CN105101982A - 处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种处理包含靶分子和热原剂的海藻提取物的方法，所述方法包括以下步骤：使所述热原剂灭活和/或除去所述热原剂，其中所述方法导致所述提取物的热原性降低。本发明的方法适用于制备其中热原除去具有重要性的药物组合物和生物材料。

Description

处理方法

申请的交叉引用

本申请要求2013年1月25日提交的美国临时专利申请61/756,570的权益，所述申请的说明书的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及处理来自海洋生物如海藻的提取物的方法。更具体地说，本发明涉及生产适用于制造用在伤口护理和外科手术中的胃肠外药物组合物的大致上无热原的提取物。

背景技术

已做了大量工作来致力于证明各种海藻组分的生物活性，所述海藻组分包括多糖组分，如岩藻依聚糖(fucoidan)和石莼聚糖(ulvan)。岩藻依聚糖是在许多褐藻物种的细胞壁中发现的硫酸化多糖。体外研究表明，岩藻依聚糖具有抗肿瘤、抗血管生成(Maruyama H, Tamauchi H, Hashimoto M, Nakano T. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida. In Vivo 2003; 17(3):245-249；Haneji K, Matsuda T, Tomita M等, Fucoidan extracted from cladosiphon okamuranus tokida induces apoptosis of human T-cell leukemia virus type 1-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells. Nutr. Cancer 2005; 52(2):189-201；Liu JM, Bignon J, Haroun-Bouhedja F等, Inhibitory effect of fucoidan on the adhesion of adenocarcinoma cells to fibronectin. Anticancer Res. 2005; 25(3B):2129-2133；Koyanagi S, Tanigawa N, Nakagawa H, Soeda S, Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities. Biochem. Pharmacol. 2003; 65(2):173-179；Alekseyenko TV, Zhanayeva SY, Venediktova AA等, Antitumor and antimetastatic activity of fucoidan, a sulfated polysaccharide isolated from the Okhotsk Sea Fucus evanescens brown alga. Bull. Exp. Biol. Med. 2007年6月;143(6):730-2；Nagamine T, Hayakawa K, Kusakabe T等, Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr. Cancer 2009;61 (3):340-7)、抗病毒(Lee JB, Hayashi K, Hashimoto M, Nakano T, Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu). Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 2004年9月;52(9):1091-4；Hayashi K, Nakano T, Hashimoto M, Kanekiyo K, Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection. Int. Immunopharmacol. 2008年1月;8(1):109-16.)和免疫调节作用(Raghavendran HR, Srinivasan P, Rekha S. Immunomodulatory activity of fucoidan against aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. Int. Immunopharmacol. 2011年2月;11(2):157-63)。这些作用是通过刺激自然杀伤细胞和通过下调参与细胞增殖的AP-1来产生。岩藻依聚糖还表现出神经保护(Do H, Pyo S, Sohn EH. Suppression of iNOS expression by fucoidan is mediated by regulation of p38 MAPK, JAK/STAT, AP-1 and IRF-1, and depends on up-regulation of scavenger receptor B1 expression in TNF-alpha- and IFN-gamma-stimulated C6 glioma cells. J. Nutr. Biochem. 2009年7月1日；Luo D, Zhang Q, Wang H等, Fucoidan protects against dopaminergic neuron death in vivo and in vitro. Eur. J. Pharmacol. 2009年9月1日;617(1-3):33-40.)、辐射防护(Byon YY, Kim MH, Yoo ES等, Radioprotective effects of fucoidan on bone marrow cells: improvement of the cell survival and immunoreactivity. J. Vet. Sci. 2008年12月;9(4):359-65)和抗溃疡(Choi Jl, Raghavendran HR, Sung NY等, Effect of fucoidan on aspirin-induced stomach ulceration in rats. Chem Biol Interact. 2010年1月5日;183(1):249-54)特性。

在其它研究中，岩藻依聚糖显示出抗凝(Colliec S, Fischer AM, Tapon-Bretaudiere J等, Anticoagulant properties of a fucoidan fraction. Thromb. Res. 1991年10月15日;64(2):143-54；Irhimeh MR, Fitton JH, Lowenthal RM. Pilot clinical study to evaluate the anticoagulant activity of fucoidan. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2009年8月18日)和抗血栓形成(Church FC, Meade JB, Treanor RE, Whinna HC. Antithrombin activity of fucoidan. The interaction of fucoidan with heparin cofactor II, antithrombin III, and thrombin. J. Biol. Chem. 1989年2月25日;264(6):3618-23)活性，并且当与抗凝剂一起服用时可具有累加效应。

岩藻依聚糖还显示在术后粘连的预防中特别有前景。Cashman等人的研究(Cashman JD, Kennah E, Shuto A, Winternitz, Springate CMK, Fucoidan Film Safely Inhibits Surgical Adhesions in a Rat Model, J. Surg. Res. 2011年12月171(2):495-503)检验了多种化合物，但鉴别出岩藻依聚糖为最安全和最有效的。与对照薄膜相比，负载有岩藻依聚糖的薄膜使粘连得分降低大约90%。与具有粘连的所有对照薄膜动物相比，总计50%至100%的动物在0.33% w/w至33% w/w的岩藻依聚糖薄膜负载量下是无粘连的。从等同于大约30 mg岩藻依聚糖/kg体重的33% w/w岩藻依聚糖薄膜未观察到任何副作用。

还提出岩藻依聚糖用于伤口护理，并且特别用于烧伤的愈合。参考了Sezer等的工作(Sezer AD, Hatipoglu F, Cevher E, Oğurtan Z, Bas AL, 及Akbuğa J, Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: Preparation and in vitro/in vivo evaluation, AAPS Pharm. Sci. Tech. 2007年6月; 8(2): E94-E101)。这些作者在兔烧伤模型中证明，在岩藻依聚糖-壳聚糖薄膜治疗组中发现最佳再生的乳突状真皮形成、最佳的再上皮化和最快的伤口闭合。

石莼聚糖(其类似于岩藻依聚糖)是从绿色海藻中提取的，并且在临床应用中具有潜力。例如，石莼聚糖作为生物材料制造中的支架、作为药物递送媒介物以及作为免疫调节剂具有显著前景。

从前述将显而易见，自海洋生物提取的多糖具有用于多种和临床上重要的应用中的潜力。在利用这些分子的益处中的一个重大问题是提取物中热原剂的存在。在疾病适应症需要胃肠外施药、直接施药至伤口或手术部位、或植入体内的情况下，这些多糖提取物由于热原诱导的发热、中毒性休克和甚至死亡的相关危险而被禁用。

与“革兰氏阴性细菌内毒素”不同的“微生物热原”已经成为许多不同物质的一般描述性术语。然而，热原物质可由一些***、分枝杆菌、真菌以及病毒产生，但由革兰氏阴性细菌产生的热原(即内毒素)对药物和医学植入物行业具有重要意义。

现有技术公开了一系列方法，这些方法用来对用于医学中的溶液去除热原。许多方法依赖于热原剂的破坏。然而，这类方法经常导致损坏或破坏溶液中的所需分子。在所需分子是天然来源的情况下尤其如此。

其它去热原的方法是针对通过如色谱法和过滤的方式物理性除去热原剂。虽然这类方法显然是更适合于处理含有不稳定分子的溶液，但在这些方法规模扩大至商业化数量的加工时出现重大问题。通常，工业规模分离方法由于介质的成本和经常更换或再生介质的需要而在经济上不可行。特别是已知海藻提取物含有会引起分离介质的阻塞或结垢的残余物和沉淀物。

有关海藻提取物的另一个问题是经常在加工期间发生的不希望的褐色变色的存在。这种变色被认为是由使用碱性条件引起的，并且通常持续存在至最终产品。在提取物被配制成人可注射的组合物的情况下，无色溶液是高度优选的以有助于在施用之前目视检查注射物。

本发明的一个方面是通过提供用于处理海藻提取物以降低热原性和/或减少着色的改进型方法来克服或减轻现有技术的问题。另一方面是对现有处理方法提供一种替代选择。

对文献、行为、材料、装置、物品等的论述仅出于提供本发明的背景的目的而被包括在本说明书中。并未暗示或表示任何或所有这些内容由于其在本申请的各项权利要求的优先权日期之前存在而形成现有技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的公知常识。

发明内容

在第一方面，本发明提供一种处理包含靶分子和热原剂的海藻提取物的方法，所述方法包括以下步骤：使所述热原剂灭活和/或除去所述热原剂，其中所述方法导致所述提取物的热原性降低。所述方法可包括使所述提取物与有效量的以下中的一种或多种相接触：氧化剂(如过氧化物)、表面活性剂(如非离子型表面活性剂)、碱(如氢氧化物)、活性炭、沸石。

