CN105177018B

CN105177018B - 提高维生素b6含量在提高水稻对于细菌性条斑病抗性中的应用

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Publication number: CN105177018B
Application number: CN201510395745.7A
Authority: CN
Inventors: 丁新华; 储昭辉; 刘海峰; 吴涛
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2018-09-21
Anticipated expiration: 2035-07-08
Also published as: CN105177018A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，基于提高维生素B6含量可以提高水稻对于细菌性条斑病抗性这一基础发现，利用强启动子驱动转基因技术，将维生素B6合成基因OsPDX1的超量表达载体转入水稻品种中花11，OsPDX1家族基因表达量显著提高的遗传转化水稻中维生素B6水平显著提高，对细菌性条斑病的抗性明显增强，而OsPDX1家族基因抑制表达的遗传转化水稻中维生素B6显著降低，对细菌性条斑病的抗性明显减弱，进而进一步验证了维生素B6及其合成基因OsPDX1在水稻抗细菌性条斑病中发挥重要作用及其应用价值。

Description

提高维生素B6含量在提高水稻对于细菌性条斑病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高水稻对于细菌性条斑病抗性的相关基因及其应用。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Science274:2060-2063；Baker等，1997，Science 276:726-733；Jia等，2000，EMBO J.19:4004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411:826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.PlantBiol.4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26：403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45:449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。

植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病反应给予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance inPlants，Academic，New York)、质量抗性和数量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1:203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)调控的抗病反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等编著，CAB International，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人们对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此，虽然水稻中已经鉴定出了大量抗病QTL，如抗白叶枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.261：58-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 136:1421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:2544-2549)、抗纹枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91:382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.97:1145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于水稻品种抗病性的改良。

近年研究发现很多抗病相关基因的染色***置与抗病QTL相对应，提示这些抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色***置与抗病QTL相对应这一现象在多种植物中都被观察到，包括水稻(Xiong等，2002，中国科学45:518-526；Ramal ingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.16:14-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269:331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271:111-120)、小麦(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98：219-225)、豆类(Geffroy等，2000，Mol.Plant-MicrobeInteract.13:287-296)和马铃薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15:587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依据。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用水稻抗病基因的克隆获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，基于提高维生素B6含量可以提高水稻对于细菌性条斑病抗性这一基础发现，利用强启动子驱动转基因技术，将维生素B6合成基因OsPDX1的超量表达载体转入水稻品种中花11，OsPDX1家族基因表达量显著提高的遗传转化水稻中维生素B6水平显著提高，对细菌性条斑病的抗性明显增强，而OsPDX1家族基因抑制表达的遗传转化水稻中维生素B6显著降低，对细菌性条斑病的抗性明显减弱，进而进一步验证了维生素B6及其合成基因OsPDX1在水稻抗细菌性条斑病中发挥重要作用及其应用价值。

发明人经过进一步研究后发现，提高维生素B6含量可以提高水稻对于细菌性条斑病抗性，而提高维生素B6含量的各种方式均可取得上述的效果，其中可以利用超量表达相关基因的方式来提高维生素B6水平，同样的，也可以采用维生素B6喷施处理、或在肥料中直接添加维生素B6含量来获得相同的效果，其中：

发明人提供了一个从水稻中分离获得的水稻抗细菌性条斑病相关基因家族OsPDX1，该基因家族包括3个成员，OsPDX1.1、OsPDX1.2和OsPDX1.3，其中：

OsPDX1.1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

OsPDX1.2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

OsPDX1.3，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

上述三个相关基因编码的蛋白是一个维生素B6蛋白，负责水稻中维生素B6的从头合成。

发明人进而利用超表达和RNA干扰技术使目标基因在植物体内过量表达和沉默，来鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，最终发现抑制表达任一OsPDX1家族基因的转基因植株维生素B6水平显著降低，对水稻细菌性条斑病的抗性水平明显降低，而超量表达任一OsPDX1家族基因的转基因植株维生素B6水平显著提高，抗病能力显著提高，可获得高抗病植株。

在上述技术的基础上，发明人采用对应的特异性引物，利用PCR技术可以从基因组中扩增得到上述OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因片段，之后与合适的超表达载体连接转入植物中去即可实现上述基因的超量表达，进而提高维生素B6的含量，产生抗细菌性条斑病病的转基因植物，而采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

