CN105051534A - 用于治疗和/或限制糖尿病发展的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于识别限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，以及用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的方法。<pb pnum="1" />

Description

用于治疗和/或限制糖尿病发展的方法
交叉引用
本申请要求2012年12月18日提交的美国临时专利申请系列No.61/738835的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
介绍
电压门控的钙(CaV)通道在β细胞的生理学和病理生理学中是重要的。它们不仅在胰岛素分泌的调节中处于中心阶段，而且还通过调节蛋白质的磷酸化、基因表达和细胞周期而涉及β细胞的发育、生存和生长。β细胞CaV通道的功能和密度受到多种机制的调节，这些机制是与其他类型的细胞所共有的，或者是β细胞所特有的，例如通道磷酸化、与其他分子的相互作用以及葡萄糖代谢衍生的信号传递。功能失调的CaV通道导致β细胞失效并且甚至死亡，这在大部分普通的代谢紊乱糖尿病中可证明。实际上，T淋巴细胞介导的自体免疫攻击在1型糖尿病的β细胞死亡中起到关键作用。此外，1型糖尿病血清中的因子迫使非生理学量的Ca2+通过β细胞CaV通道的过度活化而进入胰腺β细胞，导致β细胞凋亡。毋庸置疑，该过程在自体免疫攻击之上加重了疾病的发展。此外，此类因子还可见于在2型糖尿病的血清中，其中它们以与1型糖尿病血清中相同的方式起作用。事实上，在2型糖尿病状况(例如在Goto-Kakizaki大鼠中的那些)中，出现β细胞质量的降低和β细胞CaV通道的过度活化。
发明概述
在一个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
(a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV通道的密度和/或传导性的量的载脂蛋白CIII(ApoCIII)相接触；
(b)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加CaV通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第二群体与抑制B族I型清道夫受体(SRBI)的表达或活性的分子相接触；以及
(c)识别阳性测试化合物作为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体中更高程度地抑制了CaV通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
在一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第三群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第三群体与CaV2和/或CaV3通道阻断剂相接触，其中所述的候选物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的候选物在胰岛素分泌细胞的第三群体中比在胰岛素分泌细胞的第一群体中更高程度地抑制了密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
在可以与本发明的任意一个实施方案结合的其他实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第四群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第四群体与Src激酶抑制剂和/或蛋白质激酶A抑制剂(PKA)相接触，其中所述的这些候选化合物是用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
在可以与本发明的任意一个实施方案结合的另一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第五群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第五群体与抑制β1整联蛋白表达或活性的分子相接触，其中那些候选化合物是用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的那些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第五群体中更高程度地抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
在第二个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触；以及
b)识别那些阳性测试化合物，与对照相比，该化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中抑制了SRBI的表达或活性，其中所述的阳性测试化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物。
在一个实施方案中，所述的对照包含在一种或多种测试化合物缺乏下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触。该实施方案可以包含例如将细胞的第二群体与配制物(例如缓冲剂)相接触，其中所述的配制物与溶解有测试化合物的配制物相似或一致。
在本发明这些方面的任意一个方面的多种实施方案中(除非上下文另外作出明确说明，否则所述的这些实施方案可以结合)，所述的方法包含将所述的细胞与ApoCIII接触至少6个小时；所述的候选化合物为用于抑制I型糖尿病的发展和/或治疗I型糖尿病的候选化合物；和/或其中所述的候选化合物为用于抑制2型糖尿病的发展和/或治疗2型糖尿病的候选化合物。
在第三个方面中，本发明提供了用于治疗或限制糖尿病的发展的方法，其包含向有需要的受试对象给药有效量的SRBI表达和/或活性的抑制剂。在多种实施方案中，所述的抑制剂选自抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,和抑制SRBI表达和/或活性的小分子。
附图说明
图1.载脂蛋白CIII温育会增加β细胞中CaV1通道的密度和传导性。(a)在与媒介物溶液(作为对照)或载脂蛋白CIII(ApoCIII)温育的小鼠小岛β细胞的质膜片中检测到的单位CaV1通道电流的实例。(b)在质膜片中测量的单位CaV1通道的平均数量、开放几率、平均关闭时间和平均开放时间，其中所述的质膜片附着在暴露于对照媒介物(n＝33)或ApoCIII(n＝32)的小鼠小岛β细胞上。(c)在质膜片中记录的单位CaV1通道电流的实例，其中所述的质膜片附着于对照RINm5F细胞或使用ApoCIII处理的细胞上。(d)在对照RINm5F细胞(n＝34)或与ApoCIII温育的细胞(n＝35)的质膜片上检测的单位CaV1通道的平均数量、开放几率、平均关闭时间和平均开放时间。与对照比，*P<0.05并且**P<0.01。
图2.载脂蛋白CIII温育会增加全细胞Ca2+电流，并且在RINm5F细胞中，与CaV1通道阻断剂尼莫地平共温育会废除载脂蛋白CIII温育的作用。(a)由与媒介物溶液(作为对照)温育的细胞(细胞电容：10.1pF)和载脂蛋白CIII(ApoCIII)处理的细胞(细胞电容：11.1pF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。(b)在对照细胞(空心圈，n＝26)和使用ApoCIII处理的细胞(实心圈，n＝26)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照比，*P<0.05并且**P<0.01。(c)由尼莫地平(Nim)温育的细胞(细胞电容：10pF)以及一起暴露于Nim和ApoCIII(Nim/ApoCIII)的细胞(细胞电容：11.9pF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在Nim处理的细胞(空心圈，n＝20)以及与Nim/ApoCIII温育的细胞(空心圈，n＝21)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。与单独的Nim比，*P<0.05和**P<0.01。
图3.在RINm5F细胞中，PKA或Src激酶抑制少量地降低了全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白CIII诱导的增强，但是PKC抑制不影响该增强。(a)由与媒介物溶液(作为对照)温育的细胞(细胞电容：8.5pF)、载脂蛋白CIII(ApoCIII)处理的细胞(细胞电容：8.2pF)和暴露于ApoCIII加PKA抑制剂H-89的细胞(ApoCIII/H-89，细胞电容：8.4pF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。(b)在对照细胞(空心圈，n＝37)和使用ApoCIII处理的细胞(实心圈，n＝36)或使用ApoCIII/H-89处理的细胞(实心三角形，n＝36)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照比，*P<0.05并且**P<0.01。(c)由对照细胞(细胞电容：12.5pF)、ApoCIII温育的细胞(细胞电容：12.0pF)和经过ApoCIII和PKC抑制剂卡弗他丁(calphostin)C共处理的细胞(ApoCIII/CalpC，细胞电容：12.1pF)中登记的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在对照细胞(空心圈，n＝33)、ApoCIII处理的细胞(实心圈，n＝33)和暴露于ApoCIII/CalpC的细胞(实心三角形，n＝33)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。ApoCIII与对照比，*P<0.05并且**P<0.01。ApoCIII/CalpC与对照比，*P<0.05并且**P<0.01。(e)由对照细胞(细胞电容：9.5pF)、ApoCIII温育的细胞(细胞电容：9.2pF)以及一起暴露于ApoCIII和Src激酶抑制剂PP2的细胞(ApoCIII/PP2，细胞电容：10.0pF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。(f)在对照细胞(空心圈，n＝40)和使用ApoCIII温育的细胞(实心圈，n＝40)或使用ApoCIII/PP2温育的细胞(实心三角形，n＝40)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。ApoCIII与对照比，**P<0.01。ApoCIII/PP2与对照比，+P<0.05。
图4.在RINm5F细胞中，PKA、PKC和Src激酶的结合抑制会抵消全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白CIII诱导的增益，并且PKA和Src激酶的共抑制足以获得这种抵消。(a)由媒介物温育的细胞(对照，细胞电容：7.9pF)、在载脂蛋白(ApoCIII)处理后的细胞(细胞电容：7.0pF)以及在H-89,卡弗他丁C和PP2的蛋白质激酶抑制剂混合物存在下暴露于ApoCIII的细胞(ApoCIII/H-89/CalpC/PP2，细胞电容：7.2pF)中登记的样品全细胞Ca2+电流追踪。(b)在对照细胞(n＝35)和暴露于ApoCIII的细胞(n＝34)或暴露于ApoCIII/H-89/CalpC/PP2的细胞(n＝35)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照和apoCIII/H-89/CalpC/PP2比，*P<0.05。(c)由对照细胞(细胞电容：8.5pF)、ApoCIII处理后的细胞(细胞电容：8.2pF)和在蛋白质激酶抑制剂H-89和PP2存在下暴露于ApoCIII的细胞(ApoCIII/H-89/PP2，细胞电容：8.7pF)中得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在对照细胞(n＝26)和经历ApoCIII的细胞(n＝26)或经历ApoCIII/H-89/PP2的细胞(n＝27)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照比，*P<0.05和**P<0.01；与ApoCIII/H-89/PP2比，+P<0.05。
图5.载脂蛋白CIII温育不能改变β细胞CaV1通道的表达。(a)RINm5F细胞细胞匀浆的代表性印迹，其中所述的匀浆经过与媒介物(作为对照)或载脂蛋白CIII(ApoCIII)温育，在分别使用抗CaV1.2,抗CaV1.3和抗GAPDH抗体探测。(b)在RINm5F细胞匀浆中，与对照相比(空心柱，n＝6)，CaV1.2(条纹柱，n＝6)和CaV1.3亚单元(实心柱，n＝6)的相对丰度的免疫印迹定量，其中所述的匀浆经过ApoCIII温育。在对照细胞和与ApoCIII温育的细胞之间，总的CaV1.2和CaV1.3亚单元的相对丰度不具有显著的差异(P>0.05)。
