CN105143442A - 用于体外干细胞增殖和组织再生的生长基质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于干细胞增殖的多功能2-D和3-D基质，特别地，设计基于脱乙酰壳多糖的生物材料支架以通过稳定重组蛋白、成纤维细胞生长因子以保持干细胞的基本性质来促进自原始神经前体的CNS再生。通过加入细胞外基质蛋白纤连蛋白或小肽RGD或IKVAV进一步修饰基质。还公开了一种制造可注射的多功能微球支架的方法，所述支架适合于作为用于细胞移植以修复创伤性脑损伤的载体。

Description

用于体外干细胞增殖和组织再生的生长基质
相关申请的交叉引用
本申请依照35U.S.C.119(e)要求提交于2013年1月28日的美国临时申请第61/757,378号的权益，其内容以其整体并入本文。
政府支持声明
本发明在新泽西州脑损伤研究委员会授予的合同09-3207-BIR-E-2和CBIR12FEL025的政府支持下完成。
技术领域
一般地，本发明涉及组织工程领域。特别地，本发明涉及重组蛋白-成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)的稳定化，以促进其在干细胞中的生物学活性，以及用于培养干细胞的方法。
背景技术
干细胞疗法是组织工程和再生的有前景的领域，但是其在修复中枢神经***(CNS)尤其是严重损伤后的大脑中仅表现出了有限的成功。CNS损伤常引起广泛的特征在于神经元和神经胶质细胞死亡的组织损伤，其中，存在实质上无功能的内源性神经干细胞(NSC)的细胞替换。在中风动物模型中，据报道，少于1％的损毁神经元被室下区(SVZ)的内源性神经前体所代替。在创伤性脑损伤(TBI)的动物模型中也获得了类似的结果。Salman等人(JNeurotrauma21:283–292,2004)观察到SVZ中的神经前体(NP)重新填充到机械性损伤的皮层中。损伤区域附近的SVZ细胞产生了非常小比例的新神经元(未定量)，而大部分的移植细胞成为星形胶质细胞。直接移植NP到脑部病变的半影(penumbra)中产生很小的进展(Sanberg等人,BrMedBull101:163-181,2012)。大多数移植的细胞不能存活(Shindo等人,JMedInvest53:42–51,2006)或分化成神经胶质细胞而不是神经元(Shear等人,BrainRes1026:11–22,2004)。例如，Shear等人(2004)发现通过移植NP产生了NG2阳性神经胶质细胞，并且Sun等人(ExpNeurol216:56–65,2011)观察到他们移植的大部分前体成为了Olig2阳性细胞(可能的神经胶质细胞)。Ma等人(MolMedRep4:849–856,2011)报道了仅有4％的他们所移植的NP是NSC，从而仅有11％分化成表达神经元标记物的细胞。直接移植附着到支持基质上的干细胞到病变部位可能更有效地促进再生。Tate等人(JTissueEngRegenMed3:208–217,2009)示出了在TBI后移植到支持性纤连蛋白和层粘连蛋白基质中的NP的长期生存的改善。接受这些移植的动物相比于未接受NP的受伤小鼠，在空间学习任务中显示出改善的能力(Tate等人，2009)。
利用材料工程学和分子生物学的原理，组织工程师正在开发有机替代物以支持或替换部分故障组织或器官以创建替代物。创建这些替代物的常见方法是使用活细胞、支架和信号分子。Evans(SeminSurgOncol19:312–318,2000)鉴定了对于神经组织支架而言必要的四个组分：生长促进蛋白、细胞外基质(ECM)、支持细胞(通常是干细胞)和促进轴突再生的分子。然而，干细胞不仅需要与细胞外基质以及生长促进蛋白相接触以增殖，还需要保持干细胞的基本特性(干性(stemness))。通过整联蛋白受体发挥作用的细胞外基质因子如层粘连蛋白和纤连蛋白已被证明对于干细胞自我更新是重要的。具有对于刺激胚胎和成体干细胞的增殖而言所必要的生长促进蛋白，FGF-2，已被证明是至关重要的。
CNS的创伤性损伤适合于应用生物材料支架，这是因为存在细胞和ECM的广泛的且局部的损失。支架可以作为移入的细胞和宿主组织的人造基质和支持性网络。此外，其作为防止神经胶质疤痕的物理和化学屏障，其抑制轴突再生是公知的。ECM还是细胞功能的重要调节物。ECM和整合素的相互作用管理着细胞过程如增殖、存活、迁移和分化。
因此，持续需要设计用于神经组织的再生疗法以开发模拟天然ECM的生物材料***。应设计这样的生物材料***来获得高度适合作为用于细胞移植以修复创伤性脑损伤的载体的支架。
发明内容
由于上述问题、需求和目标，本发明人已设计了本发明的实施方式，其中多个干细胞可以维持在2-D和3-D基质上，所述基质已被修饰以稳定其中的生长促进蛋白。因此，可以使用这些基质(或生物材料支架)，以例如促进CNS再生。
在一个示例性实施方式中，培养干细胞群的方法依赖于将成纤维细胞生长因子(FGF)固定于培养板的表面上。此方法通常有以下步骤：(ⅰ)用脱乙酰壳多糖溶液包被腔室底部；(ii)干燥脱乙酰壳多糖溶液以形成脱乙酰壳多糖层；(iii)中和脱乙酰壳多糖层的酸度；(iv)将肝素结合到脱乙酰壳多糖层；(v)使用京尼平(genipin)将肝素交联到脱乙酰壳多糖层；(vi)结合生长促进蛋白；(vii)应用附着组分(例如，细胞外基质蛋白或细胞外基质肽)的溶液；(viii)将附着组分结合到脱乙酰壳多糖，其创建多功能膜；和(ix)将干细胞群接种到腔室并培养干细胞。方法还可以在添加各个组分间有洗涤/漂洗的步骤。在一个优选的实施方式中，生长促进蛋白是一种或多种生长因子，如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。不受理论束缚，铺在所公开的多功能基质上的干细胞能保持在多能和增殖状态而不提供可溶性的生长促进蛋白。此外，相比于保持在补充有可溶性的生长促进蛋白如FGF-2的培养基中的纤连蛋白包被的基质上的细胞，干细胞可以保持较小的成熟度和更高的增殖性。
使用所公开的方法培养的干细胞高度适合于细胞移植以修复组织损伤，如创伤性脑损伤。在一个实施方式中，本发明提供了通过向有治疗需求的受试者施用多功能基质来修复受伤的哺乳动物组织的方法。多功能基质包含脱乙酰壳多糖-(京尼平)-生长促进蛋白结合配偶体，其是固定其上的生长因子(优选FGF-2)上，单独的或与附着组分相组合。在一个实施方式中，附着组分是纤连蛋白。在另一个实施方式中，附着组分是肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)或异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)。
在示例性实施方式中，提供具有带有固定化的FGF-2、肝素、京尼平和脱乙酰壳多糖的支架的多功能基质。在另一个示例性实施方式中，提供了具有脱乙酰壳多糖的支架、带有固定化的FGF-2和纤连蛋白的京尼平连接的肝素的多功能基质。
在一个实施方式中，提供了制造可注射的多功能微球支架的方法以获得高度适合于作为细胞移植载体以修复创伤性CNS损伤的支架。在示例性实施方式中，作为细胞移植的载体，脱乙酰壳多糖溶液被电喷雾到凝固浴中以产生微球(范围：30-100μm)，其随后可进行修饰。接种到多功能微球中的原始神经前体可以在培养基中增殖，且包含细胞的微球足够小，使得可以使用26直径(gauge)的汉密尔顿注射器将其注射进先前经历伤害的CNS的区域。因此，这一多功能支架可以用作细胞和生长因子的递送载体以促进CNS损伤后的神经组织损伤的再生。
