CN105087757A - 鉴定大豆百粒重高低的分子标记及其应用 - Google Patents

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张孟臣
陈强
邓莹莹
杨春燕
闫龙
刘兵强
邸锐
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Abstract

本发明公开了鉴定大豆百粒重高低的分子标记及其应用。本发明与实测大豆百粒重的结果相比，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物Barcsoyssr_13_890，PCR扩增待测大豆(以冀豆12号为母本、野生大豆ZYD2738为父本的F8代杂合系群体的126个株系)的基因组DNA，通过得到的分子标记预测上述待测大豆百粒重高低，准确率可达94.44％。本发明可用于鉴定或筛选大豆品种或株系的百粒重高低，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

Description

鉴定大豆百粒重高低的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定大豆百粒重高低的分子标记及其应用。
背景技术
大豆(Glycinemax)是集粮油、饲料和工业用途于一体的重要作物，为人类提供了65％的食用植物蛋白质和31％的食用油。百粒重是大豆重要产量构成因素，对产量有较大直接作用。由于百粒重是复杂的数量性状，易受遗传背景和环境条件影响，准确预测大豆百粒重的高低对筛选高产大豆品种进行大豆育种具有重要意义。
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低的方法。
本发明提供的方法，包括用Barcsoyssr_13_890引物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，检测PCR产物，若所述PCR扩增的产物为DNA片段A和DNA片段B，则所述待测大豆为百粒重高的大豆或候选为百粒重高的大豆；若所述PCR扩增的产物为所述DNA片段A或B，则所述待测大豆为百粒重低的大豆或候选为百粒重低的大豆；
所述Barcsoyssr_13_890引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对，
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物。
上述方法中，检测PCR产物的方法为电泳或测序。
在本发明的实施例中，若PCR产物为DNA片段A和DNA片段B，则该PCR产物为杂合带型(冀豆12号和野生大豆ZYD2738杂交并繁衍至F8代的世代的带型)；若PCR产物为DNA片段A或DNA片段B，则该PCR产物为亲本带型(冀豆12号或野生大豆ZYD2738的带型)；DNA片段A的大小为120-125bp，具体为125bp,DNA片段B的大小为135-140bp，具体为135bp。
上述方法中，所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述百粒重低是指所述待测大豆的百粒重为5—8g。
在本发明的实施例中，所述百粒重具体为待测大豆籽粒成熟后含水量为12％时的百粒重。
上述方法中，所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、野生大豆ZYD2738或由所述冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生的品种或品系。
上述方法中，所述由冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和野生大豆ZYD2738杂交并繁衍至F2代以上的世代。在本发明的实施例中，具体为F8代。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低的DNA片段。
本发明提供的DNA片段如下1)或2)的DNA片段：
1)DNA片段A和DNA片段B；
2)DNA片段A或DNA片段B；
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物；
所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、野生大豆ZYD2738或由所述冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生的品种或品系。
上述DNA片段中，所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述百粒重低是指所述待测大豆的百粒重为5—8g；
所述DNA片段A和所述DNA片段B是将所述PCR扩增的产物在5—7％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离得到的。
Barcsoyssr_13_890引物对或上述方法或上述的DNA片段在鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低中的应用也是本发明保护的范围；
或Barcsoyssr_13_890引物对或上述方法或上述的DNA片段在制备用于鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低产品中的应用也是本发明保护的范围。
Barcsoyssr_13_890引物对或上述方法或上述的DNA片段在筛选所述百粒重高的大豆中的应用也是本发明保护的范围。
Barcsoyssr_13_890引物对或上述方法或是述的DNA片段在筛选所述百粒重低的大豆中的应用也是本发明保护的范围。
Barcsoyssr_13_890引物对或是述方法或是述的DNA片段在大豆育种中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第三个目的是提供一种获得百粒重高的大豆方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)、冀豆12号和野生大豆ZYD2738杂交，得到杂交子代，再自交，得到自交子代；
2)、用Barcsoyssr_13_890引物对PCR扩增自交子代大豆的基因组DNA，检测PCR产物，若所述PCR扩增的产物为DNA片段A和DNA片段B，则所述待测大豆为百粒重高的大豆或候选为百粒重高的大豆；
所述Barcsoyssr_13_890引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对，
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物。
上述方法中，
所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述自交子代为F2代以上的世代，在本发明的实施例中，具体为F8代。