图6.在RINm5F细胞中，敲除β1整联蛋白会废除全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白CIII诱导的扩大。(a)在β1整联蛋白siRNA#1-、阴性对照siRNA(NCsiRNA)-和β1整联蛋白siRNA#2-转染的细胞中，β1整联蛋白-和GAPDH-免疫反应条带的代表性印迹。(b)在NCsiRNA-(空心柱，n＝6),β1整联蛋白siRNA#1-(条纹柱，n＝6)和β1整联蛋白siRNA#2-转染的RINm5F细胞中，β1整联蛋白的免疫印迹定量。(c)分别在模拟转染和与对照媒介物温育(无siRNA/对照，细胞电容：12.1pF)、NCsiRNA转染和对照媒介物处理(NCsiRNA/对照，细胞电容：11.4pF)、NCsiRNA转染和载脂蛋白CIII(ApoCIII)温育(NCsiRNA/ApoCIII，细胞电容：12.1pF)、β1整联蛋白siRNA转染和暴露于媒介物溶液(β1整联蛋白siRNA/对照，细胞电容：11.9pF)、以及β1整联蛋白siRNA转染和ApoCIII暴露(β1整联蛋白siRNA/ApoCIII，细胞电容：12.4pF)后，在单个细胞中登记的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在经历无siRNA/对照(实心圈，n＝29)、NCsiRNA/对照(空心圈，n＝28)、NCsiRNA/apoCIII(实心三角形，n＝28)、β1整联蛋白siRNA/对照(空心三角形，n＝29)和β1整联蛋白siRNA/ApoCIII(实心方形，n＝29)的细胞中，Ca2+电流密度-电压的关系。与无siRNA/对照,NCsiRNA/对照和β1整联蛋白siRNA/对照比，*P<0.05和**P<0.01。与β1整联蛋白siRNA/ApoCIII比，+P<0.05。
图7.在RINm5F细胞中，敲除SRBI会防止全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白CIII诱导的增强。(a)在SRBIsiRNA-和阴性对照siRNA(NCsiRNA)-转染的细胞中，GAPDH-和GAPDH-mRNA条带的代表性印迹。(b)在NCsiRNA-(空心柱，n＝6)和SRBIsiRNA-转染的RINm5F细胞(实心柱，n＝6)中，SRBI蛋白质的定量免疫印迹测量。与NCsiRNA比，**P<0.01。(c)在SRBIsiRNA-和阴性对照siRNA(NCsiRNA)-转染的细胞中，SRBI-和GAPDH-免疫反应条带的样品印迹。(d)在NCsiRNA-(空心柱，n＝7)和SRBIsiRNA-转染的RINm5F细胞(实心柱，n＝7)中，SRBImRNA的定量。与NCsiRNA比，**P<0.01。(e)分别在模拟转染和与对照媒介物温育(无siRNA/对照，细胞电容：13.87pF)、NCsiRNA转染和对照媒介物处理(NCsiRNA/对照，细胞电容：13.18pF)、NCsiRNA转染和载脂蛋白CIII(ApoCIII)温育(NCsiRNA/ApoCIII，细胞电容：13.53pF)、SRBIsiRNA转染和暴露于媒介物溶液(SRBIsiRNA/对照，细胞电容：12.90pF)、以及SRBIsiRNA转染和ApoCIII暴露(SRBIsiRNA/ApoCIII，细胞电容：13.01pF)后，由单个细胞得到的代表性全细胞Ca2+电流追踪。(f)在经历无siRNA/对照(实心圈，n＝30)、NCsiRNA/对照(空心圈，n＝29)、NCsiRNA/apoCIII(实心三角形，n＝30)、SRBIsiRNA/对照(空心三角形，n＝29)和SRBIsiRNA/ApoCIII(实心方形，n＝30)的细胞中，Ca2+电流密度-电压的关系。与无siRNA/对照,NCsiRNA/对照和SRBIsiRNA/对照比，*P<0.05和**P<0.01。与SRBIsiRNA/ApoCIII比，+P<0.05。
图8.在基础条件下，在RINm5F细胞中，PKA、PKC或Src激酶抑制不会改变全细胞Ca2+电流。(a)由媒介物处理的细胞(作为对照)(细胞电容：8.8pF)和暴露于H-89的细胞(细胞电容：8.5pF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。(b)在对照细胞(空心圈：n＝20)和与H-89温育的细胞(实心圈，n＝20)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。(c)在对照细胞(细胞电容：10.4pF)和经过卡弗他丁C温育的细胞(CalpC，细胞电容：11.0pF)中记录的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在对照细胞(空心圈：n＝29)和暴露于CalpC的细胞(实心圈，n＝29)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。(e)在对照细胞(细胞电容：9.0pF)和PP2-处理的细胞(细胞电容：9.1pF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。(f)在对照细胞(空心圈：n＝20)和与PP2温育的细胞(实心圈，n＝19)中的平均Ca2+电流密度-电压的关系。
图9.在基础条件下，在RINm5F细胞中，PKA、PKC和Src激酶的结合抑制、或者PKA和Src激酶的共抑制不会影响全细胞Ca2+电流。(a)由与媒介物溶液温育的细胞(对照，细胞电容：10.8pF)中、以及在使用H-89,卡弗他丁C和PP2的蛋白质激酶抑制剂混合物处理的细胞(H-89/CalpC/PP2，细胞电容：9.7pF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。(b)在对照细胞(空心圈：n＝30)和使用H-89/CalpC/PP2处理的细胞(实心圈，n＝30)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。(c)在媒介物处理的细胞(对照，细胞电容：9.4pF)中和使用蛋白质激酶抑制剂H-89和PP2处理的细胞(H-89/PP2，细胞电容：9.1pF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。(d)在对照细胞(空心圈：n＝24)和使用H-89/PP2处理的细胞(实心圈，n＝24)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。
发明详述
所述的所有参考文献均以引用方式全文并入本文。在本申请中，除非另外说明，否则所用的技术可以在多个公知的参考文献的任意一个中找到，例如：MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook,etal.,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress),GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,editedbyD.Goeddel,1991.AcademicPress,SanDiego,CA),“GuidetoProteinPurification”inMethodsinEnzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)AcademicPress,Inc.)；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis,etal.1990.AcademicPress,SanDiego,CA),CultureofAnimal细胞s:AManualofBasicTechnique,2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY),GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N.J.),和theAmbion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“comprise”、“comprising”等解释成包含一切的含义，这与专用的或详尽的含义相反，换言之，是“包含但不限于”的含义。此外，使用单数或复数的词语分别包含复数或单数的数量。此外，当词语“此处”、“上文”和“下文”以及类似意义的词语用于本申请中时，将是指本申请作为一个整体，而不是指本申请的任何特定的部分。
如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包含复数指示物。如本文所用，除非另外明确说明，否则“和”与“或”可交换使用。
除非上下文另外清楚地指出，否则本发明的任何方面的所有实施方案都可以结合使用。
在第一个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
(a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV通道的密度和/或传导性的量的载脂蛋白CIII(ApoCIII)相接触；
(b)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加CaV通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第二群体与抑制B族I型清道夫受体(SRBI)的表达或活性的分子相接触；以及
(c)识别阳性测试化合物作为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体中更高程度地抑制了CaV通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
本发明人发现在单一的通道水平下，ApoCIII温育导致CaV1通道开放几率和密度显著增加。所述的处理显著地增强了全细胞Ca2+电流，并且CaV1通道阻断剂尼莫地平完全废除了这种增强。本发明人进一步发现敲除B族I型清道夫受体(SRBI)会防止ApoCIII过度活化β细胞CaV通道。因此，SRBI的抑制剂应该下调节了本发明的阳性候选化合物。因此，所述的这些阳性测试化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体中更高程度地抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。因此，本发明这一方面的方法可以用于识别以特定的方式限制Ca2+-依赖的胰腺β细胞死亡并由此限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的化合物。
如本文所用，“apoCIII”是指包含在SEQIDNO:2(人类)(NCBI编号CAA25233),SEQIDNO:4(大鼠)(NCBI编号),或SEQIDNO:6(恒河猴)(NCBI编号CAA48419)中所示的氨基酸序列的蛋白质或其功能等价物。
apoCIII可以为得自例如SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)的基本纯的apoCIII，其中“基本纯的”是指其由其正常的体内细胞环境中移出。备选地，apoCIII可以以混合物(例如由1型糖尿病得到的血清)或者使用标准的技术由所述的血清得到的部分或完全纯化的形式存在，例如下文所述的那些。在优选的实施方案中，可以使用基本纯的apoCIII。
如下文所讨论，有3种已知亚型的人类apoCIII，它们具有相同的氨基酸序列，但是它们的糖基化方式不同。因此，在优选的实施方案中，使用糖基化的apoCIII，其中所述的糖基化优选为唾液酸化作用。在另一个优选的实施方案中，使用单唾液酸化的或二唾液酸化的apoCIII。此类糖基化形式可以购自例如SigmaChemicalCompany，或者可以使用标准的技术部分或完全纯化的，例如下文所述的那些。
还称为SR-BI的B族I型清道夫受体(SRB1)是由SCARB1基因编码的。SRBI最众所周知的是其在促进肝脏中由高密度脂蛋白中吸收胆固醇酯中的作用。
人类SRBI的氨基酸序列在SEQIDNO:9中提供。示例性的cDNA核苷酸序列在SEQIDNO:10中提供。
抑制SRBI表达(RNA或蛋白质)或活性(包含但不限于SRBI阻断)的任何合适的分子都可以用于本发明的方法中，包含但不限于抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,和小分子SRBI抑制剂。抗SRBI抗体可得自多个商业供应商，包含ThermoFisher,Epitomics和OriGene。在一个实施方案中，所述的抑制剂包含干扰素α，其已经显示会抑制SRBI的表达(Gut.2008May；57(5):664-71.Epub2007Nov12)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂包含N-[4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)苯基]-(2-氯代-5-硝基苯基)甲酰胺(R-138329)，其已经显示会阻断SRBI受体的活性(JPharmPharmacol.2006Dec；58(12):1629-38)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂包含2-己基-1-环戊酮缩氨基硫脲,33M20,BLT1,脂质转运阻断剂-1,CAS编号321673-30-7(得自SigmaAldrich)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂为在US20040171073(该文献以引用方式全文并入本文)中公开的任意一种或多种SRBI抑制剂；这些化合物在US20040171073申请(表1-2)中记录，其化合物编号为MIT9952-1,9952-2,9952-3,9952-4,9952-5,9952-6,9952-7,9952-8,9952-9,9952-10,9952-11,9952-12,9952-13,9952-14,9952-15,9952-16,9952-17,9952-18,9952-19,9952-20,9952-21,9952-22,9952-23,9952-24,9952-25,9952-26,9952-27,9952-28,9952-29,9952-30,9952-31,9952-32,9952-33,9952-34,9952-35,9952-36,9952-37,9952-38,9952-39,9952-40,9952-41,9952-42,9952-43,9952-44,9952-45,9952-46,9952-47,9952-48,9952-49,9952-50,9952-51,9952-52,9952-53,9952-54,9952-55,9952-56,9952-57,9952-58,9952-59,9952-60,9952-61,9952-62,9952-63,9952-64,9952-65,9952-66,9952-67,9952-68,9952-69,9952-70,9952-71,9952-72,9952-73