CN105102470A - 新型α4β7肽二聚体拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及富含二硫化物的二聚体分子，所述二聚体分子抑制α4β7与粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM)的体内结合并且对α4β1结合示出高度选择性。

Description

新型α4β7肽二聚体拮抗剂
发明领域
本发明涉及具有可用于治疗由整联蛋白结合而引起或加重的病况的活性的新型化合物，包含所述化合物的药物组合物，使用所述化合物治疗的方法以及阻断或破坏整联蛋白结合的方法。
发明背景
整联蛋白非共价地缔合α/β异源二聚体细胞表面受体，所述细胞表面受体参与从细胞粘附和迁移至基因调节范围内的许多细胞过程(Dubree等，Selectiveα4β7IntegrinAntagonistandTheirPotentialasAntiinflammatoryAgents，J.Med.Chem.2002，45，3451-3457)。整联蛋白的差异表达可调节细胞的粘附性能，从而使得不同的白细胞群体响应于不同的炎性信号被募集至特定器官。如果保持未加控制，则整联蛋白-介导的粘附过程可导致慢性炎症和自身免疫疾病。
α4整联蛋白——α4β1和α4β7在遍及胃肠道中的淋巴细胞迁移起重要作用。它们在大多数白细胞(包括B和T淋巴细胞)上表达，从而它们分别经由结合于它们各自的主配体、血管细胞粘附分子(VCAM)和粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM)而介导细胞粘附。蛋白在结合特异性上是不同的，VCAM结合α4β1和少量的α4β7，而MAdCAM对α4β7具有高度特异性。除了与α4亚基配对之外，β7亚基也与αE亚基形成异源二聚体复合体以形成αEβ7，其主要在肠、肺和泌尿生殖道中的上皮内淋巴细胞(IEL)上表达。αEβ7也在消化道中的树突细胞上表达。αEβ7异源二聚体结合于上皮细胞的E-钙粘蛋白。IEL细胞被认为是为上皮层内的免疫监督提供了一种机制。因此，同时阻断αEβ7和α4β7可为治疗肠的炎性病况的有用的方法。
已经示出特定的整联蛋白-配体相互作用的抑制剂作为用于治疗各种自身免疫疾病的抗炎剂是有效的。例如，对α4β7显示出高的结合亲和力的单克隆抗体已经对胃肠的自身炎性/自身免疫疾病，诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎显示出治疗益处(同上)。然而，这些疗法干扰α4β1整联蛋白-配体相互作用，从而对患者产生危险的副作用。利用小分子拮抗剂的疗法已经在动物模型中示出类似的副作用，从而防止了进一步开发这些技术。
因此，在本领域需要对α4β7整联蛋白具有高的亲和力并且对α4β1整联蛋白具有高的选择性的整联蛋白拮抗剂分子作为各种胃肠的自身免疫疾病的治疗。
本文公开了此类整联蛋白拮抗剂分子。
发明概述
已经响应于本领域的现存状态并且特别地响应于领域中还未被对α4β7具有选择性的当前可用的整联蛋白拮抗剂彻底解决的问题和需要开发了本发明。因此，本发明提供了α4β7拮抗剂二聚体肽用作抗炎剂和/或免疫抑制剂。此外，本发明提供了α4β7拮抗剂二聚体肽用于治疗与α4β7至表达MAdCAM的组织的生物功能相关的病况。
本发明涉及表现出整联蛋白拮抗剂活性的新型类别的肽化合物。本发明还涉及对α4β7整联蛋白表现出高特异性的新型类别的肽化合物。本发明的化合物包含两个配对的亚基，所述亚基通过它们的C-或N-端经由连接部分连接在一起。本发明的每个亚基还包含两个能够桥接以形成环化结构的天然或非天然氨基酸。因此，本发明的化合物包含二聚化的肽，二聚体的每个亚基通过二硫化物盐桥、酰胺键或等同连接中的至少一种形成环化结构。当以治疗剂口服施用时，该特征为化合物提供了增加的稳定性。与非环化的类似物相比，该特征还提供了增加的特异性和效能。
在一个方面，本发明提供了二聚体化合物，其包含两个连接的式(I)的亚基或其药学上可接受的盐：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15，(I)(SEQIDNO:1)，其中式(I)为根据本发明连接以形成二聚体分子的同聚体或单体，并且其中Xaa1不存在，Xaa1为合适的接头部分，或Xaa1选自氢、Ac-、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa2不存在，Xaa2为Ac-，Xaa2为NH2，Xaa2为合适的接头部分或Xaa2选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa3不存在，Xaa3为Ac-，Xaa3为NH2，Xaa3为合适的接头部分，或Xaa3选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met和Thr、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa4选自Cys、Pen、Asp、Glu、hGlu、β-Asp、β-Glu、Lys、高Lys、Orn、Dap、Dab、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa5选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、高Arg、Dap、Dab、N-Me-Arg、Arg-(Me)sym、Arg-(Me)asym、4-Guan、Cit、Cav和合适的等排体替代物；Xaa6选自Ser、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met和合适的等排体替代物；Xaa7选自Asp、N-Me-Asp和Asp的合适的等排体替代物；Xaa8选自Thr、Gln、Ser、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Val、Tye、Trp、Met和N-甲基氨基酸包括N-Me-Thr；Xaa9选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、Ala、Phe、Leu、Asn、Glu、Val、高Leu、正丁基Ala、正戊基Ala、正己基Ala、N-Me-Leu和合适的等排体替代物；Xaa10选自Cys、Asp、Pen、Lys、高Lys、Orn、Glu,β-Asp、β-Glu、Dap和Dab；Xaa11选自Gly、Gln、Asn、Asp、Ala、Ile、Leu、Val、Met、Thr、Lys、Trp、Tyr、CONH2,COOH、His、Glu、Ser、Arg、Pro、Phe、Sar、1Nal、2Nal、hPhe、Phe(4-F)、O-Me-Tyr、二氢-Trp、Dap、Dab、Dab(Ac)、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、D-Dap、D-DabBip、Ala(3,3二苯基)、联苯基-Ala、芳族环取代的Phe、芳族环取代的Trp、芳族环取代的His、杂芳族氨基酸、N-Me-Lys、N-Me-Lys(Ac)、4-Me-Phe和对应的D-氨基酸以及合适的等排体替代物；Xaa12不存在，Xaa12为合适的接头部分，或Xaa12选自Glu、酰胺、Lys、COOH、CONH2、Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa13不存在，Xaa13为Ac，Xaa13为合适的接头部分，或Xaa13选自Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Glu、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、COOH、CONH2、合适的等排体和对应的D-氨基酸；Xaa14不存在，Xaa14为合适的接头部分或Xaa14选自天然氨基酸、COOH，CONH2、合适的等排体替代物、对应的D-氨基酸和对应的N-甲基氨基酸；Xaa15为合适的接头部分，如本文所定义，其中Xaa15选自DIG、DIG-OH、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、三氟丁酸、2-Me-三氟丁酸、三氟戊酸、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸和十二烷二酸；其中式(I)包含由两个亚基通过选自以下的合适的C-或N-端接头形成的二聚体：DIG、DIG-OH、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、合适的芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的聚乙二醇。本领域技术人员将了解本文公开的C-和N-端接头部分为合适的非限制性实例，并且本发明可以包括任何合适的接头部分。因此，本发明的一些实施方案包含选自由SEQIDNO：1-136表示的肽分子的两个单体亚基组成的同源-或异源二聚体分子，其中各自单体的C-或N-端通过任何合适的接头部分连接以提供具有整联蛋白拮抗剂活性的二聚体分子。
在另一方面，本发明提供了用于治疗需要整联蛋白-拮抗剂疗法的患者的组合物，其包含式(I)化合物与药学上可接受的载体的组合。
本发明的又一方面提供了用于治疗需要α4β7-特异性拮抗剂疗法的患者的组合物，其包含对α4β7整联蛋白具有高度选择性的式(I)化合物与药学上可接受的载体组合。
本发明的又一方面提供了用于治疗需要α4β7-特异性拮抗剂疗法的患者的组合物，其包含相对于α4β1整联蛋白对α4β7整联蛋白具有高度选择性的式(I)化合物与药学上可接受的载体的组合。
本发明的又一方面提供了用于治疗需要α4β7-特异性拮抗剂疗法的患者的组合物，其包含相对于αEβ7整联蛋白对α4β7整联蛋白具有高度选择性的式(I)化合物与药学上可接受的载体的组合。
本发明的又一方面提供了用于治疗需要α4β7-特异性拮抗剂疗法的患者的组合物，其包含相对于αEβ7整联蛋白对α4β7整联蛋白具有低选择性的式(I)化合物与药学上可接受的载体的组合。
本发明的又一方面提供了用于治疗需要整联蛋白-拮抗剂疗法的患者的方法，其包括向患者施用治疗有效量的式(I)化合物。