综上所述，本发明的发明人在国际上首次首次验证了维生素B6及其合成基因家族OsPDX1在水稻细菌性条斑病抗性中的功能，进而利用超量表达的方式使转基因植株维生素B6水平显著提高，抗病能力显著提高，获得高抗病植株，具有极高的应用价值。

附图说明

图1.OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因完整片段在中花11基因组DNA中的PCR分离扩增示意图；

图中，获得用于构建超量表达载体的目的基因条带，其中OsPDX1.1基因条带大小为957bp，OsPDX1.2基因条带大小为942bp，OsPDX1.3基因条带大小为1092bp；

图2.OsPDX1基因抑制片段在中花11基因组DNA中的PCR分离扩增示意图；

图中，利用引物OsPDX1RNAiF/OsPDX1RNAiR扩增获得目的基因抑制表达条带大小414bp；

图3.含抑制表达载体DS1301::OsPDX1的中花11遗传转化植株(CD13-22)的PCR检测示意图；

图中，利用引物ds1301S2F2/ds1301S2R2对CD13-22转基因植株进行检测，获得的13株转基因植株中有9株显示阳性；

图4.含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.1的中花11遗传转化植株(CD13-23)的PCR检测示意图；

图中，利用引物HptF2/HptR2对CD13-23转基因植株进行检测，获得的13株转基因植株中有13株显示阳性；

图5.含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.2的中花11遗传转化植株(CD13-24)的PCR检测示意图；

图中，利用引物HptF2/HptR2对CD13-24转基因植株进行检测，获得的18株转基因植株中有17株显示阳性；

图6.含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.3的中花11遗传转化植株(CD13-25)的PCR检测示意图；

图中，利用引物HptF2/HptR2对CD13-25转基因植株进行检测，获得的13株转基因植株中有9株显示阳性；

图7为CD13-23转基因植株中OsPDX1.1转录水平柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11,编号1、2、3、4、5、6、7、9、10、12分别为不同的CD13-23株系；

由图可知含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.1的中花11遗传转化植株(CD13-23)中OsPDX1.1转录水平显著高于野生型对照中花11；

图8为CD13-25转基因植株中OsPDX1.3转录水平柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11,编号1、2、5、6、9、10分别为不同的CD13-25株系；

由图可知含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.3的中花11遗传转化植株(CD13-25)中OsPDX1.3转录水平显著高于野生型对照中花11；

图9为CD13-23转基因植株接种细菌性条斑病菌病斑长度柱状图；

由图可知含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.1的中花11遗传转化植株(CD13-23)接种水稻细菌性条斑病菌RS105病斑显著低于野生型对照中花11，抗病水平提高；

图10为CD13-25转基因植株接种细菌性条斑病菌病斑长度柱状图；

由图可知含超量表达载体pCXUN::OsPDX1.3的中花11遗传转化植株(CD13-25)接种水稻细菌性条斑病菌RS105病斑显著低于野生型对照中花11，抗病水平提高；

图11为CD13-22转基因植株中OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3转录水平柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11；图可知含抑制表达载体DS1301::OsPDX1的中花11遗传转化植株(CD13-22)中OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因的转录水平显著低于野生型对照；

图12为CD13-22转基因植株接种细菌性条斑病菌病斑长度柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11；

由图可知含抑制表达载体DS1301::OsPDX1的中花11遗传转化植株(CD13-22)接种水稻细菌性条斑病菌RS105病斑显著高于野生型对照中花11，抗病水平降低；

图13为OsPDX1.1、OsPDX1.2缺失突变体接种细菌性条斑病菌病斑长度柱状图，

由图可知中花11背景下OsPDX1.1缺失突变体接种水稻细菌性条斑病菌RS105病斑显著高于野生型对照中花11；Dongjin背景下OsPDX1.2缺失突变体接种水稻细菌性条斑病菌RS105病斑显著高于野生型对照Dongjin；

图14为CD13-23、CD13-25转基因植株维生素B6含量柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11,编号1、2、5为不同的CD13-23株系，编号6、10为不同的CD13-25株系；

由图可知中花11背景遗传转化植株(CD13-23、CD13-25)中维生素B6水平显著高于野生型对照；

图15为CD13-22转基因植株维生素B6含量柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11,编号1、2、5、6、9、10、11分别为不同的CD13-22株系；