,9952-74,9952-75,9952-76,9952-77,9952-78,9952-79,9952-80,9952-81,9952-82,9952-83,9952-84,9952-85,9952-86,9952-87,9952-88,9952-89,9952-90,9952-91,9952-92,9952-93,9952-94,9952-95,9952-96,9952-97,9952-98,9952-99,9952-100,9952-101,9952-102,9952-103,9952-104,9952-105,9952-106,9952-107,9952-108,9952-109,9952-110,9952-111,9952-112,9952-113,9952-114,9952-115,9952-116,9952-117,9952-118,9952-119,9952-120,9952-121,9952-122,9952-123,9952-124,9952-125,9952-126,9952-127,9952-128,9952-129,9952-130,9952-131,9952-132,9952-133,9952-134,9952-135,9952-136,9952-137,9952-138,9952-139,9952-140,9952-141,9952-142,9952-143,9952-144,9952-145,9952-146,9952-147,9952-148,9952-149,9952-150,9952-151,9952-152,9952-153,9952-154,9952-155,9952-156,9952-157,9952-158,9952-159,9952-160,9952-161,9952-162,9952-163,9952-164,9952-165,9952-166,9952-167,9952-168,9952-169,9952-170,9952-171,9952-172,9952-173,9952-174,9952-175,9952-176,9952-177,9952-178,9952-179,9952-180,9952-181,9952-182,9952-183,9952-184,9952-185,9952-186,9952-187,9952-188,9952-189,9952-190,9952-191,9952-192,9952-193,9952-194,9952-195,9952-196,9952-197,9952-198,9952-199,9952-200,9952-201,9952-202,9952-203,9952-204,9952-205,9952-206,9952-207,9952-208,9952-209,9952-210,9952-211,9952-212,9952-213,9952-214,9952-215,9952-216,9952-217,9952-218,9952-219,9952-220,9952-221,9952-222,9952-223,9952-224,9952-225,9952-226,9952-227,9952-228,9952-229,9952-230,9952-231,9952-232,9952-233,9952-234,9952-235,9952-236,9952-237,9952-238,9952-239,9952-240,9952-241,9952-242,9952-243,9952-244,9952-245,9952-246,9952-247,9952-248,9952-249,9952-250,9952-251,9952-252,9952-253,9952-254,9952-255,9952-256,9952-257,9952-258,9952-259,9952-260,9952-261,9952-262,9952-263,9952-264,9952-265,9952-266,9952-267,9952-268,9952-269,9952-270,9952-271,9952-272,9952-273,9952-274,9952-275,9952-276,9952-277,9952-278,9952-279,9952-280,9952-281,9952-282,9952-283,9952-284,9952-285,9952-286,9952-287,9952-288,9952-289,9952-290,9952-291,9952-292,9952-293,9952-294,9952-295,9952-296,9952-297,9952-298,9952-299,9952-300,9952-301,9952-302,9952-303,9952-304,9952-305,9952-306,9952-307,9952-308,9952-309,9952-310,9952-311,9952-312,9952-313,9952-314,9952-315,9952-316,9952-317,9952-318,9952-319,9952-320,9952-321,9952-322,9952-323,9952-324,9952-325,9952-326,9952-327,9952-328,9952-329,9952-330,9952-331,9952-332,9952-333,9952-334,9952-335,9952-336,9952-337,9952-338,9952-339,9952-340,9952-341,和9952-342,或它们药物可接受的盐。本领域的任一技术人员根据在US20040171073申请(参见表1)中的化合物结构的教导，而能够容易地识别基于本发明提供的化合物编号的化合物的结构。在一个实施方案中，所述的化合物为9952-53,9952-61,9952-19,9952-29,和/或9952-6或者它们的药物可接受的盐中的一种或多种。
可以使用任何合适的胰岛素分泌细胞，包含但不限于胰腺β细胞。如本文所用，“胰腺β细胞”为包含胰腺β小岛细胞的任何细胞群体。该细胞可以得自任何哺乳动物物种，或者可以存在于哺乳动物物种内(此时在体内实施检验)。此类胰腺β小岛细胞群体包含胰腺、分离的胰腺胰岛(“胰腺小岛”)、分离的胰腺β小岛细胞和胰岛素分泌细胞系。用于胰腺分离的方法是本领域公知的，并且用于分离胰腺小岛的方法可以在例如Cejvanetal.,Diabetes52:1176-1181(2003)；Zambreetal.,Biochem.Pharmacol.57:1159-1164(1999),andFaganetal.,Surgery124:254-259(1998)以及本发明引用的文献中找到。胰岛素分泌细胞系可得自theAmericanTissueCultureCollection(“ATCC”)(Rockville,MD)。在其中使用胰腺β细胞的另一个实施方案中，它们得自ob/ob小鼠，在该小鼠的小岛中包含超过95％的β细胞，并且是市售可得的。
可以通过本领域标准的方法来测量Cav1通道的密度和/或传导性，所述的方法包含但不限于单一的通道和全细胞膜片钳测量(细胞附着的和穿孔的全细胞膜片钳技术)。如本文所用，“增加Cav1通道的密度和/或传导性”是指在检验的过程中增加至在缺乏测试化合物的情况下可见的水平之上。所述的方法不要求Cav1通道的密度和/或传导性增加至基线以上的特定的量，只要所述的化合物(多种)促进了Cav1通道的密度和/或传导性增加至在缺乏测试化合物的情况下可见的水平之上即可。在优选的实施方案中，所述的增加为具有统计学意义的增加，这可通过标准的统计分析来判断。
胰岛素分泌细胞的第一群体与apoCIII相接触可以在所述的细胞与一种或多种测试化合物相接触之前、之后或同时进行。相似地，胰岛素分泌细胞的第二群体与SBIR抑制剂(多种)相接触可以在所述的细胞与一种或多种测试化合物相接触之前、之后或同时进行。所述的接触可以为体外或体内(除了在试验动物模型中以外)。任何合适的培养条件可以用于实施任意一种本发明的候选识别方法的方法；优选的是，相同的试验条件用于细胞的第一群体和第二群体与apoCIII和一种或多种测试化合物的接触中，并且唯一不同的是细胞的第二群体与SBIR(多种)的接触。在一个实施方案中，所述的细胞与ApoCIII接触至少6个小时。在另一个实施方案中，所述的细胞在包含1mM至15mM葡萄糖、优选为3mM至12mM葡萄糖、优选为大约11mM葡萄糖的培养基中生长。在另一个实施方案中，将所述的细胞在大约37℃下培养(优选的是在潮湿的孵化器中，例如5％CO2)，然后在大约室温下记录Cav1通道的密度和/或传导性。本领域的任一技术人员根据本发明的教导，基于待使用的特定检验的特性来测定适量的一种或多种测试化合物、和SBIR抑制剂(多种)。根据本发明的教导，这些和其他合适的检验条件恰好在本领域那些技术人员的水平范围内。
在一个实施方案中，候选化合物为用于限制1型糖尿病的发展和/或治疗1型糖尿病的候选化合物。在另一个实施方案中，候选化合物为用于限制2型糖尿病的发展和/或治疗2型糖尿病的候选化合物。本发明进一步提供了通过上述筛选方法识别的化合物以及它们用于治疗有需要的受试对象的用途。
在另一个实施方案中，所述的方法进一步包含候选化合物的大规模合成，其中所述的候选化合物在胰腺β细胞中会抑制Cav1通道的密度和/或传导性的、apoCIII诱导的增加。
当测试化合物包含多肽序列时，此类多肽可以是化学合成的或重组表达的。重组表达可以使用本领域标准的技术来完成，如上文所公开的那些。此类表达载体可以包含细菌或病毒表达载体，并且此类宿主细胞可以为原核的或真核的。合成多肽(使用固相、液相、肽缩合技术或它们任意的组合的公知的技术制备)可以包含天然或非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以为具有标准的脱保护、中和、偶联和洗涤方案的标准的Boc(Nα-氨基保护的Nα-叔丁氧基羰基)氨基酸树脂，或者标准的碱稳定性Nα-氨基保护的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和BocNα-氨基保护的氨基酸可以得自Sigma,CambridgeResearchBiochemical，或者本领域的那些技术人员所熟悉的其他化学公司。此外，可以使用本领域那些技术人员所熟悉的其他Nα-保护基团来合成所述的多肽。固相肽合成可以通过本领域那些技术人员所熟悉的技术来完成，并通过例如使用自动化合成仪来提供。
当测试化合物包含抗体时，此类抗体可以为多克隆或单克隆的。所述的抗体可以是人源化的、全人类的或鼠科形式的抗体。此类抗体可以通过公知的方法来制备，例如在HarlowandLane,Antibodies；ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,(1988)中所述的那些。
当测试化合物包含核酸序列时，此类核酸还可以是化学合成的或重组表达的。重组表达技术是本领域的那些技术人员所公知的(例如参见Sambrook,etal.,1989,supra)。所述的核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。相似地，此类核酸可以使用本领域标准的技术通过人工或自动化反应而化学或酶合成。如果核酸是化学合成或体外酶合成的，则可以对该核酸进行纯化，然后引入至细胞中。例如可以通过溶剂或树脂的提取、沉淀、电泳、色谱或它们的组合来由混合物纯化所述的核酸。备选地，对核酸可以不进行纯化或进行最少量的纯化，以避免由于样品处理而导致的损失。
当测试化合物包含除了多肽、抗体或核酸以外的化合物时，此类化合物可以通过实施有机化学合成领域的多种方法的任意一种来制备。
在一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第三群体与有效增加Cav1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第三群体与Cav2和/或CaV3通道阻断剂相接触，其中所述的候选化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的候选化合物在胰岛素分泌细胞的第三群体中比在胰岛素分泌细胞的第一群体中更高程度地抑制了密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。在该实施方案中，Cav2和/或CaV3通道阻断剂选择性地用于Cav2和/或CaV3通道，并且不会起到Cav1通道阻断剂的作用。合适的Cav2和/或CaV3通道阻断剂包含但不限于ω-agatoxinIVA,ω-芋螺毒素GVIA和SNX482(CaV2通道阻断剂)；以及咪拉地尔和NNC55-0396(CaV3通道阻断剂)。基于本发明的教导来测定在给定检验中可以有效使用的任何Cav2和/或CaV3通道阻断剂(多种)的量在本领域那些技术人员的水平范围内。
在可以与本发明的任意一个实施方案结合的另一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第四群体与有效增加Cav1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第四群体与Src激酶抑制剂和/或蛋白质激酶A(PKA)抑制剂相接触，其中所述的那些候选化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，所述的候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
如以下实施例中所示，本发明人发现ApoCIII通过PKA和Src激酶的、SRBI/β1整联蛋白依赖的共活化而使β细胞CaV1通道过度活化。因此，PKA和/或Src的抑制剂应该下调节本发明的阳性候选化合物。因此，这些化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的这些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。可以使用任何合适的PKA和/或Src激酶抑制剂，包含但不限于以下实施例中公开的那些。示例性Src激酶抑制剂包含PP1类似物、PP2和在以下实施例中公开的化合物。示例性PKA抑制剂包含腺苷3’,5’-环单磷硫酰-R,H-7,H-8,H-9,H-89,和以下实施例中公开的化合物。基于本发明的教导来测定在给定检验中可以有效使用的任何Src激酶抑制剂(多种)和/或PKA抑制剂(多种)的量在本领域那些技术人员的水平范围内。