在下述实施例中描述了优选的方法和材料，其旨在说明而不是限制本发明。本领域技术人员将获悉与本文所描述的相似或等同并且可以用于本发明的实践或测试中的方法和材料。除非另有限定，所有本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的技术人员所通常理解的相同的含义。本发明的其它特征和优点将通过详细描述和权利要求而呈现。
附图说明
图1：对RG3.6细胞的形态和增殖的基质效应。RG3.6(神经干细胞系)生长于补充有B27和每天10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中5天。用F-肌动蛋白和DAPI染色细胞。使用SigmaScanPro测量离核的突起长度。人工计数离核的突起数。误差棒表示SEM。用Tukey’sposthoc通过ANOVA测定统计学显著性。(A)生长于具有各种吸附的肽的脱乙酰壳多糖包被的皿中的RG3.6细胞。20X放大。Ln：层粘连蛋白，Fn：纤连蛋白，Gel：明胶，PLL：聚-L-赖氨酸，Col：胶原蛋白，C：对照(仅脱乙酰壳多糖)(B)***＝P<0.001比对照且◆◆◆＝P<0.001比层粘连蛋白和明胶。(C)***P<0.001比PLL和对照，*＝P<0.05比PLL和对照，以及◆◆＝P<0.01比层粘连蛋白胶原和明胶。D)用核抗体Ki67和DAPI染色细胞。比例尺，100μm。
图2：固定化的FGF-2对NSC的增殖和存活的作用。次级NSC作为神经球生长于补充有B27+/-10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中2天。解离后，细胞生长于有或没有肝素(0.5mg/mL)-京尼平(0.45mM)和FGF-2(1000ng/mL)的脱乙酰壳多糖-纤连蛋白包被的96孔板上。对照每天仅接受FGF-2。(A)MTT分析(B)C-Fn-FGF-2(可溶的)对照(C)C-H-G-Fn-FGF-2(结合的)(D)CHG-Fn。C-Fn：脱乙酰壳多糖-纤连蛋白。CHG-Fn+：脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平-纤连蛋白+结合的FGF-2。CHG-Fn-：脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平-纤连蛋白，无FGF-2。比例尺：100μm。
图3：固定化的FGF-2对维持NSC的干性和分化的作用。原代NSC生长于补充有B27±FGF-2的DMEM/F12中。用脱乙酰壳多糖和纤连蛋白包被皿，有或没有肝素-京尼平-FGF-2固定化(1μg/mL)。对照每天仅接受FGF-2。在4DIV后收集细胞并分析分化。(A)相衬图像20X。(B)在无FGF-2培养基中分化7DIV的二次传代NSC的三潜能(Tripotentiality)。(C)分化条件的Western印迹分析：BLBP：脑脂质结合蛋白，TUJ1：βIII-微管蛋白，GFAP：胶质纤维酸性蛋白，PCNA：增殖细胞核抗原，SOX2：SRY-盒2，MAP-2：微管相关蛋白2。(D)图表代表了平均的IOD(积分光密度)比例尺，100μm。
图4：可移植修饰的微球的表征。将通过离子凝结和电喷雾形成的微球与通过同轴气流或无空气形成的球体比较大小。(A)微球制备的示意图。(B)电喷雾脱乙酰壳多糖微球的20X相衬图像。(C)电喷雾微球的尺寸分布。(D)脱乙酰壳多糖微球直径的频率分布。(E)共价交联至脱乙酰壳多糖微球的肝素的甲苯胺蓝染色。(F)NSC生长于用肝素-京尼平-FGF-2修饰并用纤连蛋白吸附的电喷雾微球上。
图5：多功能微球很好地适合于CNS损伤的细胞替代疗法。(A)RG3.6细胞在体外分化并针对βIIITub(βIII-微管蛋白)、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和GFP(绿色荧光蛋白)染色。(B)在创伤性脑损伤后7天，接受粘附有RG3.6细胞的多功能微球支架移植物的动物的脑切片的免疫荧光。针对GFP、巢蛋白和DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色。(c)仅针对GFP染色的切片。(D)仅针对巢蛋白染色的切片。(A)20X下，(B-D)10X放大倍数下获取。
图6：肝素在2D脱乙酰壳多糖膜和3D微球上的离子和共价固定。(A)脱乙酰壳多糖、肝素和纤连蛋白的结构。(B)肝素固定于通过使用京尼平离子地和共价地脱乙酰壳多糖包被的孔上。用甲苯胺蓝染料染色。(C)肝素、脱乙酰壳多糖和京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素复合物的FT-IR光谱。箭头指明来自京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素复合物的肝素和脱乙酰壳多糖的官能团。
图7：在京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素复合体膜上的FGF-2结合和神经干细胞培养。(A)不同浓度下结合的FGF-2的量。(B)不同浓度下结合的FGF-2的效率。(C)各种基质条件下的MTT分析。(D-G)各种基质上的神经干细胞的形态。比例尺：100μm。
图8：固定化的肽对于神经干细胞的增殖和存活的作用。用脱乙酰壳多糖包被培养板。然后进一步修饰板。一些孔进一步包被肝素-京尼平，然后用FGF-2(1μg/ml)孵育，再用粘合肽进行吸附。作为对照的孔仅每天在脱乙酰壳多糖-纤连蛋白条件下接受可溶性FGF-2。然后将孔接种RG3.6神经干细胞系并生长3天。使用MTT分析测量以下条件间的细胞生长：纤连蛋白(黄色)、RGD(蓝色)、IKVAV(红色)、RGD+IKVAV(紫色)和对照(C-FN，绿色)。所有肽以等摩尔浓度(45.45nM)孵育。RGD：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；IKVAV-异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸。
图9：在创伤性脑损伤中的多功能支架的示意图。冠状插图描绘了脑损伤修复的模型(左)。提供了方框区的放大示意图(右)。上：在受控皮质冲击后7天，注射到病变腔室中的修饰的脱乙酰壳多糖微球上的0天的绿色荧光蛋白(GFP)+脑室区(VZ)细胞。中：神经形成的再现。GFP+VZ细胞增殖并产生新皮质(eocortical)细胞。球降解。下：微球完全降解；GFP+神经元替换由于损伤所失去的神经元。
具体实施方式
公开了一种新的多功能生长基质，其可用作哺乳动物组织再生和修复的生物材料支架。在一个实施方式中，生长基质是支持干细胞扩增的2维多功能支架。例如，2维多功能支架可用于培养人类胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。在另一个实施方式中，生长基质是支持干细胞扩增的3维多功能支架。例如，此类3D支架可用于作为移植干细胞的载体。本文所公开的多功能基质通过将生长促进蛋白附着到培养板的表面上，从而稳定生长促进蛋白以促进干细胞的增殖和多能性。基质也可以通过附着附着组分(如细胞外基质蛋白质)来进行进一步修饰。此类生物材料支架促进自原始细胞的组织再生。
