CN105092833A - 一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的elisa方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA方法，所述方法为利用(E)-2-(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯(OEBr)合成半抗原(OESCH2CH2COOH)，并与牛血清蛋白(BSA)形成偶联物，免疫健康白兔得到多克隆抗体，此后以醚菌酯和肟菌酯(肟基乙酸酯类杀菌剂)为标准品，以OESCH2CH2COOH和卵清蛋白(OVA)的偶联物作为包被原，建立柑橘中肟基乙酸酯类杀菌剂的间接ELISA方法，为肟基乙酸酯类杀菌剂在柑橘中的残留检测提供了快速高效的检测手段，费用较低且重复性好。

Description

一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗原合成及ELISA检测方法。

背景技术

肟基乙酸酯类杀菌剂属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的一类，杀菌谱广，安全高效。虽然这类农药毒性低，但因用量逐年增加，仍旧存在安全风险。因此国内外仍然对其在食品中的残留进行了监控并制定了严格的限量标准，造成我国农产品出口壁垒，影响我国的出口经济形势。

当前，该类杀菌剂常用的气相、液相等仪器检测方法灵敏度高、准确性好、检查范围广，且已有较为成熟的检测标准，但是所需仪器昂贵、样品前处理时间较长，不适于现场监测。

免疫检测方法(immunoassay，IA)也具有灵敏度高、特异性强的特点，并且可以克服繁杂的前处理步骤，广泛运用于现场检测，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥着越来越重要的作用。

因此有必要开发一种免疫技术用于检测肟基乙酸酯类的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。本发明主要选取醚菌酯和肟菌酯为代表，进行ELISA方法的建立。

肟基乙酸酯类杀菌剂的毒杀基为甲氧亚胺基乙酸甲酯，而(E)-2-(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯(OEBr)是一种常见的农药中间体(图1，分子量＜1000)，结构中包含肟基乙酸酯类杀菌剂的活性官能团，因此将其作为半抗原合成原料之一与巯基丙酸(图2)合成肟基乙酸酯类杀菌剂的人工半抗原(AR)。该半抗原仍是一种小分子物质，没有免疫原性，须与大分子载体(蛋白)等偶联得到人工抗原后，才可以作为动物免疫原料，制备多克隆抗体。

本发明根据以合成的与肟基乙酸酯类杀菌剂的化学结构类似的人工半抗原(OESCH2CH2COOH)与牛血清蛋白和卵清蛋白进行偶联，分别制得免疫原和包被原。

发明内容

本发明需要解决的第一个技术问题在于提供一种肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗原的合成方法及测定方法。

1.技术方案

(1)人工半抗原合成

在50mL三口瓶中，加入5mL1equiv的巯基丙酸乙醇溶液，然后加入2equiv的NaOH，放在有加热功能的磁力搅拌器中搅拌反应，直至溶解。加入1equiv的OEBr乙醇溶液，加热回流反应1.5h后抽滤得到透明溶液，旋转蒸发除去有机溶剂。然后用5mL5％NaHCO₃溶液溶解残留物并转移到分液漏斗中，用正已烷萃取2次，每次5mL，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至3左右，和二氯甲烷进行液液分配，反复3次，收集有机相。有机相过无水Na₂SO₄，减压浓缩近干，得黄色油状物。

(2)人工抗原的合成

a.免疫原(活化酯法)：将半抗原0.1mmol和NHS0.1mmol用1.0mLDMF溶解。磁力搅拌下，向上述溶液中逐滴加入1.0mL的0.1mmolDCC的DMF溶液，室温搅拌反应1h，4℃冰箱中搅拌过夜。次日，离心取上清液，在搅拌状态下，将上清液逐滴加入到6.0mL，60mgBSA的pH8.0硼酸缓冲液中，约半小时加完，室温磁力搅拌反应1h，4℃搅拌反应过夜，次日取出，溶液转入透析袋中，悬于大烧杯中，4℃，pH7.4的PBS缓冲液透析3天，每4h换水一次。冻干保存。

