CN105076861B - 一种乌鳢的抗病免疫增强剂环-(苯丙氨酸-丝氨酸) - Google Patents

一种乌鳢的抗病免疫增强剂环-(苯丙氨酸-丝氨酸) Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乌鳢的抗病免疫增强剂环‑(苯丙氨酸‑丝氨酸)，提供的一种乌鳢配合饲料中添加了海洋细菌Pseudomonas putida代谢物环‑(苯丙氨酸‑丝氨酸)，具有提高乌鳢抗病能力及促进生长的作用；喂食配合饲料后通过免疫学检测，实验组乌鳢的血清溶菌酶活性、血清噬菌能力、血清杀菌能力均有显著提高，最大值分别为78.26U/mL、63.52U/mL、75.69U/mL，远超过对照组的17.23U/mL、20.96U/mL、39.36U/mL；上调了实验组乌鳢IL‑1β基因的相对表达为25.81，对照组仅为2.45；通过向鱼腹腔注射半致死浓度细菌检测其抗病能力，15天后实验组累计死亡率最小为36%，对照组为68%，实验组成活率显著高于对照组；本发明提供的综合饲养方法，搭配养殖充分利用水体，添加免疫增强剂，提高免疫力，促进生长，从而提高经济效益。

Description

一种乌鳢的抗病免疫增强剂环-(苯丙氨酸-丝氨酸)
技术领域
本发明属于水产养殖领域，是一种乌鳢的抗病免疫增强剂及其综合饲养方法。
背景技术
乌鳢(Channa argus)隶属鲈形目，鳢科，鳢属。因乌鳢是适合东北特有的气候和水域特点且抗逆性强的品种，又因其营养价值高、味道鲜美，有各种吃法，是很受国内外市场欢迎的品种。近年来，已对乌鳢进行驯化及人工繁育的突破，配合饲料的营养组成已有***研究。但在高密度集约化养殖中，面临各种环境胁迫，进入高密度养殖水体中的消毒剂和药物能够影响胃肠道微生物菌群的完整性，降低生产性能，抑制免疫反应。水产养殖中控制疾病的最有效的方法之一就是通过免疫增强剂的预防管理增强鱼的防御机制。从这方面看，许多中草药和其他天然免疫增强剂被筛选出并被认为是水产疾病管理中较有效的替代方法，并且许多具有抗菌性能的天然免疫增强剂的应用已经被提出。通过微生态制剂处理渔用饲料，可以改善饲料的品质，提高饲料的营养价值和饲料转化效率，提高水产动物的免疫力，促进动物生长。近来许多研究表明利用细菌细胞基质产品控制鱼类疾病是由于它们那独一无二产生新奇的代谢物的能力。所以，根据科研和实践的经验总结和梳理，海洋细菌Pseudomonas putida代谢产物环- (苯丙氨酸-丝氨酸)可作为乌鳢的一种有前景的抗病免疫增强剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种乌鳢抗病免疫增强剂环- (苯丙氨酸-丝氨酸)。
环- (苯丙氨酸-丝氨酸)作为乌鳢饲料添加剂的应用。
所述的乌鳢饲料添加剂为提高乌鳢抗病能力及促生长添加剂。
一种乌鳢的配合饲料，按质量份：
进口鱼粉15.2～16.0、国产鱼粉15.3～19.0、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5～2.0、维生素预混料1.0、蚕蛹3.5～4.5、血球蛋白粉2.40～3.2、矿物质预混料2.0、豆粕16.0～19.00、花生粕7.0～10.0、面粉25.40～31.00、鱼油2.12～2.6、玉米5.5～6.5、棉粕5.6~7.5、菜粕5.2～6.3、墨鱼粉2.3～2.5，混合后，膨化。
优选：进口鱼粉 15.23～15.6、国产鱼粉15.38～15.84、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5～2.0、维生素预混料1.0、蚕蛹3.5～4.4、血球蛋白粉2.45～3.2、矿物质预混料2.0、豆粕16.5～18.75、花生粕7.0～8.84、面粉25.42～30.2、鱼油2.2～2.5、玉米5.5～6.5、棉粕5.6~7.5、菜粕5.2～6.3、墨鱼粉2.3～2.5，混合后，膨化。