本发明的实验证明，与实测大豆百粒重的结果相比，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对Barcsoyssr_13_890，PCR扩增待测大豆(以冀豆12号为母本、野生大豆ZYD2738为父本的F8代杂合系群体的126个株系)的基因组DNA，通过得到的DNA片段预测上述待测大豆百粒重高低，准确率可达94.44％。本发明可用于鉴定或筛选大豆品种或株系的百粒重高低，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为用引物对PCR扩增待测大豆获得PCR产物的6％聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的栽培大豆品种冀豆12号(Glycinemax(L.)Merr)购自河北冀丰农产品科技有限公司。
下述实施例中所用的野生大豆ZYD2738(GlycinesojaSieb.EtZucc.)：闫龙.大豆种间杂交(Glycinemax×G.soja)后代籽粒性状QTL定位[D].北京.中国农业科学院,2011，公众可从河北省农林科学院粮油作物研究所获得。
实施例1、利用分子标记测定大豆品种冀豆12号和野生大豆ZYD2738
1、引物对
设计引物对，由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
2、利用分子标记测定大豆品种冀豆12号和野生大豆ZYD2738
利用SDS法提取大豆品种冀豆12号的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物Barcsoyssr_13_890进行PCR扩增，取10μlPCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，用6％聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)在90W恒功率下电泳分离1.5小时，经Marker比对，获得大小为约为125bp的DNA片段A。
利用SDS法提取野生大豆ZYD2738的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物Barcsoyssr_13_890进行PCR扩增，取10μlPCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，用6％聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)在90W恒功率下电泳分离1.5小时，经Marker比对，获得大小约为135bp的DNA片段B。
上述PCR扩增的反应体系及条件如下：
反应体系(20μl)：4μl模板DNA(30ng/μl)，上下游引物各0.3μl(每条引物在反应体系中的终浓度均为10μM)，1.5μldNTPs(2.5mM)，2.0μl10×PCRBuffer(含15mMMg2+)，0.2μlTaq酶(5U/μl)和11.7μlddH2O。
反应条件：94℃预变性5min，循环阶段：94℃变性30s；47℃退火30s；72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR产物于4℃保存。
上述6％聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)：57克丙烯酰胺(Acrylamide)，3克双苯酰亚胺(Bis)，420克尿素(Urea)，100毫升10×TBE缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为tris108g/L、硼酸55g/L、EDTA7.43g/L)，加ddH2O至1000毫升。
实施例2、利用分子标记鉴定或辅助鉴定大豆品种冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生品系的百粒重
利用实施例1的分子标记Barcsoyssr_13_890对待测大豆进行百粒重预测，同时对待测大豆百粒重进行实际调查，具体方法和结果如下：
1、待测大豆：以冀豆12为母本、野生大豆ZYD2738为父本杂交、自交后的F8代杂合系群体，共126个家系；
对照品种：大豆品种冀豆12和野生大豆ZYD2738。
2、分子标记检测及百粒重高低的预测
分别提取F8代的126个家系大豆叶片用SDS法提取基因组DNA，用实施例1的引物对Barcsoyssr_13_890进行PCR扩增，各取10μlPCR扩增产物，在95℃变性3min，立即放至冰上冷却，在6％聚丙烯酰胺测序胶上90W恒功率下电泳分离约1.5小时，银染、显影后拍照。
反应体系(20μl)：4μl模板DNA(30ng/μl)，上下游引物各0.3μl(每条引物在反应体系中的终浓度均为10μM)，1.5μldNTPs(2.5mM)，2.0μl10×PCRBuffer(含15mMMg2+)，0.2μlTaq酶(5U/μl)和11.7μlddH2O。
反应条件同上。
若扩增产物为DNA片段A和B，则待测大豆为或候选为百粒重高，记为“H”；
若扩增产物为DNA片段A或B，则待测大豆为或候选为百粒重低，记为“L”。
结果如图1，其中，按DNA片段类型将待测材料分为A、B、H三组，A组中依次为编号4、5、8、9、10、11、12、14、15、18、21、24、29、34、36、37、44、51、52、53的家系、B组中从左至右的泳道依次为该群体中的编号分别为13、25、30、31、32、33、38、39、40、41、45、47、49、54、59、69、70、71、72、76的家系，H组中从左至右的泳道依次为该群体中的编号分别为1、2、3、6、7、16、17、19、20、22、23、26、27、28、35、42、43、46、48、50、56、57、58、61、62、63、64、62、66、67、68、73、75、77、78、79、81、82、83、84的家系。其中与大豆品种冀豆12号带型一致的用字母A表示，与野生大豆ZYD2738带型一致的用字母B表示；
图中的结果总结如表1所示。
3、百粒重高低的实际调查
2011年夏，在石家庄大田种植步骤1的F8代的126个家系大豆，随机区组设计，每个家系种1行，行长2.0米，行距0.5米，设3次重复。正常水肥条件下管理，统计各家系及亲本的百粒重即从大豆籽粒成熟且含水量为12％时百粒大豆籽粒的重量，计算三次重复的平均值；将百粒重为10—13g的待测大豆定义为百粒重高的大豆，记为“H”，将百粒重为5—8g的待测大豆定义为百粒重低的大豆，记为“L”，结果如表1的“实测结果”一栏所示。
表1.待测大豆百粒重高低的预测结果
注：表中编号为数字的待测大豆为以冀豆12为母本、ZYD2738为父本的F8代剩余杂合系群体中不同株系。
结果表明，用引物Barcsoyssr_13_890扩增待测大豆，通过PCR产物或其带型分析预测126个大豆株系的百粒重高低中，有119个株系与实测结果相符，准确率为94.44％。

