CN101788479A - 对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法，其步骤为：根据测量得到的供体和受体的吸收和发射谱选择激发光源和滤光片；将供体和受体的混合溶液进行毛细管电泳，从在供体和受体信号通道内得到的毛细管电泳图谱上分别得到供体和受体不同存在形式的荧光强度信号F₁，F₂，F₃，F₄；分别将供体和受体单独进行毛细管电泳，从在供体和受体信号通道内得到毛细管电泳图谱上分别得到单独供体和受体的荧光强度信号F₅，F₆；将F₁，F₂和F₅带入公式

中，计算得到荧光共振能量转移效率E；将E带入公式中，计算得到供体和受体间的距离r。

Description

对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，涉及对基于量子点的荧光共振能量转移进行检测的方法，具体涉及一种利用毛细管电泳对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法。

背景技术

荧光共振能量转移(FRET)技术作为一种能在生物活体和体外检测纳米级距离变化的工具，为研究生物大分子内部结构、性质、反应机理及其动态监测，乃至定量分析等提供了一条快速简便的途径。FRET具有灵敏度高、适用广泛、分析速度快等优点，目前已在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸蛋白检测等方面有了广泛的应用。其中，量子点(QDs)所具有的独特光学性质(宽吸收、窄发射、抗光漂白及荧光可调)，使其非常适合用于FRET研究，因此对基于QDs的FRET(选用QDs作为FRET中的供体或受体)的研究已成为近年来的研究热点。

目前对FRET进行分析测量一般是通过比较供体在受体存在前、后的荧光强度变化来进行。而供体的荧光强度常由其荧光光谱的测量获得，但是对于这种单纯测量荧光光谱的方法而言，由于其无法实现对供体不同存在形式(供体一般以单纯供体及供受体结合物两种形式存在)的甄别，其所获得的供体的荧光强度信号往往是一个混杂信号，这其中既包括以供受体结合物形式存在的荧光信号，还可能包括未参加FRET的过量的单纯供体的荧光信号，而只有前者才是能真实反映FRET的信号。因此，在利用上述的荧光光谱测量法对FRET进行分析的过程中，往往造成FRET组分与非FRET组分的混杂，进而导致FRET检测准确度和灵敏度的降低，这种降低在基于QDs的FRET中尤为明显。因此，寻找一种对基于QDs的FRET进行高灵敏度检测的新方法将具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对基于QDs的FRET进行高灵敏度检测的方法，使其具有可以将FRET组分与非FRET组分进行分离、快速准确、灵敏度高、样品用量少等特点。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的这种对基于量子点(QDs)的荧光共振能量转移(FRET)进行高灵敏度检测的方法，其步骤为：

(1)利用紫外分光光度计和荧光分光光度计分别对待测的荧光共振能量转移中所采用的供体和受体的吸收光谱和荧光光谱进行测量，根据测得的供体的吸收光谱选择激发光源和滤光片，要求激发光的波长落在供体的吸收光谱范围内；

(2)分别配制待测的荧光共振能量转移中所采用的供体溶液和受体溶液，将二者以任意浓度和任意比例混合得到供体和受体的混合溶液，将此混合溶液进行毛细管电泳，在毛细管电泳中，选择毛细管的某一固定位置作为检测窗口，在检测窗口处用激发光对经过此处的电泳对象进行激发，并用在荧光信号采集装置上设置的两个信号通道分别对供体和受体的荧光强度信号进行实时测量，这两个信号通道的检测波长分别与供体和受体的荧光发射波长(供体和受体的荧光发射波长由其荧光光谱获得)相同，将得到的数据作图即得到分别表示供体和受体的荧光强度信号随其电泳迁移时间的变化情况的毛细管电泳图谱，图谱上的峰值即为不同存在形式的供体和受体的荧光强度信号；当混合溶液中供体相对于受体过量时，供体信号通道中得到的毛细管电泳图谱上得到两个峰值，分别为未参加荧光共振能量转移的过量的供体的荧光强度信号(F₁)和以供受体结合物形式存在的供体的荧光强度信号(F₂)，与此同时在受体通道中得到的毛细管电泳图谱上只得到一个峰值，为以供受体结合物形式存在的受体的荧光强度信号(F₄)，且F₂和F₄所对应的电泳迁移时间相同；当混合溶液中受体相对于供体过量时，在受体信号通道中得到的毛细管图谱上得到两个峰值，分别为未参加荧光共振能量转移的过量的受体的荧光强度信号(F₃)和以供受体结合物形式存在的受体的荧光强度信号(F₄)，与此同时在供体通道中得到的毛细管电泳图谱上只得到一个峰值，为以供受体结合物形式存在的供体的荧光信号(F₂)，且F₂和F₄所对应的电泳迁移时间相同；

