼。氯奎劑量可視需要由熟練臨床醫師使用此項技術中已知之給藥調節。如熟習此項技術者應理解，自體吞噬抑制劑可在包含ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療肉瘤之ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在某些實施例中，投與用於治療肉瘤之ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其他實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療肉瘤之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療肉瘤之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含視情況與氯奎組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療肉瘤之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與視情況與多烯紫杉醇組合的治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療黑素瘤、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，黑素瘤缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療黑素瘤之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20；該嵌合ADI-PEG 20視情況與治療有效量之多烯紫杉醇組合。就此而言，多烯紫杉醇之治療上有效劑量可包含約每3週歷時30分鐘與1小時之間靜脈內投與之75mg/m²或100mg/m²。如熟練臨床醫師應理解，多烯紫杉醇之劑量可視疾病適應症及/或預先治療而調節，且多烯紫杉醇可在包含嵌合ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療黑素瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。投與用於治療黑素瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其它實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療黑素瘤之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施 例中，治療黑素瘤之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由包含視情況與多烯紫杉醇組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療黑素瘤之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG調節)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與視情況與順鉑組合的治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療黑素瘤、改善其症狀或抑制其進展之方法。在某些實施例中，黑素瘤缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療黑素瘤之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20；該嵌合ADI-PEG 20視情況與治療有效量之順鉑組合。就此而言，順鉑之治療上有效劑量可包含每週期(每3-4週)一次投與50-100mg/m²，或每週期持續5天每天投與總共100mg/m²。如熟練臨床醫師應理解，順鉑之劑量可視疾病適應症、個體患者及/或預先治療而調節，且順鉑可在包含嵌合ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療黑素瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在某些實施例中，投與用於治療黑素瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²與約80mg/m²之間，且在其它實施例中為約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²。在某些實施例中，本發明提供治療黑素瘤之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療黑素瘤之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含視情況與順鉑組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療黑素瘤之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

在一個實施例中，本發明提供藉由投與治療有效量之嵌合ADI-PEG 20治療腎細胞癌、改善其症狀或抑制其進展之方法，該嵌合ADI-PEG 20視情況與mTOR抑制劑組合，諸如(但不限於)雷帕黴素、西羅莫司、依維莫司及地磷莫司(ridaforolimus)。在某些實施例中，腎細胞癌缺乏ASS、ASL或其兩者。在另一實施例中，本發明提供治療腎細胞癌之方法，其包含約每3天一次、約一週一次、約一週兩次或約每2週一次投與嵌合ADI-PEG 20；該嵌合ADI-PEG 20視情況與治療有效量之mTOR抑制劑(諸如雷帕黴素)組合。雷帕黴素或其他mTOR抑制劑之劑量可視需要由熟練臨床醫師使用此項技術中已知之給藥確定。如熟習此項技術者應理解，mTOR抑制劑可在包含嵌合ADI-PEG 20之組合物之前、與其同時或在其之後投與。在某些實施例中，投與用於治療腎細胞癌之嵌合ADI-PEG 20劑量在約50IU/m²與約8,000 IU/m²之間，且在其他實施例中為約50IU/m²、約100IU/m²、150IU/m²、200IU/m²、250IU/m²、300IU/m²、350IU/m²、400IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、650IU/m²、700IU/m²、750IU/m²、800IU/m²、約900IU/m²、約1,000IU/m²、1,500IU/m²、約2,000IU/m²、約2,500IU/m²、約3,000IU/m²、3,500IU/m²、4,000IU/m²、4,500IU/m²、5,000IU/m²、5,500IU/m²、6,000IU/m²、6,500IU/m²、7,000IU/m²、7,500IU/m²或約8,000IU/m²。在某些實施例中，投與用於治療黑素瘤之嵌合ADI-PEG 20劑量在約1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、6mg/m²、7mg/m²、8mg/m²、9mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²或約80mg/m²之間。在某些實施例中，本發明提供治療腎細胞癌之方法，其中嵌合ADI之劑量加倍且可提高至每週640IU/m²或640IU/m²以上。在一個特定實施例中，治療腎細胞癌之嵌合ADI用3.5-6.5個、或在一個實施例中4.5-5.5個PEG分子修飾每個嵌合ADI。在另一實施例中，本發明提供藉由投與包含視情況與雷帕黴素或其他適當mTOR抑制劑組合的嵌合ADI-PEG 20之組合物治療腎細胞癌之方法，其中該組合物包含用5±1.5個PEG分子、且在一個實施例中5±1.5個直鏈PEG分子修飾之嵌合ADI，且在某些實施例中該組合物包含少於約0.5%天然嵌合ADI(亦即，未用PEG修飾)及/或少於約5%游離PEG。在另一實施例中，組合物包含組胺酸-HCL緩衝劑。