靶分子可以是多糖，并且优选多糖如岩藻依聚糖或石莼聚糖。

所述方法内的优选组合包括(i)氧化剂和碱，(ii)氧化剂、碱和表面活性剂，(iii)活性炭和碱。

另一方面，本发明提供一种大致上去热原的海洋生物提取物。所述经处理的提取物可具有小于约100 EU/mg的热原剂水平(如通过LAL所测定)，和/或能够通过兔热原性测试。所述提取物可通过如本文所述的方法产生。

还提供一种药物组合物，其包含如本文所述的大致上去热原的海洋生物提取物与药学上可接受的赋形剂的组合。

本发明的另一方面是一种治疗或预防病状的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用如本文所述的药物组合物或植入如本文所述的生物材料。

另一个方面提供如本文所述的药物组合物或生物材料在医学中的用途。还提供如本文所述的大致上去热原的海洋生物提取物或如本文所述的药物组合物在制造用于治疗或预防病状的药剂中的用途。

具体实施方式

在考虑本说明书之后，对于本领域的技术人员来说将清楚的是如何在各种替代实施方案和替代应用中实施本发明。然而，虽然本发明的各种实施方案将在本文中加以描述，但应当了解，仅以举例方式而非限制方式来呈现这些实施方案。因此，各种替代实施方案的这种描述不应被解释为限制本发明的范围或广度。此外，优点或其它方面的陈述适用于具体示例性实施方案，但不一定适用于权利要求书所涵盖的所有实施方案。

贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包括(comprise)”和所述词语的变化形式如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”不意图排除其它添加剂、组分、整数或步骤。

贯穿本说明书提及“一个实施方案(one embodiment)”或“一实施方案(an embodiment)”意指与所述实施方案相关联描述的具体特点、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一实施方案中(in an embodiment)”不一定全部是指同一实施方案，但可以是指同一实施方案。

在第一方面，本发明提供一种处理包含靶分子和热原剂的海藻提取物的方法，所述方法包括以下步骤：使所述热原剂灭活和/或除去所述热原剂，其中所述方法导致所述提取物的热原性降低。

本申请人已经发现可有效地对海藻和海洋动物的提取物去除热原，从而使它们可安全地供人使用。重要且出人意料的是，已经证实除去和灭活对提取物中存在的活性靶分子无实质副作用。此外，靶分子的回收已被证明是商业上可接受的。

在一个实施方案中，靶分子是多糖，并且优选硫酸化多糖。在一个实施方案中，多糖是岩藻依聚糖或石莼聚糖。

如将从前述背景部分中了解到，这一发现在本领域中是一项重大进展，从而允许更全面地研究海生物中的活性分子(如岩藻依聚糖和石莼聚糖)的体内医学应用，而且潜在地研究这些活性物在药物制剂中或在医学植入物的制造中的常规用途。

在所述方法的一个实施方案中，使热原剂灭活的步骤包括使所述提取物与有效量的以下中的一种或多种相接触：氧化剂、表面活性剂、碱、活性炭、沸石。

不希望受理论限制，在所述方法包括使用氧化剂的情况下，提出氧化剂用于使热原剂灭活。然而，注意到，有效于降低热原性的氧化剂水平不会诱导提取物的多糖分子发生实质性有害变化。在一些实施方案中，岩藻依聚糖分子或石莼聚糖分子大致上保留生物活性。如本文所用，术语“生物活性”是指靶分子诱导生物分子的结构和/或功能变化或诱导生物***或途径中的变化或充当生物材料或充当生物***中的药物递送剂的任何能力。

常见氧化剂包括分子氧、臭氧、过氧化氢(H₂O₂)和其它无机过氧化物；氟(F₂)、氯(Cl₂)和其它卤素；硝酸(HNO₃)和硝酸盐化合物；硫酸(H₂SO₄)、过二硫酸(H₂S₂O₈)、过一硫酸(H₂SO₅)；亚氯酸盐、氯酸盐、高氯酸盐和其它类似卤素化合物；次氯酸盐和其它次卤酸盐化合物，包括家用漂白剂(NaCIO)；六价铬化合物，如铬酸和重铬酸以及三氧化铬、氯铬酸吡啶盐(PCC)和铬酸盐/重铬酸盐化合物；高锰酸盐化合物，如KMnO₄；过硼酸钠、一氧化二氮(N₂O)、氧化银(Ag₂O)、四氧化锇(OsO₄)、Tollens试剂和2,2'-二吡啶基二硫化物(DPS)。

在一个实施方案中，氧化剂是基于氧的氧化剂，如过氧化物、臭氧或分子氧。在一个实施方案中，氧化剂是过氧化氢。为了增强氧化反应，催化剂如铁离子可被包括于氧化反应混合物中。使用过氧化物的一个优点在于，在海藻中经常发现的有色颜料复合物被漂白，从而提供大致上澄清的溶液。

过氧化物的量可取决于提取物的种类和纯度，然而，约10%至约100% (w/w；过氧化物的质量与多糖的质量之比)的范围已被发现是有效的。本文中公开的实验工作证明，可以在作为催化剂的1%柠檬酸铁存在下用约30%氢氧化物(岩藻依聚糖的w/w)实现可接受水平的热原减少。因此，在所述方法的一个实施方案中，过氧化物的量大于约30% (w/w)。

本申请人还证明了海藻提取物的表面活性剂处理的有效性。不希望以任何方式受理论限制，提出用表面活性剂溶解热原剂，并且溶解的试剂更容易被灭活(例如用氧化剂灭活)或除去(例如通过过滤除去)。表面活性剂可以是通常在生物化学中用于溶解细胞组分和其它天然存在的分子的类型的生物表面活性剂。表面活性剂可以是用于组织培养的一种表面活性剂，如3-(N,N-二甲基十四烷基铵基)丙烷磺酸盐、3-(癸基二甲基铵基)丙烷磺酸盐内盐两性离子型洗涤剂、ASB-14、Brij^® 58 (平均M_n约为1124)、来自大豆(Glycine max；soybean)的L-α-溶血磷脂酰胆碱≥99%的冻干粉末、Brij^® 58主要组分：二十-乙二醇十六烷基醚、Brij^® L23溶液30% (w/v)、Brij^® L23主要组分：二十三-乙二醇十二烷基醚、C7BzO、CHAPS、CHAPS0、胆酸、脱氧胆酸、毛地黄皂苷、甘氨胆酸、十六烷基三甲基溴化铵≥98%、六乙二醇单十二烷基醚、IGEPAL CA-630、十二烷基硫酸锂、N-癸酰基-N-甲基葡萄糖胺、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、N-壬酰基-N-甲基葡萄糖胺、Nonidet P-40、辛基D-吡喃葡萄糖苷、辛基α-D-吡喃葡萄糖苷、辛基β-D-l-硫代吡喃葡萄糖苷、普朗尼克F-68、聚氧乙烯(20)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、皂苷、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、甘氨胆酸钠水合物、牛磺脱氧胆酸钠、吐温20、吐温40、吐温80、牛磺胆酸钠盐水合物、曲通X-100、曲通X-114、熊脱氧胆酸、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷。

表面活性剂可以是适用于溶解膜和蛋白质的一种表面活性剂，如2-环己基乙基β-D-麦芽糖苷、3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基铵基)丙烷磺酸盐、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐、3-(苄基二甲基铵基)丙烷磺酸盐、3-(癸基二甲基铵基)丙烷磺酸盐、3-[N,N-二甲基(3-棕榈酰基氨基丙基)铵基]-丙烷磺酸盐、5-环己基戊基β-D-麦芽糖苷、ASB-14、ASB-C80、环己基甲基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、癸基-β-D-1-硫代麦芽吡喃糖苷、癸基-β-D-麦芽糖苷、二甲基癸基氧化膦、二甲基乙基丙烷磺酸铵、十二烷基三甲基氯化铵、EMPIGEN^® BB洗涤剂、十六烷基氯化吡啶 一水合物、六乙二醇单癸基醚、异丙基β-D-l-硫代半乳糖吡喃糖苷、异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷、Lutrol^® OP 2000、MEGA-8、N,N-双[3-(D-葡萄糖酰胺基)丙基]脱氧胆酰胺、N-癸酰基-N-甲基葡萄糖胺、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、N-月桂酰基肌氨酸、N-壬酰基-N-甲基葡萄糖胺、九乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、聚(马来酸酐-交替-1-癸烯)、3-(二甲基氨基)-l-丙胺衍生物、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、牛磺脱氧胆酸钠水合物≥95%、蔗糖单癸酸酯、正庚基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷。

表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是用n摩尔的环氧乙烷(n可以是约12)乙氧基化的醇C12-15、烷基醇聚乙氧基化物非离子型表面活性剂G12 A12、十二醇乙氧基化物非离子型洗涤剂、十二烷醇、乙氧基化的直链醇、月桂基聚乙二醇醚、聚乙二醇单十二烷基醚、月桂醇乙氧基化物、为Teric G12A12 (ICI Chemicals)的示例性形式或等效物。

