CN105062909A - 双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用，该工程菌，为以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p作为锚定蛋白，以米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B为双脂肪酶靶蛋白，共同展示在毕赤酵母细胞表面，构建出的双脂肪酶细胞表面共展示重组酵母工程菌。本发明将米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B共展示于毕赤酵母细胞壁表面，制备了米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示型全细胞催化剂，该表面共展示型全细胞催化剂最高酶活为686U/g-细胞干重，分别是单独展示米根霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B的酶活力的3倍和2倍，催化油脂转酯化反应甲酯得率达96%。

Description

双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学、生物质能源以及基因工程等技术领域，具体涉及一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是与甘油三酯的水解、合成及转酯化有关的酶类，广泛存在于动、植物和微生物中，其最显著的特点是能在油-水界面上催化反应。脂肪酶作为一种绿色催化剂已成功应用于油脂加工、有机合成、化妆品及医药等领域，近年来在制备生物柴油的研究中亦得到广泛应用。在以真菌为来源的脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶B(CandidaantarcticalipaseB，CALB)具有化学选择性与对映选择性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。米根霉脂肪酶(Rhizopusoryzaelipase，ROL)作为一种1,3-位特异性脂肪酶，可以很好的在无有机溶剂存在的水相中催化油脂的转酯化反应，是全细胞法和酶法生产生物柴油的主要脂肪酶之一。在催化油脂转酯化的效果方面，南极假丝酵母脂肪酶B催化活性高，反应时间短，但其水相催化效果欠佳，米根霉脂肪酶具有1,3-位特异性并能很好的在水相中发挥催化作用。

近年来，在生物柴油的研究中，以脂肪酶为催化剂的生物催化法因其具有比化学法反应条件温和、醇用量小、后处理简单、无污染物排放等优点而越来越受到重视，尤其是采用固定化酶催化，使得反应结束后催化剂易回收，可多次循环利用，大大降低了生产成本，显示出良好的应用前景。但是，酶催化方法存在着酶的提取分离和纯化过程复杂及高成本、酶在制备过程中易产生活性损失等问题，因而近年来直接以脂肪酶生产菌株或细胞为催化剂的全细胞生物催化方法已成为一个重要的发展方向，尤其近些年发展起来的微生物细胞表面展示技术为全细胞催化及酶的固定化提供了一种新的基于基因重组技术的生物学方法。

微生物细胞表面展示是通过将靶蛋白基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于微生物细胞表面，保持相对独立的空间构象和原有的生物学活性。利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂。与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共价或非共价键形式固定于细胞外表面，因而具有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可重复利用等。目前，微生物表面展示***已发展出噬菌体展示***、细菌表面展示***、酵母表面展示***等，广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌，以酿酒酵母为来源的细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白，将米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B共展示于毕赤酵母GS115细胞壁表面，并实现高效表达。本发明的另一目的是提供一种上述双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法。本发明还有一目的是提供一种上述双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下是：

一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌，为以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p作为锚定蛋白，以米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B为双脂肪酶靶蛋白，共同展示在毕赤酵母细胞表面，构建出的双脂肪酶细胞表面共展示重组酵母工程菌。

所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，以Sed1p为锚定蛋白，使其与米根霉脂肪酶N端连接，通过该锚定蛋白的N端重复序列，以共价键方式，将米根霉脂肪酶ROL固定于毕赤酵母细胞表面，实现诱导表达，得到单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母；再将该单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母制备成感受态细胞，将构建的南极假丝酵母脂肪酶B表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示ROL的重组酵母感受态细胞中，筛选得到表面共展示ROL和CALB的重组酵母阳性转化子。

所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将靶蛋白米根霉脂肪酶ROL的基因序列克隆到表达载体中，得到表面展示重组质粒载体；再将锚定蛋白基因Sed1p克隆到表面展示重组质粒载体中，使酿酒酵母细胞壁蛋白基因与靶蛋白米根霉脂肪酶基因形成融合基因，得到以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白的米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒；

(2)将米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒电转化至巴斯德毕赤酵母，根据表达载体上的筛选标记筛选得到单独展示米根霉脂肪酶的重组毕赤酵母阳性转化子；