本發明亦提供治療患者體內之發炎性病症、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與單獨或與一或多種其他治療劑組合的如本文所述之包含嵌合ADI(例如嵌合ADI-PEG，特定言之嵌合ADI-PEG 20)之組合物。在一個實施例中，本發明亦提供治療患者體 內之發炎性腸病、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與單獨或與一或多種其他治療劑組合的如本文所述之包含嵌合ADI(例如嵌合ADI-PEG，特定言之嵌合ADI-PEG 20)之組合物。就此而言，本發明提供治療患者體內之克隆氏症或潰瘍性結腸炎、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與單獨或與一或多種其他治療劑組合的如本文所述之包含嵌合ADI(例如嵌合ADI-PEG，特定言之嵌合ADI-PEG 20)之組合物。

在另一實施例中，本發明提供治療患者體內之癌症、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與如本文所述之包含嵌合ADI及視情況選用之一或多種其他治療劑的組合物，其中該癌症缺乏ASS、ASL或其兩者。就此而言，ASS或ASL缺乏可為如由mRNA表現或蛋白質表現所量測之表現減少，或可為蛋白質活性之降低，且一般包含如由熟習此項技術者所測定之統計學上顯著之表現減少或活性降低。與已知無癌症之適當對照樣品中之表現或活性相比，ASS或ASL表現減少或活性降低可為約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或70%以上之表現減少或活性降低。在某些實施例中，ASS或ASL表現或活性與非癌症對照樣品中之表現或活性相比下降至少二分之一。

在某些實施例中，ASS或ASL之表現減少或活性降低由ASS或ASL促進劑之甲基化產生。在另一實施例中，ASS或ASL之表現減少或活性降低由DNA突變(例如一或多個點突變、小缺失、***及其類似者)或導致基因缺失之染色體異常產生。在一個實施例中，癌症為ASS或ASL陰性的，意謂未觀測到表現或活性。

ASS或ASL之表現減少或活性降低可使用此項技術中已知之任何方法來量測，諸如(但不限於)定量PCR、免疫組織化學、酶活性分析(例如，分析以量測瓜胺酸轉化成精胺基丁二酸鹽或精胺基丁二酸鹽 轉化成精胺酸及反丁烯二酸鹽之轉化率)及其類似方法。

因此，本發明提供治療患者體內之癌症、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與如本文所述之包含嵌合ADI之組合物，其中該癌症展現ASS或ASL或其兩者之表現減少或活性降低，其中該癌症包括(但不限於)白血病(例如急性骨髓性白血病及復發性急性骨髓性白血病)、黑素瘤、肉瘤(包括(但不限於)轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、***癌(諸如(但不限於)激素頑抗性***癌)、間皮瘤、淋巴白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(包括(但不限於)胃腺癌)、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括(但不限於)腎細胞癌)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌(包括(但不限於)頭頸部之鱗狀細胞癌；舌癌)、子宮頸癌、睾丸癌、膽囊癌、膽管癌及胃癌(stomach cancer)。

文獻中之多個研究已顯示以下腫瘤中缺乏ASS：

因此，本文特定涵蓋用單獨或與其他治療組合之嵌合ADI-PEG治療此等ASS缺乏型癌症。

本發明進一步提供治療患者體內之癌症、改善其症狀或抑制其進展之方法，其包含向患者投與包含如本文所述與自體吞噬抑制劑組合的嵌合ADI(例如嵌合ADI-PEG，且特定言之嵌合ADI-PEG 20)之組合物。在一個實施例中，本發明提供治療患者體內之癌症之方法，其包含向患者投與治療有效量之包含如本文所述與自體吞噬抑制劑組合的嵌合ADI之組合物，其中該癌症為胰臟癌或小細胞肺癌。

在某些實施例中，本發明提供治療之方法，其中投與包含本文所述之嵌合ADI的組合物使血漿中之精胺酸耗竭至少一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或6個月以上。

實例 實例1 嵌合ADI酶為活性的且與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性較小

此實例描述由以下組成之人工工程化之嵌合ADI酶之產生：(1)具有精胺酸脫亞胺酶酶活性之蛋白質，(2)降低之與抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性，(3)降低之離胺酸殘基數目及/或(4)與化學穩定連接子結合之PEG。

ADI製備。選殖、表現及純化重組重組嵌合ADI用於根據例如以下各者中所描述之標準方案來進行測試：Gallego等人，PLOS One, 7(10)：e47886,2012；Monstadt及Holldorf,Biochem.J.273：739-745,1990；Joo Noh等人，Molecules and Cells.13：137-143,2002；及Sugimura等人，Infection and Immunity.58：2510-2515,1990。參見表A1之嵌合ADI酶之胺基酸序列。