在可以与本发明的任意一个实施方案结合的另一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第五群体与有效增加Cav1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第五群体与抑制β1整联蛋白表达或活性的分子相接触，其中所述的那些阳性测试化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，所述的阳性测试化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第五群体中更高程度地抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
如以下实施例中所示，本发明人发现ApoCIII通过PKA和Src激酶的、SRBI-β1整联蛋白依赖的共活化而使β细胞CaV1通道过度活化。因此，β1整联蛋白的抑制剂应该下调节本发明的阳性候选化合物。因此，这些候选化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的这些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第五群体中更高程度地抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。可以使用任何合适的β1整联蛋白抑制剂(抗体、反义、siRNA、shRNA等)，包含但不限于以下实施例中公开的那些。基于本发明的教导来测定在给定检验中可以有效使用的任何β1整联蛋白抑制剂(多种)的量在本领域那些技术人员的水平范围内。
在第二个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
(a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触；
(b)识别那些阳性测试化合物，该阳性测试化合物抑制了Cav1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加，并且与对照相比，还抑制了SRBI在胰岛素分泌细胞的第一群体中的表达或活性，其中所述的阳性测试化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化合物。
用于测量SRBI的表达和/或活性的方法是本领域已知的。在非限定性的实施方案中，可以使用标准的逆转录聚合酶链式反应、Northern印迹、Western印迹、免疫荧光检验法或其他技术来监测RNA和/或蛋白质的表达。可以使用多种技术来监测SRBI的活性，包含但不限于受体阻断的检验，例如在JPharmPharmacol.2006Dec；58(12):1629-38中所教导的那样，该文献以引用方式并入本文。使用其他技术来测量SRBI的表达和/或活性恰好在本领域那些技术人员的水平范围内。
SRBI表达和/或活性相对于对照的任何量被认为是“抑制”，在多个实施方案中，所述的抑制包含与对照相比，SRBI表达和/或活性的至少10％,20％,50％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％。
在一个实施方案中，所述的对照包含在一种或多种测试化合物缺乏下，与胰岛素分泌细胞的第二群体相接触，其中所述的胰岛素分泌细胞的第二群体已经与有效增加Cav1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触。该实施方案可以包含例如将细胞的第二群体与配制物(例如缓冲剂)相接触，其中所述的配制物与其中溶解有测试化合物的配制物相似或一致。
除非上下文另外清楚地指出，否则本发明第一个方面的所有实施方案都可以用于上述第二个方面中。
在一个实施方案中，所述的对照包含在测试化合物缺乏下，与胰岛素分泌细胞的第二群体相接触，其中所述的胰岛素分泌细胞的第二群体已经与ApoCIII相接触。该实施方案可以包含例如将细胞的第二群体与配制物(例如缓冲剂)相接触，其中所述的配制物与其中溶解有测试化合物的配制物相似或一致。
在第三个方面中，本发明提供了用于治疗或限制糖尿病的发展的方法，其包含向有需要的受试对象给药有效量的SRBI表达和/或活性的抑制剂。在多个实施方案中，所述的抑制剂选自抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,和抑制SRBI表达和/或活性的小分子。
抑制SRBI表达或活性的任何合适的分子都可以用于本发明的治疗方法中，包含但不限于抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,和小分子SRBI抑制剂。抗SRBI抗体可得自多个商业供应商，包含ThermoFisher,Epitomics和OriGene。在一个实施方案中，所述的抑制剂包含干扰素α，其已经显示会抑制SRBI的表达(Gut.2008May；57(5):664-71.Epub2007Nov12)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂包含N-[4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)苯基]-(2-氯代-5-硝基苯基)甲酰胺(R-138329)，其已经显示会阻断SRBI受体的活性(JPharmPharmacol.2006Dec；58(12):1629-38)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂包含2-己基-1-环戊酮缩氨基硫脲,33M20,BLT1,脂质转运阻断剂-1,CAS编号321673-30-7(得自SigmaAldrich)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂为在US20040171073(该文献以引用方式全文并入本文)中公开的任意一种或多种SRBI抑制剂，并且识别为MIT9952-1,9952-2,9952-3,9952-4,9952-5,9952-6,9952-7,9952-8,9952-9,9952-10,9952-11,9952-12,9952-13,9952-14,9952-15,9952-16,9952-17,9952-18,9952-19,9952-20,9952-21,9952-22,9952-23,9952-24,9952-25,9952-26,9952-27,9952-28,9952-29,9952-30,9952-31,9952-32,9952-33,9952-34,9952-35,9952-36,9952-37,9952-38,9952-39,9952-40,9952-41,9952-42,9952-43,9952-44,9952-45,9952-46,9952-47,9952-48,9952-49,9952-50,9952-51,9952-52,9952-53,9952-54,9952-55,9952-56,9952-57,9952-58,9952-59,9952-60,9952-61,9952-62,9952-63,9952-64,9952-65,9952-66,9952-67,9952-68,9952-69,9952-70,9952-71,9952-72,9952-73,9952-74,9952-75,9952-76,9952-77,9952-78,9952-79,9952-80,9952-81,9952-82,9952-83,9952-84,9952-85,9952-86,9952-87,9952-88,9952-89,9952-90,9952-91,9952-92,9952-93,9952-94,9952-95,9952-96,9952-97,9952-98,9952-99,9952-100,9952-101,9952-102,9952-103,9952-104,9952-105,9952-106,9952-107,9952-108,9952-109,9952-110,9952-111,9952-112,9952-113,9952-114,9952-115,9952-116,9952-117,9952-118,9952-119,9952-120,9952-121,9952-122,9952-123,9952-124,9952-125,9952-126,9952-127,9952-128,9952-129,9952-130,9952-131,9952-132,9952-133,9952-134,9952-135,9952-136,9952-137,9952-138,9952-139,9952-140,9952-141,9952-142,9952-143,9952-144,9952-145,9952-146,9952-147,9952-148,9952-149,9952-150,9952-151,9952-152,9952-153,9952-154,9952-155,9952-156,9952-157,9952-158,9952-159,9952-160,9952-161,9952-162,9952-163,9952-164,9952-165,9952-166,9952-167,9952-168,9952-169,9952-170,9952-171,9952-172,9952-173,9952-174,9952-175,9952-176,9952-177,9952-178,9952-179,9952-180,9952-181,9952-182,9952-183,9952-184,9952-185,9952-186,9952-187,9952-188,9952-189,9952-190,9952-191,9952-192,9952-193,9952-194,9952-195,9952-196,9952-197,9952-198,9952-199,9952-200,9952-201,9952-202,9952-203,9952-204,9952-205,9952-206,9952-207,9952-208,9952-209,9952-210,9952-211,9952-212,9952-213,9952-214,9952-215,9952-216,9952-217,9952-218,9952-219,9952-220,9952-221,9952-222,9952-223,9952-224,9952-225,9952-226,9952-227,9952-228,9952-229,9952-230,9952-231,9952-232,9952-233,9952-234,9952-235,9952-236,9952-237,9952-238,9952-239,9952-240,9952-241,9952-242,9952-243,9952-244,9952-245,9952-246,9952-247,9952-248,9952-249,9952-250,9952-251,9952-252,9952-253,9952-254,9952-255,9952-256,9952-257,9952-258,9952-259,9952-260,9952-261,9952-262,9952-263,9952-264,9952-265,9952-266,9952-267,9952-268,9952-269,9952-270,9952-271,9952-272,9952-273,9952-274,9952-275,9952-276,9952-277,9952-278,9952-279,9952-280,9952-281,9952-282,9952-283,9952-284,9952-285,9952-286,9952-287,9952-288,9952-289,9952-290,9952-291,9952-292,9952-293,9952-294,9952-295,9952-296,9952-297,9952-298,9952-299,9952-300,9952-301,9952-302,9952-303,9952-304,9952-305,9952-306,9952-307,9952-308,9952-309,9952-310,9952-311,9952-312,9952-313,9952-314,9952-315,9952-316,9952-317,9952-318,9952-319,9952-320,9952-321,9952-322,9952-323,9952-324,9952-325,9952-326,9952-327,9952-328,9952-329,9952-330,9952-331,9952-332,9952-333,9952-334,9952-335,9952-336,9952-337,9952-338,9952-339,9952-340,9952-341,和9952-342,或它们的盐。在一个实施方案中，所述的化合物为9952-53,9952-61,9952-19,9952-29,和/或9952-6,或其药物的盐中的一种或多种。
在第三个方面的一个实施方案中，所述的方法进一步包含给药有效治疗或限制糖尿病发展的量的、PKA和Src激酶的抑制剂。Src激酶抑制剂的实例包含PP1类似物、PP2、和在以下实施例中公开的化合物。示例性PKA抑制剂包含腺苷3’,5’-环单磷硫酰-R,H-7,H-8,H-9,H-89,和以下实施例中公开的化合物。
在该第三个方面的另一个实施方案中，所述的方法进一步包含给药有效量的β1整联蛋白表达和/或活性的抑制剂。在多个实施方案中，所述的抑制剂选自抗β1整联蛋白抗体,抗β1整联蛋白适体,β1整联蛋白siRNA,β1整联蛋白shRNA,和β1整联蛋白反义寡核苷酸。
在该第三个方面的另一个实施方案中，所述的方法进一步包含给药有效量的胰腺β细胞的ApoCIII活化的抑制剂。如本文所用，apoCIII活化的“抑制剂”包含减少apoCIIIDNA转录成RNA的化合物，减少apoCIIIRNA翻译成蛋白质的化合物，以及降低apoCIII蛋白质的功能的化合物。这种抑制可以是完全抑制或部分抑制，使得apoCIII的表达和/或活性降低，导致增加细胞内钙浓度的能力降低。此类抑制剂选自与apoCIII结合的抗体；可以干扰apoCIII活性的适体；定向针对apoCIII蛋白质、DNA或mRNA的反义寡核苷酸；定向针对apoCIII蛋白质、DNA或mRNA的小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)；以及可以干扰apoCIII活性的任何其他化学或生物化合物。