b.包被原(混合酸酐法)：称取150mgOVA溶于10mL的硼酸缓冲液中，80μmol的半抗原溶解在1mL的DMF中，然后在该溶液中加入等当量的三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应1h，反应液500μL加入到8mL的15mg/mL的OVA硼酸缓冲液中，磁力搅拌，反应2h。反应完成后，转入透析袋，先用蒸馏水透析1次，再换pH7.4的PBS透析，整个透析过程持续三天，每4小时换透析液一次。冻干保存。

(3)本发明同时对所制备的人工半抗原及抗原的鉴定方法进行了公开说明，方法包括TNBS显色法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE，具体包括下列步骤：

1)人工半抗原的鉴定：称取合成的半抗原的样品，适当稀释成合适的检测浓度，进行TLC(图3)、紫外(图4)、红外图谱扫描(图5)、质谱(图6)和核磁(图7)。读取半抗原的波峰与波谷的位置并分析半抗原的官能团的红外吸收情况、分子量及各官能团的原子组成。

2)人工免疫原和包被原的鉴定：将BSA用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的溶液，取1mL加入到1mLpH10的碳酸盐缓比色。根据吸光值和蛋白质浓度作出标准曲线。斜率即BSA单位浓度的吸光值。

将制备的半抗原用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的溶液，其余步骤同上，作出曲线，曲线斜率即为样品单位浓度的吸光值。

a.氨基消耗率＝(OD_{蛋白单位浓度}-OD_{样品单位浓度})/OD_{蛋白单位浓度}

b.AR与载体蛋白克分子结合比＝AR氨基消耗率×每分子载体蛋白氨基个数载体蛋白的游离氨基大部分来自赖氨酸，每分子BSA和OVA赖氨酸个数以56和20计。

同时，将制备的抗原进行紫外(图4)、红外(图8)、SDS-PAGE(图9)，须保证所含的BSA的浓度在同一水平，分析结构与分子量。

本方法合成的目的半抗原保留了肟基乙酸酯类杀菌剂毒杀基的化学结构，有利于后续的免疫分析的特异性，合成过程简便，适合大量生产。

本方法合成的目的人工免疫原和包被原符合免疫要求，操作易实现，可以商品化。

(4)在此基础上，本发明的第二项技术问题是用制备的免疫原免疫动物，得到针对肟基乙酸酯类杀菌剂的多克隆抗体，对该抗体的进行鉴定并建立以醚菌酯和肟菌酯为代表的肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA检测方法。

制备高效价和高特异性的多克隆抗体首先要有理想的免疫原，合适的动物及可行的免疫方法。目前，国内关于肟基乙酸酯类杀菌剂的免疫分析技术少见报道，尚无快速检测方法的建立。本发明建立的肟基乙酸酯类杀菌剂ELISA检测技术，灵敏度和特异性较好，费用低，仪器化要求低，前处理简便，有可观的经济效益。

多克隆抗体制备的具体技术方案如下：

1)实验动物：雄性新西兰大白兔，体重约2.5kg；

2)免疫及采血：首免前7天，耳缘静脉取血，分离阴性血清。首次免疫，将免疫原(2mg/mL)与等体积的FCA进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的FIA制备疫苗，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的FIA制备疫苗，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；末免，此时效价达到一定水平(3.2×10⁴～6.4×10⁴)，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清。

酶联免疫检测效价的具体步骤为：

1)包被原包板：将Hapten-OVA用包被液稀释至适当浓度，每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；

2)清洗酶标板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤2遍，每次洗3min；

3)封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭2h；接着用PBST洗涤3遍后拍干；

4)加入抗血清：按1∶10³～1∶128×10³梯度稀释抗血清，加入酶标反应孔中，每样至少重复一次，每孔加100μL，37℃孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干。