人類抗ADI-PEG20抗體純化。自臨床研究期間已接受ADI-PEG20之患者之血漿樣品中純化抗ADI-PEG20抗體。彙集來自如藉由ELISA分析所測定之針對ADI-PEG20已達至高效價(效價>/=4)之8個不同患者的總共60ml血漿。使用兩步純化，蛋白質「A」層析(GE Healthcare)，後接ADI親和力層析。獲得約20mg經純化之抗體，且在-80℃下以等分試樣儲存直至需要。

ADI酶分析。精胺酸脫亞胺酶(ADI)催化L-精胺酸轉化為L-瓜胺酸及氨。可藉由比色端點分析(參見例如Knipp及Vasak,Analytical Biochem.286：257-264,2000)偵測L-瓜胺酸之量，且將其與已知L-瓜胺酸之量的標準曲線相比來計算ADI之比活性(表示為IU/mg蛋白質)。1IU酶活性定義為在所測試pH值及溫度下每分鐘產生1μmol瓜胺酸之酶量。在37℃下於生理HEPES緩衝劑(PHB)(50mM HEPES、160mM NaCl，pH 7.4)(Lang及Zander,Clin Chem Lab Med.37：563-571,1999)加0.1% BSA中執行標準分析條件。在條件允許之情況下一式兩份或一式三份地操作所有樣品及標準。

藉由使用上述活性分析之變化形式測定Km及Kcat值。如同活性分析，在37℃下於PHB加0.1% BSA中操作所有反應。為考慮其活性差異，對ADI或ADIr結構中之每一者調節酶濃度、反應時間及受質濃度範圍。一般而言，將2nM酶、5分鐘反應時間及0-160μM精胺酸用作起始條件。最佳化該等條件時，尤其關注所消耗受質之量相對於向反應添加之總受質之百分比。偵測下限為1μM瓜胺酸，而定量下限為2μM。在每一個培養板上操作瓜胺酸標準曲線，且將其用於定量 由酶促反應產生之瓜胺酸。

計算。計算各反應孔中產生之瓜胺酸濃度(μM)，且使用瓜胺酸標準曲線平均化。接著以μM/min/50nM ADI為單位計算各反應之速度。藉由使此值乘以「IU」因子(IU因子由ADI之分子量及反應體積計算)來計算比活性(IU/mg或μmol產物/min/mg ADI)。

精胺酸脫亞胺酶酶活性。ADI酶分析結果展示於表E1中。

表E1中之結果顯示本文所述之工程化之嵌合ADI酶具有有效之催化活性。用於此等酶之催化參數Km及kcat足以移除精胺酸且保持血液中之低精胺酸濃度。此等參數較佳分別為小於20μM及大於1sec^-1。pH最佳值為約7.4以便保持血液中之有效催化活性。應於37℃下在長期儲存及患者治療期間保持酶穩定性以及共價連接之PEG之穩定性。

與抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性降低。ADI由兩個區組成，即催化區及α-螺旋區。本發明係部分地關於具有ADI活性之工程化之人造嵌合重組酶。每一者由兩個區組成，其中各區係選自多個可能物種。藉由檢查來自人型黴漿菌及精胺酸黴漿菌之ADI X射線晶體結構來確定區邊界，且藉由同源性將此擴展至其他黴漿菌ADI酶。

使用來自不同物種之ADI酶之區可保持催化活性同時改變多個表面殘基。一些此等表面殘基針對在用ADI-PEG 20治療患者期間發展之抗ADI-PEG 20抗體形成抗原決定基。其替代可降低對抗ADI-PEG 20抗體之抗原性，從而減少經修飾藥物之抗ADI-PEG 20抗體之中和及清除。此展示於表E2中，其中抗ADI-PEG 20抗體之兩種製劑顯示相比於人型黴漿菌ADI，其與DS1、DS2、DS3及DS4抗原之結合較少。此可歸因於改變抗原決定基且破壞抗體-抗原結合相互作用的此等抗原表面上之殘基變化。

表面離胺酸殘基含量減少。進一步藉由用除離胺酸以外之胺基酸殘基替代表面離胺酸殘基及監測ADI活性來修飾精胺酸黴漿菌(催化區)-關節炎黴漿菌(α-螺旋區)嵌合體。製造四個突變體(表E3)且測定其ADI活性。