然而，本发明的又一方面提供了用于治疗来自以下的疾病的组合物：溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻(非热带性口炎性腹泻)、与血清反应阴性关节病相关的肠下垂、显微镜下结肠炎或胶原性结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、放疗法或化疗、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术之后产生的结肠袋炎以及各种形式的胃肠癌。在另一实施方案中，病况为胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、慢性支气管炎、慢性鼻窦炎、哮喘或移植物抗宿主病。另外，当与当前可用的疗法、医疗程序和治疗剂组合使用时，这些化合物可以用于预防或逆转这些疾病。
在另一方面，本发明提供了用于可视化和诊断疾病的诊断方法，其包括施用口服稳定的式(I)化合物，所述化合物被至少一种螯合基团和可检测标记进一步标记以用作非侵入性诊断程序的体内显像剂。
附图简述
为了使其中获得的本发明的上述和其它特征以及优点的方式将容易地理解，上文简述的本发明的更具体描述将通过参考在附图中示出的其特定的实施方案而提出。应理解这些附图描述仅为本发明的典型实施方案并不因此被认为限制它的范围，将通过使用附图用另外的特异性和细节描述和解释本发明，其中：
图1为示出C和N-端二聚化的示意图。
图2为根据SEQIDNO：58示出一对整联蛋白拮抗剂单体亚基的示意图，其中，根据本发明的代表性实施方案，亚基在它们各自的C-端通过DIG接头对齐和连接。
图3为根据本发明的各种代表性实施方案显示由SEQIDNO：39、57、82、102和121表示的整联蛋白拮抗剂同源二聚体分子的稳定性数据的图表。
图4为根据本发明的各种实施方案的代表性选择显示由SEQIDNO：71、49、63、59、61、63、65、66和83表示的整联蛋白拮抗剂单体和同源二聚体分子的效能和选择性的图表。
序列表
使用氨基酸的三字母密码子示出了在随附的序列表中列出的氨基酸序列，如在37C.F.R.1.822中所定义。仅示出了单体亚基序列，然而，应理解，根据本教导且如通常在图1和2示出的，单体亚基被二聚化以形成肽二聚体分子。单体亚基可以通过合适的接头部分二聚化，如本文所定义。一些单体亚基示出具有均包含游离胺的C-和N-端。因此，使用者必须修饰单体亚基以消除C-或N-端游离胺，从而允许在剩余的游离胺处二聚化。因此，一些单体亚基包含游离的羧基端和游离的氨基端两者，由此使用者可以选择性地修饰亚基以在期望端实现二聚化。因此，本领域技术人员将了解可以选择性地修饰本发明的单体亚基以实现单一、特定胺的期望的二聚化。
还应理解，除非另外指出，否则本文公开的单体亚基的C-端残基为酰胺。此外，应理解通过使用具有胺官能团侧链的合适的氨基酸促进C-端的二聚化，如本领域中通常所理解的。关于N-端残基，通常理解的是二聚化可以通过末端残基的游离胺来实现，或可以通过使用具有游离胺的合适的氨基酸侧链来实现，如本领域中通常所理解的。
在随附的序列表中：
SEQIDNO：1示出式(I)的二聚体化合物的单体亚基。
SEQIDNO：2示出式(II)的二聚体化合物的单体亚基。
SEQIDNO：3-38、49、57-71、76-117和124-136示出单体亚基的氨基酸序列，根据本发明，所述单体亚基被二聚化以形成各种二聚体化合物，其中这些序列已经被N-甲基化的精氨酸取代。
SEQIDNO：39-44、58-65、67-71、74-76、82、83、85、86、100-114和116-136示出单体亚基的氨基酸序列，根据本发明，所述单体亚基在它们各自C-端被二聚化以形成二聚体化合物。
SEQIDNO：45-57、66、72-73、77-81、84、87-99和115示出单体亚基的氨基酸序列，根据本发明，所述单体亚基在它们各自N-端被二聚化以形成二聚体化合物。
优选实施方案详述
除非上下文中另外明确指定，否则本文使用的单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
如在本说明书中所使用，以下术语具有指定的意义：
本文使用的术语“肽”广义上是指两个或更多个氨基酸通过肽键连接在一起的序列。应理解该术语既不暗示特定长度的氨基酸聚合物，也不旨在暗示或区分多肽是否是使用重组技术合成、化学合成或酶合成产生的或是否为天然存在的。
本文使用的术语“DRP”是指富含二硫化物的肽。
本文使用的术语“二聚体”广义上是指包含两个或更多个亚基的肽，其中所述亚基为在它们的C-或N-端连接的DRP。本发明的二聚体可以包括同源二聚体和异源二聚体，并且作为整联蛋白拮抗剂发挥功能。
本文使用的术语“L-氨基酸”是指肽的“L”异构形式，相反地术语“D-氨基酸”是指肽的“D”异构形式。本文描述的氨基酸残基优选为“L”异构形式，然而，“D”异构形式的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要肽保留所需功能。
本文使用的术语“NH2”是指在多肽的氨基端存在的游离氨基酸。本文使用的术语“OH”是指在肽的羧基端存在的游离羧基。此外，本文使用的术语“Ac”是指通过酰化多肽的C-或N-端的乙酰基保护。
本文使用的术语“羧基”是指-CO2H。
本文使用的术语“等排体替代物”是指具有与指定的氨基酸类似的化学和/或结构性能的任何氨基酸或其它类似物部分。
本文使用的术语“环化的”是指其中一部分多肽分子与另一部分的多肽分子诸如通过形成二硫桥或其它类似的键连接以形成闭合环的反应。
本文使用的术语“亚基”是指在C-或N-端连接以形成二聚体肽组合物的一对多肽单体中的一者。
本文使用的术语“二聚体”是指通过端键和/或端接头连接的两个结构上类似的单体组成的化学实体。
本文使用的术语“接头”广义上是指能够将多个DRP单体亚基连接在一起以形成二聚体的化学结构。
本文使用的术语“受体”是指在细胞表面或在细胞内部对特定的化学基团或分子具有亲和力的分子的化学基团。二聚体肽和靶标整联蛋白的结合可提供有用的诊断工具。
本文使用的术语“整联蛋白-相关的疾病”是指表现为整联蛋白结合的结果并且可以通过施用整联蛋白拮抗剂治疗的适应症。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”表示本发明的化合物的盐或两性离子形式，其为水溶或油溶的或可分散的，其适合于治疗疾病而无异常毒性、刺激和过敏反应；其与合理的效益/风险比相称并且其对它们的预期用途是有效的。在化合物的最终分离和纯化期间可制备盐或通过使氨基基团与合适的酸反应制备盐。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(naphthylenesulfonate)、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。另外，本发明的化合物中的氨基可用以下季胺化：甲基，乙基，丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸盐；癸基，月桂基，肉豆蔻基和甾醇基(steryl)氯化物、溴化物和碘化物；以及苄基和苯乙基溴化物。可用于形成治疗上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及有机酸诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。
所有肽序列根据通常通常接受的惯例书写，由此α-N-端氨基酸残基在左边，而α-C-端在右边。本文使用的术语“α-N-端”是指在肽中的氨基酸的游离α-氨基，术语“α-C-端”是指在肽中的氨基酸的游离α-羧酸端。
对于大部分来说，本文使用的天然存在的和非天然存在的氨酰基残基的名称遵循有机化学命名法IUPAC委员会(theIUPACCommissionontheNomenclatureofOrganicChemistry)和生物化学命名法IUPAC-IUB委员会(theIUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature)所表明的命名约定，如在“Nomenclatureofα-AminoAcids(Recommendations，1974)”Biochemistry，14(2)，(1975)中所列出。如果在本说明书和所附权利要求中使用的氨基酸和氨酰基残基的名称和缩写程度与所表明的不同，则将会对读者解释清楚。一些可用于描述本发明的缩写定义在以下表1中。
表1
缩写 定义
DIG 二甘醇酸(接头)
Dap 二氨基丙酸
Dab 二氨基丁酸
Pen 青霉胺
Sar 肌氨酸
Cit 瓜氨酸(Citroline)
Cav 刀豆氨酸
4-Guan 4-胍-苯丙氨酸
N-Me-Arg N-甲基-精氨酸
Ac- 乙酰基
2-Nal 2-萘基丙氨酸
1-Nal 1-萘基丙氨酸
Bip 联苯丙氨酸
O-Me-Tyr 酪氨酸(O-甲氧基)
N-Me-Lys N-甲基-赖氨酸
N-Me-Lys(Ac) N-e-乙酰基-D-赖氨酸
Ala(3,3二苯基) 3,3二苯基丙氨酸
NH2 游离胺
CONH2 酰胺
COOH 酸
Phe(4-F) 4-氟-苯丙氨酸
PEG13 具有13个聚乙二醇单元的双官能PEG接头
PEG25 具有25个聚乙二醇单元的双官能PEG接头
PEG1K 聚乙二醇分子量为1000Da的双官能PEG接头
PEG2K 聚乙二醇分子量为2000Da的双官能PEG接头
PEG3.4K 聚乙二醇分子量为3400Da的双官能PEG接头
PEG5K 聚乙二醇分子量为5000Da的双官能PEG接头
IDA(Affymax) ββ-Ala-亚氨基二乙酸(接头)
IDA-Palm ββ-Ala(Palityl)-亚氨基二乙酸
hPhe 高苯丙氨酸
Ahx 氨基己酸
DIG-OH 甘醇单酸
三嗪 氨基丙基三嗪二酸(接头)
Boc-三嗪 Boc-三嗪二酸(接头)
三氟丁酸 用4,4,4-三氟丁酸酰化
2-甲基-三氟丁酸 用2-甲基-4,4,4-丁酸酰化
三氟戊酸 用5,5,5-三氟戊酸酰化
1,4-苯二乙酸 对-苯二乙酸(接头)
1,3-苯二乙酸 间-苯二乙酸(接头)
本发明通常涉及已经示出具有整联蛋白拮抗剂活性的DRP。具体地说，本发明涉及包含异源-或同源-单体亚基的各种肽二聚体，它们通过二硫键各自形成环化结构。单体亚基在它们的C-或N-端连接，如图1所示。每个亚基的环化结构已经示出增加二聚体分子的效能和选择性，如下文中所述。环化结构的非限制性、代表性图示示于图2中。