5)加二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL37℃，30-60min，倒净，洗板3次，每次3分钟，拍干；

6)加入TMB显色剂显色：每孔100μL，置37℃避光放置10-15min。

7)终止反应：每孔加入100μL终止液结束反应，应在20min内测定结果。

8)酶标仪检测：TMB反应后酶标仪450nm波长读取OD₄₅₀。设空白及阴性对照，分别为PBS溶液和免疫前采集的阴性兔血清。

(5)本发明的第三项技术问题是建立一种所述的肟基乙酸酯类杀菌剂免疫检测方法的应用，该方法应用于柑橘中醚菌酯和肟菌酯的检测，利用效价最高(64000)的抗体进行方阵滴定，选择OD₄₅₀≈1的抗原、抗体浓度作为最佳工作浓度，即抗原浓度为10μg/mL，抗体稀释2000倍。

具体步骤为：

1)包被原包板：将Hapten-OVA用包被液稀释至适当浓度，每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜，37℃孵育2h；

2)清洗酶标板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤2遍，每次洗3min；

3)封闭：每孔加入200μL封闭液，置于37℃恒温培养箱封闭2h；接着用PBST洗涤3遍后拍干；

4)加入抗体：用样品稀释液以体积比1∶2000稀释抗体后，与标准品(或样品)1∶1预混过夜，每孔加100μL，37℃孵育半小时后洗涤(PBST)3-4次。

5)加二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL37℃，30-60min，倒净，洗板3次，每次3分钟，拍干；

6)加入TMB显色剂显色：每孔100μL，置37℃避光放置10-15min。

7)终止反应：每孔加入100μL终止液结束反应，应在20min内测定结果。

8)酶标仪检测：TMB反应后酶标仪450nm波长读取OD₄₅₀。设空白及阴性对照，分别为PBS溶液和免疫前采集的阴性兔血清。

9)用含10％甲醇的PBST缓冲液配置浓度为200，20，2，0.2，0.02，0.002μg/mLHapten、醚菌酯、肟菌酯标准溶液。用IC-ELISA方法检测灵敏性，计算三者的抑制中浓度IC₅₀及方法最低检测限IC₁₀。

10)采用与肟基乙酸酯类杀菌剂相似的唑菌铵酯，按建立的检测方法进行交叉反应。用含10％甲醇的PBST缓冲液配置浓度为200，20，2，0.2，0.02，0.002μg/mL的唑菌铵酯溶液，用IC-ELISA方法检测特异性，计算IC₅₀和交叉反应率CR＝[IC₅₀(Hapten)/IC₅₀(唑菌铵酯)]。

11)橘肉样品打浆，称取10.0g，分别添加不同浓度醚菌酯和肟菌酯标准液后旋窝混匀，4℃静置半小时，使药物与样品充分接触。后取出，8000rpm冷冻离心，取上清液。采用上述建立的IC-ELISA检测方法，测定回收率和RSD％。

2.效益结果

以上灵敏性和特异性实验方法显示，半抗原的IC₅₀为9.5μg/mL，IC₁₀为0.005μg/mL；抗体对醚菌酯和肟菌酯有较好的特异性和灵敏性，IC₅₀分别为15.3，19.6μg/mL，IC₁₀分别为0.0074，0.011μg/mL；但对唑菌铵酯的交叉反应率小于0.1％。该方法具有良好的特异性和灵敏度。

采用建立的IC-ELISA检测柑橘样品中醚菌酯和肟菌酯，检测结果表明当加标浓度为100，10，1μg/mL时，醚菌酯回收率分别为104.35％，95.57％，82.73％，RSD％分别为11.1％，10.8％8.8％；肟菌酯回收率分别为92.43％，91.75％，91.10％，RSD％分别为7.4％，10.2％，10.9％此方法符合杀菌剂痕量分析的要求。