在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物。在一个实施方案中，表面活性剂是吐温系列中的一种(或等效物)，并且在一个实施方案中是吐温80 (Sigma Aldrich)或等效物。

在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是具有亲水性聚环氧乙烷链(任选地具有约9.5个环氧乙烷单位)和芳香族烃亲脂性或疏水性基团的一种非离子型表面活性剂。烃基团可以是4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基。表面活性剂可以是曲通系列(Supelco)或等效物如普朗尼克系列(BASF)中的一种，并且特别是曲通X-100。

表面活性剂可以至少约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和90% (w/w；表面活性剂的质量与多糖的质量之比)的量使用。在一些实施方案中，表面活性剂以至少约50% w/w的量使用，所述量可导致热原负载的10倍减少。

具体地说，以75% w/w比例添加的Teric® G12A12、Tween® 20和Triton® X100导致有用水平的热原减少。

使用表面活性剂的另一优点在于，可在一些实施方案中提供高达100%的多糖产率。

所述方法可包括使提取物与碱相接触。不希望以任何方式受理论限制，提出碱用于使热原剂灭活。碱性条件(即pH > 7)的效用已在海洋生物提取物的去热原中得以证明。适合的碱可包括金属氧化物、氢氧化物、醇盐和氨。在提取物的工业规模处理中，容易获得的和成本有效的碱如氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化钙可以是适合的。在一个实施方案中，pH被调节至约10.5至约11.0的数字。

在一个实施方案中，碱是优选地呈约0.5摩尔溶液形式的氢氧化钠。在所述实施方案中，每克多糖添加50 mL体积的所述溶液，其可以至少约50 mL的量使用。在使用50 mL的情况下，注意到热原负载的可接受的减少。更高水平的氢氧化物(50 mL的0.1 M氢氧化钠)导致50%的减少。

活性碳和沸石以足以吸附至少一部分所存在的热原剂的量添加至提取物中。可使用至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50% (w/w；吸附剂的质量与多糖的质量之比)的量。至少约10% w/w的量已被证明导致热原负载的减少。

应了解，氧化剂、表面活性剂、碱、活性炭和沸石可以单独使用，或以5种的任何组合、或以任意4种的任何组合、或以任意3种的任何组合、或以任意两种的任何组合的形式使用。

优选的组合是氧化剂与碱的组合。包括在不同温度下用多糖质量的10%-200% (w/w MOH与多糖)范围内的量的MOH (其中M=Na或K)和H₂O₂ (10%-100% w/w过氧化物与多糖）处理持续不同时间的实验已被证明协同作用来显著减少热原。

在一个实施方案中，碱的量足以导致约7.0至约12.5的pH。优选的组合是氧化剂、碱和表面活性剂的组合。虽然过氧化氢与Teric-G12A12的组合未产生比直接过氧化物处理更低的热原负载，但添加碱(如氢氧化钠或氢氧化钾)导致协同作用而降低热原水平。

另一优选的组合是活性碳与碱的组合。已在酸性条件和碱性条件下检验了活性炭，其中在碱性条件下观察到热原负载的显著减少，但在酸性条件下未观察到。

在所述方法包括除去热原剂的步骤的情况下，所述方法包括以下步骤：使提取物与以下中的一种或多种结合：活性炭、沸石、能够大致上特异性地结合于热原剂的配体；并且大致上使所结合的热原剂与靶分子分离。熟练的业内人士熟悉许多方法，通过所述方法可实现所述分离。例如，可利用分批加工方法，其中在容器中处理预定体积的提取物，并且通过使复合物沉降或絮凝来使结合的热原剂与靶分子分离开来。或者，结合的热原剂可通过离心技术或通过磁珠分离方式来分离。

在一个实施方案中，能够大致上特异性地结合于热原剂的配体是多粘菌素B。

标准制备型色谱方法是熟练的业内人士所已知的，如在教科书Preparative Chromatography(制备色谱法) (由H. Schmidt-Traub等编辑, 第二版, 2012, Wiley-VCH Weinheim)中所展示，其内容以引用的方式并入本文。

本发明的方法可包括水解步骤并且任选地包括分级分离步骤以提供不同分子量的多糖片段。已经针对同一多糖源的不同分子量级分的生物活性进行了研究，并发现了显著差异。已发现，岩藻依聚糖的较高分子量级分在抑制肝纤维化方面比未分级的粗岩藻依聚糖更有效(Nakazato等; Attenuation of N-nitrosodiethylamine-induced liver fibrosis by high-molecular-weight fucoidan derived from Cladosiphon okamuranus. J. Gastroenterol. Hepatol. 2010;25:1692-1701)。另一个研究在小鼠中比较了岩藻依聚糖的三种不同级分(Shimizu等; Proportion of murine cytotoxic T-cell is increased by high-molecular weight fucoidan extracted from Okinawa Mozuku (Cladosiphon okamuranus) J. Health Sci. 2005;51:394-397)。此研究证明了差别免疫作用，并且与饲喂较低分子量岩藻依聚糖的那些动物相比，在饲喂高分子量岩藻依聚糖级分的动物的脾中CD8表达有较大增加。

水解可以是部分的或完全的，并且可通过酸性条件、酶处理或本领域技术人员已知的任何其它方式来实现。

分级分离可例如通过熟知方法如色谱方法(例如通过使用尺寸排阻树脂如琼脂糖)或超滤来实现。

或者，所述方法可被应用于已经水解和/或分级分离的多糖制剂。

有利地，所述方法的一些实施方案提供多糖的商业上所希望的产率，同时仍然提供被有效去热原的产物。所述产率可以大于约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一个实施方案中，产率大于约30%。在另一个实施方案中，产率大于约60%。虽然上述产率是基于所回收的多糖的重量来表示，但应了解，可适当地使用生物活性或其它适合的参数。

本申请人已通过使用千克量的干燥岩藻依聚糖产物证明了有关目标岩藻依聚糖在商业上有用的回收率、同时仍然使热原负载降低99%来证明了本发明方法的可缩放性的另一优点。参考本文的实施例20。在一些实施方案中，所述方法能够利用至少约0.1 kg、0.5 kg、1 kg、2 kg、3 kg、4 kg、5 kg、6 kg、7 kg、8 kg、9 kg、10 kg、20 kg、30 kg、40 kg、50 kg、60 kg、70 kg、80 kg、90 kg或100 kg的干燥多糖作为起始材料。

热原剂的灭活或除去可通过熟练的业内人士已知的任何方法来测量。一种适合的测试是鲎变形细胞溶解产物(LAL)测定。多种试剂盒可供使用，如由Associates of Cape Cod Incorporated (MA)出售的“Chromo-LAL”试剂盒。在此测试中，将共冻干LAL和底物试剂与测试样品在微板中混合并且在37℃±1℃下在读数器中孵育。在添加Chromo-LAL之后随时间推移收集吸光度测量值并且通过适合的软件进行分析。计算样品达到指定吸光度(起始OD)所花费的时间(起始时间)；并且生成显示标准内毒素的对数起始时间与对数浓度之间的线性相关的标准曲线。标准曲线的内毒素浓度的最大范围是0.005 EU/mL 50 EU/mL。所述测定的灵敏度(λ)被定义为用于标准曲线中的最低浓度。此测试的最大灵敏度是0.005 EU/mL。

从标准曲线读取未知样品的对应起始时间的内毒素浓度，所述标准曲线是起始时间对标准浓度的双对数曲线或起始时间的对数对标准浓度的对数的算法曲线。针对示例性标准曲线生成的双对数线方程式是Y= - 0.2X + 3.14，其中Y = 对数起始时间并且X = 对数内毒素浓度。具有1630秒平均起始时间的未知样品中的内毒素浓度将通过以下方式来计算：将起始时间换算成其对数值3.212，求解方程式中的X，并且取得X的反对数以获得浓度：

X = (Y-3.14)/-0.2

X = (3.212 - 3.14)/-0.2

X = -0.36

反对数(-0.36) = 0.44 EU/mL (或EU/mg)

通常，如通过LAL所测量，海藻提取物中的内毒素水平是5,000与10,000 EU/mg之间。本发明的去热原法方法可使内毒素减少至小于约9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 EU/mg的水平。

适用于证明热原剂的灭活或除去的另一个测试是美国药典兔热原测试(USP<151>)。兔热原测试是一种用于定性地检测热原的体内测试。兔具有与人相似的热原耐受性，因此通过观察兔的体温变化，有可能确定热原的存在。此方法可检测非细菌内毒素热原以及细菌内毒素。

