CN105181958B - 一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法 - Google Patents

一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法 Download PDF

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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Abstract

本发明提供了一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，采用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法，利用抗原抗体的特异性结合定量地检测了80nmAu粒子。与现有技术相比，本发明通过修饰剂的作用，将半抗原成功地合成为全抗原，为抗体得以产生作出了重大贡献。利用机体的免疫应答效应，成功的制备出特异性高的抗80nmAuNPs多克隆抗体，抗体的保质期较长，因此，可行性高；利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法对80nmAuNPs进行了一种定量检测，该方法的发明为今后纳米材料的定量检测提供了一种可行性较高的方法。该方法操作简单，可行性高，灵敏度高，检出限低，可实现高通量检测。

Description

一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法
技术领域
本发明涉及纳米材料的定量检测，特别涉及一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法。
背景技术
社会的发展必然伴随着科技的进步，随着20世纪末纳米技术的问世，纳米材料是一门新兴的并正在迅速发展的材料科学。纳米材料是指颗粒尺寸在纳米量级(1nm～100nm)的超细材料，具有小尺寸效应、大的比表面积、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应。正是由于这些特殊的性质，纳米材料在生活生产中得到了越来越广泛的应用，例如，纳米材料在生物传感器、生物探针、药物载体、医学成像、防晒霜等中有着非常重要的应用。然而科技都是有两面性的，纳米材料在给人们的生活生产带来方便的同时，其安全性问题也成为了全球人们最关注也是最担心的问题。
正面纳米生物效应将给疾病早期诊断和高效治疗带来新的机遇和新的方法；负面纳米生物效应称为纳米毒理学它研究纳米物质对人体健康生存环境和社会安全等的潜在负面影响。2003年，Nature、Science在一年内，先后4次发表编者文章，之后美国化学会以及欧洲许多学术杂志也纷纷发表文章，与各个领域的科学家们探讨纳米生物效应。
有调查研究显示，纳米金对微生物，癌症细胞等具有一定的毒理作用，日常生活中通常接触纳米粒子的途径分为：呼吸***，皮肤和胃肠道。由于纳米粒子较大的比表面积，同种材料不同尺寸的纳米材料的毒理也不尽相同，因此，对纳米材料的定量检测显得尤为重要。据已报道的文献，对纳米粒子的定性分析可以通过x射线光电子能谱，x射线衍射，扫描电子显微镜，投射电子显微镜，原子力显微镜等等。
但对于纳米粒子的定量检测目前仍是个国际难题，已有的对纳米粒子的定量检测方法研究主要有:紫外分光光度法测纳米浆料、纳米镀液中纳米微粒的含量；利用电感耦合等离子质谱法以及薄层色谱与电感耦合等离子质谱法联用对纳米金进行定量检测。两类方法均有一定的局限性，第一类方法仅局限于对金属纳米粒子的测量，对于非金属纳米粒子的定量检测具有很大的局限性，且对金属纳米粒子进行测量时首先要将其配制成溶液，要找到特定能溶解待测纳米材料的溶质，其次还要对该溶质进行紫外分光光度法建立其波长与吸光度的关系，最后再通过对比法确定待测纳米材料的测定波长，方法较为复杂，操作也相对繁琐；第二类方法样品的预处理较为繁琐，操作复杂，费时，所用实验仪器也相对昂贵。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，利用了二抗放大了检测信号，提高了实验分析的灵敏度，即通过测量抗原——一抗——二抗复合物的光学性号达到定量检测的目的，方法快速、简单，可进行高通量测定。
本发明提供的一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，包括以下步骤：
a、80nmAuNPs的制备；
b、80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备；
c、80nmAuNPs抗体制备：
将得到的80nmAuNPs免疫原注射到动物体内，得到80nmAuNPs抗体；
d、利用纯化好的高特异性的80nmAu抗体和80nmAu包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析法，通过建立标准曲线达到定量检测未知浓度的80nmAu的目的。