具体实施方式

1.仪器

2.试剂

牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)购自sigma公司；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、R250考马斯亮蓝、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、三正丁胺、氯甲酸异丁酯、无水乙醇、二氯甲烷、甲醇、DMF、硼酸、硼砂、氢氧化钠、碳酸氢钠购自杭州米克化工；Tris-base、丙烯酰胺、N，N’-亚甲双丙烯酰胺、过硫酸胺(AP)、N，N，N′，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、DTT、甘氨酸、购自杭州兰堡生物公司。弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)购自sigma公司。GoatAnti-rabbitIgG/HRP由上海博耀生物有限公司提供。TMB单组份显色液，氘代DMSO购自阿拉丁试剂公司。

实施例1肟基乙酸酯类杀菌剂半抗原的合成

按以下半抗原的合成反应途径按图11进行。具体步骤如下：在50mL三口瓶中，加入5mL1equiv的巯基丙酸乙醇溶液，然后加入2equiv的NaOH，放在有加热功能的磁力搅拌器中搅拌反应，直至溶解。加入1equiv的OEBr乙醇溶液，加热回流反应1.5h后抽滤得到透明溶液，旋转蒸发除去有机溶剂。然后用5mL5％NaHCO₃溶液溶解残留物并转移到分液漏斗中，用正已烷萃取2次，每次5mL，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至3左右，和二氯甲烷进行液液分配，反复3次，收集有机相。有机相过无水Na₂SO₄，减压浓缩近干，得黄色油状物。

实施例2肟基乙酸酯类杀菌剂人工抗原的合成

1.免疫原合成的反应途径

按图12免疫原合成的反应途径进行。具体步骤为：将半抗原0.1mmol和NHS0.1mmol用1.0mLDMF溶解。磁力搅拌下，向上述溶液中逐滴加入1.0mL的0.1mmolDCC的DMF溶液，室温搅拌反应1h，4℃冰箱中搅拌过夜。次日，离心取上清液，在搅拌状态下，将上清液逐滴加入到6.0mL，60mgBSA的pH8.0硼酸缓冲液中，约半小时加完，室温磁力搅拌反应1h，4℃搅拌反应过夜，次日取出，溶液转入透析袋中，悬于大烧杯中，4℃，pH7.4的PBS缓冲液透析3天，每4h换水一次。冻干保存。

2.包被原合成的反应途径

按图13包被原合成的反应途径进行。具体步骤为：称取150mgOVA溶于10mL的硼酸缓冲液中，80μmol的半抗原溶解在1mL的DMF中，然后在该溶液中加入等当量的三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应1h，反应液500μL加入到8mL的15mg/mL的OVA硼酸缓冲液中，磁力搅拌，反应2h。反应完成后，转入透析袋，先用蒸馏水透析1次，再换pH7.4的PBS透析，整个透析过程持续三天，每4小时换透析液一次。冻干保存。

实施例3抗原的测定

将获得的黄色油状物用甲醇溶解，进行质谱检测；用氘代DMSO溶解进行核磁检测；用纯水溶解进行紫外吸收扫描；用KBr压片法进行红外光谱检测。

半抗原在2000cm^-1以下有明显的吸收，羧酸中的O-H伸缩的范围在1720-1706cm^-1，图中出现此吸收范围的羧基特征峰，证明结构中含COOH-；在1750cm^-1处可看见有一不明显的吸收峰为C＝O的吸收峰，这是因为羰基与苯环环共轭降低吸收频率。在1600～1450cm^-1有明显的一组吸收峰，推断是半抗原中应有的苯环骨架振动峰及其C＝N双键的振动峰，在1250cm^-1处有-SCH₂-中的-CH₂-的非平面摇摆振动吸收峰。由此证明化合物含目标物所有的特征吸收峰，半抗原在紫外全波段处未见明显的波峰与波谷。质谱核磁测分子量及结构均符合预期结果，初步推断半抗原合成成功。

