CN105177017B - 抗多亚基因型hcv抗体基因r4-85及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗多亚基因型HCV抗体基因R4‑85，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，该抗体基因是用各亚型HCV中均高度保守的E2区aa412‑423线性表位(HCV CD81受体结合表位)合成肽从自主构建的抗‑HCV scFv抗体库中淘选获得；抗体库来自39份抗HCV抗体阳性的中国患者外周血样本，患者所感染的HCV涵盖中国主要HCV流行亚型，因此R4‑85是中国特有的具有广泛结合特性的抗‑HCV抗体，对我国在HCV诊断、治疗及疫苗研发等领域具有很好的应用价值。

Description

抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85，还涉及该抗体基因的应用。

背景技术

迄今为止，全球约有1亿7千万丙型肝炎病毒(hepatits C virus，HCV)感染者，占世界人口总数的3％。WHO估计全球HCV感染新发病例以每年3至4百万的速度递增。HCV主要经血行传播，感染后慢性化比例高达80％，是导致肝硬化、肝癌的重要原因。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA病毒。HCV基因组高度变异，根据基因组的异质性，共分为7个基因型近100种亚型。在全球，HCV感染具有明显的人种及地理分布差异性，如：世界主要流行的HCV亚型是1a、1b、2a、2b、3a型，而中国主要流行亚型为1b、2a、3a、3b、6a型。HCV还以准种形式存在于患者体内(即一组遗传学上密切相关又各不相同的病毒株存在于宿主体内)。HCV所具有的这些特性，给HCV的诊断、治疗及预防都带来了及大的因难。到目前为止，在诊断上尚无各亚型通用的病毒抗原检测试剂。在治疗上，聚乙二醇干扰素联合利巴韦林的抗病毒方案使应答率升高，但存在明显的副作用，最近开发的HCV特异性直接抗病毒药物则因为价格昂贵，限制了其广泛应用。在预防方面，也未开发出安全而有效的HCV疫苗。

2001年Ania Owsianka首次发现在HCV E2 N-末端(aa412-423)存在一个在各亚型HCV中均高度保守的线性表位，并且随后的研究证实该表位是HCV受体CD81的结合表位。与该表位特异性结合的抗体与各亚型HCV具有广泛的结合特性和中和能力，如：AP33(mouse)、3/11(Rat)、HCV1(human)、Hc33.1(human)等。进一步研究还发现这类抗-HCV广泛性结合抗体在人肝嵌合鼠模型中不仅可以预防HCV感染，而且还可以治疗已经建立的HCV感染，这对于预防肝移植术后高达80％的HCV再感染及治疗全球1.7亿HCV已感染者具有重大的现实意义，这类广泛结合抗体也为HCV疫苗的研究奠定了重要的基础。但是，已报道的广泛交叉结合抗体并非都对HCV所有基因型具有中和作用，且针对不同基因型的中和能力存在差异。故分离到全球通用的广泛结合性抗-HCV抗体可能十分困难，因此从中国HCV感染人群中分离出的广泛结合性抗-HCV抗体可能更匹配中国流行的HCV亚型，也更适合应用于我国的HCV诊断、治疗及疫苗研究等领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85；本发明的目的之二在于提供由所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85编码的抗体；本发明的目的之三在于提供含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的重组载体；本发明的目的之四在于提供含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的噬菌体；本发明的目的之五在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备HCV诊断的试剂中的应用；本发明的目的之六在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备预防HCV感染的疫苗中的应用；本发明的目的之七在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备治疗HCV感染的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85，所述抗体基因R4-85的重链氨基酸序列如SEQID NO.38所示或SEQ ID NO.38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示或SEQ ID NO.39所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列，其抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的构建过程如图4所示。

优选的，所述抗体基因R4-85的重链和轻链由(G₄S)₃连接肽连接。本发明中(G₄S)₃连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示，具体序列为：5’-ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg-3’。

2、由所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85编码的抗体。优选的，所述抗体为单链抗体、包括两条重链和两条轻链的单体分子或由单体分子聚合成的多聚体。