当被投以适当量的产品时，如果没有兔显示出高于其相应对照温度0.5℃或更高的个别温度上升，则所述产品符合不存在热原的要求。如果任何兔显示出0.5℃或更高的个别温度上升，则使用五只其它兔继续测试。如果八只兔中不超过三只显示出0.5℃或更高的个别温度上升并且如果八个个别最高温度上升的和不超过3.3℃，则所检验的材料符合不存在热原的要求。

在所述方法的一个实施方案中，注射所处理的提取物未导致任何兔表现出高于其相应对照温度0.5℃或更高的个别温度上升。在使用5只其它兔继续测试的情况下，在一个实施方案中，注射所处理的提取物导致八只兔中不超过三只显示出0.5℃或更高的个别温度上升并且八个个别最大温度上升的和不超过3.3℃。

LAL和USP兔热原测试两者被美国食品与药品管理局认可为在胃肠外制剂安全性的验证中是可接受的。

在所述方法的一些实施方案中，至少约1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.9%、99.99%或99.999%的热原剂被除去和/或灭活。在一个实施方案中，热原剂被除去和/或灭活至政府监管机构如美国食品药品管理局或欧洲药品管理局或澳大利亚医疗产品管理局或加拿大***可接受的水平；因为那些机构的要求是在本申请的提交日期时被指定。优选地，所述方法提供至少约50%、90%或99%的除去和/或灭活。在一个实施方案中，通过所述方法产生的岩藻依聚糖组合物能够产生能够通过USP兔热原测试和/或LAL测试的组合物。在一个实施方案中，所述方法能够产生具有小于约100 EU/mL的热原水平(如通过LAL所测量)的溶液。

海洋生物提取物可获自以下的褐藻：褐藻纲(Class Phaeophyceae)、海带目(Order Laminariales) (例如厚岸藻科(Akkesiphycacease)、翅藻科(Alariaceae)、绳藻科(Chordaceae)、多肋藻科(Costariaceae)、海带科(Laminariaceae)、巨藻科(Lessoniaceae)和拟绳藻科(Pseudochordaceae))或墨角藻目(Order Fucales) (例如比佛卡瑞普德斯藻科（Bifurcariopsdaceae）、丛梗藻科(Durvillaeaceae)、墨角藻科(Fucaceae)、海条藻科（Himanthallaceae）、索链藻科(Hormosiraceae)、纳斯藻科（Notheiaceae）、马尾藻科(Sargassaceae)和链球藻科(Seirococcaceae))。海带目海藻的实例包括裙带菜属(Genus Undaria)的物种如但不限于裙带菜(U ndaria pinnatifida)，或相关物种如翅菜(Alaria esculenta)、囊根藻多糖(Saccorhiza polysaccharides)、叶囊裙带菜(Undaria undarioides)、无肋裙带菜(Undaria peterseniana)，和海带属(Laminaria sp)如掌状海带(Laminaria digitata)、极北海带(Laminaria hyperborean)、樊基海带(Laminaria ochroleuca)、糖海带(Laminaria saccharina)、阿氏海带(Laminaria agardhii)、狭叶海带(Laminaria angustata)、伯伽地那海带(Laminaria bongardina)、库内佛利亚海带(Laminaria cuneifolia)、刺海带(Laminaria dentigera)、短生海带(Laminaria ephemera)、法氏海带(Laminaria farlowii)、格罗恩兰地卡海带(Laminaria groenlandica)、海带(Laminaria japonica)、长股海带(Laminaria longicruris)、尼格里倍司海带(Laminaria nigripes)、恩特米地阿海带(Laminaria ontermedia)、帕里达海带(Laminaria pallida)、普拉替米瑞司海带(Laminaria platymeris)、糖海带（Laminaria saccharina）、瑟彻利海带(Laminaria setchellii)、辛氏海带(Laminaria sinclairli)、索里顿谷拉海带(Laminaria solidungula)以及狭叶海带(Laminaria stenophylla)。墨角藻目海藻的实例包括墨角藻属（Genus Fucus）的物种，如但不限于墨角藻(Fucus vesicuiosus)、瑟兰诺德墨角藻(Fucus ceranoides)、彻罗尼墨角藻(Fucus chalonii)、库托尼墨角藻(Fucus cottonii)、二列墨角藻(Fucus distichus)、枯墨角藻(Fucus evanescens)、加氏墨角藻(Fucus gardneri)、尼雷德斯墨角藻（Fucus nereideus）、齿缘墨角藻(Fucus serratus)、斯倍莫夫如斯墨角藻(Fucus spermophorus)、螺旋墨角藻(Fucus spiralis)、特都墨角藻(Fucus tendo)以及伟索埃德墨角藻(Fucus virsoides)。

褐藻的其它目包括囊翼藻目(Ascoseirales)、马鞭藻目(Cutleriales)、酸藻目(Desmarestiales)、网地藻目(Dictyotales)、蒂斯克斯帕软交藻目（Discosporangiales）、水云目(Extocarpales)、铁钉菜目(Ishigeales)、尼莫德马太奥藻目（Nemodermatales）、昂斯咯维奥藻目（Onslowiales）、褐壳藻目(Ralfsiales)、萱藻目(Scytosiphonales)、斯托萨米纳奥藻目（Scytothaminales）、黑顶藻目(Sphacelariales)、毛头藻目(Sporochnales)、管皮藻目(Syringodermatales)、线翼藻目(Tilopteridales)以及目科未定(Incertaesedis)。

