CN105112367A - 一种间充质干细胞表皮分化诱导剂及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种间充质干细胞定向分化诱导剂。一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，由KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成，在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为KGF？20～30μg/L、BMP-4？5～10μg/L、PDGF-AB？5～10μg/L、VEGF？10～20μg/L、IL-2？5～10μg/L、Forskolin？1～2mg/L。本发明的间充质干细胞表皮分化诱导剂，采用细胞因子联合小分子化合物，高效诱导间充质干细胞分化为表皮细胞，诱导分化效率极大提高，诱导后细胞活性强，且无需细胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险，无伦理问题，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种间充质干细胞定向分化诱导剂。
背景技术
皮肤为人体最大的器官，总重量约占个体体重的16%，主要由表皮、真皮以及皮下组织构成。临床上由于重度烧伤、慢性溃疡、外伤等造成的皮肤损伤，需要尽早促进创面愈合，尽量减少瘫痕所造成的功能障碍。组织工程技术和再生医学的发展使新型皮肤再生产品的开发成为可能。组织工程基本原理是将种子细胞在体外培养、扩增后，整合于预先设计的生物学支架上构成细胞一支架复合体，然后植入机体相应的病损部位，修复组织缺损。组织工程的三大要素包括种子细胞、支架材料以及有助于细胞生长分化的微环境。构建组织工程皮肤所需要的最基本的种子细胞是表皮细胞，而表皮细胞是一种终末分化的细胞，在体外培养一代即进入老化状态，且其***增殖速度较慢，培养条件严格，很难短时间扩增出大量的细胞来满足皮肤组织工程的需要。
间充质干细胞（MSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，小鼠的胚胎发育10天后开始出现，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中。成体MSCs主要存在于骨髓，脂肪，骨膜下以及各个器官和组织中的血管周围，另外，新生儿脐带、胎盘、羊膜等也含有大量MSCs。MSCs具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，神经细胞，肝脏细胞，表皮细胞等。MSCs来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次***传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，因此，MSCs是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。
目前文献报道的运用MSCs体外诱导表皮干细胞分化的研究报道不多，诱导方法也比较类似，分化获得率也较低。运用较多的为条件培养基加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），辅以维甲酸（RA），或应用转基因技术导入EGF，以bFGF诱导转染后的细胞分化。例如有研究者使用皮肤组织匀浆液作为条件培养基并添加表皮生长因子（EGF）来诱导干细胞的表皮分化，通过检测表皮干细胞的标志物CK19和CK14来证明MSCs在体外也可以向表皮细胞分化，但是这种方法分化得率很低（CK19阳性率约为10%，CK14阳性率约为12%）。也有研究者联合使用EGF和维甲酸来诱导脂肪MSCs分化为表皮细胞，诱导7天后可以发现部少量细胞的形态发生变化，由梭形变成多边形，部分细胞形成卵石铺路样，对CK19的检测发现阳性率约为12%。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明人经过多次大量实验，意外发现KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin联合可以高效诱导MSCs分化为表皮细胞。其中，BMP(骨形态发生蛋白)是TGF-β超家族的成员之一，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。BMP表达于众多胚胎器官和组织，不仅参与骨骼的发生与形成，而且与众多器官密切相关，如肾、肺、眼、神经***、皮肤、性腺等。BMP是生命过程中多方面的调节因子，参与增殖、分化、凋亡和形态发生等，各成员对不同组织可能有不同的作用。细胞因子KGF、PDGF-AB、VEGF、IL-2可以维持表皮干细胞微环境，同时可以刺激其增殖、发育。Forskolin是一种常用的腺苷酸环化酶激活剂，可以通透细胞，激活腺苷酸环化酶(adenylylcyclase)，从而升高细胞内的cAMP水平。而他们组合起来，可以协同诱导MSCs分化为表皮细胞。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供间充质干细胞表皮分化诱导剂，该诱导剂能够将间充质干细胞定向诱导分化为表皮细胞。目前多数间充质干细胞表皮分化诱导剂存在诱导时间过长，诱导效率低，诱导后获得表皮细胞活性差。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，由KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成，在加入完全培养基后,各成分作用浓度依次为KGF20～30μg/L、BMP-45～10μg/L、PDGF-AB5～10μg/L、VEGF10～20μg/L、IL-25～10μg/L、Forskolin1～2mg/L。
优选的，一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为KGF25μg/L、BMP-48μg/L、PDGF-AB7μg/L、VEGF12μg/L、IL-27μg/L、Forskolin1.2mg/L。
