CN105181970B - 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,属于医学检验测定技术领域。一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂1和试剂2,所述试剂1的组分为:HCY还原剂:1‑200mmol/L,丝氨酸:1.0‑100mmol/L,NADH:0.5‑0.8g/L,LDH:50‑200KU/L;所述试剂2的组分为:稳定剂:0.1‑10g/L,胱硫醚β‑合成酶:1‑100KU/L,胱硫醚β‑分解酶:1‑100KU/L。本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒测定方便,双试剂无需配制,为液态试剂,可以直接使用,且检测速度快,灵敏度高,准确度高,稳定性好,线性范围广,储存时间长,可以达到在4℃下至少保存1年以上,另外原料成本较低,完全满足临床检验的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,属于医学检验测定技术领域。
背景技术
同型半胱氨酸是含硫氨基酸,在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。近期的研究表明,同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞,改变凝血因子功能,增加血栓形成倾向,促进动脉粥样硬化及血栓形成,使心血管疾病发病率及死亡率增加,因此测定血中同型半胱氨酸的浓度在临床上意义十分重要。
测定血浆中同型半胱氨酸的方法有很多种,包括高效液相色谱法(HPLC)、循环酶法、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、酶联免疫分析法(EIA)、氨基酸分析仪测定法、离子色谱法、毛细管气相色谱-质谱、电化学法等。
其中,高效液相色谱法(HPLC):先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式,然后与荧光剂进行衍生生成同型半胧氨酸一荧光物质复合物,将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同,因此流动相将其洗脱下来的次序也不同,根据这一原理将样品中的不同物质分开,以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸一荧光物质复合物的荧光强度,将其与标准品/内标的比值进行比较和计算,就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。该方法是经典的参考方法,但是操作复杂,耗时比较久,且成本较大,逐渐被其他方法取代。
循环酶法:目前主要用同型半胱氨酸转甲基酶及腺苷同型半胱氨酸酶的循环扩增作用,再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化 酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶等,或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量。该方法的优点在于可以直接上生化仪使用,快速,准确方便。但是由于使用的工具酶较多,连续催化反应步骤复杂,试剂质量和反应线性都需不断校正,对使用维护要求。由于各个蛋白酶的稳定性和活性要求不同,故测定试剂制造中较难找到理想的稳定条件,因此稳定性受到一定的限制。且测定主要影响因素为血氨,此外原料酶价格昂贵,市面上不容易获取,导致成本巨大。
荧光偏振免疫分析法(FPIA):测定原理是先用二硫苏糖醇将标本中结合态的Hcy还原成游离形式后,同时加入腺苷,在s-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的作用下将Hcy转化为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH),然后加入抗SAH单克隆抗体和荧光标记的SAH抗原,SAH与荧光标记抗原竞争结合抗SAH抗体,形成大分子的免疫复合物,最后测定其荧光偏振度。此方法要求血标本及时送至实验室,避免血细胞内Hcy的释放对测定结果的干扰。FPIA法测定Hcy具有较好的精密度,血清与血浆结果之间具有良好的相关性,但FPIA法较适合实验室常规应用,不适合工业化生产。
同样的,离子色谱法与毛细电泳法也主要用于实验研究,极少在临床上使用,且毛细电泳法与高效液相色谱方法相似,还存在操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大等缺点。
酶联免疫分析法(EIA):该方法是临床上测定同型半胱氨酸常用方法,优点在于操作比较简单快捷,并且重复性好,稳定性好,但是该方法大部分需要手工操作,耗时较长,且试剂昂贵。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题,提出了一种灵敏度高、热稳定性好、储存时间长的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂1和试剂2,
所述试剂1的组分为:HCY还原剂:1-200mmol/L,丝氨酸:1.0-100mmol/L,NADH:0.5-0.8g/L,LDH:50-200KU/L;
所述试剂2的组分为:稳定剂:0.1-10g/L,胱硫醚β-合成酶:1-100KU/L,胱硫醚β-分解酶:1-100KU/L。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂1中所述的HCY还原剂为TCEP、巯基乙酸、EDTA的混合物。当同型半胱氨酸在细胞内积聚,并进入血液循环后,大部分以氧化型存在,并与蛋白结合,还原型同型半胱氨酸在血中仅占1%。测定血中总同型半胱氨酸的含量,一般需采用还原剂将氧化型同型半胱氨酸还原为还原型同型半胱氨酸。HCY还原剂的试剂很多,但是因为都有还原性,所以极易被氧化,都不稳定,另外现有技术中有些试剂为干粉或者为3试剂,在使用中极其不便。本发明还原剂中的TCPE相对于其他它还原剂相对稳定,并且使用的PH范围最广。