本发明的接头部分可以包括与本文教导相容的任何结构、长度和/或大小。在至少一个实施方案中，接头部分选自由以下组成的非限制性组：DIG、PEG4、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、Boc-IDA、戊二酸、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、1,2-苯二乙酸、三嗪、Boc-三嗪、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的基于聚乙二醇的接头。合适的接头部分的非限制性实例提供在表2中。
表2
本发明还包括已经被各种氨基酸取代的各种DRP。例如，一些肽包括Dab、Dap、Pen、Sar、Cit、Cav、4-guan和各种N-甲基化的氨基酸。本领域技术人员将了解另外的取代可以实现类似的期望结果，并且此类取代在本发明的教导和精神内。
在一个方面，本发明涉及二聚体化合物，二聚体化合物的每个亚基包含结构
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15(I)，其中式(II)Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12，(II)(SEQIDNO：2)或其药学上可接受的盐还表示同源-或异源二聚体分子的亚基，其中每个亚基包含9个氨基酸。九肽的N-端可被一至三个合适的基团修饰，如通过式(I)的Xaa1、Xaa2和Xaa3表示。式(I)的基团Xaa13、Xaa14和Xaa15表示一至三个适合于修饰肽的C-端的基团。
在一些实施方案中，Xaa1、Xaa2和Xaa3不存在。在其它实施方案中，Xaa1不存在，并且Xaa2和Xaa3代表用于修饰九肽的N-端合适的基团。此外，在一些实施方案中，Xaa1和Xaa2不存在，并且Xaa3表示用于修饰九肽亚基的N-端的单一合适的基团。
Xaa1为选自以下的氨基酰基残基：Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体和对应的D-氨基酸。在一些实施方案中，Xaa1为N-端并且因此为Ac或游离NH2。在至少一个实施方案中，Xaa1为Ser。在其它实施方案中，Xaa1不存在。此外，在至少一个实施方案中，Xaa1为选自以下的N-端接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约20,000kDa的基于聚乙二醇的接头。在本发明的范围内用于修饰化合物的N-端的优选的Xaa1基团为游离的NH2、Ac、Lys、dLys。
Xaa2为选自以下的氨基酰基残基：Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met和Thr。在一些实施方案中，Xaa2为Thr或对应的D-氨基酸。当Xaa1不存在时，Xaa2为N-端并且因此为Ac、游离的NH2或合适的接头部分。此外，在至少一个实施方案中，Xaa2为选自以下的N-端接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的基于聚乙二醇的接头。在其它实施方案中，Xaa2不存在。本发明范围内用于修饰化合物的N-端优选的Xaa2基团为Ac、NH2、Lys、dLys和合适的接头部分。
Xaa3为选自以下的氨基酰基残基：Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr和对应的D-氨基酸。当Xaa1和Xaa2不存在时，Xaa3为N-端并且因此为Ac或游离的NH2。此外，在至少一个实施方案中，Xaa3为选自以下的N-端接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约20,000kDa的基于聚乙二醇的接头。在其它实施方案中，Xaa3不存在。在本发明的范围内用于修饰化合物的N-端的优选的Xaa3基团为Ac、Lys、dLys、NH2和合适的接头部分。
在一些实施方案中，Xaa4为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Cys、Pen、Asp、Glu、hGlu、β-Asp、β-Glu、Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab。当Xaa10为Lys、高Lys、Orn、Dap或Dab时，Xaa4的合适的基团为Asp、Glu、hGlu。当Xaa10为Asp、Glu、hGlu时，Xaa4的合适的基团为Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab。当Xaa4和Xaa10为Cys或Pen时，二聚体的每个亚基通过Xaa4与Xaa10之间的二硫键环化。当Xaa4为Lys、高Lys、Orn、Dap或Dab并且Xaa10为Asp、Glu、hGlu时，二聚体的每个亚基通过Xaa4与Xaa10之间的酰胺键环化。优选地，在一个实施方案中，Xaa4为Cys。在另一实施方案中，优选地，Xaa4为Pen。
Xaa5为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、高Arg、Dap、Dab、N-Me-Arg、Arg-(Me)sym、Arg-(me)asym、4-Guan、Cit、Cav和合适的等排体替代物。优选地，Xaa5为N-Me-Arg。在另一实施方案中，优选地，Xaa5为Arg。
Xaa6为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Ser、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met和合适的等排体替代物。优选地，Xaa6为Ser、Gly。
Xaa7为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Asp、N-Me-Asp和Asp的合适的等排体替代物。优选地，Xaa7为Asp。
Xaa8为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Thr、Gln、Ser、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Val、Tye、Trp、Met和N-甲基氨基酸(包括N-Me-Thr)以及Thr的合适的等排体替代物。优选地，Xaa8为Thr。
Xaa9为选自以下的氨基酰基残基或类似物：Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、Ala、Phe、Leu、Asn、Glu、Val、高Leu、正丁基Ala、正戊基Ala、正己基Ala、N-Me-Leu、具有疏水性侧链的氨基酸和合适的等排体替代物。优选地，Xaa9为Leu。
Xaa10为选自以下的氨基酰基残基：Cys、Asp、Pen、Lys、高Lys、Orn、Glu、Dap和Dab。在一些实施方案中，当Xaa4为Lys、Dap、Dab、高Lys或Orn时，Xaa10选自Asp、Glu和hGlu。在其它实施方案中，当Xaa4为Asp、Glu或hGlu时，Xaa10选自Lys、高Lys、Orn、Dap或Dab。在至少一个实施方案中，Xaa10为Pen。当Xaa10和Xaa4均为Cys或Pen时，二聚体的每个亚基通过Xaa4与Xaa10之间的二硫键环化。当Xaa10为Asp、Glu或hGlu并且当Xaa4为Lys、高Lys、Orn、Dap或Dab时，二聚体的每个亚基通过Xaa4与Xaa10之间的酰胺键环化。当Xaa11不存在并且Xaa10为亚基的C-端，Xaa10为COOH或酰胺CONH2。优选地，在一个实施方案中，Xaa10为Pen。在另一实施方案中，Xaa10优选为Cys。
Xaa11为选自以下的氨基酰基残基Gly、Gln、Asn、Asp、Ala、Ile、Leu、Val、Met、Thr、Lys、Trp、Tyr、CONH2、COOH、His、Glu、Ser、Arg、Pro、Phe、Sar、1Nal、2Nal、hPhe、Phe(4-F)、O-Me-Tyr、二氢-Trp、Dap、Dab、Dab(Ac)、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、D-Dap、D-Dab、Bip、Ala(3,3二苯基)、联苯基-Ala、芳族环取代的Phe、芳族环取代的Trp、芳族环取代的His、杂芳族氨基酸、N-Me-Lys、N-Me-Lys(Ac)、4-Me-Phe和对应的D-氨基酸以及合适的等排体替代物。当Xaa12和Xaa13不存在并且Xaa11为亚基的C-端时，Xaa11为COOH或CONH2。在至少一个实施方案中，Xaa11和Xaa12不存在。当Xaa12和Xaa13不存在时，Xaa11为选自以下的接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的基于聚乙二醇的接头。优选地，Xaa11为Trp。在其它实施方案中，Xaa11选自Lys、dLys和N-Me-Lys。
Xaa12为选自以下的氨基酰基残基：Glu、Lys、COOH、CONH2、Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、合适的等排体和对应的D-氨基酸。当Xaa13至Xaa15不存在并且Xaa12为亚基的C-端时，Xaa12为COOH或CONH2。在一些实施方案中，Xaa12不存在。优选地，Xaa12选自Lys、dLys和N-Me-Lys。
Xaa13为选自以下的氨基酰基残基：Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Glu、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、COOH、CONH2、合适的等排体和对应的D-氨基酸。在一些实施方案中，当Xaa14和Xaa15不存在时，Xaa12为C-端并且Xaa13包含选自以下的接头部分：DIG、DIG-OH、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000kDa的基于聚乙二醇的接头。在其它实施方案中，二聚体分子包含N-端接头，并且因此当Xaa14和Xaa15不存在时，Xaa13为C-端并且因此为COOH或CONH2。在至少一个实施方案中，Xaa13为Lys。在其它实施方案中，Xaa13不存在。在至少一个实施方案中，Xaa14为C-端接头。用于修饰C-端的优选的Xaa13基团为游离的NH2、COOH、CONH2和合适的接头部分。