本发明的间充质干细胞表皮分化诱导剂的应用方法，将间充质干细胞表皮分化诱导剂各成分按照作用浓度要求分别加入完全培养基中，完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。
本发明的间充质干细胞表皮分化诱导剂，采用细胞因子联合小分子化合物，高效诱导间充质干细胞分化为表皮细胞，诱导分化效率极大提高，诱导后细胞活性强，且无需细胞转染，故无基因改变及罹患癌症风险，无伦理问题，安全性高。
附图说明
图1是脂肪间充质干细胞，P3，（×200）；
图2间充质干细胞诱导后CKl9阳性表皮细胞，呈红色荧光（×200）；
图3间充质干细胞诱导后P63阳性表皮细胞，呈红色荧光（×200）；
图4间充质干细胞诱导后的β1-integrin阳性表皮细胞，呈红色荧光（×200）；
图5本发明诱导剂与传统方法诱导脂肪间充质干细胞诱导效率的比较；
图6本发明诱导剂与传统方法诱导脐带间充质干细胞诱导效率的比较。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，其特征在于：所述诱导剂由KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成。
实施例2间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基（LONZA，货号00190632）为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：KGF（Sigma，K1751-10μg）20μg、BMP-4（Sigma，SRP3016-10μg）5μg、PDGF-AB（PeproTech，96-100-00AB-10μg）5μg、VEGF（PeproTech，96-100-20-10μg）10μg、IL-2（PeproTech，96-200-02-50μg）5μg、Forskolin（Abcam，ab120058-100mg）1mg，混匀后过滤除菌。
实施例3间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以DMEM/F12+10%FBS为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：KGF（Sigma，K1751-10μg）30μg、BMP-4（Sigma，SRP3016-10μg）10μg、PDGF-AB（PeproTech，96-100-00AB-10μg）10μg、VEGF（PeproTech，96-100-20-10μg）20μg、IL-2（PeproTech，96-200-02-50μg）10μg、Forskolin（Abcam，ab120058-100mg）2mg，混匀后过滤除菌。
实施例4间充质干细胞表皮分化诱导剂，将下列原料按其各自特性进行溶解，以Keratinocyte-SFM（Gibco，170005-42）为基质，使各组分含量如下列定容至1000ml：KGF（Sigma，K1751-10μg）25μg、BMP-4（Sigma，SRP3016-10μg）8μg、PDGF-AB（PeproTech，96-100-00AB-10μg）7μg、VEGF（PeproTech，96-100-20-10μg）12μg、IL-2（PeproTech，96-200-02-50μg）7μg、Forskolin（Abcam，ab120058-100mg）1.2mg，混匀后过滤除菌。
实施例5采用实施例4制备的诱导剂，对脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）进行表皮细胞诱导分化实验
1、AD-MSCs体外原代培养：将脂肪抽吸术后液体800r/min离心3min，留上层漂浮的脂肪组织，磷酸缓冲液(PBS)漂洗，800r/min离心5min2次，留上层脂肪；加入等体积0.2％胶原酶，37℃摇床消化30min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤，1500r/min离心5min，沉淀物以1mlDME/F12重悬，PBS漂洗，1000r/min离心8min，细胞培养基重悬，5×105/ml接种；置37℃、5％CO2培养箱孵育，静置3d后酌情换液。细胞长至80％融合时，0.25％胰酶消化传代。
2、AD-MSCs的鉴定
（1）取P3代AD-MSCs，流式检测细胞表面标记，流式结果如表1。
表1AD-MSCs表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明为该细胞为MSCs。
3、AD-MSCs向表皮细胞诱导分化：取P3的AD-MSCs以5*105/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导8d,同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表2所示。
表2诱导分化分组
4、免疫细胞荧光染色检测CKl9、P63、β1-integrin的表达：每组细胞爬片均随机选取5个光镜下(×200)视野下计数CKl9、P63、β1-integrin染色阳性的细胞数目。试验重复3次。
结果：免疫细胞荧光染色发现，空白对照组无CKl9、P63、β1-integrin染色阳性的细胞。本发明诱导剂CKl9、P63、β1-integrin染色阳性细胞数目均明显多于实验组二(阳性对照)，说明本发明诱导剂明显优于传统诱导剂，如附图5示，结果有统计学意义。附图2、3、4分别示CKl9、P63、β1-integrin染色阳性的细胞。
实施例6采用实施例4制备的诱导剂，对脐带间充质干细胞（UC-MSCs）进行表皮细胞诱导分化实验
1、UC-MSCs的分离培养（组织块培养法）
（1）向脐带采集瓶中加入30ml生理盐水，初步洗涤脐带。
（2）无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，无菌手术剪将脐带剪成约2cm数段，加入生理盐水洗涤血凝块，直至基本去除血渍洗涤液较清澈。