作为优选,所述的TCEP、巯基乙酸、EDTA按质量比5-7:1.5-2.5:1混合。将HCY还原剂的浓度限定在1-200mmol/L的原因在于还原剂浓度过小不能将血清中的HCY完全还原,导致结果偏低。如果HCY浓度大了,会影响后续反应,从而影响整个结果。HCY还原剂的浓度是TCEP的浓度,巯基乙酸、EDTA按TCEP的用量调整。TCPE与巯基乙酸和EDTA按上述比例混合使用,更加稳定,从而使试剂更加稳定。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂2中所述的稳定剂为可溶性淀粉和谷胱甘肽的混合物。现有技术中同型半胱氨酸检测试剂盒一般采用甘油、乙二醇、BSA等常规的试剂做稳定性,导致稳定效果一般,本发明中采用的可溶性淀粉与谷胱甘肽都是含有较多巯基的酶,单独做稳定性存在的时候,热稳定性较差,但是通过不断试验发现,将可溶性淀粉和谷胱甘肽共同作为稳定剂使用 时,可以大幅度提高同型半胱氨酸检测试剂的稳定效果,可以达到在4℃下至少保存1年以上。
作为优选,所述可溶性淀粉和谷胱甘肽按质量比10:0.8-2混合。稳定剂的浓度是可溶性淀粉的浓度,谷胱甘肽按可溶性淀粉的用量调整。若稳定剂的浓度过高,则成本较大,但若稳定剂的浓度过低,则达不到应有的效果。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂1和试剂2均还包括缓冲液10-200mmol/L,其中缓冲液为TRIS、Good's缓冲液、MOPS、HEPES、三乙醇胺、磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液中的一种或多种。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂1和试剂2均还包括保护剂,保护剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0.1-20%,其中保护剂为BSA、蔗糖、海藻糖、甘油、乙二醇、山梨醇、PEG6000中的一种或多种。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂1和试剂2均还包括表面活性剂,表面活性剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0.01-1%,其中表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。
在上述稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒中,试剂1和试剂2均还包括防腐剂0.1-5g/L,其中,防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。
本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒原理为:氧化型HCY被转化成游离HCY,游离HCY在CBS催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚;L-胱硫醚在CBL催化下又生成HCY、丙酮酸和NH3;该循环反应生成的丙酮酸可以用乳酸脱氢酶LDH和NADH检测到,NADH转变成NAD+的速率与样品中HCY含量成正比。
反应原理的反应式如下:
在340nm处测定NADH降低速率可以测得同型半胱氨酸的含量。
本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒可以使液体试剂盒。
与现有技术相比,本发明具有以下几个优点:
本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒测定方便,双试剂无需配制,为液态试剂,可以直接使用,且检测速度快,灵敏度高,准确度高,稳定性好,线性范围广,储存时间长,可以达到在4℃下至少保存1年以上,另外原料成本较低,完全满足临床检验的需要。
附图说明
图1为本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒与对比例1进口试剂盒的血清中同型半胱氨酸含量的相关性曲线。
图2为本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒与对比例2、6、7试剂盒的热稳定性曲线。
图3为本发明稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒与对比例3、4、5试剂盒的还原剂热稳定性曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明,对本发明的技术方案作进一步的描述,但本发明并不限于这些实施例。
本发明试剂盒测定血清中同型半胱氨酸含量的测试条件为:方法:速率法;主/副波长:340nm/405nm;样本/试剂1/试剂2: 16.5/250/25;温度:37℃;血清+试剂1时间:1-5min;加入试剂2后的反应时间:3-5min;校正类型:线性;校准方法:两点定标;反应方向:向下。
测定步骤:
标本 16.5μl
试剂1 250μl
混匀,置于37℃孵育1-5min
试剂2 25μl
混匀,37℃孵育1.5min后,连续检测1-3min,计算ΔA/min。
计算结果
样品要求:
1、样本为空腹血清或血浆。
2、标本应在低温条件下运输保存,采集后需冷藏并迅速离心,标本密封2-8℃下可保存48h。如果检测延后需冷藏血清。
实施例1
本实施例稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2,
试剂1的组分为:TRIS:100mmol/L,TCEP:50mmol/L,巯基乙酸:10mmol/L,EDTA:10mmol/L,丝氨酸:100mmol/L,NADH:0.5g/L,BSA:5g/L,叠氮化钠:1g/L,曲拉通100:0.1%,LDH:50KU/L;
试剂2的组分为:TRIS:100mmol/L,BSA:5g/L,可溶性淀粉:1g/L,谷胱甘肽:1g/L,叠氮化钠:1g/L,曲拉通100:0.1%,胱硫醚β-合成酶:100KU/L,胱硫醚β-分解酶:100KU/L。
实施例2