表E4展示DS1(精胺酸黴漿菌-關節炎黴漿菌)酶及4個離胺酸替代突變體之ADI活性。減少離胺酸以減少潛在聚乙二醇化位點之數量。

在約30個潛在聚乙二醇化位點中，PEG佔有率在每個位點一般較小。減少潛在聚乙二醇化位點之數量將產生較高PEG佔有率且在每個剩餘位點產生較完全屏蔽。預期此增加蛋白水解保護且降低對來自先前治療之親和力成熟之抗ADI-PEG 20抗體的免疫交叉反應性。其亦將產生較均勻藥物。

概言之，本發明實例描述具有極佳ADI活性之工程化之ADI酶，其中移除抗ADI-PEG 20抗體抗原決定基以減少抗體中和及清除，且其受保護而不蛋白水解且藉由聚乙二醇化經腎臟清除。

可組合上述各種實施例以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或申請資料表中所列之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案均以全文引用之方式併入本文中。必要時可修改該等實施例之態樣以採用各個專利、申請案及公開案之概念來提供其他實施例。

可鑒於以上詳細描述對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能實施例以及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範圍。因此，申請專利範圍不受揭示內容限制。

<110> TDW Group

<120> 工程化之嵌合聚乙二醇化ADI及使用方法

<130> TDWG-002/01TW

<150> US 61/954,929

<151> 2014-03-18

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 409

<212> PRT

<213> 人型黴漿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 精胺酸黴漿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 410

<212> PRT

<213> 關節炎黴漿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 4

<210> 5

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS2重組嵌合ADI蛋白質

<400> 5

<210> 6

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 6

<210> 7

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 7

<210> 8

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來源於人型黴漿菌(催化區)及精胺酸黴漿菌(α-螺旋區)之重組嵌合ADI

<400> 8

<210> 9

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來源於人型黴漿菌(催化區)及關節炎黴漿菌(α-螺旋區)之重組嵌合ADI

<400> 9

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組嵌合ADI蛋白質之DS1-1離胺酸刪減突變體

<400> 10

<210> 11

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組嵌合ADI蛋白質之DS1-2離胺酸刪減突變體

<400> 11

<210> 12

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組嵌合ADI蛋白質之DS1-3離胺酸刪減突變體

<400> 12

<210> 13

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組嵌合ADI蛋白質之DS1-4離胺酸刪減突變體

<400> 13

<210> 14

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突變之人型黴漿菌ADI序列

<400> 14

<210> 15

<211> 402

<212> PRT

<213> 短吻鱷黴漿菌

<400> 15

<210> 16

<211> 401

<212> PRT

<213> 鴿黴漿菌

<400> 16

<210> 17

<211> 401

<212> PRT

<213> 雞黴漿菌

<400> 17

<210> 18

<211> 410

<212> PRT

<213> 貓黴漿菌

<400> 18

<210> 19

<211> 401

<212> PRT

<213> 惰性黴漿菌

<400> 19

<210> 20

<211> 410

<212> PRT

<213> 海豹腦黴漿菌

<400> 20

<210> 21

<211> 410

<212> PRT

<213> 海豹黴漿菌

<400> 21

<210> 22

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 22

<210> 23

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 23

<210> 24

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 24

<210> 25

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS5重組嵌合ADI蛋白質

<400> 25

<210> 26

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS6重組嵌合ADI蛋白質

<400> 26

<210> 27

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2DS7重組嵌合ADI蛋白質

<400> 27

<210> 28

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 28

<210> 29

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS2重組嵌合ADI蛋白質

<400> 29

<210> 30

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 30

<210> 31

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS5重組嵌合ADI蛋白質

<400> 31

<210> 32

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS6重組嵌合ADI蛋白質

<400> 32

<210> 33

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS7重組嵌合ADI蛋白質

<400> 33

<210> 34

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS8重組嵌合ADI蛋白質

<400> 34

<210> 35

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4DS9重組嵌合ADI蛋白質

<400> 35

<210> 36

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 36

<210> 37

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS2重組嵌合ADI蛋白質

<400> 37

<210> 38

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 38

<210> 39

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 39

<210> 40

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS6重組嵌合ADI蛋白質

<400> 40

<210> 41

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5DS7重組嵌合ADI蛋白質

<400> 41

<210> 42

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 42

<210> 43

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS2重組嵌合ADI蛋白質

<400> 43

<210> 44

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 44

<210> 45

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 45

<210> 46

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS5重組嵌合ADI蛋白質

<400> 46

<210> 47

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6DS7重組嵌合ADI蛋白質

<400> 47

<210> 48

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS1重組嵌合ADI蛋白質

<400> 48

<210> 49

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS2重組嵌合ADI蛋白質

<400> 49

<210> 50

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 50

<210> 51

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 51

<210> 52

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS5重組嵌合ADI蛋白質

<400> 52

<210> 53

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C7DS6重組嵌合ADI蛋白質

<400> 53

<210> 54

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C8DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 54