优选：进口鱼粉 15.6、国产鱼粉15.84、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5、蚕蛹3.5、豆粕16.5、血球蛋白粉2.45、花生粕7.0、面粉30.2、维生素预混料1.0、鱼油2.2、玉米5.5、矿物质预混料2.0、棉粕5.6 、菜粕5.3、墨鱼粉2.3；
优选：进口鱼粉15.36 、国产鱼粉15.38、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)1.0、蚕蛹4.25、棉粕6.8、血球蛋白粉2.56、菜粕5.2、豆粕18.75、墨鱼粉2.5、花生粕8.84、面粉26.2、维生素预混料1.0、鱼油2.5、矿物质预混料2.0、玉米6.3；
优选：进口鱼粉15.23、国产鱼粉15.6、棉粕7.5、环- (苯丙氨酸-丝氨酸) 2.0、菜粕6.3、蚕蛹4.4、墨鱼粉2.4、血球蛋白粉3.2、豆粕18.62、维生素预混料1.0、花生粕9.68、面粉25.42、鱼油2.4、玉米6.5、矿物质预混料2.0；
所述的维生素预混料：
盐酸硫胺素，15mg；核黄素，20g；叶酸，1.5g；盐酸吡哆醇，4g；尼克酸，80g；泛酸钙，28g；肌醇，40g；生物素，0.6g；Vit B3，30mg；Vit B9 ，3.0mg；Vit B12，0.01g；Vit A，6000IU ；Vit D3，0.005g；Vit C，200mg；Vit D，2000IU；Vit E，50mg；Vit K，5.0mg，载体为脱脂米糠。
所述的矿物质预混料：
磷酸二氢钠，450g；氯化钾，129g；七水硫酸镁，102g；五水硫酸铜，0.6g；柠檬酸铁150mg；七水硫酸锌，80mg；一水硫酸锰，3.25g；六水三氯化铝，0.15g；碘化钾，0.23g；***钠，0.01g；七水硫酸钴0.030g。
一种乌鳢综合饲养的方法如下：
1、每10亩塘放养体长10-15cm左右的乌鳢鱼种50000尾、搭配养殖的鱼类有：鲢(30g /尾) 2000尾，鳙(20g /尾) 800尾，鲤(40g /尾)800尾，鲫(30g /尾)800尾，细鳞斜颌鲴(20g /尾) 500尾；
2、先将鲢鱼、鳙鱼放养鱼池中，适应3d，每亩施用光合细菌200g调水2d后放养鲤、鲫和细鳞斜颌鲴；
3、乌鳢鱼苗饥饿2d，投喂上述一种乌鳢配合饲料驯食，待3～5d完全摄食后，再与鲢、鳙、鲤、鲫和细鳞斜颌鲴混养；
4、每天投喂上述一种乌鳢配合饲料，三个月后捕捞。
本发明为乌鳢的一种免疫增强剂环- (苯丙氨酸-丝氨酸)，添加海洋细菌Pseudomonas putida代谢物可抵抗常见的淡水细菌性鱼病的发生，与鲢、鳙、鲤、鲫和细鳞斜颌鲴共同饲养，可充分利用水体的饵料资源和水体空间，综合饲养经济效益更高，适合东北地区应用，商品鱼肉质好、口味极佳。
具体优点如下：
1、配方科学、营养均衡，搭配各种蛋白饲料，使得氨基酸互补，饲料和鱼体必需氨基酸平衡关联程度最佳，确保饲料系数低，使得鱼体生长快。
2、饲料中含有海洋细菌Pseudomonas putida代谢产物环-(苯丙氨酸-丝氨酸)可作为免疫增强剂对乌鳢IL-1β基因表达、体液反应和抗病力等都有正面影响，可有效地增强乌鳢的抗防病能力，提高养殖的成活率。
3、精选的蚕蛹、血球蛋白粉、花生粕和墨鱼粉的剂量和搭配比例使得饲料具有特有的颜色和气味，可使乌鳢迅速转食和摄食，提高饲料的利用率。
4、不同食性、不同水层的鱼类进行搭配养殖，充分利用水体和空间，达到生态健康养殖。
具体实施方式
实施例1环-(苯丙氨酸-丝氨酸)的提取
（1）发酵及发酵产物提取:
海洋细菌Pseudomonas putida活化2～3天后，从平板上挑取适量单菌落接种到含有10mL MB液体培养基的试管中，30℃、150r/min振荡培养1.5天。然后将菌液以5％(V／V)的接种量接种到装有100 mL培养基的锥形瓶中，30℃、150r/min振荡培养1.5天。将菌液以5％(V／V)的接种量接种至1000 mL培养基的锥形瓶中，30℃、150r/min振荡培养5天。扩大培养后的细菌发酵液用等体积的含有5%丙酮的乙酸乙酯进行萃取，菌液与提取液以一定比例混合，每瓶菌液萃取三次(第一次按菌液与混合液1：1的比例萃取，第二次按菌液与混合液2：1的比例，第三次按菌液与混合液4：1的比例)。收集上层有机相，然后将萃取液在旋转蒸发仪上水浴温度37℃，真空度82 mbar条件下蒸馏浓缩，浓缩到一定体积后转移到小体积的梨形旋蒸瓶中，再次进行浓缩，移入已称重的小离心管，氮吹仪吹干后称重，记录质量后4℃避光保存，备用。共得到粗提物约6.2 g。
（2）薄层层析：
取GF254薄层层析硅胶板置于110℃恒温鼓风干燥箱中活化1 h，待降至常温后开始进行点样。先用铅笔在层析上距末端1 cm处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，点的直径在2 mm以内。将点了样的薄层板放入已预饱和展开剂的层析缸中，密封展开缸顶的盖。由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至距离顶端1 cm处时，取出薄层板，样品组分因移动速度不同而彼此分离。展开后的薄层板经过干燥后，用紫外光灯暗室中照射(λ为254 nm和365 nm)观察检出斑点情况。展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)表示。化合物斑点中心至原点的距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是该化合物的Rf值。本实验通过试验不同的二氯甲烷+甲醇体系，选取比值Rf介于0.2到0.4之间的溶剂比例：二氯甲烷：甲醇的洗脱体系比例分别为70：1、30：1、8：1、2：1、丙酮、甲醇。
（3）分离:
取粗提物6.2g经200-300目减压桂胶柱层析，以70：1、30：1、8：1、2：1、丙酮、甲醇七个极性***快速洗脱，共得七个组分:Fr.a、Fr.b、Fr.c、Fr.d、Fr.e、Fr.f、Fr.g、Fr.h。 Fr.b部分经ODS减压柱色谱，流动相为甲醇:水比例依次为20: 80、40: 60、60: 40、80: 20、95:5、甲醇，得到 6 个组分:Fr.b-1、Fr.b-2、Fr.b-3、Fr.b-4、Fr.b-5、Fr.b-6。
其中Fr.b-1 又经 ODS加压柱色谱，以甲醇：水比例为12:88～100梯度洗脱，最后用HPLC (RP-18)分离与纯化，得到化合物 环-(苯丙氨酸-丝氨酸) (13 mg)、环-(丙氨酸-色氨酸) (12 mg)、环-(羟脯氨酸-苯丙氨酸) 10 mg、环-(酪氨酸-缬氨酸) (6 mg)、环-(酪氨酸-丙氨酸) (2 mg)、环-(酪氨酸-甘氨酸) (5.5 mg)和环-(酪氨酸-色氨酸) (11.6mg)，收集环-(苯丙氨酸-丝氨酸)。
环-(苯丙氨酸-丝氨酸)化学结构为：