在一个示例性实施方式中，所公开的基质高度适合于体外增殖神经干细胞。与现有技术中可用的***/方法相比，所公开的基质以降低的细胞饲喂(seeding)频率(无需每天饲喂)促进干细胞的增殖和多能性，同时增殖的和未分化的细胞的比例显著大于标准生长条件下所增殖的细胞。本文所使用的术语“基质”和“支架”可互换并且是指能支持2D和/或3D细胞生长的结构。
可以由所公开的生长基质所支持的干细胞包括但不限于胚胎干细胞、多能干细胞、成体干细胞、脂肪来源的干细胞、间质干细胞、造血干细胞或脐带血干细胞、少突胶质细胞祖细胞或FGF反应祖细胞，其在存在或不存在其它生长促进蛋白的情况下，都将生长于附着基质上。在一个优选的实施方式中，干细胞是哺乳动物干细胞，更优选限制为啮齿动物、灵长类动物或人类的干细胞。在另一个实施方式中，可以由所公开的生长基质所支持的干细胞还包括诱导的多能干细胞(iPSC)或iPSC来源的干细胞。
在另一个实施方式中，3D支架用作在支持性基质上移植干细胞的载体。在进一步的实施方式中，干细胞附着于支架并被移植到因脊髓、创伤性脑损伤或中风产生的病变中以重建关键神经回路。在一个实施方式中，干细胞附着于支架并被移植到非神经组织中。在进一步的实施方式中，干细胞是间质干细胞。在另一个实施方式中，非神经组织是骨、软骨、肝脏、胰脏、心脏、皮肤、膀胱、骨骼肌、肺或肾。
所公开的基质或支架的骨架由脱乙酰壳多糖制造，其衍生自几丁质的碱性脱乙酰作用。此脱乙酰壳多糖骨架提供了葡糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖的重复单元。脱乙酰壳多糖是天然的聚糖，其在结构上与糖胺聚糖相类似，其易于的修饰。
其丰度仅次于纤维素，这使其成为一种具有成本效益的材料。脱乙酰壳多糖易溶解于弱酸溶液如乙酸。一旦溶解为粘性液体，脱乙酰壳多糖可用于包被细胞培养皿的表面或用于形成复杂的2D/3D支架。CNS损伤的形状或尺寸并不统一；因此可注射并模制到损伤组织的支架是必要的。脱乙酰壳多糖的化学结构容易允许对其化学结构进行修饰，从而使其成为一种非常有吸引力且多用途的材料。
进一步修饰所公开的其中具有脱乙酰壳多糖骨架的基质，以生物学的和稳定的形式固定生长促进蛋白，其是通过使用京尼平(一种天然存在的且生物安全的交联剂)将生长促进蛋白结合配偶体共价连接到脱乙酰壳多糖上来实现。具体地，所公开的基质是由(i)脱乙酰壳多糖，(ii)京尼平，(iii)生长促进蛋白结合配偶体和(iv)生长促进蛋白所制备。优选地，所公开的基质还包含(v)附着组分。在一个实施方式中，基质包括(i)脱乙酰壳多糖，(ii)生长促进蛋白结合配偶体，(iii)京尼平，(iv)生长促进蛋白和(v)附着组分。在优选的实施方式中，方法在添加一种或多种组分的过程间还具有一个或多个洗涤/漂洗步骤。在一个优选的实施方式中，基质包括具有纤连蛋白的支架、固定化的FGF-2、肝素、京尼平和脱乙酰壳多糖。在一个更优选的实施方式中，基质包含脱乙酰壳多糖的支架，其经京尼平连接肝素到脱乙酰壳多糖并固定FGF-2和纤连蛋白在其上。不受理论束缚，在一个实施方式中，FGF-2和纤连蛋白通过形成一个或多个非共价桥如静电、范德华力和疏水作用固定于肝素上。
虽然，所公开的基质中使用的交联剂优选是京尼平，基质也可用戊二醛、甲醛、三聚磷酸盐(TPP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、β-甘油磷酸酯(βGP)、磷酸钙、柠檬酸盐、硫酸盐、铁(III)、Ho-166、聚乙二醇二醛二乙基缩醛(PEGDDA)、草酸、乙二醛、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺所制备，而不脱离本发明的精神。
生长促进蛋白结合配偶体选自肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素类似物(参见例如Guimond,S.E.等人，IntJExpPathol.2004August；85(4):A62–A63；其整体通过引用并入本文)。优选地，生长促进蛋白结合配偶体是肝素。
生长促进蛋白没有特别的限定，只要其能促进所应用的干细胞生长。生长促进蛋白选自激活素、肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子(AMF)、钙黏着蛋白、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮调节素、***(EPO)、卵泡抑素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子(GDF)、肝癌来源的生长因子(HDGF)、白细胞介素、***I或II(IGF)、白血病抑制因子(LIF)、迁移刺激因子(MSF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白(NT-3,4/5,6)、纺锤蛋白、Notch受体配体、头蛋白、制瘤素、SLIT、干细胞因子(SCF)、音猬因子(SHH)、轴突生长促进因子(NEGF)、胎盘生长因子(PlGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)或WNT。在一个优选的实施方式中，生长促进蛋白可以易于与肝素形成非共价相互作用，这包括但不限于脑来源的神经营养因子(BDNF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2、4、7、8、10、18)之一、肝素结合表皮生长因子(HbEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经调节蛋白(NRG)、神经突生长促进因子(NEGF1/2)、血小板来源的生长因子(PDGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。在一个优选的实施方式中，生长促进蛋白选自成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)或肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)。在更优选的实施方式中，生长促进蛋白是成纤维细胞生长因子(FGF)，甚至更优选地是FGF-2。
附着组分是细胞外基质蛋白、细胞外基质肽、附着糖(adhesivesaccharide)或其组合。细胞外基质蛋白选自纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、原纤蛋白、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤维蛋白溶酶、聚蛋白多糖、短蛋白聚糖、肌腱蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白多糖、多配体蛋白聚糖-1(蛋白聚糖)、IGF结合蛋白或其组合。附着糖类优选是纤维素。细胞外基质肽是选自聚-DL-赖氨酸如PDL或PLL、聚-DL-鸟氨酸、短肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)或短肽序列IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val,SEQIDNO：1)的肽。在一个优选的实施方式中，细胞外基质肽是RGD或IKVAV(SEQIDNO：1)。本领域技术人员将会理解，此类肽可以被扩展/修饰，而不脱离本发明的精神和范围。例如，RGD还包括序列RGD-S(SEQIDNO：2)、G-RGD-S(SEQIDNO：3)、G-RGD-SP(SEQIDNO：4)、G-RGD-TP(SEQIDNO：5)、N-MeGly-RGD-SP(SEQIDNO：6)、G-RGD-SPK(SEQIDNO：7)、RGD-SPASSKP(SEQIDNO：8)和ACDC-RGD-CFCG(SEQIDNO：9)。例如，IKVAV(SEQIDNO：1)还包括序列CSRARKQAAS-IKVAV-SADR(SEQIDNO：10)(及三氟醋酸盐)和S-IKVAV(SEQIDNO：11)。