Xaa14为选自以下的氨基酰基残基：天然氨基酸、COOH、CONH2、合适的等排体替代物、对应的D-氨基酸和对应的N-甲基氨基酸。在一些实施方案中，当Xaa15不存在时，Xaa13为C-端并且Xaa14包含选自以下的接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的基于聚乙二醇的接头。在其它实施方案中，二聚体分子包含N-端接头，并且因此当Xaa15不存在时，Xaa14为C-端并且因此为COOH或CONH2。在至少一个实施方案中，Xaa14不存在。在至少一个实施方案中，Xaa14为C-端接头。修饰C-端的优选的Xaa14基团为COOH、CONH2或合适的接头部分。
Xaa15为选自以下的接头部分：DIG、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的基于聚乙二醇的接头。在至少一个实施方案中，Xaa15不存在。优选地，Xaa15为DIG。
本发明的一些实施方案还包括DRP同源二聚体或异源二聚体分子，其中二聚体的每个亚基分子包含由SEQIDNO：1-136中的至少一者表示的氨基酸序列。其它实施方案包括DRP同源二聚体或异源二聚体分子，其中二聚体的每个亚基分子包含含有N-甲基化的精氨酸残基的氨基酸序列，如由SEQIDNO：1-38、49、57-71、75-117和124-136中的至少一者表示。此外，本发明的一些实施方案包括DRP同源二聚体或异源二聚体分子，其中二聚体分子的每个亚基通过二硫键环化，如由SEQIDNO：1-136中的至少一者表示。在其它实施方案中，提供了DRP同源-或异源二聚体分子，其中二聚体的每个亚基分子通过酰胺键环化，如由SEQIDNO：1和2中的至少一者表示，其中Xaa4和Xaa10选自Lys、高Lys、Orn、Dap或Dab、Asp、Glu和hGlu。
二聚体结构和生物活性
本发明提供了各种新型拮抗剂二硫化物肽二聚体。已经测试了这些化合物以更清楚地表征对α4β7结合的亲和力增加，对抗α4β1的选择性增加以及在模拟肠液(SIF)中稳定性增加。这些新型拮抗剂分子显示出与α4β7的高度结合亲和力，从而防止α4β7和MAdCAM配体之间的结合。因此，这些拮抗剂肽已经表现出有效地消除和/或减少各种实验中的炎症过程。
本发明因此提供了各种二聚体肽化合物，其结合或缔合血清和SIF中的α4β7整联蛋白以破坏或阻断α4β7与MAdCAM配体之间的结合。本发明的各种肽化合物可以仅由天然氨基酸构成。可选地，肽化合物可以包括非天然氨基酸，包括但不限于修饰的氨基酸。修饰的氨基酸包括已经被化学修饰以包括氨基酸上非天然存在的一个基团、多个基团或化学部分的天然氨基酸。本发明的肽化合物可以另外地包括D-氨基酸。此外，本发明的肽化合物可以包括氨基酸类似物。
一些拮抗剂二硫化物二聚体已经示出为胃肠稳定的并且为α4β7整联蛋白提供高水平的特异性和亲和力。本发明的一些实施提供包含当暴露于模拟肠液(SIF)时半衰期大于60分钟的二硫化物二聚体。一些实施还提供包含半衰期为约1分钟至约63分钟的DRP。
本发明的化合物为通过连接在其C-或N-端的两个亚基单体形成的同源-或异源二聚体。由SEQIDNO：1-136表示的单体亚基的二聚化相比于它们的非-二聚化单体类似物显示出增加的效能。由于用N-甲基化的类似物残基取代各种天然氨基酰基残基，本发明的一些二聚体化合物还显示增加的效能。例如，SEQIDNO.：1-38、49、57-71、75-117和124-136表示用N-Me-Arg取代的亚基单体序列。此外，本发明的一些二聚体化合物包含经历独立环化的单体亚基，由此所述环化结构相比于它们的非环化的单体和二聚体类似物显示出增加的稳定性。示例这些改善的特定的实例和数据提供在图3和4中。
现参考图3，提供了一个图表，其包括根据本发明对各种非限制性样品同源二聚体分子示例增加的稳定性的各种数据。对由SEQIDNO：39-136表示的所有单体肽以及它们各自的同源二聚体分子进行模拟肠液(SIF)稳定性测定。这些结果的选择性取样提供在图3中。
根据本文讨论的方案，申请人成功地合成、纯化和二聚化由SEQIDNO：39-139表示的所有整联蛋白拮抗剂二聚体分子以形成同源二聚体。
与单体二硫化物亚基肽相比，单体二硫化物肽亚基的二聚化通常显示出增加的稳定性。此外，当与含有Arg的SEQIDNO：39相比时，用N-Me-Arg取代精氨酸大体上增加SIF中的半衰期，如通过SEQIDNO：57显示。在一些实施方案中，当与含有Cys的SEQIDNO：39相比时，用青霉胺(Pen)取代Cys显著增加在模拟肠液(SIF)中的稳定性，如通过SEQIDNO：82，102和121显示。用Pen取代Cys也在还原条件(DTT)下增加稳定性，指示改善的胃部稳定性。
现参考图4，提供了一个图表，其包括根据本发明对各种非限制性样品同源二聚体分子实例增加的效能和选择性的各种数据。对由SEQIDNO：39-136表示的所有单体肽和它们各自的同源二聚体分子进行效能和选择性测定。这些结果的选择性抽样提供在图4中，其中所述同源二聚体肽由样品2、4、5、7、9、11、13、15、17-19和21表示，而各自的单体亚基分子由样品1、3、6、8、10、12、14、16和20表示。通过二聚化，α4β7在ELISA以及细胞粘附测定中实现了效能的显著改善。另外，二聚化产生通过α4β7的改善的效能在对α4β1的选择性中实现的显著的改善。当与α4β7相比时，肽对α4β1也具有低的功效，指示所述肽对α4β7具有选择性。
根据本文讨论的方案，申请人成功地合成、纯化和二聚化由SEQIDNO：39-136表示的所有整联蛋白拮抗剂二聚体分子以形成同源二聚体。每个这些分子经受α4β7-MAdCAM竞争性ELISA测定、α4β1-VCAM竞争性ELISA测定、α4β7-MadCAM细胞粘附测定。对于许多序列，也在单体亚基和二聚体分子上进行这些测定。这些结果的小的抽样提供在图4中。
与单体二硫化物亚基肽相比，单体二硫化物肽亚基的二聚化通常显示出对a4b7的增加的亲和力和/或对a4b1的减少的亲和力，这导致对a4b1的增加的选择性。
在C和N-端二聚化后，也观察到α4β7的效能的显著改善。此外，二聚化也导致对α4β1的效能的损失，这导致在ELISA和细胞粘附测定中对α4β7的选择性增加。当用N-Me-Arg替换Arg时，在ELISA以及细胞粘附测定中对α4β7的效能得到显著改善。
组合物
如上文讨论，整联蛋白为起细胞粘附分子作用的异源二聚体。α4整联蛋白——α4β1和α4β7在遍及胃肠道中的淋巴细胞迁移起重要作用。它们在大多数白细胞(包括B和T淋巴细胞、单核细胞和树突细胞)上表达，从而它们经由结合于它们各自的主配体，即血管细胞粘附分子(VCAM)和粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM)而介导细胞粘附。VCAM和MAdCAM在结合特异性上是不同的，VCAM结合α4β1和α4β7两者，而MAdCAM对α4β7具有高度特异性。
VCAM和MAdCAM在表达谱中的差异提供了它们在炎性疾病中的作用的最可信的证据。两者均在消化道中组成型表达；然而，VCAM表达延伸到周围器官，而MAdCAM表达限制在胃肠道器官。另外，消化道中升高的MAdCAM表达现已经与若干消化道-相关的炎性疾病相关，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和丙型肝炎。
本发明的化合物(包括但不限于实例中指定的那些)具有整联蛋白-拮抗剂活性。在一个实施方案中，病况或医学指征包含以下中的至少一种：炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻(非热带性口炎性腹泻)、与血清反应阴性关节病相关的肠下垂、显微镜下结肠炎或胶原性结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、放疗法或化疗、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术之后产生的结肠袋炎以及各种形式的胃肠癌、骨质疏松症、关节炎、多发性硬化、慢性疼痛、增重和抑郁。在另一实施方案中，病况为胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、慢性支气管炎、慢性鼻窦炎、哮喘或移植物抗宿主病。另外，当与当前可用的疗法、医疗程序和治疗剂组合使用时，这些化合物可以用于预防或逆转这些疾病。
本发明的化合物可以与治疗疾病的其它组合物和程序组合使用。另外，本发明的化合物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质，诸如生物可降解聚合物，组合以形成治疗组合物。
治疗方法
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有特征为整联蛋白结合的病况或指征的个体的方法，其中所述方法包括向个体施用根据式(I)或(II)的整联蛋白拮抗剂二聚体分子。在一个实施方案中，提供用于治疗患有特征为表达α4β7的细胞至包含表达MAdCAM的细胞的组织的不适当运输的病况或指征的个体的方法，其包括以足以(部分或全部)抑制表达α4β7的细胞至包含表达MAdCAM的细胞的组织的运输的量向个体施用根据式(I)和式(II)的至少一者的α4β7-拮抗剂二聚体分子。
在一些实施方案中，本发明提供了方法，由此包含根据式(I)的整联蛋白拮抗剂二聚体分子的药物组合物以第一治疗施用于患者。在另一实施方案中，方法还包括向个体施用第二治疗。在另一实施方案中，在将药物组合物施用于个体之前和/或同时或之后，将第二治疗施用于个体。在其它实施方案中，第二治疗包含抗炎剂。在另一实施方案中，第二药物组合物包含选自非甾体抗炎药、甾类和免疫调节剂的药剂。在另一实施方案中，方法包括向个体施用第三治疗。