白色无定型粉末；FABMS( positive mode)m/z 235.4 [M+H]+;[α]25 D-66.7°(c0.09，EtOH);1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)δ8.03 (1H，s，NH)， 7.91 (1H， s，NH)，7.28 (2H，t，J=7.5 Hz，H-3'，5')，7.17 (2H，d，J=7.5 Hz，H-2'，6')，7.22 (1H，t，J=7.5 Hz，H-4')，4.04 (1H，m，H-3)，3.65 (1H，m，H-6)， 3.28， 2.83(2H，m，CH2OH)， 3.08， 2.98 (2H，m，H-7)；13CNMR (125 MHz，APT，DMSO) δ167.65 (s，C-2)，56.61 (d，C-3)，166.87 (s，C-5)，58.26 (d，C-6)，41.03 (，t C-7)，137.76 (s，C-1')， 131.10 (d，C-2'，6')，129.26 (d，C-3'， 5')， 127.65 (d，C-4')，64.25(t ，CH2OH)。
实施例2 材料和方法
健康的乌鳢，80g左右，运到实验室后随机分布在200L流水式水槽内。正式试验前驯化14d以适应实验室的条件（溶解氧5.50 ± 0.68 mg/L； pH7.2 ± 0.5；亚硝酸盐：0.022 ± 0.01 mg/L；氨氮0.14 ± 0.05mg/L；23 ± 2℃），试验鱼随机分为对照组、I、Ⅱ、Ⅲ组，每组3个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂 0.5，1.0和 2.0%环-(苯丙氨酸-丝氨酸)。每天投喂两次（9:00和15:00），投喂量占体重的3%。
对照组饲料配方按重量份：进口鱼粉15.23、国产鱼粉15.6、棉粕7.5、菜粕6.3、蚕蛹4.4、墨鱼粉2.4、血球蛋白粉3.2、豆粕18.62、维生素预混料1.0、花生粕9.68、面粉25.42、鱼油2.4、玉米6.5、矿物质预混料2.0。
试验组I饲料配方按重量份：进口鱼粉 15.6、国产鱼粉15.84、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5、蚕蛹3.5、豆粕16.5、血球蛋白粉2.45、花生粕7.0、面粉30.2、维生素预混料1.0、鱼油2.2、玉米5.5、矿物质预混料2.0、棉粕5.6 、菜粕5.3、墨鱼粉2.3。
试验组Ⅱ饲料配方按重量份：进口鱼粉15.36 、国产鱼粉15.38、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)1.0、蚕蛹4.25、棉粕6.8、血球蛋白粉2.56、菜粕5.2、豆粕18.75、墨鱼粉2.5、花生粕8.84、面粉26.2、维生素预混料1.0、鱼油2.5、矿物质预混料2.0、玉米6.3。
试验组Ⅲ饲料配方按重量份：进口鱼粉15.23、国产鱼粉15.6、棉粕7.5、环- (苯丙氨酸-丝氨酸) 2.0、菜粕6.3、蚕蛹4.4、墨鱼粉2.4、血球蛋白粉3.2、豆粕18.62、维生素预混料1.0、花生粕9.68、面粉25.42、鱼油2.4、玉米6.5、矿物质预混料2.0。
维生素预混料：
盐酸硫胺素，15mg；核黄素，20g；叶酸，1.5g；盐酸吡哆醇，4g；尼克酸，80g；泛酸钙，28g；肌醇，40g；生物素，0.6g；Vit B3，30mg；Vit B9 ，3.0mg；Vit B12，0.01g；Vit A，6000IU ；Vit D3，0.005g；Vit C，200mg；Vit D，2000IU；Vit E，50mg；Vit K，5.0mg，载体为脱脂米糠。
矿物质预混料：
磷酸二氢钠，450g；氯化钾，129g；七水硫酸镁，102g；五水硫酸铜，0.6g；柠檬酸铁150mg；七水硫酸锌，80mg；一水硫酸锰，3.25g；六水三氯化铝，0.15g；碘化钾，0.23g；***钠，0.01g；七水硫酸钴0.030g；
实施例3 免疫测定的血液样本
饲养7、14和21d时收集血样。因此每个处理组的每个缸子总共取15尾鱼进行免疫检测。试验鱼被注射过量MS-222进行安乐死后，用2.5mL注射器进行尾静脉取血。每条鱼只取样一次，以避免多次取血和手挤压对检测的影响。白细胞分离参考Ardóet 等（2009）的方法。