由图可知含抑制表达载体DS1301::OsPDX1的中花11遗传转化植株(CD13-22)中维生素B6水平显著低于野生型对照；

图16为维生素B6处理后接种细菌性条斑病菌的表型图和病斑长度柱状图，

由图可知维生素B6(1mM维生素B6，0.02％TWEEN 20)处理后接种水稻细菌性条斑病的病斑长度显著低于对照(0.02％TWEEN 20)喷施处理的水稻植株上的病斑长度；

图17.为CD13-23、CD13-25转基因植株株高结果柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11,编号1、2、5、6、9、10为不同的CD13-23株系，编号1、2、3、4、5、10、12为不同的CD13-25株系；

由图可知中花11背景遗传转化植株(CD13-23、CD13-25)的株高显著高于野生型对照；

图18为CD13-23转基因植株千粒重结果柱状图，

图中，WT为野生型对照中花11；

由图可知中花11背景遗传转化植株CD13-23的千粒重显著高于野生型对照。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1 OsPDX1家族基因的分离和植物表达载体的构建

1.OsPDX1家族基因的分离

以感病水稻品种中花11的基因组DNA为模板，通过PCR技术，分别利用引物PDX1.1F/PDX1.1R、PDX1.2F/PDX1.2R、PDX1.3F/PDX1.3R扩增获得OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因的DNA片段，其中：

OsPDX1.3，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小(如图1所示)；

以感病水稻品种中花11的基因组DNA为模板，通过PCR技术，利用引物PDX1RNAiF/PDX1RNAiR扩增获得OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因保守部分的DNA片段，1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,(图2)，引物序列见表1

表1.相关引物序列

2.OsPDX1家族基因植物表达载体的构建

(1)DS1301::OsPDX1抑制表达载体的构建

将分离得到OsPDX1的抑制表达片段(即OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因保守部分的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)，经Kpn I和BamH I双酶切后利用乙醇沉淀纯化回收，并与用相同酶切的DS1301载体连接。转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆提取质粒，并用相同的酶进行酶切检测，测序验证正确，说明抑制载体的第一链构建成功，即过渡载体DS1301::OsPDX1-First；然后，用SpeI和SacI分别处理OsPDX1的抑制表达片段和过渡载体DS1301::OsPDX1-First，在T4 DNA Ligase的作用下构建成功完整的DS1301::OsPDX1抑制表达载体，测序验证正确，即将OsPDX1抑制片段反向连入过渡载体DS1301::OsPDX1-First中。

(2)pCXUN::OsPDX1.1、pCXUN::OsPDX1.2、pCXUN::OsPDX1.3超量表达载体的构建

将分离得到的OsPDX1.1(SEQ ID No.4)、OsPDX1.2(SEQ ID No.5)、OsPDX1.3(SEQID No.6)的片段，利用乙醇沉淀纯化回收，并与用Xcm I酶处理的pCXUN载体连接。转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆提取质粒，并用BamH I酶进行酶切检测，测序验证正确，说明超量表达载体pCXUN::OsPDX1.1、pCXUN::OsPDX1.2、pCXUN::OsPDX1.3构建成功。

将以上抑制和超量表达载体转化农杆菌EHA105，进行农杆菌介导的遗传转化。

实施例2 OsPDX1家族基因的功能验证

本发明采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术和外源启动子增强表达技术，通过抑制和超量表达水稻品种中OsPDX1.1、OsPDX1.2、OsPDX1.3基因，验证该基因的功能。RNAi技术途径的主要机理：将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA,dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA，这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。而超表达技术则是将目的基因连入具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的表达载体中，转化植物后在强启动子的作用下，目的基因的表达量远远高于本底水平。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将DS1301::OsPDX1导入水稻品种中花11中，获得的遗传转化植株分别被命名为CD13-22；将pCXUN::OsPDX1.1、pCXUN::OsPDX1.2、pCXUN::OsPDX1.3导入水稻品种中花11，获得的转化植株被命名为CD13-23、CD13-24、CD13-25。

农杆菌介导的遗传转化主要步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)