在这些治疗方面的每个方面的一个实施方案中，所述的方法用于治疗糖尿病。在该实施方案中，所述的受试对象被诊断为患有1型或2型糖尿病。如本文所用，“糖尿病”可表征为胰腺产生的胰岛素不足或不产生胰岛素，导致高的血糖水平。
如本文所用，“治疗糖尿病”是指达到以下的一种或多种：(a)降低糖尿病或糖尿病并发症的严重性；(b)限制或防止糖尿病并发症的发展；(c)抑制糖尿病并发症的恶化或抑制糖尿病的症状特征；(d)限制或防止糖尿病并发症的复发或糖尿病的症状特征；(e)在事先有症状的患者中，限制或防止糖尿病并发症的复发或糖尿病的症状特征。
糖尿病的症状特征包含但不限于血糖水平升高、胰岛素生产减少、胰岛素抵抗、蛋白尿和肾髓质清除受损。可以根据本发明的方法治疗的糖尿病并发症包含但不限于神经并发症(例如糖尿病神经病变)和与平滑肌细胞失调有关的并发症(包含但不限于***功能障碍、膀胱功能障碍和血管并发症，包含但不限于动脉粥样硬化、中风和外周血管疾病)。
在另一个实施方案中，所述的方法为限制糖尿病的发展。在这一方面中，受试对象处于1型或2型糖尿病的风险下，并且益处在于限制糖尿病和/或糖尿病并发症的发展。可以治疗任何处于发展成糖尿病风险下的受试对象，包含但不限于患有以下一种或多种的受试对象：代谢综合征、已知的糖尿病遗传风险因子、糖尿病家族史和肥胖。
在另一个实施方案中，用于治疗或限制糖尿病和/或糖尿病并发症的发展的方法进一步包含治疗那些已经识别为与对照相比过表达apoCIII的个体。apoCIII表达的增加先于糖尿病并发症的发展，并因此，该实施方案允许早期检测使用适于使用本发明的方法进行治疗的患者。
如本文所用，“过表达”为apoCIII的表达高于对照的任何量。可以使用任何合适的对照，包含由已知未患有糖尿病的受试对象得到的apoCIII表达水平，或者由相似的患者样品群体得到的、事先测定的apoCIII标准化表达水平。ApoCIII表达相对于对照升高的任何量都被认为是“过表达”的；在多个实施方案中，过表达包含apoCIII表达比对照升高至少10％、20％、50％、100％、200％或更高。在优选的实施方案中，在血液或血清样品中测定apoCIII的表达。在评价血清中apoCIII水平的一个实施方案中，使用标准的技术由血清样品中除去白蛋白，例如通过使用MontageAlbuminDepleteKit(Millipore)或AlbuSorbTM(BiotechSupportGroup)。然后，可以将收集的血清样品过夜冷冻干燥，并在sep-PakC18上运行。可以将洗脱的蛋白质冷冻干燥，此后溶解于100μL0.1％TFA中，并在ACEC1810-×0.21-cm柱20–60％上运行，并评价洗脱apoCIII的地方的曲线下面积。可以使用任何合适的技术来识别ApoCIII，包含但不限于MALDI质谱法。
如本文所用，术语“受试对象”或“患者”是指需要治疗的任何受试对象，包含人类、牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、昆虫、马、小鸡等。更优选的是，受试对象为人类。
所述的治疗可以通过任何合适的途径(包含但不限于口服、局部、肠胃外、鼻内、肺部、或直肠)给药剂量单位的配制物，该配制物包含传统的非毒性的药物可接受的载体、赋形剂和媒介物。如本文所用，术语肠胃外包含经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内或鞘内注射或输注技术等。此外，提供了包含本发明的化合物和药物可接受的载体的药物配制物。所述的治疗可以与一种或多种非毒性药物可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂、以及其他活性组分(如果需要)联合存在。所述的治疗可以为适用于口服使用的形式，例如片剂、药片、锭剂、水性或油性悬液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或者浆液或酏剂。
所述的治疗可以与药物可接受的载体结合。能够形成所述的盐的合适的酸包含：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等；以及有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、氨茴酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等。能够形成所述的盐的合适的碱包含：无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等；以及有机碱，例如一、二和三烷基和芳基胺(例如三乙基胺、二异丙基胺、甲基胺、二甲基胺等)，和可任选地取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺等)。
剂量范围取决于化合物的选择、给药的途径、配制物的本性、受试对象状况的本性和主治医生的判断。例如预计口服给药比静脉注射需要更高的给药剂量。可以使用用于优化的标准的经验常规来调节这些剂量水平的变化，这是本领域公知的。
实施例1.载脂蛋白CIII通过SRBI/β1整联蛋白-依赖的PKA和Src的共活化而使β细胞CaV1通道过度活化
概述
载脂蛋白CIII(ApoCIII)不仅作为甘油三酸酯水解的抑制剂，而且参与糖尿病相关的病理学事件，例如在胰岛β细胞中电压门控的Ca2+(CaV)通道的过度活化。但是，关于ApoCIII借以过度活化β细胞CaV通道的分子机制仍一无所知。目前，我们证明ApoCIII增加了CaV1通道开放的几率和密度。ApoCIII增强了全细胞Ca2+电流，而CaV1通道阻断剂尼莫地平完全废除了这种增强。ApoCIII的作用未受到PKA、PKC或Src的单一抑制的影响。但是，PKA、PKC或Src的结合抑制抵消了ApoCIII的作用，相似的结果可以通过PKA和Src的共抑制而获得。此外，敲除β1整联蛋白或B族I型清道夫受体(SRBI)会防止ApoCIII过度活化β细胞CaV通道。这些数据表明ApoCIII通过SRBI/β1整联蛋白-依赖的、PKA和Src的共活化而过度活化β细胞CaV1通道
结果
载脂蛋白CIII增加了β细胞的CaV1通道的密度和传导性。我们之前的工作表明在小鼠小岛β细胞中，ApoCIII温育显著增强了全细胞Ca2+电流5。为了弄清β细胞CaV通道的类型以及密度或传导性是否受影响，我们在小鼠小岛β细胞(图1a)和RINm5F细胞(图1c)中在ApoCIII温育后中分析了单位CaV1通道电流，其表征为单位Ba2+的传导系数更大，并且开放延长。在使用小鼠小岛β细胞的试验中，我们观察到在ApoCIII处理的细胞的质膜片中比那些对照细胞中具有更多的CaV1通道，这可通过更多层的单位Ba2+电流所反映(图1a)。在ApoCIII处理的细胞(n＝32)中，单位CaV1通道的平均数量、开放几率和平均开放时间比暴露于对照媒介物的细胞(n＝33)的那些明显更高(图1b)。在ApoCIII温育的细胞的质膜片中所记录的单位CaV1通道的平均关闭时间比对照质膜片的平均关闭时间明显更短(图1b)。同样，ApoCIII的相似的作用发生在胰岛素分泌RINm5F细胞的CaV1通道上。与媒介物处理的细胞相比，ApoCIII温育的细胞的质膜片容纳了更多的CaV1通道(图1c)。在ApoCIII温育的细胞的质膜片中的CaV1通道比媒介物处理的细胞的CaV1通道更频繁地开放(图1c)。与使用媒介物溶液的温育(n＝34)相比，ApoCIII温育(n＝35)显著地增加了CaV1通道的通道数量、提高了开放几率、延长了平均开放时间和缩短了平均关闭时间(图1d)。显然，数据表明ApoCIII增加了β细胞CaV1通道的密度和传导性。
药理学消除CaV1通道会防止β细胞CaV通道发生载脂蛋白CIII诱导的过度活化。通过单一通道分析证明ApoCIII对CaV1通道的作用并非一定是指ApoCIII仅攻击CaV1通道。为了检查所述的作用是否还发生在其他类型的CaV通道上，我们在CaV1通道阻断剂尼莫地平缺乏和存在下，分析了在ApoCIII温育后的RINm5F细胞中的全细胞Ca2+电流。在与ApoCIII温育的细胞中的全细胞Ca2+电流比使用媒介物溶液处理的细胞的电流更大(图2a)。在ApoCIII组中观察到电压范围为10至30mV的全细胞Ca2+电流密度比对照组中的电流密度明显更高(图2b)。显著相反的是，在尼莫地平存在下，在对照细胞和与ApoCIII温育的细胞之间，全细胞Ca2+电流是相似的(图2c)。在2种处理之间，全细胞Ca2+电流密度无显著性差异(图2d)。所述的数据证明ApoCIII仅作用于β细胞CaV1通道。
载脂蛋白CIII通过PKA和Src激酶的共活化而使β细胞CaV通道过度活化。β细胞CaV1通道通过ApoCIII的作用而使得开放几率增加、以及蛋白质激酶在ApoCIII信号传递中的调节作用表明ApoCIII可能向一些蛋白质激酶的上游发出信号，从而过度活化β细胞CaV通道16,19-22。因此，我们探索了PKA、PKC和Src激酶在β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化中的关联。
首先，我们检查了在RINm5F细胞中，PKA抑制剂H-89对β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。在对照细胞中登记的全细胞Ca2+电流比在使用ApoCIII处理的细胞的电流更高，而在使用ApoCIII加H-89温育的细胞中记录的全细胞Ca2+电流大小在2者之间(图3a)。在10至50mV的电压下，在ApoCIII处理的细胞中测量的平均Ca2+电流密度(实心圈，n＝36)比在媒介物处理的对照细胞中的电流密度(空心圈，n＝36)明显更高(图3b)。但是，ApoCIII和H-89共处理后的细胞(实心三角形，n＝36)在Ca2+电流密度方面与使用ApoCIII处理的细胞或对照细胞无显著性差异(图3b)。此外，在基础条件(即在ApoCIII缺乏下)下，H-89处理不会显著影响Ca2+电流密度(图8a,b)。结果表明PKA抑制会少量地降低β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。
第二，我们测试了在RINm5F细胞中，PKA抑制剂卡弗他丁C(CalpC)对β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。我们观察到与ApoCIII温育的细胞和ApoCIII/CalpC共处理的细胞展示出相似的全细胞Ca2+电流，该电流比在媒介物处理的细胞中所获得的电流更大(图3c)。与媒介物处理的对照细胞(空心圈，n＝33)相比，在10-50mV电压下在ApoCIII处理的细胞(实心圈，n＝33)中和在20至50mV电压下暴露于ApoCIII/CalpC的细胞(实心三角形，n＝33)中的平均Ca2+电流密度显著升高(图3d)。就Ca2+电流密度而言，在ApoCIII处理的细胞与ApoCIII/CalpC共处理的细胞之间无差异(图3d)。此外，在Ca2+电流密度方面，暴露于对照媒介物的细胞与CalpC处理的细胞相似(图8c,d)。这些数据证明PKC抑制不会影响β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。
第三，我们评价了在RINm5F细胞中Src激酶抑制剂PP2对β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。我们分别在与媒介物溶液温育后的细胞和ApoCIII温育的细胞中发现更小和更大的全细胞Ca2+电流(图3e)。就全细胞Ca2+电流而言，暴露于ApoCIII和PP2的细胞落入了媒介物对照细胞和使用ApoCIII处理的细胞之间(图3e)。与在媒介物对照细胞(空心圈，n＝40)中测定的全细胞Ca2+电流密度相比，在10-50mV电压下使用ApoCIII处理的细胞(实心圈，n＝40)中定量得到的全细胞Ca2+电流密度明显升高(图3f)。与媒介物处理的对照细胞(空心圈，n＝40)相比，经历ApoCIII和PP2共处理的细胞(实心三角形，n＝40)在20-40mV的电压下显示明显更高的Ca2+电流。但是，ApoCIII/PP2共处理的细胞和与媒介物溶液温育的细胞之间的Ca2+电流密度的差异不如使用ApoCIII处理的细胞与媒介物处理的对照细胞之间的差异那样突出(图3f)。此外，媒介物处理的细胞(空心圈，n＝20)和与PP2温育的细胞(实心圈，n＝19)展现出相似的Ca2+电流密度(图8e,f)。所述的结果表明Src激酶抑制具有降低β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化的趋势。
PKA、PKC或Src激酶抑制剂对β细胞CaV通道的、ApoCIII诱导的过度活化的微小及零值作用使我们好奇如果对所有这些激酶施加更复杂的抑制会发生什么。为了解决该问题，我们表征了在RINm5F细胞中蛋白质激酶抑制剂混合物H-89、CalpC和PP2对β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。在ApoCIII处理的细胞中显示较大的全细胞Ca2+电流，而在H-89,CalpC和PP2存在下，在媒介物处理的对照细胞和使用ApoCIII处理的细胞中，形成较小的全细胞Ca2+电流(图4a)。与媒介物处理的对照细胞(空心圈，n＝35)以及ApoCIII与H-89,CalpC和PP2一起的处理(实心三角形，n＝34)相比，在10-50mV的电压下，ApoCIII处理(实心圈，n＝35)会显著地增加Ca2+电流密度。在H-89,CalpC和PP2存在下，在暴露于ApoCIII的细胞中，Ca2+电流密度的图谱与媒介物处理的对照细胞相似(图4b)。此外，在基础条件(即ApoCIII缺乏下)下，使用蛋白质激酶抑制剂混合物H-89,CalpC和PP2处理对照细胞对全细胞Ca2+电流无显著影响(图9a,b)。结果证明PKA、PKC和Src激酶的结合抑制会有效地消除β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。
