CN105181828A - 一种人体血清叶酸的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开提供了一种人体血清叶酸的测定方法，属于医学检测领域。该方法是将人体血清经高效液相色谱分离后用化学发光检测器检测实现的，包括的步骤有：标准品制备、标本处理、色谱条件设定、化学发光体系试剂制备、检测。本发明将具有高效分离特性的高效液相色谱分析法与灵敏度高、线性范围宽的化学发光法联用，实现了人体血清叶酸高灵敏度、高准确性、强稳定性的测定；建立Fe²⁺-H₂O₂-luminol-NaOH化学发光体系用于快速精确地测量人体血清叶酸。

Description

一种人体血清叶酸的测定方法

技术领域

本发明属于医学检测领域，涉及一种人体血清叶酸的测定方法。

背景技术

叶酸是一种水溶性维生素，它不存在于自然界中也无生物活性，但为具有生物活性的叶酸盐(folate)的前体。叶酸盐在自然界广泛存在，动植物中都有，肝、肾、绿叶蔬菜、土豆、麦麸等含量丰富。叶酸能传递一碳基团(甲基或甲酰)给脱氧尿苷酸，使之变为脱氧胸苷酸，进而合成DNA。

血清叶酸测定主要用于具有细胞贫血的病因诊断。叶酸缺乏症的主要表现为贫血，其他如舌炎、舌痛、舌***萎缩、舌面光滑、口角炎及食欲减退。妊娠前一个月及妊娠初三个月内口服叶酸可预防胎儿神经管畸形。实验室诊断叶酸的方法的有多种，主要有微生物法、化学发光测定法、高效液相色谱法、荧光法、放射免疫法等。光发明专利CN100543462C公开一种人体红细胞叶酸含量测定方法，是通过化学发光法测定的，发明专利CN104807946A公开一种测定保健食品中叶酸含量的是色谱方法，是通过高效液相色谱分析法测定的，上述测定方法均采用局限性明显的单一分析方法，各自均具有不同的缺陷，限制其进一步发展和应用。

现有资料中，已报道的叶酸测定方法，如苏文斌发表的“Fenton试剂氧化-荧光分析法测定果树中叶酸的含量”采用Fe²⁺-H₂O₂发光试剂体系测定叶酸；吴宏富等发表的“高效液相色谱法测定叶酸片的含量与有关物质”采用流动相为磷酸盐缓冲液的液相色谱法测定叶酸含量，上述方法对化学发光法和高效液相色谱法测定叶酸含量分别进行了不同程度的优化，但并未出现联合使用的情况。将两种及两种以上的检测技术结合使用是现代技术发展的必然趋势，比如魏月等发表的论文“高效液相色谱与化学发光联用技术在药物分析中的应用，就有涉及两种方法联合使用测定人血清中的甲硫氧嘧啶和丙硫氧嘧啶的技术，这说明应用高效液相色谱与化学发光联合技术测定人血清叶酸含量的方法是有意义的，具有研究及应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确性好、稳定性强的人体血清叶酸的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种人体血清叶酸的测定方法，是将人体血清经高效液相色谱分离后用化学发光检测器检测，具体包括如下步骤：

⑴标准品制备：精密称取20mg叶酸对照品至一100ml棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液，精密吸取1ml标准贮备液至一10ml容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准工作溶液；

⑵标本处理：用洁净的真空采血管采集空腹血4ml，30min内3000r/min离心10min分离血清，备用；

⑶色谱条件设定：

①色谱柱：采用5μmC18色谱柱(250×4.6mm)；

②流动相：磷酸二氢钾6.8g与0.1mol·L^-1氢氧化钾溶液70mL,加水稀释至800mL,调节pH至6.3,加甲醇80mL,用水稀释成1000mL，过0.45um的膜，超声20min，备用；

③流速：1mL/min；

④进样量：20μL；

⑤柱温：常温

⑷化学发光体系试剂制备

①0.01mol/L的鲁米诺(luminol)储备液：称取1.772g鲁米诺，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解，定容至1L，得到鲁米诺储备液，避光保存；

②0.05mol/L的H₂O₂溶液：以质量分数30％H₂O₂和水配制而成；

③0.01mol/L的硫酸亚铁铵溶液：称取4g硫酸亚铁铵,溶于50ml20％硫酸中,加950ml水摇匀；

⑸检测：H₂O₂溶液和硫酸亚铁铵溶液分别以2.0ml/min的流速流动混合后与流速2.0ml/min的鲁米诺溶液再次混合，得到的混合液与流过色谱柱的流动相混合，通过化学发光器，发光器的测量仪记录发光强度作为基线，待基线稳定后，通过高效液相色谱进样阀进样，经洗脱分离后进入化学发光器，产生色谱峰，记录发光信号。