实施例4偶联物的测定

对偶联产物进行光谱扫描与电泳检测。BSA和OVA在230-240nm处有明显的波谷，而半抗原则没有，同时Hapten-BSA和Hapten-OVA此处的波谷明显被掩盖一部分，说明BSA和OVA已被半抗原修饰且仍保留着蛋白原来的性质。偶联物的电泳条带较蛋白来说相对滞后，说明半抗原与蛋白进行了偶联。

同时测定具体的结合比。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)比色法。将BSA用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的溶液，取1mL加入到1mLpH10的碳酸盐缓比色。根据吸光值和蛋白质浓度作出标准曲线。斜率即BSA单位浓度的吸光值。

将样品用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的溶液，其余步骤同上，作出曲线，曲线斜率即为样品单位浓度的吸光值。

a.氨基消耗率＝(OD_{蛋白单位浓度}-OD_{样品单位浓度})/OD_{蛋白单位浓度}

b.AR与载体蛋白克分子结合比=AR氨基消耗率×每分子载体蛋白氨基个数载体蛋白的游离氨基大部分来自赖氨酸，每分子BSA和OVA赖氨酸个数以56和20计。

按所述的结合比的方法得到结合比测定标准曲线：(BSA)y＝1.646x-0.1542，R²＝0.9976。(OVA)y＝1.712x-0.1431R²＝0.9916。因此，BSA和OVA单位浓度的吸光值分别为1.646，1.712。免疫原样品测定结合比曲线：y=1.269x-0.3082，R²＝0.9568。因此，样品单位浓度的吸光值为1.269。经计算：[(1.646-1.269)/1.646]×56≈12.8。过多的半抗原可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。以BSA为例，每个分子上连接5～20个半抗原为宜。因此本次实验结合比为12.8在范围之内，偶联效果良好。而作为包被原其结合比曲线为y＝0.954x-0.2132，R²＝0.9778。因此，样品单位浓度的吸光值为1.344。经计算：[(1.712-0.954)/1.712]×20≈8.8。

由此确定，半抗原与BSA和OVA均偶联成功，且符合免疫分析技术所要的条件。

实施例5多克隆抗体的制备

采用人工合成的免疫原与Freundadjuvant充分乳化制成疫苗，免疫新西兰大白兔，通过测定效价，获得敏感性较高的多克隆抗体。

1.免疫过程

首免前7天，耳缘静脉取血，分离阴性血清。首次免疫，将免疫原(2mg/mL)与等体积的FCA进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的FIA制备疫苗，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的FIA制备疫苗，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；末免，此时效价达到一定水平(3.2×10⁴～6.4×10⁴)，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清。

2.所需试剂的配制方法

如图14

3.ELISA反应原理

1)加抗原：包被原用包被液稀释至10μg/mL，每孔100μL加入96孔酶标板，盖上保鲜膜37℃孵育2h，按常规方法封闭洗涤；

2)加抗体：用样品稀释液以体积比1∶2000稀释抗体后，与标准品(或样品)1∶1预混过夜，每孔加100μL，37℃孵育半小时后洗涤(PBST)3-4次。

3)加二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50μL37℃，30-60min，倒净，洗板3次，每次3分钟，拍干；

4)加入TMB显色剂显色：每孔100μL，置37℃避光放置10-15min；

5)终止反应：每孔加入100μL终止液结束反应，应在20min内测定结果；

6)酶标仪检测：TMB反应后酶标仪450nm波长读取OD₄₅₀；设空白及阴性对照，分别为PBS溶液和免疫前采集的阴性兔血清。

4.IC-ELISA方法特异性检测

特异性检测用于测定醚菌酯、肟菌酯与抗体的反应能力。采用最佳工作浓度的抗原和抗体的条件。采用同为Strobilurin类杀菌剂的唑菌铵酯，按建立的检测方法进行交叉反应。用含10％甲醇的PBST缓冲液配置浓度为200，20，2，0.2，0.02，0.002μg/mL的唑菌铵酯溶液，用IC-ELISA方法检测特异性，计算IC₅₀和交叉反应率CR＝[IC₅₀(Hapten)/IC₅₀(唑菌铵酯)]。