PKA或Src激酶抑制剂单独地对全细胞Ca2+电流的微小作用不可避免地提出了这样的问题：PKA和Src激酶的共抑制是否足以防止β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。我们通过分析经过H-89和PP2的共处理后的RINm5F细胞中的全细胞Ca2+电流来回到上述问题。我们观察到在ApoCIII处理的细胞中全细胞Ca2+电流比对照细胞或在H-89和PP2存在下经历ApoCIII处理的细胞中的电流更大(图4c)。与对照组(空心圈，n＝26)或在H-89和PP2存在下经历ApoCIII温育的组(实心三角形，n＝27)相比，在ApoCIII组(实心圈，n＝26)中显示全细胞Ca2+电流的密度显著更高(图4d)。此外，对照细胞中全细胞Ca2+电流与在使用H-89和PP2处理的细胞中所观察到的电流相似(图9c,d)。这些数据表明ApoCIII通过PKA或Src激酶的共活化而增强全细胞Ca2+电流。
载脂蛋白CIII不影响β细胞CaV1通道的表达。与ApoCIII过夜温育可以影响β细胞CaV1通道的表达。为了测试这种可能性，我们在ApoCIII温育后的RINm5F细胞中分析β细胞CaV1通道的表达。我们发现抗CaV1.2、抗CaV1.3和抗GAPDH抗体分别检测到清楚的CaV1.2、CaV1.3和GAPDH免疫反应条带。对照和ApoCIII处理的样品给出相似的CaV1.2、CaV1.3和GAPDH免疫反应性的强度(图5a)。图5b显示在经历ApoCIII温育的RINm5F细胞匀浆中，与媒介物温育的细胞(空心柱，n＝6)相比，CaV1.2(条纹柱，n＝6)和CaV1.3亚单元(实心柱，n＝6)的相对丰度无显著性差异(P>0.05)。所述的数据表明ApoCIII温育未在蛋白质水平下改变β细胞CaV1通道的表达。
载脂蛋白CIII通过β1整联蛋白上调节β细胞CaV通道。已经证明β1整联蛋白在ApoCIII和某些数量的蛋白质激酶(包含PKA和Src激酶)之间起到中介物的作用16,19-22。这与我们的上述结果(ApoCIII通过PKA和Src激酶的共活化而过度活化β细胞CaV通道)一起提出这样的可能性：β1整联蛋白介导了β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。我们通过在RINm5F细胞中实施RNA干扰并结合全细胞Ca2+电流分析来调查上述可能性。证明使用2种β1整联蛋白siRNA的转染会在蛋白质水平显著降低β1整联蛋白的表达(图6a,b)。重要的是，β1整联蛋白siRNA预转染会有效地防止β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化(图6c,d)。在β1整联蛋白siRNA预转染的细胞(与ApoCIII温育)(β1整联蛋白siRNA/ApoCIII)中的全细胞Ca2+电流比暴露于ApoCIII的阴性对照siRNA预传染的细胞(NCsiRNA/apoCIII)的电流明显更小，但是与3组对照细胞的电流相似(图6c)。这些对照细胞分别经历了模拟(无siRNA/对照)、阴性对照siRNA(NCsiRNA/对照)和β1整联蛋白siRNA预转染(β1整联蛋白siRNA/对照)，然后与对照媒介物温育(图6c)。在β1整联蛋白siRNA/ApoCIII之后的细胞(n＝29)中，与NCsiRNA/apoCIII后的那些细胞(实心三角形，n＝28)相比，观察到显著降低的Ca2+电流密度(图6d)。在β1整联蛋白siRNA/ApoCIII之后的细胞显示相似的Ca2+电流密度，但是NCsiRNA/apoCIII后的那些细胞展现出比经历无siRNA/对照(n＝29),NCsiRNA/对照(n＝28)或β1整联蛋白siRNA/对照(n＝29)的那些细胞更大的Ca2+电流密度(图6d)。综上，结果证明ApoCIII严重地依赖于β1整联蛋白来过度活化β细胞CaV通道。
载脂蛋白CIII通过SRBI过度活化β细胞CaV通道。之前的研究显示ApoCIII与β1整联蛋白无直接的相互作用16,18。在寻找ApoCIII与β1整联蛋白之间的分子桥梁中，我们的兴趣集中在SRBI上，因为该受体与ApoCIII是生理相关的，并且与β1整联蛋白相互作用10,23。我们将siRNA介导的基因沉默与全细胞Ca2+电流分析结合来检查SRBI在过度活化β细胞CaV1通道中在ApoCIII与β1整联蛋白之间是否可以起到分子桥梁的作用。如图7a,b,c,d所示，在RINm5F细胞中，SRBIsiRNA转染会在mRNA和蛋白质水平上显著降低SRBI。重要的是注意到此类下调节通过ApoCIII显著消除了全细胞Ca2+电流的增强(图7e,f)。图7e显示与预转染有阴性对照siRNA的那些细胞(然后经历ApoCIII暴露(NCsiRNA/apoCIII))相比，与ApoCIII温育的SRBIsiRNA预转染细胞(SRBIsiRNA/ApoCIII)展现更小的全细胞Ca2+电流。在经历SRBIsiRNA/ApoCIII的细胞中的全细胞Ca2+电流并未与分别经历模拟(无iRNA/对照),阴性对照siRNA(NCsiRNA/对照)和SRBIsiRNA预转染(SRBIsiRNA/对照)的对照媒介物处理的细胞中的电流不同(图7e)。相反，在NCsiRNA/apoCIII处理的细胞中的全细胞Ca2+电流比在之前提及的对照细胞中所见的电流更大(图7e)。与NCsiRNA/apoCIII组中的Ca2+电流密度(实心三角形，n＝30)相比，SRBIsiRNA/ApoCIII组(n＝30)中的Ca2+电流密度明显降低(图7f)。SRBIsiRNA/ApoCIII组中的Ca2+电流密度与无siRNA/对照(n＝30),NCsiRNA/对照(n＝29)或SRBIsiRNA/对照(n＝29)的电流密度相似，但是NCsiRNA/apoCIII组中的Ca2+电流密度明显比它们更高(图7f)。数据证明ApoCIII使用SRBI作为不可缺少的传送者用于将信号由所述的载脂蛋白传递至β细胞CaV通道。
讨论
CaV通道的总传导性取决于细胞质膜中功能通道的密度和活性。1型糖尿病血清的全细胞Ca2+电流及其因子ApoCIII的增强可以产生于β细胞质膜中功能CaV通道的富集密度和/或增加的传导性4,5。但是，到目前为止，除了一个研究4以外的所有研究1,2,5,24仅在全细胞水平下检查了1型糖尿病血清对CaV通道的作用。在Juntti-Berggren等人的研究中，在单一的通道和全细胞水平下表征了1型糖尿病血清的β细胞CaV通道活性的增加4。但是，该著作并未分析1型糖尿病血清是否能够改变β细胞质膜中功能CaV通道的密度4。尽管我们之前表明ApoCIII作为1型糖尿病血清的因子而过度活化β细胞CaV通道，但是但是仅实施了全细胞膜片钳分析5。毋庸置疑，应该在ApoCIII处理的细胞中对单一的CaV通道的生物物理学性质实施详细的检查，从而机械性地剖析这种载脂蛋白对β细胞CaV通道的过度活化。有趣的是，在本著作中的细胞附着的单一通道记录表明与ApoCIII温育不仅增强了单个β细胞CaV1通道的活性，而且富集了β细胞质膜的记录区域中的功能CaV1通道的数量。由于开放几率的增加有助于平均开放时间的延长和平均关闭时间的缩短，所以可见单一CaV1通道的活性的增强。通过更高水平的单一CaV1通道传导系数的外观，可以证明功能CaV1通道的数量的富集。
胰岛素分泌RINm5F细胞装配有CaV1,CaV2和CaV3通道1,2。我们调查了在这种胰岛素分泌细胞中，ApoCIII是否选择性地过度活化了CaV1通道或者随意地影响了所有这3种类型的CaV通道。证明β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化在药理学消除CaV1通道后不再发生。这意味着ApoCIII选择性地过度活化了CaV1通道，这是在β细胞生理学或病理生理学中比其他类型的CaV通道起主要作用的主要的CaV通道类型。通过ApoCIII选择性地过度活化β细胞CaV1通道说明了这种载脂蛋白在Ca2+依赖的β细胞死亡中的病例病理生理学作用1,2,5。
一系列的蛋白质激酶(例如PKA和PKC)可以选择性地磷酸化CaV通道，使得这些通道中由于磷酸化诱导的构造改变而使开放通道的密度和活性增加3,25,26。通过ApoCIII而使得功能CaV通道的数量和开放几率增加可以通过蛋白质激酶来介导。已经证明ApoCIII在单核细胞中通过β1整联蛋白来活化PKC16。此外，β1整联蛋白的活化还通过刺激PKA、PKC和Src激酶而上调节了神经元、心室肌细胞和血管平滑肌细胞的CaV1通道19-22。所有这些成分都存在于β细胞中2,27-30，并且可以表明ApoCIII采用了β1整联蛋白-PKA/PKC/Src激酶级联而过度活化β细胞CaV通道。实际上，本著作显示PKA,PKC和Src激酶的复合抑制会有效地消除β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化，并且PKA和Src激酶的共抑制足以起到上述作用。但是，PKA,PKC或Src激酶的单个抑制仅对β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化产生(如果可能)微小的作用。因此，我们推断ApoCIII依赖于平行PKA和Src途径来上调节β细胞CaV通道。
发生β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化需要过夜温育。因此，所述的作用可以通过CaV通道表达的增加来说明。因此，我们在与ApoCIII过夜温育的RINm5F细胞中对CaV1.2和CaV1.3的免疫反应性进行了定量。但是，所述的温育对β细胞CaV1通道的表达无影响。因此，我们推断出ApoCIII升高β细胞CaV1通道表达的可能性。
跨膜受体β1整联蛋白与其他整联蛋白非共价结合，从而形成一组异源二聚体。它们识别了大量的可溶性且表面结合的蛋白质，从而介导了细胞-细胞、细胞-细胞外基质、以及细胞-病原体的相互作用31。在一些细胞类型中，β1整联蛋白位于ApoCIII的下游，PKA/PKC/Src激酶的上游16,19-22。这使我们调查ApoCIII-β1整联蛋白-PKA/PKC/Src激酶途径在β细胞是否作为机制而工作，由此该载脂蛋白过度活化CaV1通道。有趣的是，在缺乏ApoCIII的情况下，敲除β1整联蛋白不会影响β细胞CaV通道的活性，但是会显著消除β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化。该结果清楚地证明β1整联蛋白在介导ApoCIII对β细胞CaV1通道活性作用中起重要的作用。
尽管β1整联蛋白可以将ApoCIII与相应的下游效应器PKA,PKC和Src激酶偶联，但是β1整联蛋白不可能与该载脂蛋白直接作用16,19-22。在本研究中，我们证明SRBI在ApoCIII和β1整联蛋白之间起到分子桥梁的作用，这是因为SRBI基因沉默会有效地使β细胞CaV通道的ApoCIII诱导的过度活化失效。这产生了β细胞CaV通道过度活化的新级联的完整图画，即ApoCIII-SRBI-β1整联蛋白-PKA/Src。
当将细胞去极化至比+10mV更高的正电势时，发生了在本著作中观察到的β细胞CaV1通道的ApoCIII诱导的过度活化。在试验条件下，通过使用穿孔的全细胞膜片钳记录模式来检测ApoCIII的作用，其中所述的条件下将10mMCa2+加入至细胞外溶液中，从而获得最佳的Ca2+电流。与细胞外Ca2+的生理性浓度(2.5mM)相比，如此高的细胞外Ca2+的浓度可以显著地将I-V曲线迁移至更高的正电势。穿孔全细胞膜片钳记录模型具有相似的作用。因此，在体内条件下，ApoCIII在生理学质膜电势范围内可能影响β细胞CaV1电流。
综上所述，我们的发现证明ApoCIII通过平行的PKA和Src激酶途径以SRBI/β1整联蛋白依赖的方式选择性地过度活化β细胞CaV1通道。β细胞CaV1通道的ApoCIII诱导的过度活化表征为在β细胞的质膜中，功能CaV1通道的富集密度和增加的活性。这种新的信号传导途径可以作为新型药品发现平台而用于防止与糖尿病有关的Ca2+依赖的β细胞死亡。
方法
细胞培养和处理。由成年雄性小鼠和雌性小鼠分离胰岛并分散成单一的β细胞。将融合率为大约70％的RINm5F细胞进行胰蛋白酶作用。将得到的细胞悬液接种至Petri培养皿或12孔板中。将细胞在补充有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和100U/100μg/ml青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI1640培养基中培养，并在潮湿的5％CO2孵化器中保持在37℃下。它们过夜生长，然后经过siRNA转染。对于膜片钳分析而言，使用ApoCIII,PKA抑制剂H-89(Calbiochem,LaJolla,CA),PKC抑制剂卡弗他丁C(Calbiochem),Src激酶抑制剂PP2(Calbiochem)和CaV1通道阻断剂尼莫地平(Calbiochem)(在RPMI培养基中，最终浓度分别为20μg/ml,0.5μM,0.1μM,0.1μM和5μM)对细胞进行过夜处理。将ApoCIII溶解于0.1％三氟乙酸(TFA)中以制备1mg/ml的原液，而将H-89,卡弗他丁C,PP2和尼莫地平溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，从而分别形成5mM,1mM,1mM和10mM的原液。将0.002％TFA和/或0.03％DMSO用作媒介物对照。
siRNA设计和转染。设计靶向大鼠β1整联蛋白的2对21-mersiRNA(β1整联蛋白siRNA#1,ID127971和β1整联蛋白siRNA#2,ID127972)和SRBI(ID128929)双链，并通过AppliedBiosystems/Ambion(Austin,TX)化学合成。对它们的序列进行BLAST检索以确保它们的特异性。SelectNegativeControlsiRNA(4390843)(不靶向任何基因产物)和SelectGAPDHPositiveControlsiRNA(4390849)(有效沉默人类、小鼠和大鼠细胞中的GAPDH)购自AppliedBiosystems/Ambion(Austin,TX)。使用LipofectamineTMRNAiMAX逆向转染RINm5F细胞。简言之，将阴性对照siRNA,β1整联蛋白siRNA#1,β1整联蛋白siRNA#2或SRBIsiRNA与LipofectamineTMRNAiMAX混合，然后在室温下温育20min。随后，将细胞加入siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX混合物中，然后温和地搅拌，并在潮湿的5％CO2孵化器中保持在37℃下。在72h后，使转染的细胞生长至融合率大约70％，并进行免疫印迹检验或不同的处理。