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低的方法，包括用Barcsoyssr_13_890引物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，检测PCR产物，若所述PCR扩增的产物为DNA片段A和DNA片段B，则所述待测大豆为百粒重高的大豆或候选为百粒重高的大豆；若所述PCR扩增的产物为所述DNA片段A或B，则所述待测大豆为百粒重低的大豆或候选为百粒重低的大豆；
所述Barcsoyssr_13_890引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对，
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述百粒重低是指所述待测大豆的百粒重为5—8g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、野生大豆ZYD2738或由所述冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生的品种或品系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述由冀豆12号和野生大豆ZYD2738衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和野生大豆ZYD2738杂交并繁衍至F2代以上的世代。
5.一种用于鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段为如下1)或2)的DNA片段：
1)DNA片段A和DNA片段B；
2)DNA片段A或DNA片段B；
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物。
6.根据权利要求5所述的DNA片段，其特征在于：
所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述百粒重低是指所述待测大豆的百粒重为5—8g。
7.Barcsoyssr_13_890引物对或权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述的DNA片段在鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低中的应用；
或Barcsoyssr_13_890引物对或权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述的DNA片段在制备用于鉴定或辅助鉴定大豆百粒重高低产品中的应用。
8.Barcsoyssr_13_890引物对或权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述的DNA片段在筛选所述百粒重高的大豆中的应用；
或Barcsoyssr_13_890引物对或权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述的DNA片段在筛选所述百粒重低的大豆中的应用；
或Barcsoyssr_13_890引物对或权利要求1-4中任一所述方法或权利要求5或6所述的DNA片段在大豆育种中的应用。
9.一种获得百粒重高的大豆方法，包括如下步骤：
1)、冀豆12号和野生大豆ZYD2738杂交，得到杂交子代，再自交，得到自交子代；
2)、用Barcsoyssr_13_890引物对PCR扩增自交子代大豆的基因组DNA，检测PCR产物，若所述PCR扩增的产物为DNA片段A和DNA片段B，则所述待测大豆为百粒重高的大豆或候选为百粒重高的大豆；
所述Barcsoyssr_13_890引物对由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对，
所述DNA片段A为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增栽培大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的PCR产物；
所述DNA片段B为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增野生大豆ZYD2738的基因组DNA得到的PCR产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述百粒重高是指所述待测大豆的百粒重为10—13g；
所述自交子代为F2代以上的世代。
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