具体褐藻包括以下的物种：囊翼藻属(Ascoseira)、马鞭藻属(Cutleria)、麦克早尼亚藻属（Microzonia）、杂纳蒂尼亚藻属（Zanardinia）、阿斯如克拉迪亚藻属（Arthrocladia）、酸藻属(Desmarestia)、黑曼托萨拉斯藻属（Himantothallus）、法由如斯目藻属（Phaeurusm）、网翼藻属(Dictyopteris)、网地藻属(Dictyota)、厚缘藻属(Dilophus)、蒂斯处米目藻属（Distromium）、格拉斯法拉藻属（Glossophora）、等毛藻属(Homoeostrichus)、匍扇藻属(Lobophora)、拉博斯皮拉藻属（Lobospira）、纽候斯亚藻属（Newhousia）、厚网藻属(Pachydictyon)、团扇藻属(Padina)、褐舌藻属(Spatoglossum)、棕叶藻属(Stypopodium)、雀尾藻属(Taonia)、圈扇藻属(Zonaria)、斯卡斯比拉藻属（Scoresbyella）、卡瑞斯托卡普斯藻属（Choristocarpus）、蒂斯克斯帕软极目藻属（Discosporangium）、定孢藻属(Acinetospora)、费氏藻属(Feldmannia)、极目纳卡帕斯藻属（Geminocarpus）、痕克藻属(Hincksia)、髭毛藻属(Pogotrichum)、间囊藻属(Pylaiella)、腺藻属(Adenocystis)、卡皮德目藻属（Caepidium）、由垂可里德目藻属（Utriculidium）、顶毛藻属(Acrothrix)、阿斯卡斯拉菲拉藻属（Ascoseirophila）、轴球藻属(Asperococcus)、阿斯托佛利目藻属(Austrofilum)、索藻属(Chordaria)、枝管藻属(Cladosiphon)、卡卡斯藻属（Corycus）、戴氏藻属(Delamarea)、网管藻属(Dictyosiphon)、短毛藻属(Elachista)、真丝藻属(Eudesme)、基拉迪亚藻属（Giraudia）、高纳尼玛藻属（Gononema）、褐毛藻属(Halothrix)、海普拉格拉亚藻属(Haplogloia)、百丝藻属(Hecatonema)、异形褐条藻属(Heterosaundersella)、哈目米亚藻属（Hummia）、伊斯毛普利藻属（Isthmoplea）、带绒藻属(Laminariocolax)、丝带藻属(Laminar ionema)、粘膜藻属(Leathesia)、利普托尼马提拉藻属（Leptonematella）、海管藻属(Litosiphon)、小孢藻属(Microspongium)、米卡斯法藻属（Mikrosyphar）、髓藻属(Myelophycus)、多粘藻属(Myriogloea)、多丝藻属(Myrionema)、毛丝藻属(Myriotrichia)、异丝藻属(Papenfussiella)、石棉藻属(Petrospongium)、侧枝藻属(Pleurocladia)、多孔藻属(Polytretus)、普拉斯拉奇思塔藻属（Proselachista）、原水云属(Protectocarpus)、点叶藻属(Punctaria)、湿粘藻属(Sauvageaugloia)、索拉斯亚藻属（Soranthera）、聚果藻属(Sorocarpus)、斯普马欧其那斯藻属（Spermaiochnus）、球毛藻属(Sphaerotrichia)、斑管藻属(Stictyosiphon)、扭线藻属(Streblonema)、环囊藻属(Striaria)、斯氏藻属(Stschapovia)、面条藻属(Tinocladia)、卡达洛普斯藻属（Chordariopsis）、阿斯特洛克莱东藻属（Asterocladon）、水云属(Ectocarpus)、库氏藻属(Kuckuckia)、中孢藻属(Mesospora)、阿斯特洛垂卡藻属（Asterotrichia）、巴克藻属(Bachelotia)、比佛卡皮斯藻属（Bifurcariopsis）、丛梗藻属（Durvillaea）、泡叶藻属(Ascophyllum)、墨角藻属(Fucus)、西叶藻属(Hesperophycus)、鹿角藻属(Pelvetia)、拟鹿角藻属(Pelvetiopsis)、鹿角菜属(Silvetia)、西佛法拉藻属（Xiphophora）、海条藻属(Himanthalia)、哈目斯拉藻属（Hormosira）、纳斯亚藻属（Notheia）、安斯非卡斯藻属（Anthophycus）、爱克斯拉瑞拉藻属（Axillariella）、双叉藻属(Bifurcaria)、比佛卡普斯藻属（Bifurcariopsis）、卡普格拉斯目藻属（Carpoglossum）、卡拉斯蒂斯藻属（Caulocystis）、丝状分枝藻属(Coccophora)、囊载藻属(Cystophora)、囊链藻属(Cystoseira)、长角藻属(Halidrys)、羊栖菜属(Hizikia)、翼枝藻属(Hormophysa)、囊链藻属(Myagropsis)、米格拉皮斯藻属（Myogropsis）、米拉蒂斯马藻属（Myriodesma）、马尾藻属(Sargassum)、喇叭藻属(Turbinaria)、斯托佛拉藻属（Cystophaera）、马基纳瑞拉藻属（Marginariella）、育叶藻属(Phyllospora)、斯拉卡可斯藻属（Seirococcus）、铁钉菜属(Ishige)、厚岸藻属(Akkesiphycus)、翅藻属(Alaria)、黄金藻属(Aureophycus)、逐合利亚藻属（Druehlia）、尤拉瑞亚藻属（Eualaria）、宽叶藻属(Hirome)、拟巨藻属(Lessoniopsis)、普拉佛卡斯藻属（Pleurophycus）、带翅藻属(Pterygophora)、裙带菜属(Undaria)、安达瑞拉藻属（Undariella）、青裙带菜属(Undariopsis)、绳藻属(Chorda)、孔叶藻属(Agarum)、多肋藻属(Costaria)、网肋藻属(Dictyoneurum)、菊石昆布属(Thalassiophyllum)、猫脚昆布属(Arthrothamnus)、卡斯图拉瑞亚藻属（Costularia）、斯马斯瑞藻属（Cymathere）、非蒂提亚藻属（Feditia）、吉咖提藻属（Gigantea）、海带属(Laminaria)、巨藻属(Macrocystis)、海囊藻属(Nereocystis)、浮叶藻属(Pelagophycus)、浮叶藻属(Pelagophycus)×巨藻属(Macrocystis)、菲考卡斯塔纳木藻属（PhycoCastanum）、菲拉瑞拉藻属（Phyllariella）、普利斯其蒂藻属（Polyschidea）、海棕榈属(Postelsia)、拟巨藻属(Pseudolessonia)、糖藻属(Saccharina)、斯垂普特非拉普斯藻属（Streptophyllopsis）、昆布属(Ecklonia)、拟昆布属(Eckloniopsis)、双眉藻属(Egregia)、爱氏藻属(Eisenia)、巨藻属(Lessonia)、拟绳藻属(Pseudochorda)、尼目德玛藻属（Nemoderma）、昂斯拉委亚藻属（Onslowia）、维拉斯法斯拉藻属（Verosphacella）、纽拉拂斯亚藻属（Neoralfsia）、巴斯普拉藻属（Basispora）、软孢藻属(Hapalospongidion)、浆斯尼亚藻属（Jonssonia）、石皮藻属(Lithoderma)、米拉尼莫普斯藻属（Myrionemopsis）、石皮藻属（Petroderma）、普特利纳马藻属（Porterinema）、拟石皮藻属(Pseudolithoderma)、褐壳藻属(Ralfsia)、毛孢藻属(Chnoospora)、囊藻属(Colpomenia)、网胰藻属(Hydroclathrus)、幅叶藻属(Petalonia)、罗氏藻属(Rosenvingea)、萱藻属(Scytosiphon)、博达尼拉藻属（Bodanella）、空枝藻属(Coelocladia)、茸壳藻属(Heribaudiella)、褐层藻属(Phaeostroma)、阿斯特洛尼马藻属（Asteronema）、斯托萨目纳斯藻属（Scytothamnus）、斯特罗可拉登藻属（Stereocladon）、斯普拉其你德目藻属（Splachnidium）、枝轮藻属(Cladostephus)、黑顶藻属(Sphacelaria)、斯法斯拉藻属（Sphacella）、阿拉斯可拉德斯藻属（Alethocladus）、海翅藻属(Halopteris)、硬茎藻属(Stypocaulon)、阿斯特尼瑞藻属（Austronereia）、比拉提亚藻属（Bellotia）、果冠藻属(Carpomitra)、恩斯萨利亚藻属（Encyothalia）、海神藻属(Nereia)、皮瑞斯普其纳斯藻属（Perisporochnus）、皮瑞萨利亚藻属（Perithalia）、斯普拉其尼马藻属（Sporochnema）、毛头藻属(Sporochnus)、土马库拉普斯藻属（Tomaculopsis）、管皮藻属(Syringoderma)、哈拉斯方藻属（Halosiphon）、马斯纳非克斯藻属（Masonophycus）、菲拉瑞普斯藻属（Phyllariopsis）、囊根藻属(Saccorhiza)、斯氏藻属(Stschapovia)、单孢藻属(Haplospora)、法斯非尼拉藻属（Phaeosiphoniella）、线翼藻属(Tilopteris)、尼乐皮纽玛藻属（Neolepioneuma）、安纳里普斯藻属（Analipus）以及褐种阜藻属(Phaeostrophion)。

具体褐藻包括以下的物种：腺藻属（Adenocystis）、翅藻属（Alaria）、泡叶藻属（Ascophyllum）、绳藻属（Chorda）、枝管藻属（Cladosiphon）、酸藻属（Desmarestis）、网地藻属（Dictyota）、丛梗藻属（Durvillaea）、昆布属（Ecklonia）、水云属（Ectocarpus）、双眉藻属（Egregia）、墨角藻属(Fucus)、长角藻属（Halidrys）、海条藻属（Himanthalia）、哈目斯纳藻属（Hormosiria）、黏膜藻属（Lethesia）、巨藻属(Lessonia)、巨海藻属(Macrocystis)、海囊藻属（Nereocystis）、团扇藻属（Padina）、浮叶藻属（Pelagophycus）、鹿角藻属（Pelvatia）、间囊藻属（Pilaiella）、海棕榈属（Postelsia）、萨克黑泽藻属（Saccrhiza）、马尾藻属（Sargassum）、黑顶藻属（Sphacelaria）以及喇叭藻属（Turbinaria）。

其它适合的海洋生物包括绿色海藻和棘皮动物如海胆和海参。绿色海藻的实例包括石莼属(Ulva sp)物种、浒苔属(Enteromorpha sp)物种、松藻属(Codium sp)物种、蕨藻属(Caulerpa sp)物种以及哈利马拉（Halimala sp）物种。

在一个实施方案中，提取物来源于裙带菜、墨角藻或石莼属物种。

岩藻依聚糖还可来源于绳藻(Chorda filum)、岗村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、昆布(Ecklonia kurome)、红色鹿角藻(Pelvetiafastigiata)、褐条藻(Saundersella simplex)或鞭状索藻(Chordariaflagelliformis)。

因此，提取物可来源于任何棕色或绿色海藻或任何棘皮动物。

在海洋生物是植物的情况下，提取物可来源于整株植物或植物的任何部分，如叶、茎、孢子或其组合。用于制备提取物的起始材料可以是新鲜的、冷冻的或干燥的材料。

可使用工序，如浸软、渗出、煎煮、在回流下提取、借助于超声学提取、通过在溶剂相之间分配而辅助的提取以及在有或无共溶剂情况下的超临界提取来制备提取物。海藻的酸或碱处理还可用于形成可用作本发明方法的起始材料的提取物。

在一个实施方案中，所述方法是用于分离碳水化合物，并且具体地说用于分离多糖。多糖可以是藻酸盐或硫酸化多糖。

在一个实施方案中，硫酸化多糖是岩藻依聚糖或岩藻依聚糖衍生物。在本发明的上下文中，术语“岩藻依聚糖(fucoidan)”意指在许多海洋植物和动物中发现的类型的硫酸化α-L-岩藻聚糖。