半定量RT-PCR。使用RNeasyMicroKit，根据制造商(Qiagen,Valencia,CA)的建议，由RINm5F细胞分离总RNA。通过Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)合成RT-PCR引物对。SRBI引物对由正向引物5’-CAAGAAGCCAAGCTGTAGGG-3’(SEQIDNO:11)和反向引物5’-TCCTTGGAGGCCATGTAG-3’(SEQIDNO:14)组成。使用IIReverseTranscriptase(Invitrogen)和Oligo(dT)12-18Primer(Invitrogen)逆转录500ng总RNA。使用TaqDNAPolymerase(Invitrogen)实施聚合酶链式反应。在94℃下进行90秒，用于使模板完全变性并活化TaqDNAPolymerase，然后在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒、以及在72℃下延伸30秒，进行29个循环。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来检测扩增的PCR产物。
SDS-PAGE和免疫印迹分析。将不同处理后的RINm5F细胞在溶解缓冲剂(pH7.5)中溶解，其中所述的缓冲剂由50mMHEPES,150mMNaCl,1mMEGTA,1mMEDTA,10％甘油,1％TritonX-100,1mMPMSF和蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)组成。将溶解产物在4℃下在800xg下离心10min，从而除去细胞碎片和核。使用Bio-Rad蛋白质检验试剂(Bio-Rad,Hercules,CA)测定所得样品的蛋白质浓度。通过在SDS样品缓冲剂中在96℃下加热3min使样品变性，然后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，和免疫印迹分析。简言之，将50,90或180μg蛋白质在不连续的凝胶中分离，其中所述的凝胶由4％丙烯酰胺积层凝胶(pH6.8)和8％丙烯酰胺分离胶(pH8.8)组成。然后，将分离的蛋白质电转染，从而使聚偏二氟乙烯膜(Hybond-P；GEHealthcare,Uppsala,Sweden)疏水。通过在5％的脱脂奶粉的洗涤缓冲剂中温育1h来阻断印迹，其中所述的缓冲剂包含50mM三(羟甲基)氨基甲烷,150mMNaCl和0.05％Tween20(pH7.5)。然后，在4℃下将它们分别与抗β1整联蛋白(1:500；Millipore,Billerica,MA),SRBI(1:2500；Novus,Cambridge,UK),CaV1.2(1:200)和CaV1.3(1:200)的亲和纯化的兔多克隆抗体过夜温育，并在室温下分别与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,1:4000；AppliedBiosystems/Ambion,Austin,TX)的小鼠单克隆抗体温育1h。在使用洗涤缓冲剂漂洗后，在室温下将所述的印迹与二级抗体(辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG或者辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG；1:50,000；Bio-Rad,Hercules,CA)温育45min。使用ECL加Western印迹检测***来观察免疫反应条带(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)。
电生理学。将不同处理后的小鼠小岛细胞和RINm5F细胞进行单一通道和全细胞膜片钳测量。使用细胞附着的并穿孔的全细胞膜片钳构造。电极由硼硅酸盐玻璃微管制成，其经过火焰剖光并在接近它们的尖端涂敷Sylgard。将一些电极充满包含(inmM)110BaCl2,10TEA-Cl,和5HEPES(pH7.4，具有Ba(OH)2)的溶液用于单一通道测量。其他电极充满由(以mM计)76Cs2SO4,1MgCl2,10KCl,10NaCl,和5HEPES(pH7.35，具有CsOH),以及两性霉素B(0.24mg/ml)组成的溶液用于全细胞电流记录。当电极充满电极溶液并浸渍在槽液中时，电极电阻为4至6MΩ。在槽液中校正电极抵消电势，然后形成封口。使用浸泡于去极化的外部记录溶液中的细胞进行单一通道的记录，其中所述的去极化的外部记录溶液包含(以mM计)125KCl,30KOH,10EGTA,2CaCl2,1MgCl2,和5HEPES-KOH(pH7.15)。该溶液用于使细胞内电势达到0mV。对于穿孔全细胞电流测量而言，将细胞浸泡在包含(以mM计)138NaCl,5.6KCl,1.2MgCl2,10CaCl2,5HEPES(pH7.4)的溶液中。在室温(大约22℃)下，分别使用Axopatch200B倍增器(MolecularDevices,FosterCity,California)和EPC-9膜片钳倍增器(HEKAElektronik,Lambrecht/Pfalz,Germany)来记录单一通道和全细胞电流。分别使用软件程序pCLAMP10(AxonInstruments)和软件程序PatchMaster/FitMaster(HEKA)获取并分析单一通道和全细胞的电流数据。通过细胞电容将全细胞电流的振幅归一化。
统计学分析。所有数据均以平均值±SEM的提供。通过单因素ANOVA、然后通过最小显著性差异测试法测定统计学意义。当比较2组时，使用未配对的Student'st检验或Mann-WhitneyU检验。将显著性水平设定为0.05或0.01。
参考文献
1.Yang,S.N.&Berggren,P.O.b-CellCaVchannelregulationinphysiologyandpathophysiology.Am.J.Physiol.288,E16-E28(2005).
2.Yang,S.N.&Berggren,P.O.Theroleofvoltage-gatedcalciumchannelsinpancreaticb-cellphysiologyandpathophysiology.Endocr.Rev.27,621-676(2006).
3.Catterall,W.A.Structureandregulationofvoltage-gatedCa2+channels.Annu.Rev.CellDev.Biol.16,521-555(2000).
4.Juntti-Berggren,L.etal.IncreasedactivityofL-typeCa2+channelsexposedtoserumfrompatientswithtypeIdiabetes.Science261,86-90(1993).
5.Juntti-Berggren,L.etal.ApolipoproteinCIIIpromotesCa2+-dependentbcelldeathintype1diabetes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101,10090-10094(2004).
6.Sol,E.M.,Sundsten,T.&Bergsten,P.RoleofMAPKinapolipoproteinCIII-inducedapoptosisinINS-1Ecells.LipidsHealthDis.8,3(2009).
7.Holmberg,R.etal.LoweringapolipoproteinCIIIdelaysonsetoftype1diabetes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA108,10685-10689(2011).
8.Gangabadage,C.S.etal.StructureanddynamicsofhumanapolipoproteinCIII.J.Biol.Chem.283,17416-17427(2008).
9.Jong,M.C.,Hofker,M.H.&Havekes,L.M.RoleofApoCsinlipoproteinmetabolism:functionaldifferencesbetweenApoC1,ApoC2,andApoC3.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19,472-484(1999).
10.Xu,S.etal.ApolipoproteinsofHDLcandirectlymediatebindingtothescavengerreceptorSR-BI,anHDLreceptorthatmediatesselectivelipiduptake.J.LipidRes.38,1289-1298(1997).
11.Clavey,V.,Lestavel-Delattre,S.,Copin,C.,Bard,J.M.&Fruchart,J.C.ModulationoflipoproteinBbindingtotheLDLreceptorbyexogenouslipidsandapolipoproteinsCI,CII,CIII,andE.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.15,963-971(1995).
12.Huard,K.etal.ApolipoproteinsC-IIandC-IIIinhibitselectiveuptakeoflow-andhigh-densitylipoproteincholesterylestersinHepG2cells.Int.J.Biochem.CellBiol.37,1308-1318(2005).
13.Chan,D.C.,Watts,G.F.,Redgrave,T.G.,Mori,T.A.&Barrett,P.H.ApolipoproteinB-100kineticsinvisceralobesity:associationswithplasmaapolipoproteinC-IIIconcentration.Metabolism51,1041-1046(2002).
14.Sundsten,T.,Ostenson,C.G.&Bergsten,P.Serumproteinpatternsinnewlydiagnosedtype2diabetesmellitus--influenceofdiabeticenvironmentandfamilyhistoryofdiabetes.DiabetesMetab.Res.Rev.24,148-154(2008).
15.Atzmon,G.etal.Lipoproteingenotypeandconservedpathwayforexceptionallongevityinhumans.PLoSBiol.4,e113(2006).
16.Kawakami,A.etal.ApolipoproteinCIIIinapolipoproteinBlipoproteinsenhancestheadhesionofhumanmonocyticcellstoendothelialcells.Circulation113,691-700(2006).
17.Fang,D.Z.&Liu,B.W.ApolipoproteinC-IIIcanspecificallybindtohepaticplasmamembranes.Mol.Cell.Biochem.207,57-64(2000).
18.Kawakami,A.etal.ApolipoproteinCIII-inducedTHP-1celladhesiontoendothelialcellsinvolvespertussistoxin-sensitiveGprotein-andproteinkinaseCa-mediatednuclearfactor-kBactivation.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27,219-225(2007).
19.Rueckschloss,U.&Isenberg,G.ContractionaugmentsL-typeCa2+currentsinadherentguinea-pigcardiomyocytes.J.Physiol.560,403-411(2004).
20.Waitkus-Edwards,K.R.etal.a4b1IntegrinactivationofL-typecalciumchannelsinvascularsmoothmusclecausesarteriolevasoconstriction.Circ.Res.90,473-480(2002).
21.Wu,X.,Davis,G.E.,Meininger,G.A.,Wilson,E.&Davis,M.J.RegulationoftheL-typecalciumchannelbya5b1integrinrequiressignalingbetweenfocaladhesionproteins.J.Biol.Chem.276,30285-30292(2001).
22.Gui,P.etal.IntegrinreceptoractivationtriggersconvergingregulationofCav1.2calciumchannelsbyc-SrcandproteinkinaseApathways.J.Biol.Chem.281,14015-14025(2006).
23.Bamberger,M.E.,Harris,M.E.,McDonald,D.R.,Husemann,J.&Landreth,G.E.Acellsurfacereceptorcomplexforfibrillarbeta-amyloidmediatesmicroglialactivation.J.Neurosci.23,2665-2674(2003).
24.Ristic,H.,Srinivasan,S.,Hall,K.E.,Sima,A.A.&Wiley,J.W.SerumfromdiabeticBB/Wratsenhancescalciumcurrentsinprimarysensoryneurons.J.Neurophysiol.80,1236-1244(1998).