步骤a中80nmAuNPs的制备方法为：将HAuCl4溶液与蒸馏水混合后，加热沸腾，再加入柠檬酸三钠，继续反应，冷却至室温，得到80nmAuNPs。
进一步的，步骤a制备80nmAuNPs的制备方法具体为：取500μL HAuCl4溶液与99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，过程需要15min～30min，向沸腾的溶液中快速加入柠檬酸三钠，反应液迅速变黑，然后变成了泥土色红，继续反应35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs。
进一步的，步骤a加入0.7mL1wt％柠檬酸三钠溶液；
步骤a中HAuCl4溶液的制备方法为：取1g HAuCl4·4H2O粉末溶解于50mL超纯水中，制得16.5mg/mL的HAuCl4溶液；
由于还原剂柠檬酸三钠的量对纳米金尺寸的影响至关重要，尺寸大小与柠檬酸三钠的量成反比，经探索得出最佳的柠檬酸三钠的量为0.7mL1wt％柠檬酸三钠。
步骤a中因HAuCl4易潮解，所以需一次性将粉末状的HAuCl4配制成溶液密封保存，又由于HAuCl4极易腐蚀金属，所以在配制溶液过程中不应使用金属钥匙称量氯金酸，本实验中的配制方法为取1g HAuCl4粉末溶解于50mL超纯水中，密封4℃冰箱保存。
由于80nmAuNPs为小分子物质，属于半抗原，而半抗原只具有免疫反应性而不具备免疫原性。为了让80nmAuNPs具有免疫原性，需将其表面进行修饰进而连接上大分子物质成为既有免疫原性又有免疫反应性的全抗原。
步骤b中80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备为：
取步骤a制备的80nmAuNPs溶液，浓度为0.048mg/mL，搅拌的状态下加入硫代乙醇酸TGA搅拌10min～25min后，优选的搅拌15min，继续加入羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC避光搅拌2h～5h，优选的搅拌3h，调节pH＝9～10，加入1wt％牛血清白蛋白BSA或1wt％鸡卵清白蛋白OVA冰袋避光搅拌3h～8h(优选5h)，即得相应的免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析8h～15h(优选12h)，收集4℃避光储存待用；
进一步的，步骤b中，硫代乙醇酸TGA与羟基琥珀酰亚胺NHS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC的体积用量比为2:1:2,80nmAuNPs、硫代乙醇酸TGA、牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA的体积用量比为400:1:10。由于大尺寸的纳米金容易团聚，因此，上述试剂的用量比是发明人探究得到的，多余或少于以上配比，均不能实现本发明。
所述硫代乙醇酸TGA为调节活化剂，所述羟基琥珀酰亚胺NHS为偶联剂；
调节pH所用的碱为NaOH；
所述中硫代乙醇酸TGA的浓度为≧9.8％，由于其显酸性，实验过程中需用NaOH调pH至7.0，羟基琥珀酰亚胺NHS的浓度为0.09mol/L,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为10mg/mL,鸡卵清白蛋白OVA浓度为10mg/mL。由于大尺寸的纳米金容易团聚
步骤c中80nmAuNPs抗体制备方法为：
将免疫原与福氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得80nmAuNPs抗体。
进一步的，步骤c中，80nmAuNPs抗体制备方法具体为：将免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合注射到动物内，采用背部皮下多点注射的方式，注射8～10个点，免疫注射量为每次1mL/只。首次免疫三周后，进行第一次加强免疫，将免疫原与福氏不完全佐剂等体积混合均匀再注射到动物内即可，注射量为每次1mL/只，此后每隔一周再进行一次加强免疫，总共免疫次数为7～8次，中间周采血测效价，直到抗体效价满足实验需求。
佐剂：某些物质预先或与抗原同时注入体内，可以增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答，这样的辅助剂称为佐剂。
佐剂分为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂两种，福氏不完全佐剂的制备方法为：无水羊毛脂和液体石蜡按1:2的量超声，直到混合均匀，超声过程中注意及时散热。在福氏不完全佐剂中加入杀死的卡介苗即成为福氏完全佐剂，由于非医疗机构获得卡介苗较为困难，因此，本实验中的福氏完全佐剂直接购买与Sigma公司。
本发明中选雄性新西兰大白兔作为免疫对象，将体重约为2kg，兔龄为2～5个月的健康雄兔在进行实验之前首先饲养两周左右的时间，保持其健康的生活状态。