在一个实施方案中，提供用于治疗患有特征为α4β7整联蛋白结合的病况或指征的个体的方法，其中方法包括向个体施用有效量的根据式(I)和式(II)的至少一者的α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子。在一些情况下，根据式(I)和式(II)的至少一者对α4β7具有高度特异性的α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子以部分治疗性治疗施用于个体用于特征为α4β7整联蛋白结合的病况或指征。本发明的一些实施方案还提供用悬浮在缓释基质中的α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子治疗个体的方法。本文使用的缓释基质为由通常为聚合物的材料制成的基质，所述材料可通过酶或酸-碱水解或通过溶解降解。一旦***身体，基质通过酶和体液起作用。缓释基质期望选自生物相容性材料诸如脂质体、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解基质为聚交酯、聚乙交酯或聚交酯共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)中任一者的基质。
在一些方面，本发明提供了用于口服递送的药物组合物。本发明的各种实施方案和二聚体组合物可以根据本文描述的方法、技术和/或递送媒介物的任一者进行制备用于口服施用。此外，本领域技术人员将了解可以修饰本发明的二聚体组合物或可以将本发明的二聚体组合物整合入本文未公开，然而在本领域中熟知的并且相容的***或递送媒介物用于口服递送小的二聚体肽分子。
与本发明的二聚体肽使用相容的口服剂量形式或单位剂量可以包括二聚体肽活性药物组分和非药物组分或赋形剂以及其它不可重复使用的材料的混合物，所述不可重复使用的材料可以被认为是成分或包装。口服组合物可以包括液体、固体和半固体剂量形式中的至少一种。在一些实施方案中，提供包含有效量的根据式(I)的二聚体肽的口服剂量形式，其中剂量形式包含丸剂、片剂、胶囊、凝胶、糊剂、饮剂和糖浆中的至少一种。在一些情况下，提供口服剂量形式，其经设计并配置所述口服剂量形式以实现肽二聚体在个体小肠中的延迟释放。
在一个实施方案中，根据式(I)的口服药物组合物包含肠溶衣，所述肠溶衣被设计以延迟肽二聚体在小肠中的释放。在至少一些实施方案中，提供药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)的肽二聚体化合物和在延迟释放药物制剂中的蛋白酶抑制剂，诸如抑肽酶。在一些情况下，优选的是本发明的药物组合物包含在pH为约5.0或更高的胃液中可溶的肠溶衣。在至少一个实施方案中，提供药物组合物，所述药物组合物包含含有具有可解离羧基的聚合物的肠溶衣，所述聚合物为诸如纤维素的衍生物，包括羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素和乙酸纤维素偏苯三酸酯以及纤维素的类似衍生物和其它碳水合物聚合物。
在一个实施方案中，在肠溶衣中提供根据式(I)的药物组合物，所述肠溶衣被设计成在个体的下胃肠***内以可控的方式保护和释放药物组合物，并且避免全身副作用。除了肠溶衣之外，本发明的二聚体肽可以被包封、涂覆、接合或以其它方式缔合在任何相容的口服药物递送***或组分内。例如，在一些实施方案中，本发明的二聚体肽在液体载体***中提供，所述液体载体***包含聚合物水凝胶、纳米粒子、微球、胶束和其它脂质***。
为了克服肽在小肠中降解，本发明的一些实施包含水凝胶聚合物载体***，其中根据本发明含有肽二聚体，由此水凝胶聚合物保护肽二聚体免于在小肠内发生蛋白质水解。可以进一步配制本发明的肽二聚体用于与载体***相容使用，所述载体***被设计成增加二聚体肽的溶解动力学和增强肠道吸收。这些方法包括使用脂质体、胶束和纳米粒子以增加肽的GI道渗透。
各种生物响应性***也可以与本发明的一种或多种肽二聚体组合以提供用于口服递送的药剂。在一些实施方案中，本发明的肽二聚体与生物响应性***组合使用，诸如水凝胶和含有氢键基团的粘膜粘附聚合物(如，PEG、聚(甲基丙烯酸)[PMAA]、纤维素、、壳聚糖和藻酸盐)以提供用于口服施用的治疗剂。其它实施方案包括优化或延长本文公开的肽二聚体的药物滞留时间的方法，其中肽二聚体表面的表面通过氢键、含有连接的粘蛋白的聚合物或/和疏水性相互作用修饰以包含粘膜粘附性能。根据本发明的期望特征，这些修饰的二聚体分子可以在个体内显示出增加药物滞留时间。而且，靶向的粘膜粘附***可以特异性地结合于肠细胞和M-细胞表面的受体，从而进一步增加含有二聚体肽的粒子的吸收。
其它实施方案包括用于口服递送根据式(I)的二聚体肽的方法，其中二聚体肽与渗透促进剂组合使用，所述渗透促进剂通过增加细胞旁或跨细胞渗透来促进二聚体肽穿过肠粘膜的运输。例如，在一个实施方案中，渗透促进剂与根据式(I)的二聚体肽组合，其中渗透促进剂包含长链脂肪酸、胆汁盐、两亲性表面活性剂和螯合剂中的至少一种。在一个实施方案中，包含N-[羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠的渗透促进剂用于与本发明的二聚体肽形成弱的非共价缔合，其中渗透促进剂支持膜运输并且一旦达到血液循环会进一步解离。在另一实施方案中，本发明的肽二聚体缀合于寡聚精氨酸，从而增加二聚体肽至各种细胞类型的细胞渗透。此外，在至少一个实施方案中，在根据式(I)的二聚体肽与选自环糊精(CD)和树状物的渗透促进剂之间提供非共价键，其中渗透促进剂减少肽聚集并增加肽二聚体分子的稳定性和溶解性。
本发明的其它实施方案提供用具有增加的半衰期的α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子治疗个体的方法。在一个方面，本发明提供具有足以每天(q.d.)或每天两次给药(b.i.d.)的治疗有效量的至少若干小时至一天的体外或体内(如，当施用于人个体时)半衰期的整联蛋白拮抗剂二聚体分子。在另一实施方案中，二聚体分子具有足以每周(q.w.)给药的治疗有效量的三天或更久的半衰期。此外，在另一实施方案中，二聚体分子具有足以每两周(b.i.w.)或每月给药的治疗有效量的八天或更久的半衰期。在另一实施方案中，二聚体分子为衍生的或修饰的使得与未衍生的或未修饰的二聚体分子相比其具有较长的半衰期。在另一实施方案中，二聚体分子含有一个或多个化学修饰以增加血清半衰期。
当在本文描述的至少一种治疗或递送***中使用时，本发明的治疗有效量的化合物中的一者可以以纯的形式或以药学上可接受的盐的形式(在此种形式存在的情况下)使用。本文使用的“治疗有效量”的本发明的化合物意在描述以适用于任何医学治疗的期望效益/风险比治疗整联蛋白-相关的疾病(例如，以减少与IBD相关的炎症)的足量的肽二聚体化合物。然而，应理解将由主治医师在可靠的医学判断范围内决定本发明化合物和组合物的总的每日用法。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括a)正在治疗的病症和病症的严重性；b)使用的特定化合物的活性；c)使用的特定组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；d)施用时间、施用途径和使用的特定化合物的***率；e)治疗的持续时间；f)与使用的特定化合物组合使用或偶然使用的药物以及在医学领域熟知的类似的因素；例如，化合物的起始剂量水平低于需要实现所需的治疗效果并逐渐增加剂量直至实现所需效果为本领域技术人员熟知的。
可选地，本发明的化合物可以以含有所关注的化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的药物组合物施用。药学上可接受的载体或赋形剂是指非毒性固体、半固体或液体填充物、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。组合物可以经胃肠外、脑池内、***内、腹膜内、直肠内、局部地(如通过粉剂、软膏剂、滴剂、栓剂或经皮贴片)、直肠或经颊施用。本文使用的术语“胃肠外”是指施用模式，其包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、皮内和关节内注射和输注。
用于胃肠外注射的药物组合物包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散剂、悬浮剂或乳剂以及用于临用前重构入无菌可注射溶液或分散剂中的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过保持所要求的颗粒大小以及通过使用表面活性剂。
这些组合物也可以含有佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的预防可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。也可取的是，包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝和明胶引起注射用药物形式的吸收延长。
通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)、聚(酸酐)和(聚)二醇类，诸如PEG的可生物降解聚合物中形成所述药物的微胶囊化基质来制造可注射储库形式。根据药物与聚合物的比率及所使用的具体聚合物的性质，可控制药物释放速率。还通过将所述药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库式可注射制剂。
可以对可注射制剂进行灭菌，例如，通过经细菌截留过滤器过滤，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行，可在使用前将所述无菌固体组合物溶解于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
局部施用包括施用于皮肤或粘膜，包括肺和眼睛的表面。用于局部肺施用的组合物(包括用于吸入和鼻内的那些)可以包含在水性和非水性制剂中的溶液和悬浮剂并且可被制备成干粉，所述干粉可以为加压的或非加压的。在非加压的粉剂组合物中，可以将呈细碎形式的活性成分与包含例如，直径尺寸高达100微米的粒子的较大尺寸的药学上可接受的惰性载体混合使用。合适的惰性载体包括糖，诸如乳糖。
可选地，组合物可以被加压并且含有压缩气体，诸如氮气或液化气体推进剂。液化的推进剂介质，事实上全组合物为优选使得活性成分不会在任何实质程度上溶解于其中。加压的组合物还可以含有表面活性剂，诸如液体或固体非离子表面活性剂或可以为固体阴离子表面活性剂。优选使用呈钠盐形式的固体阴离子表面活性剂。