当研究人员从工作台移到诊所时，存在无异种培养***的实际需要。理想情况下，干细胞衍生、建立、细胞银行和未分化扩增应全部使用无异种组分(即不来源于活组织)来完成。通过使用细胞外基质肽的肽序列如RGD和IKVAV(SEQIDNO：1)，本领域技术人员能够避免与使用自组织或培养的细胞中提取的细胞外基质组分相关的成本和潜在污染。
设计所公开的多功能基质时，目的是使生长促进蛋白缓慢释放到培养基中以刺激生长。然而，在评估本发明的基质时，惊奇地发现几乎没有生长促进蛋白被释放。此外，铺在多功能基质上的干细胞保持在多能增殖状态至少3天而不更新生长促进蛋白。相比于保持在缺少束缚的生长促进蛋白的类似支架中的细胞，生长于基质上的细胞仍保持较小的成熟度和更高的增殖性。此外，当与所公开的基质结合约7天时，生长促进蛋白可保持生物活性。相比之下，现有技术的基质不具有稳定固定化的所限定本性的生长促进蛋白，并因此不适合于治疗用途。因此，本文所述基质的一大优势是，其可以使用限定的组分进行配制，这将稳定那些组分的生物活性，并且其可以更均匀的、增殖的和原始的状态维持干细胞。本领域技术人员还公知的是，使用现有方法增殖干细胞需要每天饲喂细胞，而所公开的基质降低了每天饲喂细胞的耗时且乏味的工作，并同时保持其干性。
所公开的基质可以通过下述进行制备：(i)用脱乙酰壳多糖溶液包被腔室底部；(ii)干燥脱乙酰壳多糖溶液以形成脱乙酰壳多糖层；(ⅲ)通过施加碱性水溶液(通常是氢氧化钠或氢氧化铵)并冲洗以去除碱性水溶液来中和脱乙酰壳多糖层的酸度；(ⅳ)将生长促进蛋白结合配偶体结合至脱乙酰壳多糖层；(v)使用京尼平将生长促进蛋白结合配偶体交联至脱乙酰壳多糖层；(ⅵ)施加生长促进蛋白的溶液；(ⅶ)使生长促进蛋白附着，(ⅷ)施加附着组分溶液；和(ⅸ)使附着组分附着，其创造多功能膜。为了支持干细胞的扩增，方法进一步具有步骤：(x)将干细胞群接种至腔室并培养干细胞。虽然，以步骤顺序的方式提供了制备所公开的多功能基质的方法，显而易见的是，本领域技术人员可以修改此顺序，而仍然获得所公开的多功能基质。
置于所公开的基质上的干细胞保持在多能和增殖状态，而不需要提供可溶性生长促进蛋白。此外，相比于保持在补充有可溶性的生长促进蛋白(例如，可溶性的FGF-2)的培养基中的纤连蛋白包被的基质上的细胞，所公开的基质上的干细胞保持更少的成熟度和更高的增殖性。在一个优选的实施方式中，生长促进蛋白结合配偶体是肝素，且生长促进蛋白是一种或多种生长因子如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。在更优选的实施方式中，基质由脱乙酰壳多糖的支架、具有固定化的FGF-2的京尼平连接的肝素和纤连蛋白制备。
所公开的方法可制备高度适合于作为用于细胞移植以修复组织损伤(如CNS损伤)的载体的支架。在一个实施方式中，本发明提供了在培养基中生长干细胞的方法，其然后可用于修复受损伤的哺乳动物组织。在另一个实施方式中，本发明提供了通过利用支架组合物将干细胞递送到受试者中来修复受损伤组织的方法。支架组合物是由脱乙酰壳多糖、京尼平固定化的生长促进因子结合配偶体、生长促进蛋白和附着组分制备。在一个优选的实施方式中，支架组合物包括脱乙酰壳多糖、具有固定化FGF-2的京尼平连接的肝素和纤连蛋白。
在一个实施方式中，提供了制造可注射的多功能微球支架的方法以获得高度适合于作为用于细胞移植以修复脑损伤的载体的支架。在示例性的实施方式中，作为用于细胞移植的载体，脱乙酰壳多糖溶液被电喷雾到凝固浴中，以产生微球(范围：30-100μm)，其随后可进行修饰。接种到多功能微球中的神经干细胞可以在培养基中增殖，且包含细胞的微球足够小，使得可以使用26直径的汉密尔顿注射器将其注射进先前经历伤害的脑部。因此，这一多功能支架可以用作细胞和生长因子的递送载体以在脑损伤后促进神经组织损伤的再生。
在一个实施方式中，微球通过添加纤连蛋白来修饰。纤连蛋白不仅有助于细胞对脱乙酰壳多糖的附着，还可以提高其增殖(如图1和2所示)并保持其干性(如图3所示)，这归因于纤连蛋白的分子结构。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，其首先在纤连蛋白中被鉴定出来，其包含于其它的ECM蛋白如胶原蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)、纤维蛋白原、明胶和某些层粘连蛋白中。与RGD肽在提高神经干细胞增殖中的作用相一致，生长于纤连蛋白包被的基质上的RG3.6细胞表现出较高的有丝***指数(参见图1)。胶原蛋白也具有RGD序列，但当附着到胶原蛋白上时，细胞增殖不显著。这可能是归因于当结合到脱乙酰壳多糖时，胶原蛋白的负电荷以及形成的凝胶状包衣。重要的是，RGD序列结合至α5β1整联蛋白受体，其胞内氨基末端影响细胞迁移、增殖、自我更新和分化。已观察到，在皮质祖细胞中降低α5β1的表达会增加其分化。观察到特异性蛋白对α6β1的相似的作用。这一受体被纺锤蛋白-4和层粘连蛋白γ1激活。这些蛋白的减少会增加NSC的分化。这一概念应用于使用具有固定化的RGD的基于水凝胶的透明质酸的用于脑组织工程的体内应用。皮质损伤后使用透明质酸-RGD支架的移植增强了基质中的细胞的浸润性和血管生成，同时抑制神经胶质疤痕的形成。也观察到在神经突延伸中的增加。如图8所示，纤连蛋白可被具有可比性能的RGD肽所取代。
可以设计本文所公开的修饰的脱乙酰壳多糖微球以允许将FGF-2束缚在支架的表面，其不同于现有技术的使用球体作为包封生长因子或可移植细胞的方法的***。FGF-2是用于神经前体并维持这些细胞在原始状态下的已知的存活因子。FGF-2已被证明在TBI后能增加脑室下区中的干细胞/祖细胞的数量。
通过将FGF-2固定到脱乙酰壳多糖的表面上，其以更多的生物学活性形式(归因于肝素的结合)呈递给细胞，且当以结合而不是以可溶性的形式从介质供给或从封装中释放时更易到达附着的细胞。本发明人已发现，保持在多功能膜(基质)上的细胞在涂布后至少3天不需要进行饲喂，但增殖和未分化的细胞比例显著大于在标准生长条件下增殖的细胞的比例。干细胞通常需要每天饲喂；然而，利用所公开的基质，细胞可以明确得无人照管至少3天。
本领域技术人员理解，本发明并不限于具体示出的和本文所描述的内容。而是，本发明的范围是由随后的权利要求所限定。还应理解的是，上述描述仅代表了实施方式的说明性实例。为了易于读者理解，上述描述集中于可能的实施方式的代表性实例，此实例教导了本发明的原理。其它实施方式可能会产生来自不同实施方式的各部分的不同组合。
实施例
实施例1(干细胞形态、增殖和分化)