(2)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

生根

(1)剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

本发明共获得CD13-22独立转化植株13株，CD13-23独立植株13株，CD13-24植株18株，CD13-25独立转化植株13株。用DS1301载体上二链克隆位点的侧翼序列设计引物ds1301S2F2/ds1301S2R2(表1)对CD13-22转化植株进行PCR阳性检测，获得部分典型阳性结果(图3)。用pCXUN载体Hpt基因的侧翼序列设计引物HptF2/HptR2(表1)对CD13-23、CD13-24、CD13-25转化植株进行阳性检测，获得部分阳性检测结果(图4，5和6)。最终，获得CD13-22、CD13-23、CD13-24、CD13-25阳性植株分别为9株、13株、17株、9株。对部分转基因植株和野生型水稻在成株期阶段注射接种水稻细菌性条斑病菌RS105，与野生型中花11植株相比，OsPDX1超量表达阳性植株的抗性显著增强(P<0.05)(图9和10)，OsPDX1抑制表达阳性植株的抗性水平明显降低(图12)。

为了进一步确认OsPDX1超量表达转基因植株对水稻细菌性条斑病菌的抗性，在T1代转基因株系进行了RS105接种，与野生型对照中花11相比，OsPDX1超量表达阳性植株的抗性显著增强(P<0.05)(表2)。

表2 OsPDX1超量表达T1代转基因植株接种RS105^a表型

^a所有水稻材料在成株期接种

^b每个单株接种3片叶子

^c P值结果是与中花11比较得到

为进一步验证转化植株的抗病能力增强与减弱是否与OsPDX1基因的表达量相关，本发明采用实施例1中的实时定量RT-PCR技术分析了OsPDX1基因在不同的遗传转化株系中的表达量(图7、8和11)。

实验结果显示转化植株中OsPDX1基因的表达量变化与植株的表型变化密切相关。本发明提供具有代表性的可靠结果进行说明。抗病性减弱的典型阳性转化植株CD13-22中OsPDX1基因的表达量与对照材料中花11相比显著减少(图11)，同时OsPDX1.1、OsPDX1.2缺失突变体植株也比对应的野生型对照更加易感细菌性条斑病菌(图13)，而OsPDX1基因的表达量在CD13-23、CD13-25株系中相应的增高(图7和8)。该结果说明了OsPDX1基因的编码产物在水稻抗细菌性条斑病反应中发挥正调控因子的作用。超量表达水稻中OsPDX1基因，可增强水稻对细菌性条斑病的抗性，从而可以改良水稻对细菌性条斑病的抗性。

实施例3 维生素B6提高水稻对细菌性条斑病的抗性

上述实施例的实验结果显示转化植株中维生素B6的水平变化与植株对细菌性条斑病抗性的变化密切相关。本发明提供具有代表性的可靠结果进行说明。抗病性减弱的典型阳性转化植株CD13-22中维生素B6水平与对照材料中花11相比显著减少(图15)。而OsPDX1基因的表达量在CD13-23、CD13-25株系中相应的增高(图14)。该结果说明了维生素B6正调控水稻对细菌性条斑病的抗性。

为进一步验证维生素B6在水稻抗细菌性条斑病菌中的作用，本发明采用维生素B6溶液(1mM维生素B6，0.02％TWEEN 20)喷施处理水稻中花11，喷施处理1小时后接种细菌性条斑病菌。与对照处理(0.02％TWEEN 20)相比，维生素B6处理显著降低细菌性条斑病病斑长度(图16)，该结果说明维生素B6处理显著提高水稻对细菌性条斑病的抗性。除此之外现有各种提高维生素B6含量的处理，均可以提高水稻对细菌性条斑病的抗性。

实施例4 维生素B6合成基因OsPDX1提高水稻株高和千粒重

超量表达OsPDX1的转化植株中维生素B6的水平变化与植株株高的变化密切相关。本发明提供具有代表性的可靠结果进行说明。维生素B6水平提高的转化植株CD13-23和CD13-25的株高对照材料中花11相比显著增加(图17)。同时，维生素B6水平提高的转化植株CD13-23水稻千粒重对照材料中花11相比显著增加(图18)。该结果说明了维生素B6正调控水稻的株高和千粒重。

Claims

1.提高水稻中维生素B6含量在提高水稻对于细菌性条斑病抗性中的应用。

2.维生素B6合成基因OsPDX1提高水稻对于细菌性条斑病抗性中的应用。