实验过程中选择了若干只健康的雄性新西兰大白兔作为免疫对象。将体重约为2kg，兔龄为2～5个月的健康雄兔在进行实验之前首先饲养两周左右的时间，保持其健康的生活状态。所采用的免疫注射的部位和方式有多种，主要分为：点眼滴鼻免疫，气雾免疫，饮水免疫，翼下刺种以及皮内、皮下或肌肉注射，具体注射方法视所免疫的动物种类而定。本实验采用了背部皮下多点注射的方式，在每只兔子的背部皮下注射8～10个点，总的注射量约为1mL/只。
步骤d间接竞争酶联免疫分析法为：
(1)包被：将稀释比为1/50-1/500的80nmAuNPs-OVA包被抗原包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
(2)封闭：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去未被结合上的80nmAuNPs包被抗原，加入封闭鸡卵清白蛋白1wt％OVA封闭，每孔200μL，封闭未被包被抗原结合的位点，37℃烘箱温育1～2h；
(3)加样竞争：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去多余的封闭液，每孔加入50μL80nmAuNPs的标准品或待测80nmAuNPs样品溶液和50μL80nmAuNPs抗体进行竞争反应，烘箱温育1～2h，使待测物或者标准品与包被抗原中的AuNPs同时竞争抗80nmAuNPs抗体；
(4)加酶：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去未被结合的游离态的待测液或抗体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)，每孔100μL(用于与上一步中与包被抗原中AuNPs结合的抗80nmAuNPs抗体(一抗)结合)烘箱温育2～4h；
(5)显色:PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min,洗去未被结合的二抗，加入邻苯二胺，每孔100μL，烘箱温育显色0.5～1h；
(6)终止：每孔加入50μL,2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值；
(7)绘制标准曲线，由标准曲线计算所测未知浓度80nmAuNPs的浓度。
本发明提供了一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法，通过80nmAu多克隆抗体的制备，利用抗原抗体的特异性结合定量的检测了80nmAu粒子。与现有技术相比，本发明具有以下几个特点：(1)通过修饰剂的作用，将半抗原成功的合成为全抗原，为抗体得以产生作出了重大贡献。(2)利用机体的免疫应答效应，成功的制备出特异性高的80nmAuNPs多克隆抗体，抗体的保质期较长，因此，可行性高。(3)利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法对80nmAuNPs进行了一种定量检测，该方法的发明为今后纳米材料的定量检测提供了一种可行性较高的方法。(4)该方法操作简单，可行性高，灵敏度高，检出限低。
附图说明
图1为实施例1得到的标准曲线；
图2为实施例2得到的标准曲线。
具体实施方式
1、实验试剂及仪器：
(1)试剂
氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸钠、柠檬酸、硫代乙醇酸(TGA)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDAC)、鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、HRP标记的羊抗兔IgG、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、Tween-20、无水羊毛脂、液体石蜡、***、福氏完全佐剂、邻苯二胺、过氧化氢、氢氧化钠、硫酸、超纯水。
(2)仪器
电热恒温箱培养箱303-1、DF-101S型集散式恒温加热磁力搅拌器、PHS-3C型精密pH计、KQ3200E型超声波清洗器、TGL-16G型高速台式离心机、UV-4100型紫外-可见分光光度计、多功能酶标仪、磁力搅拌器、96孔酶标板、一次性注射器(1mL，5mL)。
(3)溶液
1)2wt％氯金酸溶液：将1g氯金酸粉末溶于50mL蒸馏水中；
2)1wt％柠檬酸三钠溶液：称取0.1g柠檬酸三钠溶于9.9mL蒸馏水中，混合均匀；
3)稀释液PBS(0.01mol/L pH＝7.4)：称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H200.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL；
4)洗液PBST：在1000mLPBS中加入500μL Tween-20，混合均匀；
5)包被缓冲液CB(0.05mol/L pH＝9.6)：称取Na2CO31.59g、NaHCO32.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL；