神经干细胞：使用两种细胞类型以评估修饰的脱乙酰壳多糖膜和微球的功能性：永生化细胞系RG3.6，其是由第13.5天的胚胎绿色荧光蛋白阳性(GFP+)的大鼠新皮质细胞所创造的；以及自第13.5天的胚胎EGFP(SD-Tg(GFP)Bal/2Rrrc(RRRC:0065))的大鼠新皮质中收获的原代NSC。对于具体的实验，使用RG3.6细胞系而不是原代细胞以消除使用异源原代细胞培养物可见的多个变量并在基质优化中实现更高的一致性。将RG3.6和原代NSC维持在补充有B27、庆大霉素(50μg/mL)、脱辅基转铁蛋白(50μg/mL)和rhFGF-2(10ng/mL+1ng/mL硫酸乙酰肝素)的DMEM/F12培养基中。其生长为神经球或在聚鸟氨酸/纤连蛋白包被的皮氏培养皿上生长为附着的单层。
脱乙酰壳多糖膜：在2％乙酸(v/v)中制备3％w/v的低分子量脱乙酰壳多糖溶液。脱乙酰壳多糖(低分子量，约50kDa)购自Sigma(StLouis,MO)。将溶液吸移到两孔玻璃室载玻片(NUNC,Rochester,NY)以包被腔室的底部。去除剩余溶液并在室温将载玻片干燥2-3h。用0.5MNaOH(Sigma；StLouis,MO)中和脱乙酰壳多糖包衣10分钟，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次5分钟。随后将脱乙酰壳多糖用在dH2O中制备的纤连蛋白(10μg/mL)、层粘连蛋白(20μg/mL)、明胶(0.1％)、I型胶原蛋白(0.1mg/mL)或聚(L-赖氨酸)(0.05mg/mL)的溶液进行吸附。
干细胞形态、增殖和分化：
为了确定哪个表面修饰物最能保持NSC的形态，RG3.6细胞系接种于吸附有纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、I型胶原蛋白或聚(L-赖氨酸)的脱乙酰壳多糖并与生长于不具有吸附的基质因子或聚合物的脱乙酰壳多糖上的细胞相比较。生长4天后，将细胞固定并针对肌动蛋白染色并用DAPI复染色。NSC的形态明晰，具有少量的长突起。当生长于具有各种附着蛋白的脱乙酰壳多糖基质上时，RG3.6细胞有不同的响应。包被有纤连蛋白的基质促进了NSC的形态(参见图1A、1B和1C)。保持在纤连细胞上的RG3.6细胞具有1-3个突起，其是很长且直的(49±5μm)且其缺少分支。生长于层粘连蛋白上的RG3.6细胞也具有突起，其在数量和长度上很小(35±3μm)，但其短于生长于纤连蛋白上的细胞的突起。生长于I型胶原蛋白上的细胞(11±1μm)、生长于明胶上的细胞(31±2μm)和生长于未修饰的脱乙酰壳多糖上的细胞(13±1μm)具有短的突起。生长于聚(L-赖氨酸)上的细胞具有大量的短的频繁分支的突起(17±1μm)。
干细胞增殖：将RG3.6细胞针对Ki67染色，其是经历有丝***的细胞的标记物。这些研究表明，在所有基质条件下生长的RG3.6细胞的有丝***指数是高的且仅有轻微差异，但两个ECM蛋白，纤连蛋白和明胶分别产生了92±1％和93±2％的最高有丝***指数(参见图1D)。生长于其它基质上的细胞的有丝***指数是：层粘连蛋白，89±2％；胶原蛋白，87±4％；聚(L-赖氨酸)，77±5％和未修饰的脱乙酰壳多糖，82±1％。
总之，脱乙酰壳多糖对于NSC是无毒的(数据未显示)，但细胞需要附着肽以在支架上有效生长。在所有的脱乙酰壳多糖基质上，增殖率是高的，但当脱乙酰壳多糖用纤连蛋白或明胶包被时，其明显更高。
实施例2(支架效率)
通过使用MTT分析测量细胞生长并分析NSC的形态来验证结合到支架上的人成纤维细胞生长因子-2(hFGF-2)的生物活性。来自牛肠粘膜的肝素钠盐购自Sigma(StLouis,MO)。重组人成纤维细胞生长因子-2(rhFGF-2)购自Peprotech(RockyHill,NJ)。京尼平购自WakoPureChemicalIndustries,Ltd.(Osaka,日本)。
细胞生长：用50μL的3％脱乙酰壳多糖包被96孔板并空气干燥过夜。用肝素(0.5mg/mL)和京尼平(0.45mM)在室温下过夜孵育选择包被的孔。在50mMHEPES+0.9％NaCl溶液(HBS)(VWR；WestChester,PA)中制备肝素-京尼平溶液。其它孔仅在HBS中孵育过夜。翌日，于37℃将纤连蛋白(10ug/mL)加入到各个孔中4小时以增强到脱乙酰壳多糖和修饰的脱乙酰壳多糖基质的细胞附着。随后，将1μg/mL的FGF-2加入到一半的脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平孔中。其它孔未经处理。在高(5×104个细胞/孔)和低(2×104个细胞/孔)的密度下将NSC接种到各个条件中。在脱乙酰壳多糖-纤连蛋白条件下的细胞在培养基中每日接受FGF-2，因为这些细胞在体外增殖时将会变得正常。在多功能支架上的细胞没有接受补充有FGF-2的培养基。将前一条件作为对照。培养物生长3天后，使用MTT分析来分析细胞的生长。
形态分析：NSC是具有典型的2个很长的突起的形态明晰的细胞类型。使用SigmaScanPro软件(SystatSoftware,SanJose,CA)测量细胞突起长度。人工计算从各个细胞延伸出的突起的平均数量。使用具有Tukeypost-hoc的ANOVA进行统计分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
MTT还原分析：MTT分析是比色分析，其测量的是细胞中黄色底物3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑(MTT，购自Sigma,StLouis,MO)还原成不溶性的紫色甲月替(formazan)产物。简言之，将10μL的PBS中的5mg/mL的MTT溶液加入到100μL培养基中并于37℃在细胞培养箱中孵育2-4h。通过加入100μL包含50％(w/v)N,N二甲基甲酰胺和20％SDS(pH4.8)的溶液终止反应。在培养箱中于37℃将板保持过夜并使用微量滴定板读数器(PowerWave200,Bio-tekInstruments)确定560-690nm处的吸收。
细胞分化分析：为了产生分化的细胞，将NSC接种到聚-d-赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿并在培养基中维持24h，然后将FGF-2从培养基中移除，使细胞在随后的4天进行分化。为了使用标准培养条件评估增殖的细胞，将NSC在培养基中接种到具有吸附的纤连蛋白(10μg/mL)的脱乙酰壳多糖包被的培养皿。每天更换百分之十的培养基并用包含10XFGF-2的培养基(100ng/mL)等体积替换。为了评价接种到多功能支架上时NSC的生长和分化，将NSC接种到具有共价结合的肝素和吸附的纤连蛋白的脱乙酰壳多糖包被的皿中。将一个1μg/mL的FGF-2(在1mg/mL的BSA溶液中)加入到皿中并在室温下孵育3小时。然后将FGF-2溶液吸出并轻柔漂洗2次以去除任何未结合的生长因子。将NSC接种到板上并在基础生长培养基(其缺少可溶性的FGF-2)中保持4天。在裂解缓冲液中将细胞从板上刮下并贮存直至进行WesternBlot蛋白分析。使用BCA分析(ThermoScientific,Rockford,IL)测定蛋白浓度。分析WesternBlot：使用1：1000的兔抗-BLBP抗血清(Abcam,CambridgeMA)分析干细胞和祖细胞标记物脑脂质结合蛋白(BLBP)；使用1：200的兔抗-Sox2抗血清(Chemicon,Temecula,CA)分析性别决定区域Y-盒2(Sox2)；使用1：1000的兔抗-MAP2(Sigma)分析β微管蛋白(TUJ1)(Covance,Princeton,NJ)、1：200的分析微管相关蛋白2(MAP2)。