(3)将单独展示米根霉脂肪酶ROL的重组酵母制备成感受态细胞。

(4)采用与步骤(1)相同的方法构建南极假丝酵母脂肪酶B的细胞表面展示表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p，将pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母感受态细胞中，通过阳性转化子筛选得到米根霉脂肪酶ROL与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示的重组酵母细胞。

所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌做为双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。

所述的应用，催化转酯化制备生物柴油的油脂原料为大豆油、菜籽油、小桐子油或麻风树籽油、橡胶籽油等植物油脂，也可以为微藻油脂，也可以为餐饮废弃油脂。

本发明的米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示型全细胞催化，可结合两种酶所具备的在水相中催化效率高和催化反应时间短等优点，比现有的固定化酶催化、非表面展示型全细胞催化和单一脂肪酶表面展示型全细胞催化具有更为显著的优点，必将成为油脂催化转酯化制备生物柴油领域的最新发展趋势。因此，结合基因工程技术和细胞表面工程技术研究脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂是极其必要的。

有益效果：与现有技术相比，本发明将米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B共展示于毕赤酵母细胞壁表面，制备了米根霉脂肪酶与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示型全细胞催化剂，该表面共展示型全细胞催化剂最高酶活为686U/g-细胞干重，分别是单独展示米根霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B的酶活力的3倍和2倍，催化油脂转酯化反应甲酯得率达96％。

附图说明

图1是重组质粒构建图；

图2是平板筛选高产脂肪酶的表面共展示重组菌株图；其中，(a)三辛酸甘油酯平板，(b)橄榄油-MMH-RB平板；

图3是表面共展示重组基因工程菌的荧光分析结果图；其中，1.白光，2.488nm，3.555nm；

图4是Westernblot分析结果图；其中，lane2，(a)；lane1，(b)为表面共展示重组菌GS115/pGAPZA-RCS细胞壁蛋白；lane3，(a)为ROL表面展示重组菌GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p细胞壁蛋白，lane2,(b)为CALB表面展示重组菌GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p细胞壁蛋白,lane1,(a)；lane3,(b)为毕赤酵母GS115细胞壁蛋白；

图5是表面共展示脂肪酶的酶活力结果图；其中，表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS的脂肪酶活力；ROL表面展示重组菌GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p的脂肪酶活力；CALB表面展示重组菌GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p的脂肪酶活力；

图6是表面共展示型全细胞催化剂催化大豆油转酯化反应的甲酯得率图；

图7是表面共展示型全细胞催化剂的重复使用性能图。

具体实施方式

以下实施例所使用的培养基和相关试剂如下：

10×YNB(1L)：溶解134gYNB(含硫酸铵不含氨基酸)于1LddH₂O中，在50℃以下溶解。

BMGY(1L)：溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨于700mLddH₂O中，121℃灭菌20min，冷至室温，加入100mL1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，100mL10×YNB，2mL500×B，100mL10×GY。

BMMY(1L)：溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨于700mLddH₂O中，121℃灭菌20min，冷至室温，加入100mL1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，100mL10×YNB，2mL500×B，100mL10×M。

25％聚乙烯醇橄榄油乳化液(1L)：称取3g聚乙烯醇，加蒸馏水150mL，加热搅拌溶解成2％溶液。向其中加入50mL橄榄油，用高速组织捣碎机搅动3～4次，每次10s。

橄榄油-MMH-RB平板(1L)：橄榄油乳化液800mL，加入15g琼脂，121℃灭菌20min，冷至60℃时，加入100mL10×YNB，2mL500×B，100mL10×M，100mL10×RB，10mL100×H，混匀后倒平板。

一定浓度三辛酸甘油酯聚乙烯醇乳化液：称取3g聚乙烯醇，加蒸馏水150mL，加热搅拌溶解成2％溶液。以2％聚乙烯醇溶液:三辛酸甘油酯体积比为3:1配置，使用微型高速匀浆机搅拌4-5次，每次20s，直至出现白色乳化液，若不均匀或分层，可稍微加热或增加搅拌次数和时间。