(3)用与步骤(2)相同的电泳装置和电泳条件，将供体溶液单独进行毛细管电泳，其中供体的浓度与步骤(2)混合溶液中所含供体的浓度相同，电泳完成后在供体通道中得到的毛细管电泳图谱上得到一个峰值，为无受体存在时单独供体的荧光强度信号(F₅)；

(4)用与步骤(2)相同的电泳装置和电泳条件，将受体溶液单独进行毛细管电泳，其中受体的浓度与步骤(2)混合溶液中所含受体的浓度相同，电泳完成后在受体通道中得到的毛细管电泳图谱上得到一个峰值，为无供体存在时单独受体的荧光强度信号(F₆)；

(5)若在供体存在时受体的荧光强度信号(F₃+F₄)大于无供体存在时单独受体的荧光强度信号(F₆)，则说明在步骤(2)的混合溶液中发生了荧光共振能量转移。FRET效率和供体受体间的距离是表征FRET时最重要的两个参数。利用公式(a)计算得到荧光共振能量转移效率(E)；

$E=1-\frac{F_2}{F_5-F_1}$ 公式(a)

(6)将步骤(5)中得到的FRET效率带入公式(b)计算得到发生FRET时供体和受体之间的距离(r)。

$r=R_0{\left(\frac{1-E}{E}\right)}^{1/6}$ 公式(b)

其中R₀为临界距离，即FRET效率为50％时供体和受体之间的距离，其值由公式R₀ ⁶＝8.8×10^-25(k²n^-4Ф_DJ)求得，其中k²是偶极空间定向因子，描述供体和受体的跃迁偶极的相对取向；n是介质的折射率；Φ_D是受体不存在时供体的荧光量子产率；J是供体的荧光光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分。

步骤(1)中所述的供体和受体信号通道有如下性质：两个通道要彼此独立，相互间没有信号干扰；激发光不在两个通道的检测光谱范围内；供体通道必须包括部分或全部供体荧光发射谱；受体通道必须包括部分或全部受体荧光发射谱。

本发明只适用于对基于QDs的FRET的检测，即供体和受体二者中至少有一个采用量子点。

本发明利用毛细管电泳实现了对基于QDs的FRET中FRET组分与非FRET组分的分离，建立了一种对基于QDs的FRET进行高灵敏度检测的方法。与常规的荧光光谱测量法相比，此方法具有快速准确、灵敏度高、样品用量少的特点。

附图说明

图1为实施例中用到的供体和受体的吸收和荧光光谱：(a)供体CdTeQDs的吸收光谱；(b)受体CdSe/ZnS QDs的吸收光谱；(c)供体CdTe QDs的荧光光谱；(d)受体CdSe/ZnS QDs的荧光光谱；

图2为实施例中供体信号通道内检测得到的毛细管电泳图谱：(e)受体不存在时供体的毛细管电泳图谱；(f)受体存在时供体的毛细管电泳图谱；

图3为实施例中受体信号通道内检测得到的毛细管电泳图谱：(g)供体不存在时的受体的毛细管电泳图谱；(h)供体存在时受体的毛细管电泳图谱。

图4为实施例中用荧光光谱法所测量得到的荧光光谱：(i)受体不存在时供体溶液的荧光光谱；(j)供体和受体混合溶液的荧光光谱。

具体实施方式

下面通过借助附图和实施例进一步描述本发明，但实施例仅是说明的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。

实施例

下面以毛细管电泳检测两种QDs间的FRET为例，对本发明的实施做详细说明。

(1)本实例中选用的供体为标记有小鼠lgG的CdTe QDs，受体为标记有羊抗小鼠lgG的CdSe/ZnS QDs。图1为所选用的供体和受体的吸收和发射光谱，从中可以得到供体CdTe QDs的第一吸收峰和最大荧光发射峰分别为488nm和530nm，受体CdSe/ZnS QDs的第一吸收峰和最大荧光发射峰分别为613nm和630nm。根据得到的供体和受体的吸收和发射光谱，本实施例中我们采用了宽谱汞灯作为激发光源，光纤光谱仪作为QDs荧光信号采集装置，所采用的滤光片的参数如下：激发滤光片(BP 420±20nm)，二色镜(DM455)，发射滤光片(BA 474nm)。在光纤光谱仪上设置了两个信号通道分别对供体和受体在毛细管电泳过程中的实时荧光强度信号进行检测，其中供体信号通道的检测波长为530±20nm，受体信号通道的检测波长为630±20nm。