实施例4 免疫学检测
白细胞噬菌能力的测定采用 Mathews 等（2012）的方法，血清杀菌活性参照Secombes等（2011）的方法。溶菌酶活性测定采用Parry等（2013）方法。
数据用平均值±标准差表示，凡标有不同小写字母者表示组间差异显著（P<0.05）。下表同
实施例5 IL-1β基因的表达
免疫相关基因表达的检测方法在 Yang等（2012）的基础上进行小的改动。总RNA提取采用 TRIzol Reagent (simgen)。实时荧光定量PCR 采用THUNDERBIRD SYBR qPCR MixKit (TOYOBO)试剂盒，在astratagene MxProSystem (stratagene mx3005p,USA) 96孔板上进行操作反应。每个引物的扩增效率在 97.2%- 99.5%之间。反应体系为10 uLTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，1 uL上游引物和下游引物 (10 mM) 和 1uL cDNA，最后添加超纯水至总体积为20 ul。反应条件为：95℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃10s进行40个循环。每个PCR管设置3个重复。数据采用stratagene MxPro (stratagene mx3005p, USA)软件分析。
实施例6 抗病力
从病鱼体内分离出嗜水气单胞菌，接种在TSB培养基中，28℃条件下进行孵育。培养物1500rpm离心15min，沉淀的细胞清洗后，将所需的剂量保存在磷酸盐缓冲盐水中。饲养21d后，剩下的25条鱼通过腹腔注射半致死浓度的细菌，半致死浓度通过预试验确定为3.5×10 7 cfu/mL。观察15d，记录死亡率。15d内相对生存率=1-（试验组死亡率/对照组死亡率）×100
实施例7 效益分析
注：放养在10亩池塘中，饲养3个月后的出塘情况
从上述的试验结果表明，从海洋细菌Pseudomonas putida中分离出活性次级代谢产物，并将其不同剂量添加在饲料中饲喂乌鳢，通过免疫反应的影响来评价其活性。应用层析技术获得纯化的代谢分子，并通过光谱数据（质谱和核磁共振）确认添加剂化合物。结果饲喂该活性成分的饲料后，其非特异性免疫指标（溶菌酶活性、噬菌活性和杀菌活性）显著升高，上调 IL-1 β基因的表达。攻毒后，饲喂活性成分的乌鳢成活率显著高于对照组，表明从海洋细菌Pseudomonas putida分离出来的活性成分环-(苯丙氨酸-丝氨酸)对免疫反应有积极影响，并能够增强乌鳢对嗜水气单胞菌的抗病能力，同时进行生产试验，表明搭配养殖充分利用水体，添加免疫增强剂，提高免疫力，促进生长，从而提高经济效益。

Claims (9)

1.环- (苯丙氨酸-丝氨酸)在制备提高抗嗜水气单胞菌病能力及促生长的乌鳢饲料添加剂中的应用。
2.一种乌鳢的配合饲料，其特征在于，按质量份：
进口鱼粉15.2～16.0、国产鱼粉15.3～19.0、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5～2.0、维生素预混料1.0、蚕蛹3.5～4.5、血球蛋白粉2.40～3.2、矿物质预混料2.0、豆粕16.0～19.00、花生粕7.0～10.0、面粉25.40～31.00、鱼油2.12～2.6、玉米5.5～6.5、棉粕5.6~7.5、菜粕5.2～6.3、墨鱼粉2.3～2.5，混合后，膨化。
3.根据权利要求2所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于，按质量份：