干细胞的形态和生长：当生长于更加高度修饰的脱乙酰壳多糖基质上时，RG3.6细胞和原代NSC反应不同。细胞优选添加京尼平交联的肝素、纤连蛋白和固定化的FGF-2至脱乙酰壳多糖基质上。当生长于此复合体上，MTT分析返回比生长于相同复合体但没有固定化的FGF-2的NSC高2.5倍的值(参见图2A)。在显微镜下也很明显的是，生长于具有固定化的FGF的支架条件上的细胞数量高于每天接受培养基中的FGF-2的脱乙酰壳多糖-纤连蛋白条件下的细胞数量(参见图2B-2D)。给让本发明人惊喜的是，相比于用于增殖NSC的标准生长条件，固定化的FGF-2在促进NSC细胞增殖方面更优越。NSC细胞在培养基中通常生长为单层，接受每天更换的培养基中的可溶性FGF。
为了确定支架是否也增强非永生化的NSC的生长，使原代NSC生长于纤连蛋白上或包括脱乙酰壳多糖、京尼平交联的肝素、FGF-2和纤连蛋白的多功能膜上。此多功能膜促进NSC的增殖和多能性，同时降低饲喂细胞的频率(参见图3A-3B)。作为其NSC表型的测量，通过Westernblot评估脑脂质结合蛋白(BLBP)的水平(参见图3C-3D)。作为其增殖状态的指数，测量增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白水平。测量III类β微管蛋白(TUJ1)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达以评估细胞是否向神经元分化，并通过测量胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的水平来测定细胞是否向星形胶质细胞分化，或通过测量SRY盒-2结合蛋白(SOX2)的水平来测定细胞是否仍保持为干细胞或祖细胞。这些研究表明，生长在多功能支架上的原代NSC相比于标准生长条件下维持的NSC，具有更高水平的PCNA、BLBP和SOX-2。此外，GFAP是不可检测的，且生长于多功能支架上的TUJ1的表达显著低于标准生长条件下所维持的。这些数据支持这一结论，即多功能支架保持在增殖型干细胞状态下的NSC。特别地，这些研究表明，固定化的FGF-2在保持其干性、限制其分化，甚至延缓星形胶质细胞的形成方面优于可溶性的FGF-2。
实施例3(3维支架的表征)
脱乙酰壳多糖微球的制备：将脱乙酰壳多糖粉末(1.5g)分散于50mL的包含2.0％v/v乙酸的水中以创造3％脱乙酰壳多糖溶液。700rpm机械搅拌脱乙酰壳多糖溶液直至完全溶解。将所得的溶液收集并2,000rpm离心10分钟。随后，收集上清液并将沉淀的剩余杂质丢弃。使用注射器以5mL/小时的流速将酸性脱乙酰壳多糖溶液挤压入碱性凝固浴(由2.5M氢氧化钠：甲醇：水(20：30：50v/v)组成)来形成脱乙酰壳多糖微球。为了降低针末端上的表面张力，从而将微球的尺寸降低到所期望的范围，施加25kV的电流。接着，使用100μm滤器过滤球体以去除任何过大的球体。从离子溶液中将其取出，用蒸馏水漂洗4次以去除任何残留的氢氧化钠和甲醇。然后，将其在70％的乙醇中消毒30分钟。使用SigmaScanPro5软件测量微球尺寸。微球直径的频率分布也被量化。如前所述，用蒸馏水漂洗后，用HBS中的肝素(0.5mg/mL)和京尼平(0.45mM)将微球体包被过夜以将肝素交联到微球上。翌日，将肝素交联的球体用HBS冲洗3次，每次10分钟，并用纤连蛋白(10μg/mL)孵育4小时并在1μg/mL的rhbFGF中孵育2小时。
本实施例说明了制造载体以促进神经前体细胞递送至脑损伤，此细胞附着在微球的表面上。图4A中示出了载体设计的示意图。使用同轴气流使先前生成的微球的尺寸范围介于200-500μm的直径之间。此类球体对于用23直径的针头注射而言太大。利用23直径的汉密尔顿注射器进行移植的最佳球体尺寸是在20-100μm之间。为了克服现有技术缺陷，本发明人发现可以使用电流降低微球的尺寸。高流速和高电压降低了注射器上的表面张力以允许较小的液滴被“喷”入凝固溶液中。使用22kV和90mL/小时的流速形成10-100μm之间的微球，平均直径64μm(参见图4C和4D)。如频率分布所示，大多数的球体在30-100μm范围内。通过京尼平将肝素共价交联到脱乙酰壳多糖来修饰微球以允许固定化FGF-2。也可添加纤连蛋白用于细胞附着。在微球上甲苯胺蓝对肝素的染色是明显的(参见图4E)。为了确定NSC是否会附着并生长于这些微球上，将RG3.6细胞的单细胞悬浮液与微球相混合并孵育过夜，借此其附着到球上(参见图4F)。这些3-D培养物在体外保持10天且每日更换培养基。RG3.6在支架上增殖良好，伴随有限的细胞死亡。
实施例4(移植研究)
受控皮层冲击：使用***/赛拉嗪混合物(90mg/kg和10mg/kg)通过腹膜内注射递送将两月龄的成年SpragueDawley雄性大鼠麻醉。使用电动剃刀去除覆盖头部的毛发并使用解剖刀穿过头皮制造中线切口。将皮肤偏转并使用5mm直径的环钻进行颅骨切除术。将环钻置于前囟点和人字点之间的中间，环钻边缘靠近中线。在开颅期间用冷的PBS充溢颅骨表面以降低热量的产生，热量可能导致底层硬脑膜和新皮质的损伤。将颅骨瓣去除并将动物置于处于受控皮质冲击仪(CCI)(eCCI6.3装置，由CustomDesign和Fabrication,Richmond,VA制造)下的立体定位装置中。通过将直径3.5mm的砧尖(anvil)接触暴露的硬脑膜，使其归零。冲击仪速度设定在4.0±0.2m/s，穿透深度1.5mm，变形期150毫秒。冲击后，确认硬脑膜的完整性并用3-0尼龙线缝合头皮切口。手术后施用丁丙诺啡(Buprenorphine)(0.05mg/kg，SC)并将大鼠置于保持于37℃的加热垫上，手术后持续监视2小时。此外，手术后立刻向所有受试者皮下注射(SC)3％体重的0.9％盐水以防止脱水。
移植：CCI损伤后7天进行亚急性移植。用***/甲苯噻嗪混合物将动物再次麻醉，去除缝合线以暴露颅骨。从培养皿中收集细胞-球复合体并重悬于无补充物的无苯酚培养基中。使用26直径的汉密尔顿注射器将支架注射于3个不同的深度：硬脑膜下1.5、1.0和0.5mm。在5分钟内于每个深度注射一个μL，每次注射之间间隔5分钟，最后一次注射后间隔10分钟。用3-0尼龙线缝合头皮切口并将动物置于37℃加热垫上，直到其完全清醒。本报道中的在动物上所进行的所有程序都基于动物方案##08056得到了新泽西医学院(NewJerseyMedicalSchool)IACUC的批准。
免疫荧光：对于体外研究，将细胞固定在3％的多聚甲醛中并用0.1mg/mL(Sigma,St.LouisMissouri)缀合罗丹明的鬼笔环肽染色F-肌动蛋白，染色标记物Ki-67(VectorLaboratories,BurlingameCA1:1000)并使用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma，1μg/mL)复染色。对于体内研究，移植后3天使用4％的多聚甲醛(PFA)灌注大鼠。收集脑并保存在4％PFAON中。翌日，用PBS冲洗脑并浸入dH2O中的30％蔗糖中冷冻保护。在蔗糖溶液的一个变化后，将脑置于塑料冷冻模具(cryomold)中并在干冰-乙醇浆上冷冻于OCT中。以40和15μm厚度将脑冰冻切片并使用小鼠抗-巢蛋白抗体(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,Iowa,1:5)染色。将切片在二抗中于室温孵育2小时(全部来自于JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA；1:200)。仔细检查所有二抗组合以确保没有荧光染料之间的串扰(cross-talk)或二抗之间的交叉反应。当一抗替换为免疫前血清时，没有获得高于背景的信号。二抗孵育后，洗涤切片，用DAPI复染色5-10分钟并用GelMount(Biomeda,FosterCity,CA)封盖上盖玻片。