3、含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的重组载体。

4、含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的噬菌体。

5、所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备HCV诊断的试剂中的应用。

6、所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备预防HCV感染的疫苗中的应用。

7、所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备治疗HCV感染的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过提取39例HCV感染者(涵盖中国地区主要HCV流行亚型)的外周血白细胞mRNA，并采用T7噬菌体展示技术***，成功构建了足够大的抗多亚型HCV scFv噬菌体展示库，原始库及扩增库的库容分别为3.6×10⁷PFU及1.12×10¹¹PFU/mL，通过对原始库中随机挑选的12个scFv克隆进行氨基酸序列分析，发现两两之间均不相同，表明该噬菌体展示抗体库具有足够大的多样性，最后通过HCV E2区aa412～423线性表位肽QLINTNGSWHIN进行淘选，分离得到与这个在各亚型HCV E2区均高度保守的线性表位高特异性结合的R4-85scFv抗体基因(s/n＝24)。研究已经证实，HCV E2区aa412～423线性表位在各HCV亚型中均高度保守并且是HCV进入肝细胞的重要受体CD81的结合位点，与此表位特异性结合的抗体对各亚型HCV具有广泛结合特性及中和能力，对HCV诊断、治疗及疫苗研发具有潜在的应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为人源性HCV scFv噬菌体展示库的构建(A：丙型肝炎患者外周血来源的IgG、IgM重链及轻链可变区扩增条带，M代表DNA Marker；B：针对低拷贝或单拷贝抗体基因采用半巢式PCR进行第一轮扩增的目的条带，1-5分别代表以下上游引物：HuVH2aSS，HuVH6aSS，HuVκ5aSS，HuVκ6aSS，HuVλ5SS；C：采用重叠延伸PCR法连接重链与轻链可变区基因的扩增产物，1代表VLκ-linker-VH scFv；2代表VLλ-linker-VH scFv)。

图2为每轮生物淘选后噬菌体克隆与HCV E2区aa412-423序列结合活性的对比结果，采用ELISA方法检测克隆的结合特性，每轮淘选均设阴性对照，无游离肽段被亲和素捕获。

图3为淘选的R4-85阳性克隆与特异性识别E2蛋白aa412-423序列的其他中和抗体的CDRs区比对(★表示该位点氨基酸在所有序列中相同，#表示该位点氨基酸相同的序列数≥3)。

图4为HCV scFv抗体构建流程图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例的研究对象如下：慢性HCV感染者及其血清样本均来自西南医院感染科门诊患者。总共39人份抗-HCV阳性患者抗凝外周血，每份3mL。包括中国主要流行HCV亚型：1b型7例，2a型2例，3a型5例，3b型5例，6a型4例，基因型不确定16例(经抗病毒治疗，HCVRNA已阴转)。新鲜采集的患者外周抗凝血立即与33mL RNA/DNA固定剂(RNA/DNAStabilization Reagent for Blood/Bone Marrow)(Roche)混合，-20℃保存备用。

实施例1、引物设计

根据John McCafferty的报道设计人IgG、IgM重链恒定区及κ、λ轻链恒定区mRNA基因特异性逆转录引物，以及重链、轻链可变区PCR扩增引物(McCafferty J，Griffiths AdFau-Winter G，Winter G Fau-Chiswell DJ，Chiswell DJ.Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature.1990；348(6301)：552-4.)。为了方便***T7噬菌体载体，在轻链可变区(VL)正向引物5’端及重链可变区(VH)反向引物5’端分别加上EcoR I及Hind III酶切位点。为了产生VL-linker-VH基因片段，采用重叠延伸PCR的方式连接PCR扩增的VL和VH片段，并在VL反向引物5’端及VH正向引物5’端分别加上彼此反向重叠互补的(G₄S)3连接肽编码序列。引物scFvSS和scFvAS用于最后生成完整的scFv基因片段，所有引物序列如表1所示。

表1、人源性抗多亚基因型HCV scFv噬菌体展示库构建所用引物

实施例2、mRNA抽提及cDNA合成

联合RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow(Roche)和mRNAisolation kit for blood/bone marrow(Roche)，用磁珠法直接从外周血白细胞中分离提取mRNA，按说明书进行操作，测定提取的mRNA浓度及A260/A280值。结果显示，每毫升患者抗凝外周血细胞中平均获取130ng mRNA，A260/A280值为1.90～2.00，表明分离提取mRNA可以用于建库，然后-80℃保存备用。各取用50ng从所有样本提取的mRNA做模板，分别用人IgG、IgM重链恒定区，κ、λ轻链恒定区mRNA基因特异性逆转录引物，

II FirstStrand cDNA Synthesis Kit(NEB)合成cDNA，合并cDNA，-20℃保存备用。

实施例3、单链可变区片段(scFv)扩增

PCR扩增重链、轻链可变区基因，具体操作方法如下：等摩尔浓度分别预混重链及κ、λ轻链可变区反向引物，终浓度10μM。在50μL PCR体积中，各包含单条上游引物及预混反向引物各25pmoL，cDNA 2μL，5×Reaction Buffer 10μL，5×High GC Enhancer 10μL，10mmol dNTP 1μL，

High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)1单位。反应条件：98℃预变性30秒后，98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；最后72℃后延伸2分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)纯化PCR，电泳结果如图1中A所示。结果显示，单条上游引物与混合的下游引物能有效的扩增出除低拷贝和单拷贝基因外的所有VH及VL。