三辛酸甘油酯平板(1L)：以10g酵母提取物、20g蛋白胨于900mLddH₂O中溶解，加入一定浓度的三辛酸甘油酯聚乙烯醇乳化液，用去离子水定容至1L(需要加10×D则无需定容)，混匀，加入1.5％(w/v)的琼脂粉，121℃灭菌20min，根据需要，灭菌后加入10×D，倒平板，可4℃保存。

实施例1

酿酒酵母S.cerevisiaeEBY100基因组的提取，步骤如下：

(1)S.cerevisiaeEBY100购自Invitrogen。首先在YPD平板上活化菌株，挑取单菌落于YPD摇瓶中，30℃过夜培养。

(2)取对数生长期的菌体5000rpm/min离心5min，菌体用无菌蒸馏水洗一次，去上清。

(3)加入5mLDNA破壁缓冲液(100mmol/LTris-HCl,pH8.0,10mmol/LEDTA,1％SDS)，混匀，65℃保温1h。

(4)10000rpm离心15min，取上清。

(5)加酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提2次，每次5000rpm离心7min。

(6)取上层抽提液，加6μLRNaseA(10mg/mL)，用3倍乙醇沉淀过夜(加0.3mol/L醋酸钠，pH5.2)。12000rpm离心30min。

(7)75％乙醇洗2次，风干。

(8)加50μL无菌超纯水溶解。

实施例2

米根霉脂肪酶(ROL)毕赤酵母细胞表面展示***的构建，步骤如下：

A.表面展示重组质粒载体pPICZαA-ROL构建

克隆米根霉脂肪酶基因ROL，与质粒pPICZαA融合。根据含有米根霉脂肪酶基因序列的质粒pPIC9K-ROL设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

R1(5’-3’，下同)：CCGGAATTCATGGTTCCTGTTTCTGGTAAATCTG，前面添加EcoRⅠ酶切位点。

R2：TCCCCGCGGATGATGATGATGATGATGCAAACAGCTTCCTTCGTTGATATCA，前面添加SacⅡ酶切位点及His-tag标签蛋白(下划线部分)。

用合成的引物进行PCR扩增，PCR反应体系：1μL质粒pPIC9K-ROL，1μLR1引物，1μLR2引物,25μLPremixExtaq，22μLddH₂O。扩增条件为：变性94℃，2min；变性94℃，30s；退火55℃，1min；延伸72℃，1min；重复循环30次；延伸72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到带有His-tag标签蛋白基因的米根霉脂肪酶ROL基因。

将米根霉脂肪酶ROL基因与pPICZαA用EcoRⅠ和SacⅡ酶切并纯化回收。用T4DNA连接酶连接，构建表面展示重组质粒pPICZαA-ROL。

B.酵母表达载体pPICZαA-ROL-Histag-Sed1p的构建

(1)PCR扩增成熟的锚定蛋白基因Sed1p

按照已知的酿酒酵母Sed1p蛋白的基因序列(GeneID:851649)设计引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

S1：TCCCCGCGGCAATTTTCCAACAGTACATCTGCTTCT，前面添加SacⅡ酶切位点。

S2：CTAGTCTAGATTATAAGAATAACATAGCAACACCAGC，前面添加XbaⅠ酶切位点。

以提取的酿酒酵母EBY100基因组DNA为模板，用上述合成的引物进行PCR扩增。PCR反应体系：1μL酿酒酵母EBY100基因组DNA，1μLS1引物，1μLS2引物,25μLPremixExtaq，22μLddH₂O。扩增条件为：变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，1min；重复循环30次；延伸72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到成熟的锚定蛋白基因Sed1p。

(2)将Sed1p与pPICZαA-ROL用SacⅡ、XbaⅠ酶切并用试剂盒纯化回收，用T4DNA连接酶连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒pPICZαA-ROL-Histag-Sed1p。将得到的pPICZαA-ROL-Histag-Sed1p质粒转化大肠杆菌宿主TOP10F。用含50μg/mlZeocinLLB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒并测序，结果表明壁蛋白sed1p基因序列正确***。构建方法见图1(a)所示。