进口鱼粉 15.23～15.6、国产鱼粉15.38～15.84、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5～2.0、维生素预混料1.0、蚕蛹3.5～4.4、血球蛋白粉2.45～3.2、矿物质预混料2.0、豆粕16.5～18.75、花生粕7.0～8.84、面粉25.42～30.2、鱼油2.2～2.5、玉米5.5～6.5、棉粕5.6~7.5、菜粕5.2～6.3、墨鱼粉2.3～2.5，混合后，膨化。
4.根据权利要求2所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：
进口鱼粉 15.6、国产鱼粉15.84、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)0.5、蚕蛹3.5、豆粕16.5、血球蛋白粉2.45、花生粕7.0、面粉30.2、维生素预混料1.0、鱼油2.2、玉米5.5、矿物质预混料2.0、棉粕5.6 、菜粕5.3、墨鱼粉2.3。
5.根据权利要求2所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：
进口鱼粉15.36 、国产鱼粉15.38、环- (苯丙氨酸-丝氨酸)1.0、蚕蛹4.25、棉粕6.8、血球蛋白粉2.56、菜粕5.2、豆粕18.75、墨鱼粉2.5、花生粕8.84、面粉26.2、维生素预混料1.0、鱼油2.5、矿物质预混料2.0、玉米6.3。
6.根据权利要求2所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：
进口鱼粉15.23、国产鱼粉15.6、棉粕7.5、环- (苯丙氨酸-丝氨酸) 2.0、菜粕6.3、蚕蛹4.4、墨鱼粉2.4、血球蛋白粉3.2、豆粕18.62、维生素预混料1.0、花生粕9.68、面粉25.42、鱼油2.4、玉米6.5、矿物质预混料2.0。
7.根据权利要求2、3、4、5或6 所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：所述的维生素预混料：盐酸硫胺素，15mg；核黄素，20g；叶酸，1.5g；盐酸吡哆醇，4g；尼克酸，80g；泛酸钙，28g；肌醇，40g；生物素，0.6g；Vit B3，30mg；Vit B9 ，3.0mg；Vit B12，0.01g；Vit A，6000IU ；Vit D3，0.005g；Vit C，200mg；Vit D，2000IU；Vit E，50mg；Vit K，5.0mg，载体为脱脂米糠。
8.根据权利要求7所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：所述的矿物质预混料：磷酸二氢钠，450g；氯化钾，129g；七水硫酸镁，102g；五水硫酸铜，0.6g；柠檬酸铁150mg；七水硫酸锌，80mg；一水硫酸锰，3.25g；六水三氯化铝，0.15g；碘化钾，0.23g；***钠，0.01g；七水硫酸钴0.030g。
9.一种乌鳢综合饲养的方法，它包括：
（1）每10亩塘放养体长10-15cm的乌鳢鱼种50000尾、搭配养殖的鱼类有：30g /尾的鲢2000尾，20g /尾的鳙800尾，40g /尾鲤800尾，30g /尾的鲫800尾，20g /尾的细鳞斜颌鲴500尾；
（2）先将鲢鱼、鳙鱼放养鱼池中，适应3d，每亩施用光合细菌200g调水2d后放养鲤、鲫和细鳞斜颌鲴；
（3）乌鳢鱼苗饥饿2d，投喂权利要求3所述的一种乌鳢配合饲料驯食，待3～5d完全摄食后，再与鲢、鳙、鲤、鲫和细鳞斜颌鲴混养；
（4）每天投喂权利要求3所述的一种乌鳢配合饲料，三个月后捕捞。
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