干细胞植入：许多研究已将细胞封装进球或其它递送载体以使细胞产生可溶性的生长因子和营养因子。相比之下，本文所述的递送载体具有附着于微球体表面上的细胞。这种构造能使干细胞的后代从支架迁移到邻近的组织中，这对于重建受损脑部是至关重要的。为了测试这种方法，在自CCI恢复的第7天，将包含附着到多功能微球上的NSC细胞系的多功能微球移植到病变腔。由于NSC表达GFP，其可以使用荧光显微镜从宿主细胞中区别开。当NSC体外分化时，其形成神经元和神经胶质细胞(参见图5A)。在移植后的第3天，可以在邻近宿主组织的病变腔中识别出微球。NSC大量附着于珠上(参见图5B和5C)，并且其对于干细胞/祖细胞标记物巢蛋白呈阳性(参见图5C)。如图5D中箭头所示，一些移植的细胞或其后代开始从球体迁移进入相邻组织。这些数据支持了这样的结论，即细胞可在球体上茁壮成长并能抵抗注射器的机械力。图9提供了在TBI之后，用于CNS修复的方法的原理图。
初始损伤和随后的炎症导致了皮质组织的损失，包括许多层状神经元的损失。7天后，当炎症消退并在胶质瘢痕开始形成之前，可以移植包含附着NSC的微球复合体。理想地，细胞开始增殖并形成延伸到软脑膜表面的突起，模拟胚胎神经形成。神经母细胞和其它后代可以沿其突起迁移，最终生成适合于各个皮质层和支持性神经胶质的神经元。与此同时，支架随时间降解，暴露出再生和有序的皮质。
实施例5(固定化在支架上的肝素和生长因子)
在脱乙酰壳多糖膜和微球上的离子的和共价的肝素固定化：制备2-D脱乙酰壳多糖膜和3-D脱乙酰壳多糖微球用于离子的和共价的肝素固定化。为了制备脱乙酰壳多糖膜，用3％的脱乙酰壳多糖溶液的薄层包被24孔板。将孔干燥过夜并随后使用0.5M的氢氧化钠将酸性中和。之后，用蒸馏水将板漂洗3次，并用HEPES缓冲液(HBS)中的0.5mg/mL的肝素(用于离子结合)和HBS中的0.45mM的京尼平(用于共价结合)孵育过夜。翌日，从各个孔中吸出溶液并用HBS冲洗3次。为了表征和比较脱乙酰壳多糖表面上的肝素的离子的和共价的固定，在定轨振荡器上于室温用1.5MNaCl将各个条件包被的孔中的一半孵育30分钟以去除离子肝素结合。剩余的孔孵育于HBS中用于比较。通过甲苯胺蓝染料检测固定化的肝素。简言之，将3mg/mL的甲苯胺蓝溶液加入到各个孔中。10分钟后，通过抽吸将甲苯胺蓝去除，用HBS轻柔洗涤孔2次。用数码彩色相机(NikonDS-Ril)和倒置荧光显微镜(NikonTi-S)获得图像。对于3-D脱乙酰壳多糖肝素固定化，如上所述制备微球并如2-D膜所述进行处理。
FTIR分析：使用衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR；PerkinElmer)分析京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素膜，以检测肝素结合。作为对照，通过FTIR测量脱乙酰壳多糖膜和肝素粉末。
生长因子结合到肝素：通过ELISA评估固定于脱乙酰壳多糖-肝素复合体的FGF-2的水平。如上所述，使用50μL每孔的3％的脱乙酰壳多糖在96孔板中制备二维脱乙酰壳多糖膜。用仅有HBS或包含0.45mM京尼平、0.5mg/mL肝素或京尼平与肝素两者的HBS孵育脱乙酰壳多糖包被的孔过夜。翌日，将孔抽吸，用新鲜的HBS漂洗3次并用100μL增加浓度的FGF-2(100、500、1000ng/mL)或无生长因子于室温孵育3小时。FGF溶液包含1mg/mL的BSA以保持生长因子的稳定性。使FGF-2结合后，将溶液收集到单独的EP管中以测定未结合的FGF-2。用50μL的HBS将各孔轻柔洗涤2次，将其也加入到各个相应的收集管中。为了测试长期释放，用100μLPBS回填孔并在7天后收集。使用夹心ELISA测量随时间释放的FGF-2。从加入到支架的FGF-2的总量减去第0天所释放的量，这揭示了结合的生长因子的百分比。
脱乙酰壳多糖上的肝素保留：已经证明肝素促进血管生成以减少炎症，并且其对成纤维细胞生长因子的高亲和性，因此，我们推断，这将非常有利于肝素共价附着到微球上。图3A示出了脱乙酰壳多糖、肝素和京尼平的化学结构。以2种方式(通过比色染料染色和FTIR分析)测试肝素结合到脱乙酰壳多糖。带正电荷的甲苯胺蓝染色(其将带负电的肝素染色)在脱乙酰壳多糖-肝素2-D膜和3-D微球上是强的(参见图6B)。甲苯胺蓝也强烈地染色脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平膜和微球。如所预期的，对照(仅脱乙酰壳多糖)没有表现出任何的对膜和微球的甲苯胺蓝染色。在仅有脱乙酰壳多糖的条件下，边缘的蓝色染色是由于甲苯胺蓝被困于脱乙酰壳多糖包衣的薄的边缘下。这是难以避免的，因此仅考虑膜的中心来进行分析。当膜或微球浸没和洗涤于1.5M的NaCl(而不是HBS)时，如所预期的，单独的脱乙酰壳多糖仍未染色。然而，当用NaCl洗涤脱乙酰壳多糖-肝素膜和微球(离子结合)，再进行甲苯胺蓝染色时，几乎未检测到染色。相比之下，脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平样品(共价结合)在NaCl洗涤之后如HBS一样呈现相同的阳性甲苯胺蓝染色(2-D和3-D)。这是因为，NaCl洗涤去除了脱乙酰壳多糖和肝素之间的离子结合，但当京尼平交联剂加入时，并未去除脱乙酰壳多糖和肝素之间的共价结合。FTIR结果证实了肝素通过京尼平交联(0.45mM)成功固定于脱乙酰壳多糖上。京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素复合体的FTIR光谱显示出1230nm和820nm处的峰，这分别代表肝素的硫酸基团的S＝O和C-O-S延伸(参见图6C)。脱乙酰壳多糖-肝素复合体也显示了脱乙酰壳多糖的官能团的峰，这包括1560nm处的N-H转折和1,380nm处的CH2转折。这些结果表明，0.45mM的京尼平是有效结合脱乙酰壳多糖和肝素的一个合适浓度。较高浓度的京尼平(4.5mM)导致了大量的交联，其消除了脱乙酰壳多糖和肝素上的结合位点；因此并未观察到同样的硫酸盐和羧酸盐的峰(数据未显示)。较低浓度的京尼平(0.045mM)不足以在肝素和脱乙酰壳多糖之间形成共价键。
