CN104920213B - 毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法 - Google Patents
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Abstract
毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：(1)筛选出生活力高于75％的毛竹种子；(2)取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50％以上的胚乳，依次用流水、乙醇、无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水、加有吐温‑80的升汞进行处理，再去除表面水分备用；(3)将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，暗培养7—10天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20—30天即可。本发明选取毛竹种子的种胚作为外植体，可以直接将毛竹种子的外种皮与内在种胚之间的缝隙处藏纳的污垢、泥土和细菌等污染物去除，从而有效降低污染率。本发明愈伤组织诱导率可以达到64.3％，而污染率能控制在20％以下，并且愈伤组织的形态优良，生长状态好。
Description
技术领域
本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，具体地说涉及一种毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法。
背景技术
毛竹(Phyllostachys Pubescens)，别名楠竹、孟宗竹、江南竹，属于禾本科(Gramineae)、竹亚科(Bambusoideae)、刚竹属(Phyllostachys)植物，多年生常绿散生竹类植物，是中国的传统经营竹种，集材用、食用、观赏等众多用途于一体，并具固土防风作用，广泛应用于建材、建筑、绿色食品、医疗保健、家具农具、日用品、旅游工艺品、文体文艺器材及环境绿化美化等各个领域。
全国有毛竹林约300万hm2，约占全国竹林总面积的65％。毛竹林是我国发展高效林业、使农民迅速致富和增强地区财政发展的的重点扶持工程。传统的毛竹培育技术已经严重制约了毛竹产业的发展，培育优良品质、经济和生态效益更高的毛竹新品种，对实现竹材资源培育的可持续发展具有重大意义。现代生物技术为竹类的育种工作开辟了一条新的途径，例如可以通过植物组织培养技术来进行高效无性繁殖，甚至还可以在竹子组织培养的基础上开展基因工程育种的研究。
目前，近90％的竹子组织培养成功的报道是丛生竹种，以毛竹为代表的散生竹种一直是组织培养的难点。关于毛竹组织培养的研究，从已有的报道来看，用新发毛竹笋作为外植体，褐化现象较严重。而且多受季节和植物发育时期的限制，取材困难。成熟种子相对来说具有易保存、操作简单、不受季节和植物发育时期等因素限制的优点，研究较为方便，但是成熟种子愈伤组织诱导率低(低于50％)、污染率较高(高于30％)，成为毛竹培育技术的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种诱导率高、污染率低的毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
(1)种子的筛选
取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活力高于75％的毛竹种子；
(2)种胚的消毒
取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50％以上的胚乳，用流水冲洗2—4小时，然后置于70—75％(v/v)乙醇中浸泡2—4分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后于无菌条件下，置于1—2％(v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡15—20分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有3—5滴吐温-80的0.05—0.1％(w/v)升汞中浸泡振荡30—40分钟，再去除表面水分备用；
(3)愈伤组织的诱导与增殖
将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，暗培养7—10天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20—30天即可。
进一步的，所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加3—5mg/L的2，4-D、0.1—0.3mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白，所述N6/B5/MS复合培养基包括1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、170mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的七水合硫酸镁、440mg/L的二水合氯化钙、0.75mg/L的碘化钾、3.0mg/L的硼酸、10.0mg/L的一水合硫酸锰、2.0mg/L的七水合硫酸锌、0.25mg/L的二水合钼酸钠、0.025mg/L的六水合氯化钴、0.025mg/L的五水合硫酸铜、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.85mg/L的七水合硫酸亚铁、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、2.0mg/L的甘氨酸、28g/L的蔗糖和8g/L的琼脂；
所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加3—5mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
本发明的有益效果为：
1.本发明选取毛竹种子的种胚作为外植体，可以直接将毛竹种子的外种皮与内在种胚之间的缝隙处藏纳的污垢、泥土和细菌等污染物，以及因啮齿类动物的咀嚼而残留的细菌等去除，从而有效降低污染率。
2.本发明切除了种胚的50％以上的胚乳(从种胚形态学上端开始切除)，可以进一步去除污染源(胚乳中含有大量污染菌)，降低污染率，而且虽然切除了大部分胚乳，但是本发明提供的诱导培养基完全能够提供种胚生长发育所必须的养分，不会影响种胚愈伤组织的形成。
3.本发明对种胚的消毒采取流水、次氯酸钠溶液、加有吐温-80的升汞进行反复处理，可以有效清除种胚表面大部分的污染物，保证消毒效果，有效降低污染率。