在一个实施方案中，硫酸化多糖是石莼聚糖或石莼聚糖衍生物。在本发明的上下文中，术语“石莼聚糖(ulvan)”意指来自绿藻的由不同程度的硫酸化鼠李糖、木糖、葡糖醛酸和艾杜糖醛酸残余物组成的硫酸化细胞壁组分。

此外，术语“岩藻依聚糖”和“石莼聚糖”还包括其生物活性片段、衍生物或类似物。还包括通过较大分子的降解(例如水解)产生的岩藻依聚糖或石莼聚糖的片段。降解可通过用酸、碱、热量或酶处理来实现以得到降解的岩藻依聚糖或石莼聚糖，其可以或可以不单独地分离。岩藻依聚糖和石莼聚糖还可化学改变并且可具有修饰，其包括但不限于硫酸化、聚硫酸化、乙酰化、酯化和甲基化。

在一个实施方案中，所述方法缺乏需要使用石棉、脂多糖去毒性酶、盐酸胍、硫酸铵、色谱树脂、Acticlean内毒素、固定化组胺或曲通二氧化硅或在本申请的提交日期可商购的任何其它去热原过滤器的步骤。

一方面，本发明提供一种大致上去热原的海洋生物提取物。优选地，所述提取物具有小于约100 EU/mL的热原剂水平(如通过LAL所测定)，和/或能够通过兔热原性测试。

另一方面，本发明提供通过如本文所述的方法产生的提取物。

在一个实施方案中，所述提取物至少部分地通过本文所公开的方法产生。应了解，本发明方法可用用于减少和/或除去热原剂的其它步骤增强。

可针对其中包含的多糖的纯度和各种特性对处理的提取物进行分析，如分子量、碳水化合物含量(包括岩藻糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸)、重金属污染、硫酸化、乙酰化、反离子和水。许多分析技术可用于表征多糖样品，其包括但不限于，高效液相色谱法(HPLC)、元素组成分析、激光散射(LLS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、紫外可见光谱(UV-Vis)以及GC-MS。在一些实施方案中，当与未处理的岩藻依聚糖相比时，处理的提取物中的岩藻依聚糖关于一种或多种前述特性是大致上类似的。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本文所述的方法产生的多糖与药学上可接受的赋形剂的组合。示例性赋形剂包括但不限于，碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱以及其组合。适合用于可注射组合物的赋形剂包括水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂和表面活性剂。碳水化合物如糖、衍生的糖如糖醇、醛糖酸、酯化的糖和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括例如：单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以及其组合。

本发明的组合物还可包含抗微生物剂，以用于防止或阻止微生物生长。适用于本发明的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞以及其组合。

所述组合物可包含抗氧化剂以抑制氧化，从而防止制剂的岩藻依聚糖或其它组分的劣化。用于在本发明中使用的适合的抗氧化剂包括例如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、多酚、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠以及其组合。

表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如“吐温20”和“吐温80”，以及普朗尼克类如F68和F88 (BASF)；脱水山梨糖醇酯；脂质如磷脂，如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，如胆固醇；螯合剂，如EDTA；以及锌和其它这类适合的阳离子。

酸或碱可作为赋形剂存在于所述组合物中。可使用的酸的非限制性实例包括选自由以下组成的组的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸以及其组合。适合的碱的实例包括但不限于，选自由以下组成的组的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾以及其组合。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包含根据如本文所述的方法产生的多糖的生物材料。石莼聚糖可用作生物胶接剂(例如骨胶接剂)，或用于形成三维支架以促进新组织的生长。此外，石莼聚糖可用作可生物降解的水凝胶，并且潜在适用作药物递送媒介物。在所述背景下，石莼聚糖可例如通过接枝自由基可聚合基团来官能化以获得可生物降解的水凝胶。

本发明的去热原岩藻依聚糖将在一种或多种临床应用中或在无菌离体应用中具有效用，特别是作为凝血的调节剂、溶纤维蛋白剂、作为抗癌剂、作为抗病毒剂(具体参见申请人的公布的国际专利申请WO/2011/100805，其内容以引用的方式并入本文)或作为造血干细胞或其它类型干细胞动员剂。

本发明的除热原的岩藻依聚糖提取物可具有效用的其它临床适应症包括炎症。岩藻依聚糖可通过选择蛋白阻断活性、清除剂受体阻断和炎性细胞积聚的调节起作用。急性和慢性炎性病状包括哮喘、过敏性皮炎、心血管疾病、局部缺血后炎症以及继其它感染或病理之后的炎症。

去热原岩藻依聚糖提取物可在放射和化学疗法佐剂的背景下充当干细胞动员剂以保护癌症患者的干细胞。所述提取物可适用作直接抗癌剂或辅助抗癌剂。还考虑针对肠道病症的治疗性应用。具体地说，由乙醇或其它剂或者由感染如幽门螺杆菌和艰难梭菌引起的胃病状。

还考虑抗病毒应用，包括治疗疱疹病毒感染(包括HSV1、HSV2以及其耐药性菌株)、巨细胞病毒(HCMV)、流感病毒、HIV。局部或口服递送将是在这些情况中典型的，但是一些疱疹感染可能需要通过注射或其它方法直接应用于所述部位。

鉴于岩藻依聚糖增强免疫功能，包括免疫细胞(如单核细胞、NK细胞和树突状细胞)的数目和活性的能力，涉及免疫调节的病状也是潜在适合的。已知岩藻依聚糖增强这些细胞的活性以便产生抗病原或抗癌作用。

另一考虑的用途是用于抗粘连疗法中以防止外科手术应用中的粘连。

另一考虑的用途是用于离体和体内调节酶功能(包括涉及凝血、葡萄糖代谢的那些)、调节基质蛋白质更新和其它酶过程。本发明的岩藻依聚糖提取物还可用于调节生长因子如TGFβ及其受体的活性。

本发明的去热原提取物可用于神经疾病(包括依赖于淀粉状蛋白积聚的那些)、凝血病症(包括作为抗血栓形成剂、溶血栓剂或抗凝剂或促凝剂)以及血友病、局部化妆品乳膏、牙科应用、眼部应用中以及作为用于P选择蛋白成像的放射性标记的载体。此外，本发明的去热原岩藻依聚糖提取物可用作用于抗生素或其它活性剂的释放剂或载体。

去热原提取物可通过任何适合的方法递送至身体并且递送至身体的任何部分，如由临床医生认为必要或适当。

因此，本发明提供使用如本文所述的组合物治疗人和其它哺乳动物中的这类病状的方法。

现在将参考以下非限制性实施例来更全面地描述本发明。

实施例 1 ： 从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

起始材料是先前针对岩藻依聚糖纯化至约87%的冻干产物，其包含中性碳水化合物(大约50% - 27.5%岩藻糖、22.5%半乳糖)、硫酸盐(26%)、乙酰基部分(3%)和反离子(8%)。

在所述方法中使用的所有水在使用之前通过去热原过滤器过滤。对所有设备进行消毒并且在使用之前用去热原水冲洗。

将2.86 kg的冻干岩藻依聚糖产物溶解于50倍 (143 L)的0.05 M NaOH中。

通过首先将约114.4 L的去离子水(即143 L的80%)放置于反应容器中来进行溶解。将5.94 kg的NaOH添加至去离子水中，并且添加143 L的去离子水的剩余部分。然后在混合时添加固体岩藻依聚糖(2.86 kg)。将溶液加热至40℃，同时混合直到所有固体完全溶解。然后将溶液在40℃下保持10分钟。

将3 kg的Speedplus助滤剂(Dicalite, PA)添加至所述溶液中，并且使用压力过滤器进行过滤。收集180 L的滤液，并且将其转移至新鲜反应容器。

将2.6 L的H₂O₂ (50% w/w)添加至滤液中并且在混合的同时将溶液在60℃下保持1小时。然后允许将溶液冷却至45℃，并且用H₂SO₄ (36% w/w)将pH调节至10.0至10.5。实现10.44的最终pH。

将经pH调节的溶液使用77 ft²的具有30 kDa标称截止值的膜(Synder Filtration, CA)进行超滤。

组装UF设备并且通过在45℃至50℃、pH 10至11下每100 L的去离子水再循环150 mL NaOCI的溶液持续30分钟来进行消毒。将所述设备用至少200 L的去热原的去离子水进行冲洗。将岩藻依聚糖溶液添加至渗余物容器中，并且进行超滤直到渗余物被浓缩至原始体积的约20%。将进给压力维持为2.0巴，并且在整个超滤步骤中渗余物压力为1.0巴。渗透通量以12.5 L/分钟开始，并且在超滤结束时下降至10.8 L/分钟。