本实施例稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2,试剂1的组分为:TRIS:100mmol/L,TCEP:80mmol/L,巯基乙 酸:20mmol/L,EDTA:10mmol/L,丝氨酸:80mmol/L,NADH:0.5g/L,蔗糖:10g/L,硫酸庆大霉素:1g/L,曲拉通100:0.1%,LDH:80KU/L;
试剂2的组分为:TRIS:100mmol/L,蔗糖:10g/L,可溶性淀粉:2g/L,谷胱甘肽:1g/L,硫酸庆大霉素:1g/L,吐温-80:0.1%,胱硫醚β-合成酶:80KU/L,胱硫醚β-分解酶:80KU/L。
实施例3
本实施例稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2,试剂1的组分为:磷酸缓冲液:100mmol/L,TCEP:80mmol/L,巯基乙酸:50mmol/L,EDTA:10mmol/L,丝氨酸:100mmol/L,NADH:0.5g/L,BSA:5g/L,叠氮化钠:1g/L,曲拉通100:0.1%,LDH:100KU/L;
试剂2的组分为:磷酸缓冲液:100mmol/L,BSA:5g/L,可溶性淀粉:2g/L,谷胱甘肽:1g/L,叠氮化钠:1g/L,曲拉通100:0.1%,胱硫醚β-合成酶:50KU/L,胱硫醚β-分解酶:100KU/L。
对比例1
市售的进口同型半胱氨酸检测试剂盒。
对比例2
市售的普通国产同型半胱氨酸检测试剂盒。
对比例3
与实施例1中同型半胱氨酸检测试剂盒的区别仅在于试剂1中的还原剂只有一种TCEP:50mmol/L,其他与实施例1相同,此处不再累述。
对比例4
与实施例1中同型半胱氨酸检测试剂盒的区别仅在于试剂1中的还原剂只有TCEP:50mmol/L和EDTA:10mmol/L,其他与实施例1相同,此处不再累述。
对比例5
与实施例1中同型半胱氨酸检测试剂盒的区别仅在于试剂1中的还原剂只有TCEP:50mmol/L和巯基乙酸:10mmol/L,其他与实施例1相同,此处不再累述。
对比例6
与实施例1中同型半胱氨酸检测试剂盒的区别仅在于试剂2中的稳定剂只有可溶性淀粉:1g/L,其他与实施例1相同,此处不再累述。
对比例7
与实施例1中同型半胱氨酸检测试剂盒的区别仅在于试剂2中的稳定剂只有谷胱甘肽:1g/L,其他与实施例1相同,此处不再累述。
1、将本发明实施例中(此处以实施例1为例,也可以为本发明的其他实施例)和对比例1作比较,测试30份血清样本中同型半胱氨酸含量,检测结果如表1所示;然后以对比例1进口试剂盒测试结果为纵坐标,以实施例1测试结果为横坐标,做回归分析,两者相关性如图1所示。
表1:实施例1和对比例1的相关性
从表1和图1可知:实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为9.5%,回归方程为Y=0.9954X-0.1642,R2=0.9985,相关系数R为0.9993,表明本发明实施例1试剂盒同对比例1市售进口同型半胱氨酸检测试剂盒的相关性强,说明本发明的试剂盒可以替代市场上常见的试剂盒。
2、将本发明实施例中(此处以实施例1为例,也可以为本发明的其他实施例)和对比例2、6、7中的试剂一起放入37℃水浴箱中,观察每天的灵敏度变化,每天的灵敏度变化如表2所示,热稳定性曲线如图2所示。
表2:实施例1和对比例2、6、7中试剂的灵敏度变化
从表2和图2可知,本发明同时加入可溶性淀粉和谷胱甘肽复配的稳定剂可以显著提高同型半胱氨酸检测试剂盒的稳定性。
3、将本发明实施例中(此处以实施例1为例,也可以为本发明的其他实施例)和对比例3、4、5中的试剂一起放入37℃水浴箱中,监测试剂中TCEP的含量,TCEP含量的变化如表3所示,反应试剂中还原剂的稳定性如图3所示。
表3:实施例1和对比例3、4、5中试剂的TCEP的含量的变化
从表3和图3可知,本发明加入TCEP、巯基乙酸、EDTA混合而成的HCY还原剂可以显著提高同型半胱氨酸检测试剂盒的稳定性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例, 但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (7)
1.一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2,
所述试剂1的组分包括:HCY还原剂:1-200mmol/L,丝氨酸:1.0-100mmol/L,NADH:0.5-0.8g/L,LDH:50-200KU/L;
所述试剂2的组分包括:稳定剂:0.1-10g/L,胱硫醚β-合成酶:1-100KU/L,胱硫醚β-分解酶:1-100KU/L,稳定剂为可溶性淀粉和谷胱甘肽的混合物,所述可溶性淀粉和谷胱甘肽按质量比10:0.8-2混合。
2.根据权利要求1所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,试剂1中所述的HCY还原剂为TCEP、巯基乙酸、EDTA的混合物。
3.根据权利要求2所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,TCEP、巯基乙酸、EDTA按质量比5-7:1.5-2.5:1混合。
4.根据权利要求1所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2均还包括缓冲液10-200mmol/L,其中缓冲液为TRIS、Good's缓冲液、MOPS、HEPES、三乙醇胺、磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2均还包括保护剂,保护剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0.1-20%,其中保护剂为BSA、蔗糖、海藻糖、甘油、乙二醇、山梨醇、PEG6000中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2均还包括表面活性剂,表面活性剂占试剂1或试剂2的质量百分比的0.01-1%,其中表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2均还包括防腐剂0.1-5g/L,其中,防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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