6)底物液：称取1.85g Na2HPO4·12H2O、0.51g C6H8O7溶解于蒸馏水中并定容至50mL,称取4mg邻苯二胺溶于10mL上述溶液中，临用前加入15μL30％H2O2；
7)封闭液:称取1mgOVA溶于1mLPBS中，混合均匀；
8)终止液：2mol/L H2SO4；
实施例1
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，包括以下步骤：
(1)、80nmAuNPs全抗原的合成
1)80nmAuNPs的制备
取500μL2％wt HAuCl4和99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，加热至沸腾过程费时15min～30min，再向沸腾的溶液中快速加入0.7mL1％柠檬酸三钠，继续沸腾35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs。
2)80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备
取8mL上述80nmAuNPs溶液，搅拌的状态下加入20μL9.8％硫代乙醇酸(TGA)搅拌15min后，继续加入10μL 0.09mol/L羟基琥珀酰亚胺(NHS)和20μL 0.05mol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDAC)避光搅拌3h，NaOH调pH 9～10，加入200μL 10mg/mLBSA或10mg/mL OVA冰袋搅拌5h即相应得到了免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析12h，收集4℃避光储存待用。
(2)80nmAuNPs多克隆抗体的制备
1)福氏佐剂的制备
称取50g的无水羊毛脂，量取100mL的液体石蜡混合，超声仪多次超声，每次不超过20min，防止超声过程中温度过高，不能及时散热，超声使之混合均匀，直到将该混合液体滴到水中并且半分钟内不扩散为止，得到的油状液体即为福氏不完全佐剂，4℃冰箱储存待用。由于非医疗机构，卡介苗较难获得，所以福氏完全佐剂只能从试剂公司购买，本实验所用的福氏完全佐剂从sigma公司购买。
2)80nmAuNPs抗体制备方法
为了增强机体对抗原的免疫应答，首次免疫时，需将免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合均匀皮下注射到雄兔体内。加强免疫时用等体积比的免疫原和福氏不完全佐剂混合均匀再进行皮下注射，每隔一周进行加强免疫，中间周采血测抗体效价，总共加强免疫六次，抗体效价达到实验需求即可取血得到抗血清，纯化得80nmAuNPs抗体。具体免疫过程如下：
取4只体重为2kg左右的健康雄性新西兰大白兔作为实验动物，其中3只作为免疫对象，第4只作为空白对照。首次免疫时，取等体积的80nmAuNPs免疫原和福氏完全佐剂乳化均匀，皮下注射到3只雄兔的背部，每只雄兔的背部注射8～10个点，注射量为1mL/只。3周后进行第一次加强免疫，加强免疫时用等体积比的免疫原和福氏不完全佐剂的混合物，注射方法同第一次免疫，以后每隔一周进行一次加强免疫，注射量为1mL/只,中间周静脉采血测血清效价，直到血清效价满足实验需求为止，进行最后一次加强免疫，总共加强免疫六次，取血纯化得抗体。
3)抗体效价的鉴定
抗体的效价是用来衡量免疫效果的，为了检测所制得的80nmAuNPs抗体质量的好坏，本实验采取了间接竞争酶联免疫分析法测定抗体的效价。具体方法：用CB将80nmAuNPs-OVA稀释成一系列的浓度包被在96孔酶标板上，4℃冰箱过夜，次日早晨，用洗液PBST洗3次，每次3min，除去未包被上的包被抗原，每孔200μL1％OVA封闭，37℃封闭1h，PBST洗3次，每次3min，加入用PBS稀释的抗血清(稀释比为1/1000～1/64000),每孔100μL，37℃温育2h，PBST洗3次，每次3min，加入稀释比为1/1000的HRP标记的羊抗兔IgG,每孔100μL，37℃温育2.5h，PBST洗3次，每次3min，加入底物液显色，每孔100μL，37℃温育显色0.5h，加入2mol/LH2SO4终止反应。用多功能酶标仪测490nm处吸光值。
(3)间接竞争酶联免疫分析法定量检测80nmAuNPs
由于光度酶联免疫分析法中的间接竞争酶联免疫分析法是利用HRP标记的羊抗兔IgG(即二抗)检测与包被抗原结合的抗80nmAu抗体(即一抗)，最后通过检测抗原一抗二抗的复合物的光信号达到定量检测抗原的目的，该方法比仅利用抗原一抗的复合物即直接竞争酶联免疫法的光信号检测抗原具有更低的检出限，更高的灵敏度，因此本实验采用间接竞争酶联免疫法对80nmAuNPs进行定量检测。具体实验过程如下：
1)包被：用浓度为21.7μg/mL的80nmAu-OVA包被96孔酶标板，每孔100μL，冰箱4℃过夜。
2)封闭：次日早晨，取出酶标板，PBST洗涤3次，每次3min，加入1％OVA进行封闭，每孔200μL，37℃封闭1h。