(2)在250μL浓度为0.34mg/mL的供体CdTe QDs水溶液中，加入了50μL浓度为0.83mg/mL的受体CdSe/ZnS QDs水溶液，并用纯水将此混合溶液的总体积稀释到500μL，此时混合溶液中供体相对于受体是过量的。将混合溶液静置反应2.5小时后进行毛细管电泳。图2f和图3h分别为毛细管电泳完成后在供体和受体信号通道中得到的毛细管电泳图谱。由于此时混合溶液中供体相对于受体是过量的，所以在供体信号通道内检测得到的电泳图谱上有两个峰值，分别为未参加FRET的过量的供体的荧光强度信号(F₁)和以供受体结合物形式存在的供体的荧光强度信号(F₂)，从图2f中可以得到F₁和F₂的值分别为24.43和18.56；与此同时在受体信号通道内得到的电泳图谱上只得到一个峰值，为以供受体结合物形式存在的受体的荧光强度信号(F₄)，从图3h中可以得到F₄的值为9.12。

毛细管电泳采用正极端电压进样(10kV，20s)，电泳缓冲液为Na₂B₄O₇溶液(25mM pH 9.20)，毛细管有效长度为40cm(总长65cm)，分离电压12kV。

(3)将供体CdTe QDs水溶液单独进行毛细管电泳，其中供体的浓度(0.17mg/mL)和步骤(2)混合溶液中供体的浓度相同。图2e为毛细管电泳完成后在供体信号通道内得到的毛细管电泳图谱，从此图谱上可以得到供体的荧光强度信号(F₅)的值为67.13。本步骤中毛细管电泳的条件和设备与步骤(2)中所述相同。

(4)将受体CdSe/ZnS QDs水溶液单独进行毛细管电泳，其中受体的浓度和步骤(2)混合溶液中受体的浓度相同(0.083mg/mL)。图3g为毛细管电泳完成后在受体信号通道内得到的毛细管电泳图谱，从此图谱上可以得到受体的荧光强度信号(F₆)的值为5.57。本步骤中毛细管电泳的条件和设备与步骤(2)中所述相同。

(5)经过比较上述步骤中得到的F₄和F₆的值，可以得到F₄(9.12)＞F₆(5.57)，即在供体存在的情况下受体的荧光强度要大于同浓度时单独受体的荧光强度，说明在步骤(2)的混合溶液中供体和受体间发生了FRET。将上述步骤中的得到的荧光强度信号F₁(24.43)，F₂(18.56)和F₅(67.13)带入公式(a)中，计算得到FRET效率(E)为：

我们还用常规的荧光光谱法在同样的条件下对上述供体和受体间的FRET进行了测量。首先对步骤(2)中所述的混合溶液的光谱进行了测量，结果如图4j所示，从此图中得到此时混合溶液中供体的荧光强度(F_DA)值为212.14(即得到的荧光光谱中荧光发射波长在530nm处的荧光强度值)；然后对步骤(3)中所述的供体溶液的光谱进行了测量，结果如图4i所示，从此图中得到此时供体的荧光强度(F_D)值为277.81(荧光光谱中荧光发射波长在530nm处的荧光强度值)；最后将上述得到的供体的荧光强度F_DA(212.14)和F_D(277.81)带入公式

中，计算得到FRET效率(E)为：图4中的荧光光谱由荧光光度计测得，其中测量参数设置如下：激发波长为400nm，光谱测量范围为450～750nm，波长扫描速度为200nm/min。

经过比较可以发现，与用常规的荧光光谱法所测得的23.64％的FRET效率相比，用本发明所述的方法得到了较高的FRET效率(56.53％)，这说明本发明所述的方法可以极大的提高FRET测量中的灵敏度。

(6)将步骤(5)中得到的FRET效率带入公式(b)中，计算得到发生FRET时供体和受体之间的距离(r)为：

其中R₀是FRET效率为50％时供体和受体之间的距离，其值由公式R₀ ⁶＝8.8×10^-25(k²n^-4Ф_DJ)求得，其中k²是偶极空间定向因子，描述供体和受体的跃迁偶极的相对取向；n是介质的折射率；Ф_D是受体不存在时供体的荧光量子产率；J是供体的荧光光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分。本实例中受体不存在时供体的荧光量子产率为25％，介质水的折射率为1.33，从图1中可以得到供体荧光光谱和受体吸收光谱的重叠积分为3.24×10^-12cm⁶/(mol/L)，取k²＝2/3，得到R₀的值为7.31nm。