<210> 55

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C8DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 55

<210> 56

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C8DS9重組嵌合ADI蛋白質

<400> 56

<210> 57

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C9DS3重組嵌合ADI蛋白質

<400> 57

<210> 58

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C9DS4重組嵌合ADI蛋白質

<400> 58

<210> 59

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C9DS8重組嵌合ADI蛋白質

<400> 59

Claims (25)

1. 一種重組嵌合精胺酸脫亞胺酶(ADI)，其包含來源於第一微生物之ADI蛋白質催化區及來源於第二微生物之ADI蛋白質α-螺旋區，其中：該第一微生物為雞黴漿菌(Mycoplasma gallinarum)且該第二微生物為鴿黴漿菌(Mycoplasma columbinum)；該第一微生物為雞黴漿菌且該第二微生物為惰性黴漿菌(Mycoplasma iners)；該第一微生物為鴿黴漿菌且該第二微生物為惰性黴漿菌；該第一微生物為惰性黴漿菌且該第二微生物為鴿黴漿菌；該第一微生物為鴿黴漿菌且該第二微生物為雞黴漿菌；或該第一微生物為惰性黴漿菌且該第二微生物為雞黴漿菌，其中該重組嵌合ADI具有精胺酸脫亞胺酶活性。
2. 如請求項1之重組嵌合ADI，其中該重組嵌合ADI包含有或沒有六組胺酸標記之如SEQ ID NO：55、56、35、58、34或59中之任一者中所列舉之胺基酸序列或變異體，該變異體與有或沒有六組胺酸標記之SEQ ID NO：55、56、35、58、34或59中之任一者之胺基酸序列具有至少98%之一致性，其中該重組嵌合ADI或其變異體具有精胺酸脫亞胺酶活性。
3. 如請求項1或2之重組嵌合ADI，其中至少一個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
4. 如請求項3之重組嵌合ADI，其中至少5個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
5. 如請求項3之重組嵌合ADI，其中至少10個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
6. 如請求項3之重組嵌合ADI，其中至少15個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
7. 如請求項3之重組嵌合ADI，其中至少20個離胺酸殘基已由胺基酸取代修飾。
8. 如請求項1或2之重組嵌合ADI，其經由生物相容性連接子共價結合至一或多個聚乙二醇分子。
9. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該精胺酸脫亞胺酶共價結合至多於一個聚乙二醇分子。
10. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該精胺酸脫亞胺酶共價結合至約1至約10個聚乙二醇分子，或該精胺酸脫亞胺酶共價結合至5±3個PEG分子。
11. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該等PEG分子為直鏈或分支鏈PEG分子。
12. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該聚乙二醇之總重量平均分子量為約1,000至約40,000。
13. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該聚乙二醇之總重量平均分子量為約10,000至約30,000。
14. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該生物相容性連接子包含丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基或其組合。
15. 如請求項8之重組嵌合ADI，其中該丁二醯基之來源為丁二醯亞胺丁二酸酯。
16. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1或2之重組嵌合ADI。
17. 一種載體，其包含如請求項16之聚核苷酸。
18. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項17之載體。
19. 一種組合物，其包含如請求項1至15中任一項之重組嵌合ADI及生理學上可接受之載劑。
20. 如請求項19之組合物，其進一步包含自體吞噬調節劑。
21. 如請求項20之組合物，其中該自體吞噬調節劑係選自由以下組成之群：氯奎(chloroquine)、3-甲基腺嘌呤、羥基氯奎、巴弗洛黴素A1(bafilomycin A1)、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖苷(AICAR)、岡田酸(okadaic acid)、N6-巰嘌呤核糖苷、長春鹼、渥曼青黴素、雷帕黴素、依維莫司(everolimus)、二甲雙胍、哌立福新(perifosine)、白藜蘆醇(resveratrol)及他莫昔芬(tamoxifen)。
22. 如請求項19之組合物，其進一步包含化學治療劑。
23. 如請求項22之組合物，其中該化學治療劑係選自由以下組成之群：多烯紫杉醇、卡鉑、環磷醯胺、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)及依維莫司(everolimus)。
24. 一種如請求項19之組合物之用途，其用於製造治療癌症、改善癌症症狀或抑制癌症進展之藥物。
25. 如請求項24之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑素瘤、胰臟癌、***癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓性白血病、復發性急性骨髓性白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睾丸癌及胃癌(stomach cancer)。