CN105056209A - 珍珠母蛋白n16在制备促成骨活性药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，公开了一种珍珠母蛋白N16在制备促成骨活性药物中的应用。本发明首次发现珍珠母蛋白N16具有促成骨活性。本发明为目前骨发育不全、骨质疏松、骨折的治疗提供了一种全新的选择和思路，也为该技术领域的发展做出了贡献。
Description
技术领域
本发明涉及珍珠母蛋白N16在制备骨科药物中的一种新用途。
背景技术
成骨细胞分化、成熟能力不足，是骨发育不全、骨质疏松、骨折愈合缓慢等疾病的一个重要病理因素。目前，临床上针对促进成骨活性的药物较少，因此，骨发育不全、骨质疏松、骨折愈合缓慢的防治亟需安全有效的药物。
珍珠母蛋白N16是属于珍珠母蛋白，分子量为16kDa，在1999年由Samata等人在珍珠母不溶于水的组分中发现。研究表明，珍珠母蛋白N16能影响碳酸钙结晶的形状。但珍珠母蛋白N16的促成骨活性，尚未见文献报道。
在国内外，珍珠母粉被认为是一种良好的骨组织替代材料。珍珠母移植或透皮注射到动物体内无免疫排斥反应或明显毒副作用。
发明内容
本发明的目的是为制备促成骨活性药物提供一种新途径，即公开珍珠母蛋白N16在制备促成骨活性药物中的应用。
所述促成骨活性药物可以制备成目前适于人用的药物制剂，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等。
本发明的有益效果是：
本发明首次证明珍珠母蛋白N16具有显著的促成骨活性，为目前促成骨活性提供了一种全新的选择和思路。
附图说明
图1为本发明中基因重组的珍珠母蛋白N1615％SDS-PAGE图。
图2为前体成骨细胞MC3T3-E1增殖实验结果示意图。
图3为成骨细胞标志性酶ALP活性测定实验结果示意图。
图4为矿化结节实验结果示意图。
图5为AR-S含量测定结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
各实施例中所涉及的固体混合物中之固体，液体中之液体，以及液体中之固体的百分比分别是以wt/wt、vol/vol、wt/vol计算，除非另有说明。
实施例1：珍珠母蛋白N16的制备
珍珠母蛋白N16的制备方法，具体包括以下步骤：
从马氏珠母贝Pinctadafucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA。根据NCBI数据库珍珠母蛋白N16的基因序列，设计引物珍珠母蛋白N16F(5'-GGAATTCGCTGTCCATTATAAGTGC-3')和珍珠母蛋白N16R(5'-CGTTAATTGTCAAACCGTTC-3')，其中下划线部位碱基分别为NdeI和BamHI限制性内切酶位点。利用PCR法扩增珍珠母蛋白N16基因，反应程序设为95℃1分钟，50℃20秒，72℃1分钟，共25个循环，最后72℃10分钟。扩增所得珍珠母蛋白N16基因连接到表达载体pET3α上，并导入BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli，用于表达N16蛋白。当BL21(DE3)plysScompetentEscherichiacoli生长到对数期，加入0.4mMIPTG，37℃诱导珍珠母蛋白N16的表达。16h后，收集菌体。
珍珠母蛋白N16的纯化：将表达菌体分散在20mMTris-HCl(pH7.0)中，超声破碎，离心，弃上清。不溶物以washingbuffer(2Murea,20mMTris,0.1％Tween20,pH7.0)超声溶解。离心，收集不溶物，再以solubilizingbuffer(8Murea,20mMTris,40mMbeta-mercaptoethanol,pH7.0)室温溶解过夜。离心，取上清，0.45μm滤膜过滤。以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩，其中，上样缓冲液为8Murea,20mMTris,40mMbeta-mercaptoethanol,pH7.0，洗脱液为8Murea,20mMTris,40mMbeta-mercaptoethanol,1MNaCl，pH7.0，洗脱方式为梯度洗脱。15％SDS-PAGE检测珍珠母蛋白N16。收集含珍珠母蛋白N16的洗脱液，超滤浓缩，以Superdex75柱子进行凝胶排阻层析，分离纯化珍珠母蛋白N16。15％SDS-PAGE检测珍珠母蛋白N16的纯度。
结果见图1。重组表达所得到的珍珠母蛋白N16，分子量约为16kDa，与预测结果相吻合。纯度高，无明显可见杂蛋白条带，可用于后续实验。
实施例2：珍珠母蛋白N16对成骨细胞增殖的影响
采用小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1，于100U/mL青霉素，100g/mL链霉素的α-MEM培养液中培养，培养细胞置于37℃、饱和湿度5％C02浓度下，2～3天换液1次。取对数生长期生长状态良好的细胞以3～5×103个/孔接种于96孔培养板，每孔180μl。37℃、5％C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，实验组加入不同浓度的珍珠母蛋白N16，每个浓度设4个复孔。继续培养48、72、96小时。结果见图2。图示标注解析：One-wayANOVA,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001，与阴性对照组(N16＝0μM)比较。