C.重组质粒pPICZαA-ROL-Histag-Sed1p在毕赤酵母中表达

采用限制性内切酶SacI线性化质粒pPICZαA-ROL-Histag-Sed1p。电转化巴斯德毕赤酵母GS115，在含100μg/mLZeocin的YPD平板上生长72h，挑取抗性阳性转化子，即整合有融合基因序列的转化子，点至含400μg/mLZeocin的高抗YPD平板，挑选较大菌株，即含有较多拷贝子的转化子。

实施例3

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)毕赤酵母表面展示***的构建，步骤如下：

A.表面展示重组质粒载体pGAPZαA-CALB构建

克隆南极假丝酵母脂肪酶B基因CALB，与pGAPZαA融合。根据南极假丝酵母脂肪酶B基因序列设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

C1：CCGGAATTCATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTG，前面添加EcoRⅠ酶切位点。

C2：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGGGGTGACGATGCCGGAGC，前面添加NotⅠ酶切位点。

以南极假丝酵母基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增)。PCR反应体系：1μL南极假丝酵母基因组DNA，1μLC1引物，1μLC2引物,25μLPremixExtaq，22μLddH₂O。扩增条件为：变性94℃，2min；变性94℃，30s；退火55℃，1min；延伸72℃，1min；重复循环30次；延伸72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到南极假丝酵母脂肪酶B基因。

将南极假丝酵母脂肪酶B基因与pGAPZαA用EcoRⅠ和NotⅠ酶切并纯化回收。用T4DNA连接酶连接，构建表面展示重组质粒pGAPZαA-CALB。

B.酵母表达载体pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p的构建

(1)PCR扩增成熟的锚定蛋白基因Sed1p

按照已知的酿酒酵母Sed1p蛋白的基因序列设计引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

SC1：AAGGAAAAAAGCGGCCGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCT，前面添加NotⅠ酶切位点和FLAG标签蛋白(下划线部分)。

SC2：CTAGTCTAGATTATAAGAATAACATAGCAACACCAG，前面添加XbaⅠ酶切位点。

以提取的酿酒酵母EBY100基因组DNA为模板，用上述合成的引物进行PCR扩增。PCR反应体系：1μL酿酒酵母EBY100基因组DNA，1μLSC1引物，1μLSC2引物,25μLPremixExtaq，22μLddH₂O。扩增条件为：变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，1min；重复循环30次；延伸72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到成熟的锚定蛋白基因Sed1p.

(2)将Sed1p与pGAPZαA-CALB用NotⅠ和XbaⅠ酶切并用试剂盒纯化回收，用T4DNA连接酶连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p。将得到的pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p质粒转化大肠杆菌宿主TOP10F。用含50μg/mlZeocinLLB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒并测序，结果表明壁蛋白Sed1p基因序列正确***。构建方法见图1(b)。

C.重组质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p在毕赤酵母中表达

采用限制性内切酶SacI线性化质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p。电转化巴斯德毕赤酵母GS115，在含100μg/mLZeocin的YPD平板上生长72h，挑取抗性阳性转化子，即整合有融合基因序列的转化子，点至含400μg/mLZeocin的高抗YPD平板，挑选较大菌株，即含有较多拷贝子的转化子。

实施例4

米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B表面共展示重组基因工程菌的构建与鉴定，步骤如下：

A.表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZαA-RCS的构建

将表面展示米根霉脂肪酶(ROL)的重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p制备感受态细胞。

将表达载体pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p用限制性酶SacI酶切线性化，电泳检测线性化是否完全。表达载体经完全线性化后，转化至重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p的感受态细胞，涂布于含Zeocin抗生素的YPDS平板。通过含不同浓度的Zeocin抗生素的YPDS平板筛选得到高拷贝的重组菌。挑取转化子，点到一定浓度的橄榄油-MMH-RB平板和三辛酸甘油酯平板上，挑取水解圈较大的菌(图2(a)，(b))，将表面共展示菌株记为GS115/pGAPZαA-RCS，用于后续培养。