对扩增效果不佳的HuVH2aSS，HuVH6aSS，HuVκ5aSS，HuVκ6aSS，HuVλ5SS引物(针对低拷贝或单拷贝抗体基因引物)采用半巢式PCR(semi-nested PCR)进行扩增。在第一轮PCR后，上述引物分别与cDNA合成所用的逆转录引物配对进行PCR，然后取2μL反应产物，按上述条件进行第二轮PCR，扩增结果如图1中B所示，结果显示低拷贝和单拷贝基因通过半巢式PCR，最终也能有效的扩增出VH、VL。然后纯化PCR产物，分别等量合并重链、κ、λ轻链可变区基因扩增产物，命名为VH mix，VL-κmix，VL-λmix，-20℃保存备用。

通过重叠延伸PCR的方式分别连接重链与κ轻链可变区基因扩增产物及重链与λ轻链可变区基因扩增产物，构成VL-linker-VH scFv基因片段。具体方法如下：100ng VH mix和100ng VL-κmix或VL-λmix，25pmol scFvSS和scFvAS引物，上述条件进行PCR，结果如图1中C所示。结果显示，通过重叠延伸PCR分别连接VH与VLκ、VLλ，获得了预计750bp的scFv基因片段。纯化PCR产物，-20℃保存备用。

实施例4、人源性抗多亚基因型HCV scFv噬菌体展示库的构建

采用T7

Phage Display System(Novagen)构建scFv噬菌体展示库。根据人正常的抗体轻链κ，λ比例，按摩尔比例2：1将经EcoR I和Hind III双酶消化回收纯化的Vh-linker-VLκ及Vh-linker-VLλscFv片段混合，然后与T7噬菌体载体连接。连接反应按试剂盒操作，具体方法如下：在5μL连接反应体系中，包括0.5μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，0.12pmoL混合scFv片段，0.04pmoL同样内切酶线性化的T7Select10-3b载体臂，0.5μL T4DNA连接酶(NEB)，连接反应在16℃下孵育16小时。然后在连接产物中加入25μL T7 SelectPackaging Extract，22℃连接2小时，进行噬菌体体外包装，最后加入270μL LB培养基终止反应，获得人抗-HCV scFv原始噬菌体展示库。从300μL原始展示库中取出10μL进行噬斑测定，以确定原始库容大小，经检测滴定总库容达到3.6×10⁷PFU，并随机挑选12个噬斑克隆，用scFvSS和scFvAS引物PCR扩增克隆的scFv基因并做核酸序列分析，以确定原始库的多样性，scFv克隆的氨基酸序列如表2所示。

表2、噬菌体原始展示库中随机挑选的12个scFv克隆的氨基酸序列

A

B

A表示轻链可变区的氨基酸序列；B表示重链可变区的氨基酸序列。

由表2可知，在12个克隆中未发现重复scFv序列，表明原始库具有高度的多样性。

原始库噬菌体加入500mL BLT5403宿主菌进行扩增，获得1代噬菌体扩增库，同样进行噬斑测定确定1代扩增库的大小。结果显示，1代噬菌体扩增库库容达到1.12×10¹¹PFU/mL。

实施例5、生物淘选及阳性克隆鉴定

根据的HCV E2区高保守aa412-423线性表位(QLINTNGSWHIN)，人工合成生物素标记的合成肽QLINTNGSWHINGSGK-biotin(由Shanghai Sangon合成)，2mg合成肽加入1mL含10μL冰酸的PBS中，配成浓度为2mg/mL的贮存液。连接合成肽与磁珠，取5mg(500μL)DynabeadsM-280 Streptavidin magnetic beads(Invitrogen)加入10μL 2mg/mL的合成肽，4℃转动孵育16小时，清洗后悬浮于1mL PBS中，4℃保存备用。为排除可能与Dynabeads M-280非特异性结合的噬菌体，在2mL PTM(PBS+1％Tween-20+2％nonfat dry milkpowder)中加入200μL噬菌体(2×10¹⁰pfu)，2mg(100μL)Dynabeads M-280，室温转动孵育2小时，磁力架吸附磁珠，吸取上清备用。100μL合成肽结合磁珠加入1mL PTM，室温封闭1小时，然后加入1mL经Dynabeads M-280预处理的噬菌体，室温2小时，接着1.5mL PBST清洗1次，1.5mL PBS清洗3次，最后磁珠结合的噬菌体悬浮于100μL PBS中，其中50μL加入1％SDS，从磁珠上洗脱噬菌体，做噬斑检测，确定噬菌体产出量，另50μL直接接种于4mL BLT5403菌液中，扩增噬菌体，用于下一轮淘选。