3)加样竞争：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入50μL自制的80nmAuNPs标准液或待测液和50μL80nmAuNPs抗体，37℃竞争2h。
4)加酶：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入100μL稀释比为1/1000的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃温育2.5h。
5)显色：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入100μL底物液37℃显色0.5h。
6)终止:每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止反应,于多功能酶标仪上测490nm处吸光值。
(4)绘制标准曲线
制得标准曲线如图1所示，标准曲线的线性方程为：A＝0.862-0.076logC，相关系数R2＝0.96，线性范围为10-3-103，检出限为0.0063ng/mL.由标准曲线计算所测未知浓度80nmAuNPs的浓度为0.96ng/mL，回收率为82％-101％。
实施例2
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，包括以下步骤：
(1)、80nmAuNPs全抗原的合成
1)80nmAuNPs的制备
取500μL2wt％HAuCl4和99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，加热至沸腾过程费时15min～30min，再向沸腾的溶液中快速加入0.7mL1wt％柠檬酸三钠，继续沸腾35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs。
2)80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备
取8mL上述80nmAuNPs溶液，搅拌的状态下加入20μL9.8％硫代乙醇酸(TGA)搅拌13min后，继续加入10μL0.09mol/L羟基琥珀酰亚胺(NHS)和20μL0.05mol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDAC)避光搅拌4h，加入180μL 10mg/mL BSA或10mg/mL OVA冰袋搅拌5h即相应得到了免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析12h，收集4℃避光储存待用。
(2)80nmAuNPs多克隆抗体的制备
1)福氏佐剂的制备
称取50g的无水羊毛脂，量取100mL的液体石蜡混合，超声仪多次超声，每次不超过20min，防止超声过程中温度过高，不能及时散热，超声使之混合均匀，直到将该混合液体滴到水中并且半分钟内不扩散为止，得到的油状液体即为福氏不完全佐剂，4℃冰箱储存待用。由于非医疗机构，卡介苗较难获得，所以福氏完全佐剂只能从试剂公司购买，本实验所用的福氏完全佐剂从sigma公司购买。
2)80nmAuNPs抗体制备方法
为了增强机体对抗原的免疫应答，首次免疫时，需将免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合均匀皮下注射到雄兔体内。加强免疫时用等体积比的免疫原和福氏不完全佐剂混合均匀再进行皮下注射，每隔一周进行加强免疫，中间周采血测抗体效价，总共加强免疫六次，抗体效价达到实验需求即可取血得到抗血清，纯化得80nmAuNPs抗体。具体免疫过程如下：
取4只体重为2kg左右的健康雄性新西兰大白兔作为实验动物，其中3只作为免疫对象，第4只作为空白对照。首次免疫时，取等体积的80nmAuNPs免疫原和福氏完全佐剂乳化均匀，皮下注射到3只雄兔的背部，每只雄兔的背部注射8～10个点，注射量约为1mL/只。3周后进行第一次加强免疫，加强免疫时用等体积比的免疫原和福氏不完全佐剂的混合物，注射方法同第一次免疫，以后每隔一周进行一次加强免疫，注射量为1mL/只,中间周静脉采血测血清效价，直到血清效价满足实验需求为止，进行最后一次加强免疫，总共加强免疫六次，取血纯化得抗体。
3)抗体效价的鉴定
抗体的效价是用来衡量免疫效果的，为了检测所制得的80nmAuNPs抗体质量的好坏，本实验采取了间接竞争酶联免疫分析法测定抗体的效价。具体方法：用CB将80nmAu稀释成一系列的浓度包被在96孔酶标板上，4℃冰箱过夜，次日早晨，用洗液PBST洗3次，每次3min，除去未包被上的包被抗原，每孔200μL1％OVA封闭，37℃封闭1h，PBST洗3次，每次3min，加入用PBS稀释的抗血清(稀释比为1/1000～1/64000),每孔100μL，37℃温育2h，PBST洗3次，每次3min，加入稀释比为1/1000的HRP标记的羊抗兔IgG,每孔100μL，37℃温育2.5h，PBST洗3次，每次3min，加入底物液显色，每孔100μL，37℃温育显色0.5h，加入2mol/LH2SO4终止反应。用多功能酶标仪测490nm处吸光值。
(3)间接竞争酶联免疫分析法定量检测80nmAuNPs