B.表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZαA-RCS的鉴定

(1)表面共展示重组基因工程菌的荧光分析

将阳性转化子GS115/pGAPZαA-RCS接种于50mLBMGY培养基中，30℃，180rpm振荡培养16-20h至OD₆₀₀到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加0.5％的甲醇进行诱导表达。发酵72h后，分别用anti-Histag及anti-Flag抗体进行免疫反应后，采用荧光显微镜对GS115/pGAPZαA-RCS，GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p，GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p和对照菌株GS115进行分析比较。经过相同条件的培养诱导及荧光抗体孵育在紫外488nm和555nm处的检测结果如图3。含组氨酸标签的脂肪酶重组菌GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p和GS115/pGAPZαA-RCS在488nm蓝光激发下呈现绿色荧光，而不含组氨酸标签的空白菌GS115无法与荧光抗体结合，故无荧光显示。类似地，含Flag标签的脂肪酶重组菌GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p和GS115/pGAPZαA-RCS在555nm绿光激发下呈现红色荧光，而不含Flag标签的空白菌GS115无法与荧光抗体结合，故无荧光显示。此结果证明脂肪酶ROL和CALB均成功的通过锚定蛋白Sed1p锚定展示在毕赤酵母细胞表面。

(2)表面共展示重组毕赤酵母细胞壁蛋白的分析

摇瓶培养双脂肪酶共展示菌株GS115/pGAPZαA-RCS，再分别以空白菌株毕赤酵母GS115、单一脂肪酶表面展示菌株GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p和GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p作为阴性对照。通过昆布多糖酶抽提出上述菌株的细胞壁蛋白，并进行WesternBlot分析。结果如图4所示，图4(a)为采用抗His标签抗体免疫杂交的Western-blot结果。泳道2,3分别为展示有ROL的重组菌GS115/pGAPZαA-RCS、GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p的细胞壁蛋白，有明显的一条带，大小为75kDa左右，和理论值一致，此外泳道1的GS115菌细胞壁蛋白作为阴性对照，无条带形成。类似地，图4(b)为采用抗Flag标签抗体免疫杂交的Western-blot结果。泳道1,2为展示有CALB的重组菌GS115/pGAPZαA-RCS、GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p的细胞壁蛋白，同样在75kDa左右有明显的一条带，和理论值一致，泳道3的GS115菌细胞壁蛋白作为阴性对照，无条带形成。此结果再次证明了表面共展示重组毕赤酵母构建成功。

实施例5

表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZαA-RCS脂肪酶活性的测定，过程如下：

摇瓶培养上述筛选双脂肪酶展示菌株GS115/pGAPZαA-RCS，以脂肪酶的最适反应底物pNPD(4-nitrophenyldodecanoate)来考察菌株的最佳诱导时间和最高酶活力。1000μL酶活测定体系：0.05mol/LTris-HCLbufferpH7.5850μL，稀释一定浓度的菌液100μL，13.5mmol/L的pNPD50μL。

将重组菌株诱导表达144h后，6,000g室温离心收集菌体，用50mMpH7.5的PBS缓冲液冲洗菌体3次，并最终重悬菌体于50mMpH7.5的PBS缓冲液中。分别调整不同样品的OD₆₀₀＝50，初步获得共展示脂肪酶重组菌GS115/pGAPZαA-RCS，单独展示脂肪酶的重组菌GS115/pPICZαA-ROL-Sed1p和GS115/pGAPZαA-CALB-Sed1p及对照菌株毕赤酵母GS115的菌体悬液，并于在45℃，pH8.0和适当的反应转速下反应15min。展示脂肪酶活力测定选用吸光度法。1个酶活力单位(IU)定义为：每分钟水解底物对硝基苯酚酯pNPD所生成的lμmol对硝基苯酚所需的酶量。