5.IC-ELISA方法灵敏性检测

用含10％甲醇的PBST缓冲液配置浓度为200，20，2，0.2，0.02，0.002μg/mLHapten、醚菌酯、肟菌酯标准溶液。用IC-ELISA方法检测灵敏性，计算三者的抑制中浓度IC₅₀及方法最低检测限IC₁₀，结果如图15。

唑菌铵酯(Pyraclostrobin)的交叉反应率CR＝IC₅₀(Hapten)/IC₅₀(Pyraclostrobin)＜0.1％。因其结构中不含甲氧亚氨基乙酸甲酯，所以加入系列浓度后与抗体不产生竞争反应。多克隆抗体特异性较好，对含有半抗原结构的肟基乙酸酯类(醚菌酯、肟菌酯等)杀菌剂具有较好的亲和力，对不含该结构的杀菌剂不能有效识别。

6.样品检测及回收率

橘肉样品打浆，称取10.0g，分别添加不同浓度醚菌酯和肟菌酯标准液后旋窝混匀，4℃静置半小时，使药物与样品充分接触。后取出，8000rpm冷冻离心，取上清液。采用上述建立的IC-ELISA检测方法，测定回收率和RSD％。结果见图16，基本符合痕量检测要求。

说明书附图

图1为半抗原合成原料OEBr

图2为半抗原合成原料2-巯基丙酸

图3为半抗原合成TLC结果1.巯基丙酸2.OEBr3.反应液

图4为人工抗原紫外全波段扫描图

图5为半抗原红外扫描图

图6为半抗原质谱

图7为半抗原核磁氢谱

图8为半抗原-BSA(上)和半抗原-OVA(下)红外扫描图

图9为人工抗原的蛋白电泳图

图10为醚菌酯(左)和肟菌酯(右)

图11半抗原合成的反应途径

图12免疫原合成的反应途径

图13包被原合成的反应途径

图14所需试剂的配制方法

图15抗体对不同抗原的交叉反应

图16加标回收率和精密度结果

Claims (4)

1.一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA方法，包括以下内容：

(1)通过活性基团肟基乙酸酯((E)-2(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯(OEBr))为原料合成人工抗原；

(2)制备含肟基乙酸酯类杀菌剂人工抗原的疫苗并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体；

(3)建立检测肟基乙酸酯类杀菌剂的间接ELISA检测方法，测定不同样品中杀菌剂的残留。

2.根据权利要求1所述的一种肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA检测方法，其特征在于，肟基乙酸酯类杀菌剂人工半抗原的合成中巯基丙酸乙醇溶液、NaOH、OEBr乙醇溶液的投料比为1∶2∶1equiv；采用二氯甲烷进行液液分配时pH应为2.8-3.2左右。

3.根据权利要求1所述的一种肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA检测方法，其特征在于，肟基乙酸酯类杀菌剂人工抗原(免疫原和包被原)制备中，合成的半抗原和NHS的摩尔比为1∶1，加入DMF溶液时为逐滴加入；三正丁胺和氯甲酸异丁酯的投料比为1∶1equiv；所述半抗原与BSA或OVA的质量份数比为60～150∶1；制备免疫原的整个体系的pH应为7.4，制备包被原的整个体系为8.0；利用免疫原同免疫佐剂混合，制备含肟基乙酸酯类杀菌剂人工抗原的疫苗并免疫新西兰大白兔，采取大白兔血液并分离血清，制备能与肟基乙酸酯类杀菌剂特异反应的多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的一种肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA检测方法，其特征在于，酶联免疫检测中包被原用包被液稀释至10μg/m；用样品稀释液以体积比1∶2000稀释抗体后，与标准品(或样品)1∶1预混过夜；将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍。