CN114369165B - 一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法和用途，该抗体包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL‑Linker‑VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL‑Linker‑VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明单链抗体与金黄色葡萄球菌混合后，能与金黄色葡萄球菌甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶GapC特异性结合，能够用于奶牛乳腺炎的防控的进一步研究，具有良好的应用前景。

Description

一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程原核表达单链抗体领域，尤其涉及一种针对牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用。
背景技术
奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，流行率达到了50％，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。金黄色葡萄球菌主要是通过产生多种致病因子而致病，目前，针对金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。
单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及其能够大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。
单链抗体是通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
因此，本领域迫切需要开发高特异性抗金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的单链抗体。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法和用途。
本发明的第一个方面是提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体，其特征在于，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL-Linker-VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL-Linker-VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述连接肽Linker氨基酸序列为(GGGGGSGGGGS)。
所述牛源单链抗体片段VL-Linker-VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的第二个方面是提供一种DNA分子，可以编码所述牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体。
本发明的第三个方面是提供一种抑制奶牛乳腺炎的药物，该药物包括所述牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体。
本发明的第四个方面是提供一种用于金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括所述牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体，或编码所述牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体的基因片段以及与之交联的探针。
本发明的第五个方面是提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、PCR扩增轻链可变区VL和重链可变区基因VH
采集患乳腺炎的奶牛血液，分离出外周血白细胞，提取总RNA，合成第1链cDNA，设计扩增抗体轻、重链的引物，采用RT-PCR扩增抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH基因；
步骤2、合成scFv基因
利用SOE-PCR法将连接轻链可变区VL基因和重链可变区基因，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；
步骤3、构建重组表达质粒
将步骤2中获得的scFv基因和pCANTAB5E载体分别经双酶切后，scFv基因***pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒；
优选地，切酶位点为Sfi I和Not I，其中SfiI：GGCCCAGCCGGCC，NotI：GCGGCCGC；
步骤4、建立初级单链抗体文库
将重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
步骤5、用原核表达的金黄色葡萄球菌毒力因子GapC作为包被抗原，富集淘选；
步骤6、采用phage ELISA筛选,用原核表达的金黄色葡萄球菌毒力因子GapC作为包被抗原，筛选阳性克隆；
步骤7、将筛选得到的阳性克隆酶切，回收单链抗体编码基因GapC-scFv，与同步酶切的原核表达载体pGEX-4T-1混匀后，14～16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞后，挑取单克隆，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆进行测序；
步骤8、测序正确的克隆进行质粒的提取，再将重组质粒转化到BL21感受态细胞后，挑取单克隆，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆测序，测序正确的即为构建成的单链抗体原核表达质粒pGEX-4T-1-GapC-scFv。
优选地，酶切位点为BamH I和Xho I，其中BamH I：GGATCC，Xho I：CTCGAG。
所述抗体轻、重链的引物分别为VL F、VL R、VH F和VH R，核苷酸序列如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，VLF、VH R分别含有SfiI和NotI酶切位点，VH F、VL R含互补的Linker序列，步骤7中所述菌落PCR引物为VL-F、VH-R，核苷酸序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。
所述PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，25μM上下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL；PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
优选地，步骤5中富集淘选4轮。
本发明的第六个方面是提供一种原核表达质粒pGEX-4T-1-GapC-scFv，包括牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体编码基因。
本发明的有益技术效果：
1、构建重组牛源单链抗体(scFv)时，按照VL-Linker-VH的顺序，将抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH用中间的Linker进行连接，构成的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH，这样连接被本发明证明构建的重组牛源scFv相比较一般的文献报道都是按照VH-Linker-VL的顺序连接更为有效。
2、将筛选到的阳性克隆的单链抗体编码基因(scFv)克隆到原核表达质粒pET32a(+)，构建成单链抗体原核表达质粒pET-32a-GapC-scFv，将该单链抗体与金黄色葡萄球菌混合后，在LB培养基中孵育，能与金黄色葡萄球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC特异性结合，能够用于奶牛乳腺炎的防控的进一步研究，具有良好的应用前景。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是噬菌粒载体pCANTAB5E的结构图；
图2是phage ELISA筛选到的scFv阳性克隆；
图3是原核表达筛选到的scFv阳性克隆基因的扩增片段电泳图；
图4是scFv基因表达的蛋白SDS-PAGE检测图；
图5是scFv基因表达的蛋白Western Bloting检测图；
图6是GapC-scFv抑制金黄色葡萄球菌生长试验。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建
1、采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。用抗凝血提取牛外周血白细胞，用Trizol法(TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。
2、分析已发表文献中的牛抗体编码基因可变区序列，根据其FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH F和VH R用于扩增VH区；VL F和VL R用于扩增VL区。其中，VLF、VH R分别含有SfiI和NotI酶切位点；VH F、VL R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
Figure BDA0003490354690000041
3、VH和VL基因的扩增。以cDNA为模版，VH F、VH R为引物扩增VH基因；VL F、VL R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH2O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作)。
4、scFv基因的获得。通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VL和VH基因连接为scFv基因(VL-linker-VH)，并加入SfiI和NotI酶切位点。
5、初级文库的构建。如附图1噬菌粒载体pCANTAB5E的结构图所示，根据常规分子克隆方法(参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，scFv基因和pCANTAB5E载体分别经SfiINotI双酶切后，将scFv基因***pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒，并将其电转化TG1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于2YT-AG固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；通过菌落PCR计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体M13KO7拯救后建立初级文库。
实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC单链抗体的筛选
1、富集淘选制备金黄色葡萄球菌(ATCC25923)金黄色葡萄球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC原核表达产物，将其作为抗原，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的PBST封闭96孔板，37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100ul 0.2mol/L Gly-Hcl缓冲液(PH＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50ul 1mol/L Tris-Hcl(PH＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌TG1后，重复上述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用PBST洗脱20次后用PBS洗涤20次。
2、phage ELISA筛选从第四轮中随机挑取96个克隆，用M13K07拯救后制备重组噬菌体。将纯化后的金黄色葡萄球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapC原核表达蛋白用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h，用PBST(0.1％Tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，PBST和PBS各洗涤6次；加入HRP-antiM13抗体100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST和PBS各洗涤6次；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设辅助噬菌体M13K07为阴性对照。ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性phage ELISA筛选到的scFv阳性克隆结果如附图2所示，其中BlankControl为空白对照，Negative Control为阴性对照，scFv为阳性克隆，阳性克隆的OD450值很高，接近2.6；而阴性对照的OD450值小于0.4，两者比值大于2.1。
实施例3单链抗体pGEX-4T-1-GapC-scFv的原核表达及纯化
1重组质粒pGEX-4T-1-GapC-scFv的构建以阳性克隆菌株为模板，用特异性引物(如表2所示，下划线为酶切位点)扩增GapC-scFv目的基因，选择限制性内切酶BamH I和XhoI对目的基因和原核表达载体pGEX-4T-1进行双酶切，酶切后连接获得重组质粒，将其转化到DH5α感受态，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序；
表2扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
Figure BDA0003490354690000051
Figure BDA0003490354690000061
测序正确的克隆进行质粒的提取，再将重组质粒转化到BL21感受态细胞后，挑取单克隆，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序，测序正确的即为构建成功的原核表达重组质粒pGEX-4T-1-GapC-scFv，如附图3所示。
2单链抗体GapC-scFv蛋白的纯化重组表达的融合蛋白含有GST-tag，采用GST预装重力柱(采购自上海生工生物工程股份有限公司)对蛋白进行纯化，具体步骤如说明书所示，纯化后再进行蛋白超滤，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE以及Western Bloting分析，蛋白大小为44kD，结果如附图4和5所示，采用Bradford法对蛋白浓度进行测定，根据标准品绘制的标准曲线和样品所测得的OD值，得到单链抗体GapC-scfv蛋白的浓度约为350μg/mL。
实施例4重组scFv序列分析
对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序***到原核表达质粒pGEX-4T-1载体中，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其序列顺序是VL-Linker-VH，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例5检测单链抗体GapC-scFv抑制金黄色葡萄球菌生长试验
检测单链抗体GapC-scFv抑制金黄色葡萄球菌生长试验包括如下两个步骤，分别为：
1、实验方法和步骤
本实验所用试剂为GapC-scFv重组蛋白、金黄色葡萄球菌ATCC25923、4％牛红细胞。
利用0.9％生理盐水将GapC-scFv稀释至10、20、40，50ug/mL，按1：1比例与OD600约为0.6的金黄色葡萄球菌ATCC25923混合，加入200μLLB培养培养基于37℃振动培养，分别测定6h和12h金黄色葡萄球菌的OD600，其中以0.9％生理盐水为阳性对照，青霉素组做为阴性对照，每组设置三个重复。
按照说明书顺序依次加入各溶液，并注意避免产生气泡。
按说明书将所需溶液依次加入后，作用相应时间，酶标仪440nm处测定各孔吸光度。
2、数据统计和实验结果
将10，20，40，50，100ug/mL的GapC-scFv分别与处于对数生长期的金黄色葡萄球菌共同孵育后，结果如附图6所示，6小时后得到不同浓度的GapC-scFv对金黄色葡萄球菌的抑制与生理盐水组比较均有显著差异；而12小时后从浓度为20ug/mL的GapC-scFv均对金黄色葡萄球菌的生长产生显著的抑制效果。
GapC具有金黄色葡萄球菌糖酵解途径中关键酶GAPDH的活性，同时也是金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺炎的重要毒力因子，故通过对GapC毒力因子的单链抗体的制备，利用GapC的单链抗体对金黄色葡萄球菌的生长进行抑制，结果显示，筛选并制备得到的GapC-scFv具有良好的抑制金黄色葡萄球菌生长的效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用
<130> 01335-21298PIX
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Met Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu
1               5                   10                  15
Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly
            20                  25                  30
Arg Tyr Gly Val Gly Trp Tyr Gln Glu Val Pro Gly Ser Gly Leu Arg
        35                  40                  45
Thr Ile Ile Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Ile Asp Gly
                85                  90                  95
Ser Ser Gly Thr Ala Val Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Glu Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Val Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Ser Val Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly
                85                  90                  95
Arg Val Val Ser Thr Thr His Val Ile Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser
        115                 120
<210> 3
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Met Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu
1               5                   10                  15
Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly
            20                  25                  30
Arg Tyr Gly Val Gly Trp Tyr Gln Glu Val Pro Gly Ser Gly Leu Arg
        35                  40                  45
Thr Ile Ile Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Ile Asp Gly
                85                  90                  95
Ser Ser Gly Thr Ala Val Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Arg
        115                 120                 125
Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Glu Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
    130                 135                 140
Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Arg Trp Val
145                 150                 155                 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg
                165                 170                 175
Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile
            180                 185                 190
Thr Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Ser Val Ser Ser Val
        195                 200                 205
Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Arg Val Val Ser Thr
    210                 215                 220
Thr His Val Ile Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser Thr Ser
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gtggcccagc cggccatggc ccaggctgtg ctgactcag 39
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
agatccgccg ccaccggatc caccaccgcc cgagccaccg ccacctagga cggtcagtgt 60
ggt 63
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ggcggtggtg gatccggtgg cggcggatct caggtgcagc tgcg 44
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ttgcggccgc actagtggag gagacggtga ccag 34
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cgcggatcca tggcagtaaa agtag 25
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ccgctcgagt ttagaaagtt cagctaag 28

Claims (6)

1.一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体，其特征在于，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL-Linker-VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL-Linker-VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体，其特征在于，所述牛源单链抗体片段VL-Linker-VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种DNA分子，其特征在于编码权利要求1或2所述的牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体。
4.一种抑制奶牛乳腺炎的药物，其特征在于，该药物包括权利要求1或2所述的牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体。
5.一种用于金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2的抗体，或权利要求3的DNA分子以及与之交联的探针。
6.一种原核表达质粒pGEX-4T-1-GapC-scFv，其特征在于，所述质粒包括权利要求1或2所述的牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体编码基因。
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