然后使用去热原的去离子水(160 L)对浓缩的岩藻依聚糖溶液(40 L)进行渗滤。将进给压力维持在2.0巴下，渗余物压力维持在1.0巴下。渗透通量在20分钟内从10.9 L/分钟降低至7.5 L/分钟。

然后用H₂SO₄将pH调节至8，并且再用4体积(160 L)的去热原的去离子水继续渗滤。将进给压力维持在2.0巴下，渗余物压力维持在1.0巴下。渗透通量在27分钟渗滤的过程内从7.5 L/分钟降低至6.0 L/分钟。

然后将溶液浓缩直至40 L的体积。

使浓缩液通过新的Cuno 1 DEPL除热原过滤器，并且随后冻干。回收总计1820 g的固体。将冻干产物通过Comil 032筛网进行研磨。

计算到63%的过程产率。注意到热原的90%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 2 ： 通过与沸石相接触、接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(15.00 g)溶解于300 mL的蒸馏水中并且通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液用蒸馏水补足至300 g。将岩藻依聚糖溶液的40 mL等分部分用蒸馏水稀释至100 mL，并且添加0.2 g的沸石。将悬浮液搅拌14小时，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且用100 mL的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至40 mL的最终体积并且冻干。

注意到热原的1%减少(如通过LAL所测量)。

类似的过程但无沸石接触步骤则产生92.5%的岩藻依聚糖产率，但无热原减少。

实施例 3 ： 通过与 低水平的碱和活性碳 相接触 、 接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(15.00 g)溶解于300 mL的蒸馏水中并且通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液用蒸馏水补足至300 g。将岩藻依聚糖溶液的40 mL等分部分用0.5% NaOH稀释至100 mL，并且添加0.2 g的活性碳。将悬浮液搅拌14小时，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且用100 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至40 mL的最终体积并且冻干。注意到热原的66%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 4 ： 通过与 表面活性剂 相接触 、 接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(10.00 g)溶解于300 mL的去热原的水中。将溶液通过玻璃纤维过滤器过滤以产生澄清褐色溶液(约280 mL)。

将岩藻依聚糖溶液的75 g等分部分用蒸馏水稀释至150 mL，并且添加1.8 g的Teric® G12A12。将悬浮液搅拌1小时，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且用100 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至40 mL的最终体积并且冻干。注意到热原的93%减少(如通过LAL所测量)。

将岩藻依聚糖溶液的75 g等分部分用蒸馏水稀释至150 mL，并且添加1.8 g的Tween® 20。将悬浮液搅拌1小时，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且用100 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至40 mL的最终体积并且冻干。

将岩藻依聚糖溶液的75 g等分部分用蒸馏水稀释至150 mL，并且添加1.8 g的Triton® X100。将悬浮液搅拌1小时，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且用100 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至40 mL的最终体积并且冻干。

实施例 5 ： 通过与低水平的过氧化物相接触、接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(6.00 g)溶解于250 mL的蒸馏水中。使用自动滴定仪分配0.5 M NaOH来将pH保持在7.00下。将溶液在热板上在搅拌下加热至90℃，然后添加3.0 mL的30% w/w H₂O₂。在1小时之后，反应已经消耗了4.37 mL的碱。将溶液在室温下静置过夜，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池过滤并且用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至50 mL并且冻干。

注意到热原的83%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 6 ： 通过 在铁系催化剂存在下 与过氧化物相接触 、 接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(10.00 g)溶解于250 mL的蒸馏水中。使用自动滴定仪分配0.5 M NaOH来将pH保持在7.00下。将溶液在热板上在搅拌下加热至60℃，然后添加10.0 mL的30% w/w H₂O₂和0.1 g的柠檬酸铁III。在4小时之后，14.92 mL的碱被消耗。将溶液在室温下静置过夜，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池过滤并且用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至50 mL并且冻干。

注意到热原的94%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 7 ： 通过 在铁系催化剂存在下 与高水平的过氧化物相接触、用第二过氧化物处理、接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(10.00 g)溶解于250 mL的蒸馏水中。使用自动滴定仪分配0.5 M NaOH来将pH保持在7.00下。将溶液在热板上在搅拌下加热至60℃，然后添加10.0 mL的30% w/w H₂O₂和0.1 g柠檬酸铁III。在2小时之后，12.10 mL的碱被消耗。再添加5.0 mL的30% w/w H₂O₂。在10小时之后，总计15.23 mL的碱已经被消耗。将溶液在室温下静置过夜，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池过滤并且用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物，之后浓缩至50 mL并且冻干。

注意到热原的99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 8 ： 通过 在铁系催化剂 和表面活性剂 存在下 与高水平的过氧化物相接触、接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(10.00 g)溶解于250 mL的蒸馏水中。使用自动滴定仪分配0.5 M NaOH来将pH保持在7.00下。将溶液在热板上在搅拌下加热至70℃，然后添加10.0 mL的30% w/w H₂O₂和0.1 g柠檬酸铁III。在1小时之后，12.22 mL的碱已经被消耗。将溶液冷却并且在室温下静置过夜，之后通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液的125 mL等分部分用2.0 g的Teric® G12A12处理1小时，之后通过Amicon搅拌池超滤。将渗余物用170 mL的去热原的蒸馏水洗涤，之后浓缩至30 mL并且冻干。

注意到热原的99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 9 ： 通过与 高水平的碱 相接触 、 接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(2.00 g)溶解于100 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40℃。在10分钟之后，通过离心分离出固体并且丢弃。将上清液通过玻璃纤维过滤器过滤并且将50 mL等分部分加热至60℃持续3小时。然后将反应混合物用去热原的蒸馏水稀释至100 mL并且通过Amicon搅拌池超滤至5 mL的浓缩度。然后将渗余物用75 mL的去热原的蒸馏水洗涤，浓缩至5 mL并且冻干。

注意到热原的>99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 10 ： 通过与低水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触 、 接着超滤来进行从裙带菜纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(2.00 g)溶解于100 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40℃。在10分钟之后，通过离心分离出固体并且丢弃。将上清液通过玻璃纤维过滤器过滤并且将50 mL等分部分在60℃下用1.00 mL的30% w/w H₂O₂处理3小时。然后将反应混合物用去热原的蒸馏水稀释至100 mL并且通过Amicon搅拌池超滤至5 mL的浓缩度。然后将渗余物用75 mL的去热原的蒸馏水洗涤，浓缩至5 mL并且冻干。

注意到热原的>99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 11 ： 通过与低水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触、接着超滤来进行从大昆布 (Ecklonia maxima) 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(8.00 g)溶解于400 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至45 ℃。在10分钟之后，将溶液在65℃下用4.00 mL的30% w/w H₂O₂处理1小时。然后将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液的pH用50% H₂SO₄从13.0调节至10.5并且然后通过Amicon搅拌池超滤且浓缩至20 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至20 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 12 ： 通过与低水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触、接着超滤来进行从墨角藻纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(6.3 g)溶解于300 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至45℃。将反应混合物加热至65℃并且用2.00 mL的30% w/w H₂O₂处理1小时。然后将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液的pH用50% H₂SO₄从11.7调节至11.0并且然后通过Amicon搅拌池超滤且浓缩至20 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至20 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

注意到热原的>99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 13 ： 通过与 高 水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触 、 接着超滤来进行从 泡叶藻 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(15.0 g)溶解于735 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40 ℃。将反应混合物离心并且将上清液通过Dicalite助滤剂过滤。将滤液加热至60℃并且用30.0 mL的30% w/w H₂O₂处理1小时。然后将pH 10.0的反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 14 ： 通过与低水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触 、 接着超滤来进行从 翅菜 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(4.0 g)溶解于200 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40 ℃。将反应混合物离心并且将上清液通过Dicalite助滤剂过滤。将滤液加热至60℃并且用5.0 mL的30% w/w H₂O₂处理30分钟。然后将pH 10.7的反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 15 ： 通过与低水平的过氧化物 和高水平的碱 相接触 、 接着超滤来进行从 边花 昆布 (Ecklonia radiata) 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(4.0 g)溶解于200 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40 ℃。将反应混合物离心并且将上清液通过Dicalite助滤剂过滤。将滤液加热至60℃并且用2.0 mL的30% w/w H₂O₂处理30分钟。然后将pH 10.7的反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 16 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着超滤来进行从羊栖菜 (Sargassum fusiforme) 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(4.0 g)溶解于200 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40℃。将反应混合物离心并且将上清液通过Dicalite助滤剂过滤。将滤液加热至70℃并且用0.7 mL的30% w/w H₂O₂处理30分钟。然后将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 17 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着超滤来进行从巨藻 (Macrocystis pyrifera) 纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(2.0 g)溶解于200 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40℃。然后将反应混合物加热至65℃并且用1.0 mL的30% w/w H₂O₂处理30分钟。然后将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 18 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着超滤来进行从岗村枝管藻 (Cladosiphon okamuranus) 纯化的岩藻依聚糖的去热原