局部施用的其它形式为施用于眼睛。本发明的化合物在药学上可接受的眼科媒介物中递送，使得化合物与眼表面保持接触充分的时间段以允许化合物渗入眼睛的角膜区域和内部区域，如，例如前房、后房、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫毛、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。药学上可接受的眼科媒介物可以，例如，为软膏剂、植物油或包封材料。可选地，本发明的化合物可以直接注射入玻璃状体和房水。
用于直肠或***施用的组合物优选为栓剂，所述栓剂可以通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，所述合适的无刺激性赋形剂或载体在室温下为固体但在体温下为液体，因此在直肠或***腔中熔化并且释放活性化合物。
本发明的化合物也可以以脂质体的形式施用。如本领域中已知的，脂质体通常来源于磷脂或其它脂质物质。脂质体通过单层或多层水合的液晶体形成，所述水合的液晶体分散在水介质中。可使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理上可接受的且可代谢的脂质。呈脂质体形式的本组合物可含有除了本发明的化合物之外的稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质为天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法为本领域已知的。
以单剂量或分剂量待施用于人或其它哺乳动物宿主的本发明的组合物的总日剂量可以为每天例如，0.0001至300mg/kg体重的量并且更通常能够为1至300mg/kg体重的量。
肠炎的非侵入性检测
本发明的肽可以使用口服稳定的式(I)化合物通过microPET成像作为非侵入性诊断程序的一部分用于肠炎的检测、评估和诊断，所述式(I)化合物用至少一种螯合基团和可检测标记进一步标记。在一个实施方案中，整联蛋白拮抗剂二聚体分子与双官能螯合剂缀合以提供口服稳定的二聚体分子。在另一实施方案中，整联蛋白拮抗剂二聚体分子被放射性标记以提供口服稳定的二聚体分子。然后，口服稳定的、螯合的或放射性标记的二聚体分子经口服或直肠施用于个体。在一个实施方案中，口服稳定的二聚体分子包括在饮用水中。在摄取二聚体分子之后，可以使用microPET成像以显现遍及个体的肠和消化道的炎症。
肽亚基的合成
本发明的单体肽亚基可以通过本领域技术人员已知的许多技术合成。使用本文提供的技术，合成、纯化和二聚化新的独特的单体亚基。
在ProteinTechnology’sSymphony多通道合成仪上使用Merrifield固相合成技术合成本发明的肽。使用HBTU(O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐)、二异丙基乙胺(DIEA)偶联条件组装肽。RinkAmideMBHA树脂(100-200筛目，0.57mmol/g)用于含有C-端酰胺的肽，而含有N-a-Fmoc保护的氨基酸的预加载的Wang树脂用于含有C-端酸的肽。偶联剂(预混合的HBTU和DIEA)在100mmol浓度下制备。类似地，氨基酸溶液在100mmol浓度下制备。使用标准的Symphony方案组装肽。
组装
将肽序列如下组装：将在每个反应小瓶中的树脂(250mg，0.14mmol)用4mlDMF洗涤两次，随后用2.5ml20％的4-甲基哌啶(Fmoc脱保护)处理10min。然后将树脂过滤，用DMF(4ml)洗涤两次并用N-甲基哌啶再处理另外的30分钟。将树脂用DMF(4ml)再洗涤三次，随后加入2.5ml氨基酸和2.5mlHBTU-DIEA混合物。在45min的频繁搅拌之后，将树脂过滤并用DMF洗涤三次(每次4ml)。对于本发明的典型肽而言，对于前25个氨基酸进行双偶联，而对于剩余的残基进行三偶联。在完成偶联反应之后，在进行下一氨基酸偶联之前，将树脂用DMF(每次4ml)洗涤三次。
裂解
在完成肽组装之后，通过用裂解剂，诸如试剂K(82.5％三氟乙酸(trigluoroaceticacid)，5％水，5％茴香硫醚，5％苯酚，2.5％1,2-乙二硫醇)处理从树脂裂解肽。裂解剂能够成功地从树脂裂解肽以及所有剩余的侧链保护基团。
将裂解物在冷的二***中沉淀，随后用***进行两次洗涤。倒出滤液，加入第二等份的冷的醚并重复所述程序。将粗制肽溶解于乙腈:水(7:3，含有1％TFA)的溶液中并过滤。然后在进行纯化之前，使用电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)(Micromass/WatersZQ)证实线性肽的量。
经由氧化的二硫键形成
将50mg粗制、裂解的肽溶解于20ml水:乙腈中。然后逐滴加入含饱和碘的乙酸同时搅拌直至持续为黄色。将溶液搅拌15分钟并用分析性HPLC和LCMS监控反应。当反应完成时，加入固态抗坏血酸直至溶液变澄清。然后将溶剂混合物纯化，所述纯化通过首先用水稀释，然后装载到反相HPLC机器(LunaC18支撑物，10u，100A，流动相A：含有0.1％TFA的水，流动相B：含有0.1％TFA的乙腈(ACN)，在60分钟内开始梯度为5％B，变化至50％B，流速为15ml/min)。然后将含有纯产物的级分在冷冻干燥器上冷冻干燥。
内酰胺键形成
将100mg粗制、裂解的肽(大约0.12mmol)溶解于100ml的无水二氯甲烷中。加入HOBt(1-羟基苯并***水合物)(0.24mmol，2当量)，随后加入DIEA(N,N-二异丙基乙胺)(1.2mmol，10当量)和TBTU(O-(苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)(0.24mmol，2当量)。将混合物搅拌过夜，随后将反应物通过HPLC。当反应完成时，将二氯甲烷蒸发并用水和乙腈稀释，然后装载到反相HPLC机器(LunaC18支撑物，10u，100A，流动相A：含有0.1％TFA的水，流动相B：含有0.1％TFA的乙腈(ACN)，在60分钟内梯度开始为5％B，变化至50％B，流速为15ml/min)上。然后将含有纯产物的级分在冷冻干燥器上冷冻干燥。
纯化
分析性反相高效液相色谱法(HPLC)在GeminiC18柱(4.6mm×250mm)(Phenomenex)上进行。半制备反相HPLC在Gemini10μmC18柱(22mm×250mm)(Phenomenex)或Jupiter10μm，300A°C18柱(21.2mm×250mm)(Phenomenex)上进行。使用含线性梯度的缓冲液B的A(流动相A：含有0.15％TFA的水，流动相B：含有0.1％TFA的乙腈(ACN))以1ml/min(分析性)和15ml/min(制备性)的流速实现分离。使用含线性梯度的缓冲液B的A(流动相A：含有0.15％TFA的水，流动相B：含有0.1％TFA的乙腈(ACN))以1ml/min(分析性)和15ml/min(制备性)的流速实现分离。
接头活化和二聚化
小规模的DIG接头活化程序：将5mlNMP加入至含有IDA二酸(304.2mg，1mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，253.2mg，2.2当量，2.2mmol)和搅拌棒的玻璃小瓶中。在室温下搅拌混合物以完全溶解固体原料。然后将N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC，453.9mg，2.2当量，2.2mmol)加入至混合物中。在10min内出现沉淀并将反应混合物在室温进一步搅拌过夜。然后将反应混合物过滤以去除沉淀的二环己脲(DCU)。在用于二聚化之前，将活化的接头保持在密闭小瓶中。活化接头的标称浓度为约0.20M。
对于使用PEG接头进行二聚化而言，未涉及预活化步骤。使用可商购获得的预活化双功能性PEG接头。
二聚化程序：将2ml无水的DMF加入至含有肽单体(0.1mmol)的小瓶中。用DIEA将肽的pH调节至8～9。然后，将活化的接头(IDA或PEG13，PEG25)(相对于单体为0.48当量，0.048mmol)加入至单体溶液中。将反应混合物在室温搅拌一小时。使用分析性HPLC监控二聚化反应的完成。完成二聚化反应的时间根据接头而改变。在完成反应之后，将肽在冷的醚中沉淀并离心。丢弃上清液醚层。将沉淀步骤重复两次。然后将粗制二聚体使用反相HPLC(LunaC18支撑物，10u，100A,流动相A：含有0.1％TFA的水，流动相B：含有0.1％TFA的乙腈(ACN)，在60min内梯度为15％B变化至45％B，流速为15ml/min)纯化。然后将含有纯产物的级分在冷冻干燥器上冷冻干燥。
模拟肠液(SIF)稳定性测定
在模拟肠液(SIF)中进行研究以评价本发明二聚体分子的胃部稳定性。通过将6.8g磷酸二氢钾和10.0g胰酶加入至1.0L水中来制备SIF。在溶解之后，使用NaOH将pH调节至6.8。首先制备用于测试化合物的DMSO储液(2mM)。将DMSO溶液的等分试样分配到6个单独管中，每个管中含有0.5mlSIF，所述SIF已经被预温热至37℃。
最终测试化合物的浓度为20μM。在实验期间，将小瓶保持在台式中。在每个时间点(0、5、10、20、40和60分钟)，将1.0ml含有1％甲酸的乙腈加入至一个小瓶中以终止反应。将样品储存在4℃直至实验结束。在最终时间点取样之后，将各管混合，然后在3,000rpm离心10分钟。去除等分试样的上清液，以1:1稀释至含有内标的蒸馏水中并通过LCMS/MS分析。基于测试化合物与内标的峰面积响应比计算每个时间点处剩余的百分比。将时间0设为100％，所有以后的时间点相对于时间0来计算。使用GraphPad通过拟合一阶指数式衰减方程计算半衰期。在上文参照图3提供并讨论了这些研究的结果的小的抽样。
实施例
α4β7-MAdCAM竞争性ELISA
将包被镍的板(Pierce#15442)用重组人整联蛋白α4β7(R&D***#5397-A30)以800ng/孔涂覆并在室温在搅拌下孵育1小时。然后通过振荡去除溶液并用测定缓冲液(50mMTris-HClpH7.6，150mMNaCl，1mMMnCl2，0.05％吐温-20和0.5％BSA)以250μl/孔封闭。然后将板在室温孵育1小时。将每个孔用洗涤缓冲液(50mMTris-HClpH7.6，100mMNaCl，1mMMnCl2，0.05％吐温-20)洗涤3次。向每个孔中加入25μl起始为20μM肽的系列稀释(在测定缓冲液中3倍稀释)。然后，将25μl重组人MAdCAM-1(R&D***#6056-MC)以20nM的固定浓度加入至每个孔中。最终起始肽浓度为10μM，而最终MAdCAM-1浓度为10nM。然后将板在室温孵育1小时以达到结合平衡。然后用洗涤缓冲液洗涤孔三次。然后将在测定缓冲液中以1:2000稀释的50μl小鼠抗人IgG1-HRP(Invitrogen#A10648)加入至每个孔中。将所述孔在室温在振荡下孵育45min。然后用洗涤缓冲液洗涤所述孔3次。然后将100μlTMB加入至每个孔中并在显色时间期间密切观察。用2NH2SO4停止反应并在450nm处读取吸光度。