如图5所示，展示在毕赤酵母表面的脂肪酶的酶活随着诱导时间的增大而增大，表面共展示脂肪酶GS115/pGAPZA-RCS培养至144h时活力最高，最高酶活达686U/g干细胞，而单独表面展示ROL和CALB的脂肪酶活力分别是217U/g干细胞和379U/g干细胞，可见表面共展示脂肪酶活力明显高于单独展示ROL和CALB的脂肪酶活力。

实施例6

表面共展示型全细胞催化剂催化油脂转酯化制备生物柴油，步骤如下：

A.表面共展示型全细胞催化剂的制备：表面共展示毕赤酵母工程菌所产酶分泌在胞外，目标产物是菌体，诱导表达的目的是尽可能多的得到酶活高的细胞。重组毕赤酵母工程菌诱导表达方法如下：

(1)对筛选得到的GS115/pGAPZαA-RCS基因工程菌在YPD平板上，30℃培养2d。挑取单菌落接种于含150mLBMGY培养基的500mL摇瓶中，28℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝2～6。

(2)室温，3000×g离心5min收获菌体，去上清，用新的BMMY培养基重悬菌体至OD₆₀₀约等于1.0。

(3)将重悬BMMY培养物400mL加入到1L摇瓶中，用4层无菌纱布盖瓶口，继续28℃，200r/min摇床培养。

(4)每24h添加一次甲醇到摇瓶中维持诱导，甲醇添加量为终浓度0.5％。

(5)在BMMY培养基开始诱导72h后，6000rpm离心收集菌体。

(6)将收集的菌体，用缓冲液清洗3次后，用于后续做全细胞催化剂使用。

(7)测定表面共展示的脂肪酶活力，方法见实施例5。

B.表面共展示型全细胞催化剂催化油脂转酯化

在50mL具塞三角瓶中，按摩尔比1:1加入5g油脂和0.18g甲醇，加入一定量去离子水使反应体系的含水率控制在50-80％，称取总酶量为60-120U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZA-RCS全细胞催化剂，加入到三角瓶中。将该体系置于35-50℃的恒温培养振荡器中，于200r/min下进行甲酯化反应，每间隔12小时分批加入摩尔比1:1的甲醇，每隔一定时间取100μL上清，离心后对样品进行气相色谱分析，计算油脂转酯化反应的甲酯得率。

1)表面共展示型全细胞催化剂催化大豆油甲酯化

在50mL具塞三角瓶中，按摩尔比1:1加入5g市售大豆油和0.18g甲醇，加入总酶量为80U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为70％。在反应温度45℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并按照摩尔比1:1分别于12h、24h、48h分批加入甲醇。每隔一段时间取100μL上清，离心后对样品进行气相色谱分析，转酯化反应的甲酯得率随时间变化如图6所示。反应60h时，甲酯得率最高可达96.0％。

2)表面共展示型全细胞催化剂催化菜籽油甲酯化

在50mL具塞三角瓶中，按摩尔比1:1加入5g市售菜籽油和0.18g甲醇，加入总酶量为80U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为70％。在反应温度45℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并分别于12h、24h、48h按照摩尔比1:1分批加入甲醇。该条件下反应60h时，甲酯得率为94.8％。

3)表面共展示型全细胞催化剂催化麻风树籽油(小桐子油)甲酯化

在50mL具塞三角瓶中，加入5g经溶剂提取并脱胶处理的麻风树籽油及0.18g甲醇，加入总酶量为100U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为60％。在反应温度40℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并分别于12h、24h、48h按照摩尔比1:1分批加入甲醇。该条件下反应60h时，甲酯得率为93.2％。

4)表面共展示型全细胞催化剂催化餐饮废弃油脂甲酯化

在50mL具塞三角瓶中，加入5g经预处理后的餐饮废弃油脂及0.18g甲醇，加入总酶量为100U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为60％。在反应温度40℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并分别于12h、24h、48h按照摩尔比1:1分批加入甲醇。该条件下反应60h时，甲酯得率为94.0％。

5)表面共展示型全细胞催化剂催化微藻油脂甲酯化

在50mL具塞三角瓶中，加入5g由小球藻提取得到的微藻油脂及0.18g甲醇，加入总酶量为120U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为60％。在反应温度45℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并分别于12h、24h、48h按照摩尔比1:1分批加入甲醇。该条件下反应60h时，甲酯得率为95.5％。