将岩藻依聚糖(4.0 g)溶解于200 mL的0.5 M NaOH中，同时加热至40℃。将反应混合物离心并且将上清液通过硅藻土助滤剂过滤。将滤液加热至65℃并且用2.0 mL的30% w/w H₂O₂处理30分钟。然后将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外2次。然后将最终浓缩的渗余物冻干。

实施例 19 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着超滤来进行从石莼属 (Ulva sp.) 纯化而来的石莼聚糖的去热原

将石莼聚糖(2.0 g)溶解于150 mL的0.5 M KOH中，同时加热至55℃。将滤液加热至65℃并且用6.0 mL的30% w/w H2O2处理60分钟。然后用50% H₂SO₄将反应混合物从pH 12.1中和至pH 7.8。然后将滤液通过Amicon搅拌池超滤并且浓缩至30 mL的体积。然后将渗余物用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤，并且再浓缩至30 mL。重复50 mL洗涤和再浓缩另外3次。然后将最终浓缩的渗余物通过0.2 μm过滤器过滤并且冻干。

注意到热原的>99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 20 ： 从墨角藻纯化而来的岩藻依聚糖的去热原

起始材料是先前针对岩藻依聚糖纯化至约95%的冻干产物，其包含中性碳水化合物(大约60.1% - 54.0%岩藻糖、3.0%半乳糖)、硫酸盐(27.5%)和反离子(7.5%)。

在所述方法中使用的所有水在使用之前通过蒸馏进行纯化。对所有设备进行消毒并且在使用之前用纯化水冲洗。

将1.99 kg的冻干岩藻依聚糖产物溶解于50倍 (100 L)的0.04 M KOH中。

通过首先将约100 L的纯化水放置于反应容器中来进行溶解。将4 L的50% KOH添加至纯化水中，并且将溶液加热至60℃。然后在混合的同时添加固体岩藻依聚糖(1.99 kg)。将溶液维持在60℃下，同时混合直到所有固体完全溶解。溶液获得11.9的pH。

将0.5 L的H₂O₂ (50%)添加至滤液中并且在混合的同时将溶液在65℃下保持1小时。然后用H₂SO₄ (50% w/w，3.35 L)将溶液从11.9 pH调节至9.5至10.0。实现9.8的最终pH。然后使溶液冷却至45℃。

将经pH调节的溶液使用各自78 ft²的具有5 kDa标称截止值的三个膜(Koch, MA)进行超滤。

对UF设备进行组装并且通过再循环100 L的0.05% w/w KOH溶液、接着在45℃至50℃下100 L的100 ppm NaOCI溶液、并且最后100 L的0.1% w/w H₂O₂溶液(各自持续15分钟)来进行消毒。然后将所述设备用至少200 L的纯化水进行冲洗。将岩藻依聚糖溶液添加至渗余物容器中，并且进行超滤直到渗余物被浓缩至原始体积的约30%。在整个超滤步骤中将渗余物压力维持在50 psi下。渗透通量以2.0 L/分钟开始，并且在超滤结束时是1.6 L/分钟。

然后将浓缩的岩藻依聚糖溶液(30 L)使用纯化水(120 L，按每份10 L)进行渗滤。将渗余物压力维持在50 psi下。渗透通量在7分钟内保持在1.5 L/分钟下。

然后将溶液浓缩直至22 L的最终体积。

然后将浓缩液冻干。回收总计820 g的固体。

计算到41%的过程产率。注意到热原的99%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 21 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着两级超滤来进行从墨角藻纯化而来的岩藻依聚糖的去热原和分级分离

将岩藻依聚糖(50 g)溶解于2 L的1% w/w H₂SO₄中，同时加热至50℃。将反应混合物在此温度下搅拌1小时。通过添加50% w/w NaOH将溶液pH从1.2升至4.0。

再添加50 g的固体NaOH，并且在10分钟内将反应混合物加热至65℃。添加H₂O₂ (26 mL，30% w/w)，并且将反应混合物搅拌另一小时。

通过添加50% w/w H₂SO₄将溶液pH从12.0降低至10.5，允许冷却过夜，然后使用Advantec AMI UHP搅拌池超滤。

使用30 kDa膜将反应混合物首先浓缩至500 mL，然后将渗余物(>30kDa级分)用500 mL的蒸馏水洗涤并且再浓缩至500 mL。重复洗涤/再浓缩另外三次。渗透物(<30 kDa级分)经历相同浓缩工序，接着洗涤且再浓缩四次，这次使用10 kDa膜。收集最终渗余物(10-30 kDa和>30 kDa级分两者)并且冻干。

对于两种级分注意到热原的98%减少(如通过LAL所测量)。

实施例 22 ： 通过与低水平的过氧化物和高水平的碱相接触 、 接着超滤来进行来自裙带菜的岩藻依聚糖的原位分离、纯化和去热原

将海藻(5.0 g，裙带菜)悬浮于先前已经加热至55℃的100 g的0.5% w/w H₂SO₄中。将pH 1.8的所得悬浮液在50℃下搅拌4小时并且然后通过覆盖在硅藻土中的纤维素过滤器过滤。然后用10% w/w NaOH将滤液的pH升至11.0并且将溶液在搅拌下加热至45℃。向所述溶液中添加0.5 mL的30% w/w H₂O₂，并且通过添加10% w/w NaOH将溶液pH维持在pH 10.9以上。在1小时之后，将溶液从加热中移去并且用10% w/w H₂SO₄将pH降低至5.01。然后将冷却的溶液通过Amicon搅拌池过滤并且用50 mL的去热原的蒸馏水洗涤渗余物三次，之后浓缩至50 mL并且冻干。获得10.8%的纯化的白色岩藻依聚糖的分离产率。

应了解，虽然已经从多个离散方面描述了本发明，并且关于每个方面公开了某些实施方案和/或优选特征，但可预期各个实施方案或优选项中的任何一项可与任何方面共同实现。此外，任何给定方面的特征可与任何其它方面的特征一起实现。

虽然本文描述的一些实施方案包括在其它实施方案中包括的一些特征但不包括其它特征，但不同实施方案的特征的组合意图在本发明的范围内，并且形成不同实施方案，如将由本领域的技术人员所理解。

Claims (28)

1.一种处理包含靶分子和热原剂的海藻提取物的方法，所述方法包括以下步骤：使所述热原剂灭活和/或除去所述热原剂，其中所述方法导致所述提取物的热原性降低。

2.如权利要求1所述的方法，其包括使所述提取物与有效量的以下中的一种或多种相接触：氧化剂、表面活性剂、碱、活性炭、沸石。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述氧化剂是过氧化物。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述过氧化物以至少约30％(w/w；过氧化物的质量与多糖的质量之比)的量使用。

5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是生物表面活性剂。

6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。

7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以至少约50％(w/w；表面活性剂的质量与多糖的质量之比)的量使用。

8.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述碱以足以导致大于约7.0且小于约12.5的pH的量使用。

9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述活性碳或所述沸石以至少约10％(w/w；吸附剂的质量与多糖的质量之比)的量使用。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括使所述提取物与有效量的氧化剂和碱相接触。

11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括使所述提取物与有效量的氧化剂、碱和表面活性剂相接触。

12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括使所述提取物与有效量的活性碳和碱相接触。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中关于多糖的回收率是至少约30％。

14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中关于多糖的回收率是至少约60％。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中至少约50％的热原剂被除去和/或灭活。

16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中至少约99％的热原剂被除去和/或灭活。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述靶分子是多糖。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述多糖是硫酸化多糖，任选地为岩藻依聚糖或石莼聚糖。

19.一种提取物，其通过如权利要求1至18中任一项所述的方法产生。

20.一种大致上去热原的海洋生物提取物。

21.根据权利要求20所述的提取物，其具有如通过LAL所测定小于约100EU/mg的热原剂水平。

22.根据权利要求20所述的提取物，其能够通过兔热原性测试。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的提取物，其通过如权利要求1至18中任一项所述的方法产生。

24.一种药物组合物，其包含根据权利要求19至23中任一项所述的提取物与药学上可接受的赋形剂的组合。

25.一种生物材料，其包含根据权利要求19至23中任一项所述的提取物。

26.一种治疗或预防病状的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用如权利要求24所述的药物组合物或植入根据权利要求25所述的生物材料。

27.一种如权利要求24所述的药物组合物或如权利要求25所述的生物材料或如权利要求19至23中任一项所述的提取物的用途，其用于医学中。

28.一种如权利要求19至23中任一项所述的提取物或如权利要求25所述的生物材料或如权利要求24所述的药物组合物的用途，其用于制造用以治疗或预防病状的药剂。