4.本发明的愈伤组织诱导率可以达到64.3％，而污染率能控制在20％以下，并且愈伤组织的形态优良，生长状态好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
下述实施例中所使用的毛竹种子均为购买于云南昆明的当年生毛竹种子，购买后于4℃的条件下遮光储存。
实施例1
毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
(1)种子的筛选
取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活力为80％的毛竹种子；
(2)种胚的消毒
取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除70％的胚乳，用流水冲洗2小时，然后置于75％(v/v)乙醇中浸泡2分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后于无菌条件下，置于2％(v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡15分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有4滴吐温-80的0.1％(w/v)升汞中浸泡振荡35分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
(3)愈伤组织的诱导与增殖
将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱(25℃)中暗培养7天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养25天即可；
所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加4mg/L的2，4-D、0.2mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白；
所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加4mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
实施例2
毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
(1)种子的筛选
取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活力为85％的毛竹种子；
(2)种胚的消毒
取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50％的胚乳，用流水冲洗3小时，然后置于70％(v/v)乙醇中浸泡4分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后于无菌条件下，置于1.5％(v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡18分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有3滴吐温-80的0.05％(w/v)升汞中浸泡振荡40分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
(3)愈伤组织的诱导与增殖
将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱(25℃)中暗培养10天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20天即可；
所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加3mg/L的2，4-D、0.1mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白；
所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加5mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
实施例3
毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
(1)种子的筛选
取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活力为90％的毛竹种子；
(2)种胚的消毒
取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除60％的胚乳，用流水冲洗4小时，然后置于72％(v/v)乙醇中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后于无菌条件下，置于1％(v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡20分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于每升加有5滴吐温-80的0.08％(w/v)升汞中浸泡振荡30分钟，再用无菌纸将种胚表面水分吸干备用；
(3)愈伤组织的诱导与增殖
将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，置于恒温培养箱(25℃)中暗培养8.5天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养30天即可。
所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加5mg/L的2，4-D、0.3mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白；
所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
实施例1至实施例3中所使用的N6/B5/MS复合培养基包括1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、170mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的七水合硫酸镁、440mg/L的二水合氯化钙、0.75mg/L的碘化钾、3.0mg/L的硼酸、10.0mg/L的一水合硫酸锰、2.0mg/L的七水合硫酸锌、0.25mg/L的二水合钼酸钠、0.025mg/L的六水合氯化钴、0.025mg/L的五水合硫酸铜、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.85mg/L的七水合硫酸亚铁、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、2.0mg/L的甘氨酸、28g/L的蔗糖和8g/L的琼脂。