阳性克隆鉴定用含5μg/mL Neutravidin(invitrogen)的碳酸盐缓冲液(pH＝9.7)包被Maxisorp Plates(Nunc)酶标板，洗板后加入1μg/mL生物素标记的合成多肽，室温1小时孵育，让合成肽与包被的亲和素结合，PBST洗板3次除去未结合多肽，再加入PTM室温封闭1小时，然后分别加入单个噬斑扩增的克隆噬菌体，室温2小时，PBST清洗3次，加入1:5000稀释的酶标二抗

Antibody HRP Conjugate(Novagen)，室温1小时孵育，PBST清洗3次，每孔加入100μL TMB底物显色，用2mol硫酸终止反应后450nm波长读取OD值。每个克隆做复孔检测，同时每个检测克隆各配置一个未加合成肽的阴性对照孔，另外用碳酸盐缓冲液代替亲和素溶液作为空白对照。每轮淘洗后随机挑选噬斑进行检测，以确定特异性结合多肽的噬菌体展示scFv的富集程度，并按OD值S/N＞10倍标准，选出阳性克隆做进一步序列分析。筛选和鉴定结果如图2和表3所示。

表3、噬菌体库的生物淘选及阳性克隆的富集

结果显示，经过4轮淘洗，从第1轮到第4轮，产出相对于投入的比例逐轮增大，ELISA检测阳性率从第1轮未检出阳性克隆上升到第4轮的35.46％，4轮检测结果对比图更能明显看出增加趋势，特异性结合HCV E2区高保守表位噬菌体展示抗体得了明显的富集。

实施例6、序列分析

各取2μL阳性克隆噬菌体溶液加入100μL10mol EDTA液中，65℃5分钟，离心后取2μL上清，用T7噬菌体上，下游测序引物及Q5高保真聚合酶进行PCR，PCR产物纯化后进行DNA序列分析(shanghai，sangon)。核酸序列资料用kabat编号分析scFv重链及轻链的框架区(framework region，FR)和互补决定区(complementarity determining region，CDR),并与已发表的AP33等抗-HCV广泛结合抗体CDRs区进行比对。结果显示，从第3，4轮淘选的100个阳性克隆序列重复度非常高。从中选出强阳性的R4-85(s/n＝24)克隆，R4-85重链氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，属于λ家族。与已报导的AP33(鼠源性)、3/11(鼠源性)、HCV1(人源性)和Hc33.1(人源性)等抗HCV E2区aa412-423线性表位的广泛结合性抗体进行CDR区氨基酸序列比对发现，不同来源的抗体CDRs氨基酸序列虽然差异明显，特别是通常对抗体亲和力影响最大的重链CDR3，氨基酸个数从3到18不等，但是在多个氨基酸位点存在明显的保守性，如图3所示。这些在多个不同来源的抗-HCV广泛结合抗体中均高度保守的位点可能就是与CD81受体结合的关键氨基酸位点。

从上述研究可以得出，本发明从39人份包含中国主要HCV流行亚型(1b、2a、3a、3b、6a型)抗HCV抗体阳性患者血清中抽提mRNA，逆转录和PCR扩增IgG、IgM抗体重链及轻链可变区基因，连接噬菌体载体，成功构建了高容量的中国地区抗多亚型HCV scFv T7噬菌体展示库，并淘选出与HCV E2高保守线性表位(QLINTNGSWHIN)高度特异性结合的抗体基因R4-85。因此，本发明成功的构建了抗-HCV多基因亚型T7噬菌体展示库，并从中成功的淘选出了与HCV E2区aa412～423高保守线性表位QLINTNGSWHIN高度特异性结合的scFv抗体，该表位在各HCV亚型中高度保守，是HCV与CD81的结合位点。因而，用该表位淘选出的抗体对各亚型HCV具有广泛的结合能力。R4-85抗体在HCV诊断、治疗及疫苗研发等领域具有很好的应用价值。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.抗多亚基因型HCV抗体R4-85，其特征在于：所述抗体R4-85的重链氨基酸序列如SEQID NO.38所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。

2.根据权利要求1所述的抗多亚基因型HCV抗体R4-85，其特征在于：所述抗体R4-85的重链和轻链由(G₄S)₃连接肽连接。

3.根据权利要求2所述的抗多亚基因型HCV抗体R4-85，其特征在于：所述(G₄S)₃连接肽的基因序列如SEQ ID NO.40所示。

4.根据权利要求3所述的抗多亚基因型HCV抗体R4-85，其特征在于：所述抗体为单链抗体、包括两条重链和两条轻链的单体分子或由单体分子聚合成的多聚体。

5.含有编码权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体R4-85的核酸的重组载体。

6.含有编码权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体R4-85的核酸的噬菌体。

7.权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体R4-85在制备HCV诊断的试剂中的应用。

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