α4β1-VCAM竞争性ELISA
将NuncMaxiSorp板用400ng/孔每孔50μl于1倍PBS中的rhVCAM-1/CD106Fc嵌合体(R&D#862-VC)涂覆并在4℃孵育过夜。通过振荡去除溶液，然后用每孔250μl含1％BSA的1倍PBS封闭。然后将孔在室温在振荡下孵育1小时。然后将每个孔用洗涤缓冲液(50mMTris-HClpH7.6，100mMNaCL，1mMMnCl2，0.05％吐温-20)洗涤一次。将在测定缓冲液(测定缓冲液：50mMTris-HClpH7.6，100mMNaCl，1mMMnCl2，0.05％吐温-20)中的起始为200μM的25μl连续稀释的肽加入至各个孔中。另外，将25μlα4β1(R&D***#5668-A4)以120nM的固定浓度加入至每个孔中。最终肽和α4β1浓度分别为100μM和60nM。然后将板在37℃孵育2小时。然后通过振荡去除溶液，并用洗涤缓冲液洗涤每个孔三次。然后将50μl，4μg/ml的9F10抗体(纯化的小鼠抗人CD49d，BDBioscienceCat#555502)加入至每个孔中，并将板在室温在振荡下孵育1小时。通过振荡再次去除溶液，并用洗涤缓冲液洗涤每个孔三次。将在测定缓冲液中以1:5000稀释的50μl过氧化物酶-缀合的亲和纯化山羊抗小鼠IgG(Jacksonimmuneresearchcat#115-035-003)加入至每个孔中。将板在室温在振荡下孵育30min。然后用洗涤缓冲液洗涤每个孔三次。然后将100μlTMB加入至每个孔中并在显色时间期间密切观察。用2NH2SO4停止反应并在450nm处读取吸光度。
实施例3：α4β7-MAdCAM细胞粘附测定
将RPMI8866细胞(Sigma#95041316)在补充有10％血清(胎牛血清，Invitrogen#16140-071)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen#11360-070)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen#25030-081)以及100单位的青霉素和每ml100μg链霉素的青霉素-链霉素(Invitrogen#15140-122)的RPMI1640HEPES培养基(Invitrogen#22400-089)中培养。将细胞在补充有0.1％BSA、10mMHEPESpH7和1mMMnCl2的DMEM培养基(ATCC#30-2002)中洗涤两次。将细胞以4×106个细胞/ml的密度重新悬浮在补充的DMEM培养基中。
将NuncMaxiSorp板用每孔200ng每孔50μl于1倍PBS中的rhMAdCAM-1/Fc嵌合体(R&D#6065-MC)涂覆并在4℃孵育过夜。然后通过振荡去除溶液，用每孔250μl的含有1％BSA的PBS封闭，并在37℃孵育1小时。通过振荡去除溶液。将肽通过连续稀释而稀释到每孔50μl的最终体积(2倍浓度)。向每个孔中加入50μl细胞(200,000个细胞)并将板在37℃，5％CO2中孵育30-45min以使得细胞粘附。将孔用补充的DMEM手动洗涤三次(每次洗涤为100μl)。在最终洗涤之后，加入100μl/孔的补充的DMEM和10μl/孔的MTT试剂(ATTCcat#30-1010K)。将板在37℃，5％CO2中孵育2-3小时直至看到紫色沉淀物。将100μl去垢剂(ATTCcat#30-1010K)加入至每个孔中。将板遮光，包在封口膜中以防止蒸发并在室温于暗处放置过夜。将板振荡5min并在570nm处测量吸光度。为了计算剂量响应，从每个测试孔中减去未含有细胞的对照孔的吸光度值。
实施例4：α4β1-VCAM细胞粘附测定
将JurkatE6.1细胞(Sigma#88042803)在补充有10％血清(胎牛血清，Invitrogen#16140-071)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen#11360-070)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen#25030-081)以及100单位的青霉素和每ml100μg的链霉素青霉素-链霉素(Invitrogen#15140-122)的RPMI1640HEPES培养基(Invitrogen#22400-089)中培养。将细胞在补充有0.1％BSA、10mMHEPESpH7和1mMMnCl2的DMEM培养基(ATCC#30-2002)中洗涤两次。将细胞以4×106个细胞/ml的密度重新悬浮在补充的DMEM培养基中。
将NuncMaxiSorp板用每孔400ng每孔50μl于1倍PBS中的rhVCAM-1/CD106Fc嵌合体(R&D#862-VC)涂覆并在4℃孵育过夜。然后通过振荡去除溶液，用每孔250μl的含有1％BSA的PBS封闭，并在37℃孵育1小时。通过振荡去除溶液。将肽通过连续稀释而稀释至每孔50μl的最终体积(2倍浓度)。向每个孔中加入50μl细胞(200,000个细胞)并将板在37℃，5％CO2中孵育30-45min以使得细胞粘附。将孔用补充的DMEM手动洗涤三次(每次洗涤为100μl)。在最终洗涤之后，加入100μl/孔的补充的DMEM和10μl/孔的MTT试剂(ATTCcat#30-1010K)。将板在37℃，5％CO2中孵育2-3小时直至看到紫色沉淀物。将100μl去垢剂(ATTCcat#30-1010K)加入至每个孔中。将板遮光，包在封口膜中以防止蒸发并在室温于暗处放置过夜。将板振荡5min并在570nm处测量吸光度。为了计算剂量响应，从每个测试孔中减去未含有细胞的对照孔的吸光度值。
本发明可以在不背离其结构、方法或如本文广泛描述和下文广泛要求保护的其它基本特征的情况下以其它特定形式体现。所描述的实施方案在所有方面仅被视为示例性的而非限制性的。因此，本发明的范围通过所附权利要求而非由前面的描述来指示。在权利要求的含义和等效范围内的所有变化被涵盖在它们的范围内。

Claims (42)

1.肽二聚体化合物或其药学上可接受的盐，其包含两个式(I)的肽单体亚基
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15(I)，其中
Xaa1选自合适的接头部分、不存在、氢、Ac-、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体、对应的D-氨基酸和合适的接头部分；
Xaa2选自Ac-、NH2、合适的接头部分、不存在、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体、合适的接头部分和对应的D-氨基酸；
Xaa3选自Ac-、NH2、合适的接头部分、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、合适的等排体、合适的接头部分和对应的D-氨基酸；
Xaa4选自Cys、Pen、Asp、Glu、hGlu、Lys、高Lys、Orn、Dap、Dab、合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa5选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Thr、高Arg、Dap、Dab、N-Me-Arg、Arg-(Me)sym、Arg-(me)asym、4-Guan、Cit、Cav、合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa6选自Ser、Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Leu、Val、Tye、Trp、Met、合适的等排体替代物和对应的D-氨基酸；
Xaa7选自Asp、N-Me-Asp、Asp的合适的等排体替代物和对应的D-氨基酸；
Xaa8选自Thr、Gln、Ser、Asn、Asp、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Asn、Glu、Val、Tye、Trp、Met、N-甲基氨基酸；合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa9选自Gln、Asn、Asp、Pro、Gly、Ala、Phe、Leu、Asn、Glu、Val、高Leu、正丁基Ala、正戊基Ala、正己基Ala、N-Me-Leu、合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa10选自Cys、Asp、Pen、Lys、高Lys、Orn、GluDap、Dab、合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa11选自Gly、Gln、Asn、Asp、Ala、Ile、Leu、Val、Met、Thr、Lys、Trp、Tyr、CONH2、His、Glu、Ser、Arg、Pro、Phe、Sar、1Nal、2Nal、hPhe、Phe(4-F)、O-Me-Tyr、二氢-Trp、Dap、Dab、Dab(Ac)、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、D-Dap、D-Dab、Bip、Ala(3,3二苯基)、联苯基-Ala、芳族环取代的Phe、芳族环取代的Trp、芳族环取代的His、杂芳族氨基酸、N-Me-Lys、N-Me-Lys(Ac)、4-Me-Phe、对应的D-氨基酸；合适的等排体；和合适的接头部分；
Xaa12选自Glu、酰胺、Lys、COOH、CONH2、Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、合适的等排体、合适的接头部分和对应的D-氨基酸；