由于光度酶联免疫分析法中的间接竞争酶联免疫分析法是利用HRP标记的羊抗兔IgG(即二抗)检测80nmAuNPs抗体(即一抗)，最后通过检测抗原一抗二抗的复合物的光信号达到定量检测抗原的目的，该方法比仅利用抗原一抗的复合物即直接竞争酶联免疫法的光信号检测抗原具有更低的检出限，更高的灵敏度，因此本实验采用间接竞争酶联免疫法对80nmAuNPs进行定量检测。具体实验过程如下：
1)包被：用浓度为21.7μg/mL的80nmAu-OVA包被96孔酶标板，每孔100μL，冰箱4℃过夜。
2)封闭：次日早晨，取出酶标板，PBST洗涤3次，每次3min，加入1％OVA进行封闭，每孔200μL，37℃封闭1h。
3)加样竞争：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入50μL自制的80nmAuNPs标准液或待测液和50μL80nmAuNPs抗体，37℃竞争2h。
4)加酶：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入100μL稀释比为1/1000的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃温育2.5h。
5)显色：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入100μL底物液37℃显色0.5h。
6)终止:每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止反应,于多功能酶标仪上测490nm处吸光值。
(4)绘制标准曲线
制得标准曲线如图2所示，标准曲线的线性方程为：A＝1.18-0.145logC，相关系数R2＝0.994，线性范围为10-3-103，检出限为0.0057ng/mL.由标准曲线计算所测未知浓度80nmAuNPs的浓度为9.48ng/mL，回收率为103.9％-117％。

Claims (5)

1.一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、80nmAuNPs的制备:
取500µL HAuCl4溶液与99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，过程需要15min～30min，向沸腾的溶液中快速加入柠檬酸三钠，反应液迅速变黑，然后变成了泥土色红，继续反应35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs；
步骤a加入0.7mL1wt%柠檬酸三钠溶液；步骤a中HAuCl4溶液的制备方法为：取1gHAuCl4•4H2O粉末溶解于50mL超纯水中，制得16.5mg/mL的HAuCl4溶液；
b、80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备；
c、80nmAuNPs抗体制备：
将得到的80nmAuNPs免疫原注射到动物体内，得到80nmAuNPs抗体；
d、利用纯化好的高特异性的80nmAuNPs抗体和80nmAuNPs包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析法，通过建立标准曲线达到定量检测未知浓度的80nmAuNPs的目的；
步骤b中80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备为：取步骤a制备的80nmAuNPs溶液，搅拌的状态下加入硫代乙醇酸TGA搅拌10-25min后，继续加入羟基琥珀酰亚胺NHS和 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC避光搅拌2-5h，调节pH=9～10，加入1wt%牛血清白蛋白BSA或1wt%鸡卵清白蛋白OVA冰袋避光搅拌5h，即得相应得到了免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析8-15h，收集4℃避光储存待用；
步骤b中，硫代乙醇酸TGA与羟基琥珀酰亚胺NHS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC的体积用量比为2:1:2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中80nmAuNPs、硫代乙醇酸TGA、牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA的体积用量比为400:1:10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中80nmAuNPs抗体制备方法为：
将免疫原与福氏佐剂以体积比1:1 混溶, 对动物进行多次免疫，制得80nmAuNPs抗体。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤c中，80nmAuNPs抗体制备方法具体为：将免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合注射到动物内，采用背部皮下多点注射的方式，注射8～10个点，免疫注射量为每次1mL/只；