以上所述为本发明的实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (4)

1.一种对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法，其步骤为：

(1)利用紫外分光光度计和荧光分光光度计分别对待测的荧光共振能量转移中所采用的供体和受体的吸收光谱和荧光光谱进行测量，根据测得的供体的吸收光谱选择激发光源和滤光片，要求激发光的波长落在供体的吸收光谱范围内；

(2)分别配制待测的荧光共振能量转移中所采用的供体溶液和受体溶液，将二者以任意浓度和任意比例混合得到供体和受体的混合溶液，将此混合溶液进行毛细管电泳，在毛细管电泳中，选择毛细管的某一固定位置作为检测窗口，在检测窗口处用所选择的激发光对经过此处的电泳对象进行激发，并用在荧光信号采集装置上设置的两个信号通道分别对供体和受体的荧光强度信号进行实时测量，这两个信号通道的检测波长分别与供体和受体的荧光发射波长(供体和受体的荧光发射波长由其荧光光谱获得)相同，将得到的数据作图即得到分别表示供体和受体的荧光强度信号随其电泳迁移时间的变化情况的毛细管电泳图谱，图谱上的峰值即为不同存在形式的供体和受体的荧光强度信号；当混合溶液中供体相对于受体过量时，供体信号通道中得到的毛细管电泳图谱上得到两个峰值，分别为未参加荧光共振能量转移的过量的供体的荧光强度信号F₁和以供受体结合物形式存在的供体的荧光强度信号F₂，与此同时在受体通道中得到的毛细管电泳图谱上只得到一个峰值，为以供受体结合物形式存在的受体的荧光强度信号F₄，且F₂和F₄所对应的电泳迁移时间相同；当混合溶液中受体相对于供体过量时，在受体信号通道中得到的毛细管图谱上得到两个峰值，分别为未参加荧光共振能量转移的过量的受体的荧光强度信号F₃和以供受体结合物形式存在的受体的荧光强度信号F₄，与此同时在供体通道中得到的毛细管电泳图谱上只得到一个峰值，为以供受体结合物形式存在的供体的荧光信号F₂，且F₂和F₄所对应的电泳迁移时间相同；

(3)用与步骤(2)相同的电泳装置和电泳条件，将供体溶液单独进行毛细管电泳，其中供体的浓度与步骤(2)混合溶液中所含供体的浓度相同，电泳完成后在供体通道中得到的毛细管电泳图谱上得到一个峰值，为无受体存在时单独供体的荧光强度信号F₅；

(4)用与步骤(2)相同的电泳装置和电泳条件，将受体溶液单独进行毛细管电泳，其中受体的浓度与步骤(2)混合溶液中所含受体的浓度相同，电泳完成后在受体通道中得到的毛细管电泳图谱上得到一个峰值，为无供体存在时单独受体的荧光强度信号F₆；

(5)若在供体存在时受体的荧光强度信号F₃+F₄大于无供体存在时单独受体的荧光强度信号F₆，说明在步骤(2)的混合溶液中发生了荧光共振能量转移，此时利用公式a计算得到荧光共振能量转移效率E， $E=1-\frac{F_2}{F_5-F_1}$ 公式(a)。

2.根据权利要求1所述的对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法，其特征在于，将步骤(5)中得到的荧光共振能量转移效率E带入公式b计算得到发生荧光共振能量转移时供体和受体之间的距离r， $r=R_0{\left(\frac{1-E}{E}\right)}^{1/6}$ 公式(b)

其中，R₀为临界距离，即FRET效率为50％时供体和受体之间的距离，其值由公式R₀ ⁶＝8.8×10^-25(k²n^-4Φ_DJ)求得，其中k²是偶极空间定向因子，描述供体和受体的跃迁偶极的相对取向；n是介质的折射率；Φ_D是受体不存在时供体的荧光量子产率；J是供体的荧光光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分。

3.根据权利要求1所述的对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法，其特征在于，所述的荧光信号采集装置是能对荧光信号进行记录和采集的仪器。

4.根据权利要求3所述的对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法，其特征在于，所述的能对荧光信号进行记录和采集的仪器是光谱仪或光子计数器。

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