统计实施例1至实施例3的愈伤组织诱导率和污染率，以种子脱分化产生淡黄色或者淡绿色颗粒状愈伤组织为衡量种子愈伤诱导率的标准，其中：
污染率＝(污染外植体数/接种的外植体数)×100％；
诱导率＝(种胚萌发启动数/无菌外植体接种总数)×100％；
经统计，实施例1的愈伤组织诱导率为64.3％，污染率为13.4％；实施例2的愈伤组织诱导率为58.5％，污染率为16.5％；实施例3的愈伤组织诱导率为60.8％，污染率为15.4％。实施例4
毛竹种胚的胚乳保留量和不同培养基对诱导率的影响实验
具体操作如下：在超净工作台面上首先将种子前端的芒截去，并按照以下两种方式继续进行切除：(Ⅰ)切除后种胚的胚乳保留量为70％。(Ⅱ)切除后种胚的胚乳保留量为30％。对切除胚乳后的种胚按实施例1所述的方法进行消毒，消毒处理后将种胚接种在培养基中，然后置于恒温培养箱(25℃)中暗培养7天。培养基选取加入了0.2mg/L的ZT、4.0mg/L的2，4-D、8g/L的琼脂、28g/L的蔗糖的MS培养基和本发明实施例1提供的诱导培养基，每个培养皿接种10粒，每种组合50粒，进行3次重复实验，以种子脱分化产生淡黄色或者淡绿色颗粒状愈伤组织为衡量种子愈伤诱导率的标准，其中：
污染率＝(污染外植体数/接种的外植体数)×100％；
诱导率＝(种胚萌发启动数/无菌外植体接种总数)×100％；
实验结果见表1。
表1.胚乳保留量和不同培养基对发芽率及诱导率的影响
注：本实施例各组所用的毛竹种子均为生活力为80％的毛竹种子。
从表1可以看出，胚乳保留量较少的种胚的污染相对容易控制，污染率最低可降至11.4％。这可能是由于毛竹种子胚乳中所含的大量真菌和内生菌是无菌萌发时产生污染的主要因素，因此切除大部分胚乳，可以进一步去除污染源，从而降低污染率。
同样是胚乳保留量较少的情况下，接种在本发明诱导培养基上的种胚的诱导率也比常用的MS培养基的诱导率高；当同时接种在本发明诱导培养基的情况下，胚乳保留量较少的种胚诱导率远高于胚乳保留量较多的种胚，这是由于胚乳的保留量可以直接影响到接种的污染率，进而影响种胚脱分化形成愈伤组织。
综上，本发明采取切除50％以上的胚乳可以有效降低污染率、提高诱导率，而本发明提供的诱导培养基可以进一步提高诱导率。
实施例5
不同消毒方式对毛竹种胚发芽率的影响实验
第一种消毒方式为本发明实施例1所提供的消毒方法。
第二种消毒方式为现有方式，即先用75％(v/v)的乙醇处理1分钟，再用每升加5—6滴吐温-80的0.2％次氯酸钠处理15—20分钟，最后用无菌水冲洗数次。
将消毒后的种胚接种在培养基中，该培养基是以MS培养基为基础，添加8g/L琼脂和28g/L蔗糖，然后在温度为25℃的条件下每天光照培养10h(2000lx)、暗培养14h。每瓶接种2—3个种子，每个处理接种9瓶，实验重复3次，每次选取100粒种子。7天后观察种胚萌发情况并统计数据，实验结果见表2：
表2.不同消毒方式对毛竹种胚发芽率的影响
注：本实施例各组所用的毛竹种子均为生活力为80％的毛竹种子。
从表2可以看出，本发明提供的消毒方式的效果明显优于现有的消毒方式，可以有效的降低污染率，提高发芽率。种胚发芽率和污染率的高低与种胚愈伤诱导率的高低有直接的关联，污染率高，则诱导愈伤率必然会降低，而发芽率低意味着种子的生命活力弱，生命活力弱的种胚在诱导脱分化阶段很难形成愈伤组织，也就说本发明的消毒方式能够在毛竹种胚的愈伤组织形成过程中有效降低污染率、提高诱导率。
实施例6
不同培养基对毛竹种胚愈伤诱导率的影响实验
按实施例1提供的方法进行种子的筛选和种胚的消毒，然后将消毒后的种胚接种到分别接种在MS培养基、N6培养基、B5培养基以及本发明实施例1提供的诱导培养基中，MS培养基、N6培养基、B5培养基中均加有28/L的蔗糖、8g/L的琼脂、4mg/L的2，4-D、0.2mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白，然后置于恒温培养箱(25℃)中暗培养7天，每个处理均重复三次，观察和统计愈伤组织诱导率和生长情况，实验结果见表3。
表3.不同培养基对毛竹种胚愈伤诱导率的影响实验
注：表中的数值为3次重复的平均值。
从表3可以看出，接种在本发明诱导培养基中的种胚愈伤组织诱导率最高，可达到64.3％，而且愈伤组织的形态也最好。而接种在现有的MS培养基、N6培养基和B5培养基中的种胚愈伤组织诱导率均低于本发明，其愈伤组织的形态也达不到本发明的效果。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，在不脱离本发明精神实质的情况下，都属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.毛竹种胚诱导愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
(1)种子的筛选
取毛竹种子，剥去外稃，采用TTC染色法对毛竹种子进行生活力测定，筛选出生活力高于75％的毛竹种子；
(2)种胚的消毒
取出筛选出的毛竹种子的种胚，切除50％—70％的胚乳，用流水冲洗2—4小时，然后置于70—75％(v/v)乙醇中浸泡2—4分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，然后于无菌条件下，置于1—2％(v/v)次氯酸钠溶液中浸泡振荡15—20分钟，再用无菌水冲洗至表面光滑、背部沟槽中无明显异物，最后于无菌条件下，置于0.05—0.1％(w/v)升汞中，每升升汞还加有3—5滴吐温-80，浸泡振荡30—40分钟，再去除表面水分备用；
(3)愈伤组织的诱导与增殖
将消毒后的种胚接种到诱导培养基上，暗培养7—10天使愈伤组织形成，然后将愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上增殖培养20—30天即可；
所述诱导培养基是以N6/B5/MS复合培养基为基础，添加3—5mg/L的2，4-D、0.1—0.3mg/L的ZT，500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白，所述N6/B5/MS复合培养基包括1900mg/L的硝酸钾、1650mg/L的硝酸铵、170mg/L的磷酸二氢钾、370mg/L的七水合硫酸镁、440mg/L的二水合氯化钙、0.75mg/L的碘化钾、3.0mg/L的硼酸、10.0mg/L的一水合硫酸锰、2.0mg/L的七水合硫酸锌、0.25mg/L的二水合钼酸钠、0.025mg/L的六水合氯化钴、0.025mg/L的五水合硫酸铜、37.25mg/L的乙二胺四乙酸二钠、27.85mg/L的七水合硫酸亚铁、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的烟酸、2.0mg/L的甘氨酸、28g/L的蔗糖和8g/L的琼脂；
所述增殖培养基是以MS培养基为基础，添加3—5mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺和300mg/L的水解酪蛋白。
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