C.表面共展示型全细胞催化剂的重复使用性能

在50mL具塞三角瓶中，按摩尔比1:1加入5g市售大豆油和0.18g甲醇，加入总酶量为80U的表面共展示重组菌GS115/pGAPZαA-RCS全细胞催化剂，加水调节反应体系含水率为70％。在反应温度45℃、摇瓶转速200r/min条件下反应，并分别于12h、24h、48h按照摩尔比1:1分批加入甲醇。

反应60h后，于6000rpm离心收集菌体，以去离子水洗涤菌体3次后重复使用，其催化大豆油甲酯化的结果如图7所示。该全细胞催化剂重复使用10次后催化油脂转酯化反应的甲酯得率仍保持在80％以上，表明催化剂具有较好的重复使用性能。

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用

<130>100

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>R1序列

<400>1

ccggaattcatggttcctgtttctggtaaatctg34

<210>2

<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>R2序列

<400>2

tccccgcggatgatgatgatgatgatgcaaacagcttccttcgttgatatc51

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>S1序列

<400>3

tccccgcggcaattttccaacagtacatctgcttct36

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>S2序列

<400>4

ctagtctagattataagaataacatagcaacaccagc37

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>C1序列

<400>5

ccggaattcatgaagctactctctctgaccggtg34

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>C2序列

<400>6

aaggaaaaaagcggccgctgggggtgacgatgccggagc39

<210>7

<211>69

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>SC1序列

<400>7

aaggaaaaaagcggccgcgattacaaggatgacgacgataagatgaaattatcaactgtc60

ctattatct69

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>SC2序列

<400>8

ctagtctagattataagaataacatagcaacaccag36

Claims (5)

1.一种双脂肪酶细胞表面共展示工程菌，其特征在于：为以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p作为锚定蛋白，以米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B为双脂肪酶靶蛋白，共同展示在毕赤酵母细胞表面，构建出的双脂肪酶细胞表面共展示重组酵母工程菌。

2.权利要求1所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，其特征在于，以Sed1p为锚定蛋白，使其与米根霉脂肪酶N端连接，通过该锚定蛋白的N端重复序列，以共价键方式，将米根霉脂肪酶ROL固定于毕赤酵母细胞表面，实现诱导表达，得到单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母；再将该单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母制备成感受态细胞，将构建的南极假丝酵母脂肪酶B表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示ROL的重组酵母感受态细胞中，筛选得到表面共展示ROL和CALB的重组酵母阳性转化子。

3.根据权利要求2所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将靶蛋白米根霉脂肪酶ROL的基因序列克隆到表达载体中，得到表面展示重组质粒载体；再将锚定蛋白基因Sed1p克隆到表面展示重组质粒载体中，使酿酒酵母细胞壁蛋白基因与靶蛋白米根霉脂肪酶基因形成融合基因，得到以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白的米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒；

（2）将米根霉脂肪酶细胞表面展示表达质粒电转化至巴斯德毕赤酵母，根据表达载体上的筛选标记筛选得到单独展示米根霉脂肪酶的重组毕赤酵母阳性转化子；

（3）将单独展示米根霉脂肪酶ROL的重组酵母制备成感受态细胞；

（4）采用与步骤（1）相同的方法构建南极假丝酵母脂肪酶B的细胞表面展示表达质粒pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p，将pGAPZαA-CALB-Flag-Sed1p电转化至单独展示米根霉脂肪酶的重组酵母感受态细胞中，通过阳性转化子筛选得到米根霉脂肪酶ROL与南极假丝酵母脂肪酶B细胞表面共展示的重组酵母细胞。

4.权利要求1所述的双脂肪酶细胞表面共展示工程菌做为双脂肪酶细胞表面共展示型全细胞催化剂在催化油脂转酯化制备生物柴油中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，催化转酯化制备生物柴油的油脂原料为大豆油、菜籽油、小桐子油或麻风树籽油、橡胶籽油，微藻油脂，餐饮废弃油脂。