首次免疫三周后，进行第一次加强免疫，将免疫原与福氏不完全佐剂等体积混合均匀再注射到动物内即可，注射量为每次1mL/只，此后每隔一周再进行一次加强免疫，总共免疫次数为7～8次，中间周采血测效价，直到抗体效价满足实验需求。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d间接竞争酶联免疫分析法为：
（1）包被：将稀释比为1/50-1/500的80nmAuNPs-OVA包被抗原包被96孔酶标板，每孔100µL，4℃冰箱过夜；
（2）封闭：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去未被结合上的80nmAuNPs包被抗原，加入封闭鸡卵清白蛋白1wt%OVA封闭，每孔200µL，封闭未被包被抗原结合的位点，37℃烘箱温育1～2h；
（3）加样竞争：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去多余的封闭液，每孔加入50µL80nmAuNPs的标准品或待测80nmAuNPs样品溶液和50µL80nmAuNPs抗体进行竞争反应，烘箱温育1～2h，使待测物或者标准品与包被抗原中的AuNPs同时竞争抗80nmAuNPs抗体；
（4）加酶：PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，洗去未被结合的游离态的待测液或抗体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，每孔100µL烘箱温育2～4h；
（5）显色: PBST洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min,洗去未被结合的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，加入邻苯二胺，每孔100µL，烘箱温育显色0.5～1h；
（6）终止：每孔加入50µL,2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值；
(7) 绘制标准曲线，由标准曲线计算所测未知浓度80nmAuNPs的浓度。
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CN106841595B (zh) * 2017-01-20 2020-06-19 安徽师范大学 一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法
CN106706894B (zh) * 2017-01-20 2018-04-13 安徽师范大学 一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺高分子纳米药物载体的方法
CN107228938B (zh) * 2017-06-24 2019-07-19 安徽师范大学 一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法
CN107328929B (zh) * 2017-06-24 2019-06-04 安徽师范大学 一种PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料的定量检测方法
GB2617621A (en) * 2022-04-16 2023-10-18 Uk Nivd Ltd Detector

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101509920A (zh) * 2009-03-26 2009-08-19 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司 尘螨过敏原快速检测试剂盒及其制备方法
US20110212088A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Sabbadini Roger A Anti-paf antibodies
WO2013132338A2 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 Calpro As Competitive immunoassay for calprotectin
CN103675272B (zh) * 2013-12-24 2015-07-22 安徽师范大学 一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法
CN104251902B (zh) * 2014-09-29 2016-06-01 安徽师范大学 一种50nm银粒子的定量检测方法

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