FGF-2的固定化和释放：肝素具有多种生长因子的结合位点，生长因子包括但不限于FGF、VEGF、HGF和BMP。因此，本发明人研究了可被固定于脱乙酰壳多糖-肝素复合体的FGF-2的水平。评估了用于结合到脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平膜支架的3种不同浓度(100、500和1000ng/mL)的FGF-2。如所预测的，随着FGF-2的浓度增加，结合的FGF-2的量也增加(参见图7A)。在各个浓度中，约70-80％的FGF-2结合于支架(参见图7B)。为了评估固定化的FGF-2的生物活性，将神经干细胞系RG3.6细胞接种到2-D脱乙酰壳多糖-肝素-京尼平交联的支架上并在体外2天后进行MTT分析以评估细胞活力和生长。在4种条件下测试细胞，将其接种于：具有在培养基中的FGF-2的复合体膜(对照)；具有新鲜结合的FGF-2的复合体膜(结合的，第0天)；或具有在早些时候结合并于37℃孵育3天的FGF-2的复合体膜(结合的，第3天)；或在培养基中不具有添加的FGF-2的复合体膜。通过MTT分析所反映的神经干细胞的生长和活力在接种细胞之前立刻结合到支架上的FGF-2上最高。在结合的FGF-2条件下的细胞生长优于具有在培养基中提供的FGF-2的支架上的细胞生长。有趣的是，具有在接种前3天附着于支架上的固定化FGF-2的复合体膜上的细胞生长与对照(其接受每天添加到培养基中的FGF-2)具有可比性(参见图7C)。在包含FGF-2的支架以及对照上的细胞生长都显著高于培养基中缺少FGF-2的复合体膜上的细胞生长。当分析超过1周的生长因子释放时(数据未示出)，通过ELISA分析可检测到少量的FGF-2。然而，难以判断新鲜束缚的FGF-2(第0天)和结合3天的FGF-2(第3天)之间的MTT值的轻微下降是否可以归因于此释放或因活性损失。保持在这些生长条件下的神经干细胞的相衬图像与MTT实验结果相平行(图7D-G)。
实施例6(附着肽与纤连蛋白的比较)
附着肽上的干细胞增殖：将RGD肽(其首先在纤连蛋白中鉴定出)结合至整联蛋白受体(其呈现于多种类型细胞的表面上)上。如先前所知，研究表明，这些受体对于维持神经干细胞在原始状态是至关重要的。因此，本发明人假设，RGD肽足以作为支架上的附着肽。确认了这一假说的有效性，用RGD肽生产的支架增强了RG3.6细胞的生长，并且当使用与纤连蛋白一样的等摩尔浓度时，产生了更强的生长(参见图8)。
由于本发明人已发现层粘连蛋白也促进支架上的神经干细胞的生长(参见图1)，本发明人测试了小肽IKVAV，其是存在于层粘连蛋白中的受体结合肽。再一次的，在与纤连蛋白等摩尔的浓度，IKVAV促进了优良的生长(相比于纤连蛋白)(参见图8)。
为了确定这2个小肽是否可以协同作用，本发明人制备了包被有等摩尔浓度的RGD和IKVAV的支架。植于此基质的干细胞比植于纤连蛋白上的干细胞生长得更好；但使用组合的肽的干细胞并没有比单独使用任一肽的干细胞生长得更好(参见图8)。
本说明书并没有试图穷尽地列举出所有可能的变化。可替代的实施方式可能并未呈现于本发明的特定部分中，并可能导致所述部分的不同组合，或其它未描述的可替代的实施方式可用于一个部分中，这些都不认为是对那些可替代的实施方式的放弃。应当理解的是，许多未描述的实施方式都在下述权利要求的字面范围内，且其它是等同的。此外，本说明书所引用的所有参考文献、出版物、美国专利和美国专利申请公开均通过引用以其整体并入本文，就如同在本说明书中已经对其进行了完全的阐述一样。

Claims (27)

1.一种培养干细胞的方法，其包括
制备多功能基质，其具有下列步骤：
干燥脱乙酰壳多糖溶液以形成脱乙酰壳多糖层；
用碱性溶液中和脱乙酰壳多糖层的酸度；
将生长促进蛋白结合配偶体附着至脱乙酰壳多糖层；
用京尼平将生长促进蛋白结合配偶体交联至脱乙酰壳多糖层；
施加生长促进蛋白的溶液；和
允许生长促进蛋白附着至脱乙酰壳多糖层；
接种一种或多种干细胞到多功能基质；和
在限定的饲喂条件下培养干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中制备多功能基质还包括下列步骤：
施加附着组分的溶液；和
允许附着组分附着至脱乙酰壳多糖层。
3.如权利要求1所述的方法，其中生长促进蛋白结合配偶体是肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素的类似物。
4.如权利要求3所述的方法，其中生长促进蛋白结合配偶体是肝素。
5.如权利要求1所述的方法，其中在多功能基质上培养的干细胞保持多能和增殖状态而无任何可溶性生长促进蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其中干细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、成体干细胞、脂肪来源的干细胞、间质干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、少突胶质细胞祖细胞、FGF反应祖细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)和iPSC来源的干细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中多功能基质是2维的，且干细胞选自hESC和iPSC。
8.如权利要求1所述的方法，其中多功能基质是3维的。
9.如权利要求1所述的方法，其中基质不包含异种组分。
10.如权利要求6所述的方法，其中干细胞是哺乳动物的，优选啮齿类的、灵长类的或人类的。
11.如权利要求1所述的方法，其中生长促进蛋白选自FGF、PDGF、EGF和HB-EGF。
12.如权利要求1所述的方法，其中FGF是FGF-2。
13.如权利要求2所述的方法，其中附着组分是选自纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、原纤蛋白、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤维蛋白溶酶、聚蛋白多糖、短蛋白聚糖、肌腱蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸蛋白多糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素蛋白多糖、多配体蛋白聚糖-1(蛋白聚糖)和IGF结合蛋白的细胞外基质蛋白。
14.如权利要求2所述的方法，其中附着组分是具有包含RGD或IKVAV的肽序列的细胞外基质肽。
15.如权利要求1所述的方法，其中干细胞在3天内饲喂至多1次。
16.一种制备促进细胞递送到损伤组织的载体的方法，所述方法包括
使用电流产生具有30-100μm之间尺寸的脱乙酰壳多糖微球；
将生长促进蛋白结合配偶体附着至脱乙酰壳多糖层
使用京尼平将生长促进蛋白结合配偶体交联至脱乙酰壳多糖层；
施加生长促进蛋白的溶液；
施加附着组分的溶液；和
允许生长促进蛋白和附着组分附着至脱乙酰壳多糖微球。
17.如权利要求15所述的方法，其中生长促进蛋白结合配偶体是肝素，生长促进蛋白是FGF-2。
18.如权利要求16所述的方法，其中附着组分是纤连蛋白。
19.如权利要求16所述的方法，其中附着组分是包含序列RGD的肽。
20.如权利要求16所述的方法，其中附着组分是包含序列IKVAV的肽。
21.如权利要求16所述的方法，其中电流约25kV。
22.一种修复需要治疗的受试者的损伤组织的方法，方法包括：
制备如权利要求16所述的载体；
将干细胞接种在载体上并进行增殖；和
将具有增殖的干细胞的载体注射进需要治疗的受试者的损伤组织中；
其中所注射的载体促进组织的再生。
23.如权利要求22所述的方法，其中损伤组织是创伤性脑损伤。
24.如权利要求22所述的方法，其中生长促进蛋白结合配偶体是肝素，生长促进蛋白是FGF-2。
25.如权利要求22所述的方法，其中附着组分是纤连蛋白。
26.如权利要求22所述的方法，其中附着组分是包含序列RGD的肽。
27.如权利要求22所述的方法，其中附着组分是包含序列IKVAV的肽。
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