Xaa13选自Gln、Pro、Gly、His、Ala、Ile、Phe、Lys、Arg、Leu、Val、Tye、Trp、Met、Glu、Gla、Ser、Asn、Dap、Dab、Orn、D-Orn、N-Me-Orn、N-Me-Dap、N-Me-Dab、N-MeLys、D-Dap、D-Dab、COOH、CONH2、NH2、不存在、合适的接头部分、合适的等排体和对应的D-氨基酸；
Xaa14选自天然氨基酸、不存在、COOH、CONH2、NH2、合适的等排体、合适的接头、对应的D-氨基酸和N-甲基氨基酸；并且
Xaa15选自合适的接头和不存在。
2.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中当Xaa1不存在时，Xaa2选自Ac、NH2和合适的接头。
3.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中当Xaa1和Xaa2不存在时，Xaa3选自Ac、NH2和合适的接头。
4.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中当Xaa10选自Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab时，Xaa4选自Asp、Glu和hGlu，而当Xaa10选自Asp、Glu和hGlu时，Xaa4选自Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab。
5.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中当Xaa4和Xaa10选自Cys和Pen时，Xaa4和Xaa10通过二硫键环化。
6.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中当Xaa4选自Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab并且Xaa10选自Asp、Glu和hGlu时，Xaa4和Xaa10通过酰胺键环化。
7.根据权利要求1所述的肽二聚体化合物，其中所述合适的接头选自DIG、DIG-OH、PEG13、PEG25、PEG1K、PEG2K、PEG3.4K、PEG4K、PEG5K、IDA、IDA-Palm、IDA-Boc、IDA-异戊酸、三嗪、三嗪-Boc、间苯二甲酸、1,3-苯二乙酸、1,4-苯二乙酸、戊二酸、壬二酸、庚二酸、十二烷二酸、合适的脂族化合物、合适的芳族化合物、杂芳族化合物和分子量为约400Da至约40,000Da的聚乙二醇。
8.用于治疗患者的炎性肠病的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求1的肽二聚体化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述炎性肠病为溃疡性结肠炎。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述炎性肠病为克罗恩病。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述肽二聚体化合物抑制α4β7至MAdCAM的结合。
12.用于治疗患有炎性肠病的人的方法，其包括向所述人施用有效量的根据权利要求1所述的组成的肽二聚体的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其还包括其中所述肽二聚体以初始剂量随后以一种或多种随后的剂量施用的步骤，并且任意两个剂量之间的最小间隔为少于1天的时段，并且其中每个所述剂量包含有效量的所述肽二聚体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述有效量的肽二聚体足以实现选自以下的至少一种：a)α4β7整联蛋白分子上MAdCAM结合位点的约50％或更高的饱和；b)细胞表面上α4β7整联蛋白表达的约50％或更高的抑制；以及c)α4β7分子上MAdCAM结合位点的约50％或更高的饱和以及细胞表面上α4β7整联蛋白表达的约50％或更高的抑制，其中i)所述饱和保持与每天不超过两次的给药频率一致的时段；ii)所述抑制保持与每天不超过两次的给药频率一致的时段；或iii)所述饱和和所述抑制各自保持与每天不超过两次的给药频率一致的时段。
15.根据权利要求12所述的方法，其中口服施用所述肽二聚体。
16.根据权利要求12所述的方法，其中胃肠外施用所述肽二聚体。
17.根据权利要求12所述的方法，其中局部施用所述肽二聚体。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述肽二聚体选自SEQIDNO：39-136。
19.根据权利要求12所述的方法，其还包括以足以改善所述炎性肠病的间隔向所述人施用所述肽二聚体的步骤。
20.用于治疗患有与α4β7的生物功能相关的病况的人的方法，所述方法包括向所述人施用根据权利要求1所述的组成的肽二聚体。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括以足以改善所述病况的间隔向所述人施用所述肽二聚体的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述间隔选自全天候、每小时、每四个小时、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每隔一天、每周、每两周和每月。
23.稳定权利要求1的肽二聚体化合物的方法，所述方法包括用选自Cys和Pen的氨基酸残基取代Xaa4和Xaa10的步骤，其中Xaa4和Xaa10通过二硫键形成环化结构。
24.稳定式(II)的肽二聚体化合物或其药学上可接受的盐的方法
Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(II)，
其中所述方法包括用能够通过酰胺键和二硫键中的至少一种形成环化结构的相容性氨基酸残基取代Xaa4和Xaa10的步骤。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述相容性氨基酸选自Cys和Pen，其中Xaa4和Xaa10通过二硫键形成环化结构。
26.根据权利要求24所述的方法，其中当Xaa4选自Lys、高Lys、Orn、Dap和Dab并且Xaa10选自Asp、Glu、hGlu、β-Asp和β-Glu时，Xaa4和Xaa10通过酰胺键环化。
27.药物组合物，其包含根据式(I)和式(II)中的至少一者的肽二聚体化合物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其还包含肠溶衣。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肠溶衣保护所述药物组合物并在个体的下胃肠***释放所述药物组合物。
30.治疗个体的病况的方法，其包括将权利要求27的药物组合物施用于所述个体，其中所述病况可通过(部分地或全部地)降低所述个体中α4β7的活性治疗。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述个体为人。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述病况为胃肠***的炎性病况。
33.治疗患有与α4β7的生物功能相关的病况的人的方法，其包括以足以(部分地或完全地)抑制α4β7对表达MAdCAM的组织的生物功能的量向个体施用式(I)的肽二聚体。
34.治疗患有与α4β7的生物功能相关的病况的人的方法，其包括以足以至少部分地抑制α4β7对表达MAdCAM的组织的生物功能的有效量向个体施用式(I)的肽二聚体。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述病况为炎性肠病。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述病况选自炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻(非热带性口炎性腹泻)、与血清反应阴性关节病相关的肠下垂、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、放疗法、化疗法、直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术之后产生的结肠袋炎、胃肠癌、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、慢性支气管炎、慢性鼻窦炎、哮喘和移植物抗宿主病。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述肽二聚体通过选自以下的施用形式施用于所述个体：口服、静脉内、腹膜、皮内、皮下、肌内、鞘内、吸入、蒸汽疗法、喷雾、舌下、颊部、胃肠外、直肠、***和局部。
38.使用根据式(I)和式(II)中的至少一者的α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子治疗个体的方法，其中所述α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子包括增加的半衰期。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述增加的半衰期在体外或体内为至少一天。
40.根据权利要求36所述的方法，其中当所述半衰期等于或大于与不超过一天两次的体内给药频率一致的时段时，所述α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子包括经口服施用的药物制剂。
41.根据权利要求36所述的方法，其中当所述半衰期在体内为约12小时至大于24小时时，所述α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子包括经胃肠外施用的药物制剂。
42.根据权利要求36所述的方法，其中当所述半衰期在体内为约12小时至大于24小时时，所述α4β7整联蛋白拮抗剂二聚体分子包括局部施用的药物制剂。
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