MTT法检测细胞增殖情况，结果见图2，珍珠母蛋白N16作用48、72、96小时，对MC3T3-E1细胞的增殖没有显著影响，说明珍珠母蛋白N16对MC3T3-E1细胞没有毒性。
实施例3：珍珠母蛋白N16提高成骨细胞标志性酶碱性磷酸酶活性
取对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5×103个/孔接种于96孔培养板，每孔180μl。37℃、5％C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基(含50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)。加入不同浓度的珍珠母蛋白N16，每个浓度设4个复孔。继续培养96小时。碱性磷酸酶测定试剂盒测定每组ALP活性，BCA法测定蛋白浓度。以测得的ALP活性除以各自的蛋白浓度和反应时间，得到酶的单位。比较各组酶活力单位的差异。
结果见图3。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。珍珠母蛋白N16作用96小时，能提高MC3T3-E1细胞ALP活性。其中，0.6、1.25和2.5μM珍珠母蛋白N16分别使MC3T3-E1细胞ALP活性提高了18.5％、20.5％和26.4％，表明珍珠母蛋白N16能促进成骨细胞分化。
实施例4：珍珠母蛋白N16促进成骨细胞矿化结节的产生
取对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5×104个/孔接种于24孔培养板，37℃、5％C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基(含50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)。加入不同浓度的珍珠母蛋白N16，每个浓度设3个复孔。继续培养21天，每3天换一次液。第21天，茜素红(AR-S)染色，检测矿化结节。拍照后，采用10％(wt/vol)西吡氯铵溶解与钙离子特异性结合的茜素红染料，分光光度法测定其含量，比较各组茜素红染料的差异，以此代表各组矿化结节程度的差异。
结果见图4及图5。矿化结节是成骨细胞分化的最终阶段的标志，能和茜素红染料结合形成红色斑点。红色颜色越深，代表形成的矿化结节越多，成骨细胞越成熟，功能越强。从图4可见，珍珠母蛋白N16能促进成骨细胞矿化结节的形成。图5显示，珍珠母蛋白N16对成骨细胞矿化结节形成具有促进作用。1.25、2.5和5μM珍珠母蛋白N16分别使MC3T3-E1细胞矿化程度提高了2.4、4.2和3倍。结果表明，珍珠母蛋白N16能促进成骨细胞分化成熟，增强成骨细胞的矿化功能。
实施例5：珍珠母蛋白N16促进成骨细胞分化相关基因的表达
采用对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞，以3～5×104个/孔接种于6孔培养板，37℃、5％C02培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基(含50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)。加入不同浓度的珍珠母蛋白N16。继续培养72h，弃去原培养基，Trizol法提取总mRNA，逆转录得cDNA，实时定量PCR法(qPCR)测定成骨细胞分化相关基因的表达情况。
表1所用到的引物
在成骨分化过程中，成骨细胞标志基因的表达量会显著升高。本实验测定了成骨细胞分化相关基因OPN、OCN和Runx2的表达量。表2中数据为阴性对照组相应基因表达量的倍数。当基因表达量的改变大于2倍时，表示基因的表达量有改变。从表2可知，珍珠母蛋白N16在1.25μM和2.5μM浓度下，促进了MC3T3-E1细胞OPN、OCN和Runx2的表达，表明珍珠母蛋白N16对成骨细胞的分化成熟具有促进作用。
表2珍珠母蛋白N16对成骨细胞分化相关基因的表达影响(mean±SD)
Claims (2)
1.珍珠母蛋白N16在制备促成骨活性药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物剂型是片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或鼻吸入剂。
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-
2015
- 2015-07-16 CN CN201510420588.0A patent/CN105056209A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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