（3）剔除血管：按血管螺旋走式剔除两条动脉，一条静脉。
（4）分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色***即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中。
（5）洗涤红细胞：向无菌平皿中加入10ml注射用水，洗涤胶体1min，共洗涤2次。
（6）胶体称重：将洗涤后的华通氏胶移入到50ml离心管中，称重记录。
（7）组织匀浆：用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪切成1mm3左右的组织匀浆块，剪切时间15～20min。
（8）定容种瓶：根据胶体重量，加入适量脐带MSC专用培养基，定容组织匀浆浓度为0.4g/ml，电动移液器吹打匀浆均匀后，每75cm2接种1ml组织匀浆（即0.4g/75cm2），T75培养瓶中加入15ml脐带MSC无血清培养基（LONZA，00190632），晃动培养瓶混匀后培养。
（9）培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，参数：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。
（10）原代培养：原代4～5d半量换液一次，（拟采用平板离心机，在培养瓶中初步离心后，移除半量培养基，加入半量新鲜培养基，重悬浮组织块培养），原代培养14～16d之后，P0代细胞密度达到80%～90%，消化传代。
（11）P0代细胞传代：消化酶为0.125%Trypsin-0.01％EDTA溶液，每75cm2加入1～1.5ml消化酶溶液，消化时间为40～60sec，加入无血清培养基2～3ml反复吹打瓶底，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入5ml生理盐水冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，统计细胞总量。
（12）洗涤接种传代：离心参数，250g/min,10min，去除上清液后，加入新鲜培养液定容后接种新培养瓶中，传代细胞密度为(6～8)×105/75cm2。
（13）细胞培养与传代：P1代后，每周换液2次，每3～4天传代，传代时细胞融合应在80%～90%，传代细胞密度为（6～8）×105/75cm2。
2、UC-MSCs的鉴定
（1）取P3代脐带间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，流式结果如表3。
表3UC-MSCs表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD105表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明该细胞为MSCs。
3、UC-MSCs向表皮细胞诱导分化：取P3的UC-MSCs以5*105/孔接种于6孔板中，过夜贴壁后换成本发明的诱导培养基连续诱导8d。同时设置空白对照组和阳性对照组。分组如表4所示。
表4诱导分化分组
4、免疫细胞荧光染色检测各组CKl9、P63、β1-integrin的表达：每组细胞爬片均随机选取5个光镜下（×200）视野下分别计数CKl9、P63、β1-integrin染色阳性的细胞数目，试验重复3次。
结果：免疫细胞荧光染色发现，空白对照组无CKl9、P63、β1-integrin染色阳性的细胞，而本发明诱导剂CKl9、P63、β1-integrin染色阳性细胞数目均明显多于实验组二（阳性对照），标明本发明诱导剂明显优于传统诱导剂，如附图6示，结果有统计学意义。
Claims (4)
1.一种间充质干细胞表皮分化诱导剂，其特征在于：由KGF、BMP-4、PDGF-AB、VEGF、IL-2、Forskolin组成，在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为KGF20～30μg/L、BMP-45～10μg/L、PDGF-AB5～10μg/L、VEGF10～20μg/L、IL-25～10μg/L、Forskolin1～2mg/L。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞表皮分化诱导剂，其特征在于：在加入完全培养基后，各成分作用浓度依次为KGF25μg/L、BMP-48μg/L、PDGF-AB7μg/L、VEGF12μg/L、IL-27μg/L、Forskolin1.2mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞表皮分化诱导剂，其特征在于：所述的完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。
4.一种间充质干细胞表皮分化诱导剂的应用方法，其特征在于：将间充质干细胞表皮分化诱导剂各成分按照作用浓度要求分别加入完全培养基中，完全培养基为Keratinocyte-SFM、人间充质干细胞专用无血清培养基或者DMEM/F12+10%FBS。
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Denomination of invention: A mesenchymal stem cell epidermal differentiation inducer and its application method Granted publication date: 20180727 Pledgee: Qingdao Huitong Chinese financing Company limited by guarantee Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024370010043 |
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