本发明的有益效果：将具有高效分离特性的高效液相色谱分析法与灵敏度高、线性范围宽的化学发光法联用，实现了人体血清叶酸高灵敏度、高准确性、强稳定性的测定；建立Fe²⁺-H₂O₂-luminol-NaOH化学发光体系用于快速精确地测量人体血清叶酸。

附图说明

图1是本发明的人体血清叶酸测定方法流程示意图。

具体实施方式

结合实施例及附图说明进一步对本发明详述，但不构成对本发明的限制。

实施例

如图1所示，一种人体血清叶酸的测定方法，包括如下步骤：

⑴标准品制备：精密称取20mg叶酸对照品至一100ml棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液，精密吸取1ml标准贮备液至一10ml容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准工作溶液；

⑵标本处理：用洁净的真空采血管采集空腹血4ml，30min内3000r/min离心10min分离血清，备用；

⑶色谱条件设定：

①色谱柱：采用5μmC18色谱柱(250×4.6mm)；

②流动相：磷酸二氢钾6.8g与0.1mol·L^-1氢氧化钾溶液70mL,加水稀释至800mL,调节pH至6.3,加甲醇80mL,用水稀释成1000mL，过0.45um的膜，超声20min，备用；

③流速：1mL/min；

④进样量：20μL；

⑤柱温：常温

⑷化学发光体系

①0.01mol/L的鲁米诺(luminol)储备液：称取1.772g鲁米诺，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解，定容至1L，得到鲁米诺储备液，避光保存；

②0.05mol/L的H₂O₂溶液：以质量分数30％H₂O₂和水配制而成；

③0.01mol/L的硫酸亚铁铵溶液：称取4g硫酸亚铁铵,溶于50ml20％硫酸中,加950ml水摇匀；

⑸检测：H₂O₂溶液和硫酸亚铁铵溶液分别以2.0ml/min的流速流动混合后与流速2.0ml/min的鲁米诺溶液再次混合，得到的混合液与流过色谱柱的流动相混合，通过化学发光器，发光器的测量仪记录发光强度作为基线，待基线稳定后，通过高效液相色谱进样阀进样，经洗脱分离后进入化学发光器，产生色谱峰，记录发光信号。

本方法技术参数：

检测限0.4ng/ml；

平均回收率98.75％；

40个样品分四组进行平行测定，组内相对标准偏差小于3％，组间相对标准偏差小于5％。

Claims (1)

1.一种人体血清叶酸的测定方法，是将人体血清经高效液相色谱分离后用化学发光检测器检测，其特征在于：包括如下步骤：

⑴标准品制备：精密称取20mg叶酸对照品至一100ml棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液，精密吸取1ml标准贮备液至一10ml容量瓶中，用0.5％氨水溶解并稀释至刻度，作为标准工作溶液；

⑵标本处理：用洁净的真空采血管采集空腹血4ml，30min内3000r/min离心10min分离血清，备用；

⑶色谱条件设定：

①色谱柱：采用5μmC18色谱柱(250×4.6mm)；

②流动相：磷酸二氢钾6.8g与0.1mol·L^-1氢氧化钾溶液70mL,加水稀释至800mL,调节pH至6.3,加甲醇80mL,用水稀释成1000mL，过0.45um的膜，超声20min，备用；

③流速：1mL/min；

④进样量：20μL；

⑤柱温：常温

⑷化学发光体系试剂制备

①0.01mol/L的鲁米诺(luminol)储备液：称取1.772g鲁米诺，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解，定容至1L，得到鲁米诺储备液，避光保存；

②0.05mol/L的H₂O₂溶液：以质量分数30％H₂O₂和水配制而成；

③0.01mol/L的硫酸亚铁铵溶液：称取4g硫酸亚铁铵,溶于50ml20％硫酸中,加950ml水摇匀；

⑸检测：H₂O₂溶液和硫酸亚铁铵溶液分别以2.0ml/min的流速流动混合后与流速2.0ml/min的鲁米诺溶液再次混合，得到的混合液与流过色谱柱的流动相混合，通过化学发光器，发光器的测量仪记录发光强度作为基线，待基线稳定后，通过高效液相色谱进样阀进样，经洗脱分离后进入化学发光器，产生色谱峰，记录发光信号。