25.Kavalali,E.T.,Hwang,K.S.&Plummer,M.R.cAMP-dependentenhancementofdihydropyridine-sensitivecalciumchannelavailabilityinhippocampalneurons.J.Neurosci.17,5334-5348(1997).
26.Yang,J.&Tsien,R.W.EnhancementofN-andL-typecalciumchannelcurrentsbyproteinkinaseCinfrogsympatheticneurons.Neuron10,127-136(1993).
27.Mukai,E.etal.Exendin-4suppressesSrcactivationandreactiveoxygenspeciesproductionindiabeticGoto-KakizakiratisletsinanEpac-dependentmanner.Diabetes60,218-226(2011).
28.Kantengwa,S.etal.Identificationandcharacterizationofa3b1integrinonprimaryandtransformedratisletcells.Exp.CellRes.237,394-402(1997).
29.Bosco,D.,Meda,P.,Halban,P.A.&Rouiller,D.G.Importanceofcell-matrixinteractionsinratisletb-cellsecretioninvitro:roleofa6b1integrin.Diabetes49,233-243(2000).
30.Nikolova,G.etal.Thevascularbasementmembrane:anicheforinsulingeneexpressionandbcellproliferation.Dev.Cell10,397-405(2006).
31.Luo,B.H.,Carman,C.V.&Springer,T.A.Structuralbasisofintegrinregulationandsignaling.Annu.Rev.Immunol.25,619-647(2007).

Claims (19)

1.一种用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
(a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的载脂蛋白CIII(ApoCIII)相接触；
(b)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第二群体与抑制B族I型清道夫受体(SRBI)的表达或活性的分子相接触；以及
(c)识别阳性测试化合物作为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体中更高程度地抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
2.权利要求1所述的方法，其进一步包含在一种或多种所述的候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第三群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第三群体与Cav2和/或CaV3通道阻断剂相接触，其中所述的候选化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的候选化合物在胰岛素分泌细胞的第三群体中比在胰岛素分泌细胞的第一群体中更高程度地抑制了密度和/或传导性的ApoCIII诱导的增加。
3.权利要求1或2所述的方法，其进一步包含在一种或多种所述的候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第四群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第四群体与Src激酶抑制剂和/或蛋白质激酶A(PKA)抑制剂相接触，其中所述的这些候选化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的这些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
4.权利要求1-3的任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包含在一种或多种所述的候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第五群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第五群体与抑制β1整联蛋白表达或活性的分子相接触，其中所述的这些候选化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的这些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第五群体中更高程度地抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。
5.一种用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物的方法，其包含：
a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触；以及
b)识别那些阳性测试化合物，与对照相比，该化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中抑制了CaV1通道的密度和/或传导性的ApoCIII诱导的增加并且抑制了SRBI的表达或活性，其中所述的阳性测试化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物。
6.权利要求6所述的方法，其中所述的对照包含在所述的测试化合物缺乏下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加CaV1通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触。
7.权利要求1-6的任意一项所述的方法，其中所述的胰岛素分泌细胞为胰腺β细胞。
8.权利要求1-7的任意一项所述的方法，其中所述的方法包含将所述的细胞与ApoCIII接触至少6小时。
9.权利要求1-8的任意一项所述的方法，其中所述的候选化合物为用于限制1型糖尿病的发展和/或治疗1型糖尿病的候选化合物。
10.权利要求1-8的任意一项所述的方法，其中所述的候选化合物为用于限制2型糖尿病的发展和/或治疗2型糖尿病的候选化合物。
11.权利要求1-10的任意一项所述的方法，其中所述的SRBI抑制剂选自抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,小分子SRBI抑制剂,干扰素α,N-[4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)苯基]-(2-氯代-5-硝基苯基)甲酰胺(R-138329),2-己基-1-环戊酮缩氨基硫脲,33M20,(BLT1),以及选自以下的一种或多种SRBI抑制剂：MIT9952-1,9952-2,9952-3,9952-4,9952-5,9952-6,9952-7,9952-8,9952-9,9952-10,9952-11,9952-12,9952-13,9952-14,9952-15,9952-16,9952-17,9952-18,9952-19,9952-20,9952-21,9952-22,9952-23,9952-24,9952-25,9952-26,9952-27,9952-28,9952-29,9952-30,9952-31,9952-32,9952-33,9952-34,9952-35,9952-36,9952-37,9952-38,9952-39,9952-40,9952-41,9952-42,9952-43,9952-44,9952-45,9952-46,9952-47,9952-48,9952-49,9952-50,9952-51,9952-52,9952-53,9952-54,9952-55,9952-56,9952-57,9952-58,9952-59,9952-60,9952-61,9952-62,9952-63,9952-64,9952-65,9952-66,9952-67,9952-68,9952-69,9952-70,9952-71,9952-72,9952-73,9952-74,9952-75,9952-76,9952-77,9952-78,9952-79,9952-80,9952-81,9952-82,9952-83,9952-84,9952-85,9952-86,9952-87,9952-88,9952-89,9952-90,9952-91,9952-92,9952-93,9952-94,9952-95,9952-96,9952-97,9952-98,9952-99,9952-100,9952-101,9952-102,9952-103,9952-104,9952-105,9952-106,9952-107,9952-108,9952-109,9952-110,9952-111,9952-112,9952-113,9952-114,9952-115,9952-116,9952-117,9952-118,9952-119,9952-120,9952-121,9952-122,9952-123,9952-124,9952-125,9952-126,9952-127,9952-128,9952-129,9952-130,9952-131,9952-132,9952-133,9952-134,9952-135,9952-136,9952-137,9952-138,9952-139,9952-140,9952-141,9952-142,9952-143,9952-144,9952-145,9952-146,9952-147,9952-148,9952-149,9952-150,9952-151,9952-152,9952-153,9952-154,9952-155,9952-156,9952-157,9952-158,9952-159,9952-160,9952-161,9952-162,9952-163,9952-164,9952-165,9952-166,9952-167,9952-168,9952-169,9952-170,9952-171,9952-172,9952-173,9952-174,9952-175,9952-176,9952-177,9952-178,9952-179,9952-180,9952-181,9952-182,9952-183,9952-184,9952-185,9952-186,9952-187,9952-188,9952-189,9952-190,9952-191,9952-192,9952-193,9952-194,9952-195,9952-196,9952-197,9952-198,9952-199,9952-200,9952-201,9952-202,9952-203,9952-204,9952-205,9952-206,9952-207,9952-208,9952-209,9952-210,9952-211,9952-212,9952-213,9952-214,9952-215,9952-216,9952-217,9952-218,9952-219,9952-220,9952-221,9952-222,9952-223,9952-224,9952-225,9952-226,9952-227,9952-228,9952-229,9952-230,9952-231,9952-232,9952-233,9952-234,9952-235,9952-236,9952-237,9952-238,9952-239,9952-240,9952-241,9952-242,9952-243,9952-244,9952-245,9952-246,9952-247,9952-248,9952-249,9952-250,9952-251,9952-252,9952-253,9952-254,9952-255,9952-256,9952-257,9952-258,9952-259,9952-260,9952-261,9952-262,9952-263,9952-264,9952-265,9952-266,9952-267,9952-268,9952-269,9952-270,9952-271,9952-272,9952-273,9952-274,9952-275,9952-276,9952-277,9952-278,9952-279,9952-280,9952-281,9952-282,9952-283,9952-284,9952-285,9952-286,9952-287,9952-288,9952-289,9952-290,9952-291,9952-292,9952-293,9952-294,9952-295,9952-296,9952-297,9952-298,9952-299,9952-300,9952-301,9952-302,9952-303,9952-304,9952-305,9952-306,9952-307,9952-308,9952-309,9952-310,9952-311,9952-312,9952-313,9952-314,9952-315,9952-316,9952-317,9952-318,9952-319,9952-320,9952-321,9952-322,9952-323,9952-324,9952-325,9952-326,9952-327,9952-328,9952-329,9952-330,9952-331,9952-332,9952-333,9952-334,9952-335,9952-336,9952-337,9952-338,9952-339,9952-340,9952-341,和9952-342,或者它们的盐。
12.一种治疗或限制糖尿病的发展的方法，其包含向有需要的受试对象给药有效量的SRBI表达和/或活性的抑制剂。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的抑制剂选自抗SRBI抗体,抗SRBI适体,SRBIsiRNA,SRBIshRNA,SRBI反义寡核苷酸,小分子SRBI抑制剂,干扰素α,N-[4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)苯基]-(2-氯代-5-硝基苯基)甲酰胺(R-138329),2-己基-1-环戊酮缩氨基硫脲,33M20,(BLT1),以及选自以下的一种或多种SRBI抑制剂：MIT9952-1,9952-2,9952-3,9952-4,9952-5,9952-6,9952-7,9952-8,9952-9,9952-10,9952-11,9952-12,9952-13,9952-14,9952-15,9952-16,9952-17,9952-18,9952-19,9952-20,9952-21,9952-22,9952-23,9952-24,9952-25,9952-26,9952-27,9952-28,9952-29,9952-30,9952-31,9952-32,9952-33,9952-34,9952-35,9952-36,9952-37,9952-38,9952-39,9952-40,9952-41,9952-42,9952-43,9952-44,9952-45,9952-46,9952-47,9952-48,9952-49,9952-50,9952-51,9952-52,9952-53,9952-54,9952-55,9952-56,9952-57,9952-58,9952-59,9952-60,9952-61,9952-62,9952-63,9952-64,9952-65,9952-66,9952-67,9952-68,9952-69,9952-70,9952-71,9952-72,9952-73,9952-74,9952-75,9952-76,9952-77,9952-78,9952-79,9952-80,9952-81,9952-82,9952-83,9952-84,9952-85,9952-86,9952-87,9952-88,9952-89,9952-90,9952-91,9952-92,9952-93,9952-94,9952-95,9952-96,9952-97,9952-98,9952-99,9952-100,9952-101,9952-102,9952-103,9952-104,9952-105,9952-106,9952-107,9952-108,9952-109,9952-110,9952-111,9952-112,9952-113,9952-114,9952-115,9952-116,9952-117,9952-118,9952-119,9952-120,9952-121,9952-122,9952-123,9952-124,9952-125,9952-126,9952-127,9952-128,9952-129,9952-130,9952-131,9952-132,9952-133,9952-134,9952-135,9952-136,9952-137,9952-138,9952-139,9952-140,9952-141,9952-142,9952-143,9952-144,9952-145,9952-146,9952-147,9952-148,9952-149,9952-150,9952-151,9952-152,9952-153,9952-154,9952-155,9952-156,9952-157,9952-158,9952-159,9952-160,9952-161,9952-162,9952-163,9952-164,9952-165,9952-166,9952-167,9952-168,9952-169,9952-170,9952-171,9952-172,9952-173,9952-174,9952-175,9952-176,9952-177,9952-178,9952-179,9952-180,9952-181,9952-182,9952-183,9952-184,9952-185,9952-186,9952-187,9952-188,9952-189,9952-190,9952-191,9952-192,9952-193,9952-194,9952-195,9952-196,9952-197,9952-198,9952-199,9952-200,9952-201,9952-202,9952-203,9952-204,9952-205,9952-206,9952-207,9952-208,9952-209,9952-210,9952-211,9952-212,9952-213,9952-214,9952-215,9952-216,9952-217,9952-218,9952-219,9952-220,9952-221,9952-222,9952-223,9952-224,9952-225,9952-226,9952-227,9952-228,9952-229,9952-230,9952-231,9952-232,9952-233,9952-234,9952-235,9952-236,9952-237,9952-238,9952-239,9952-240,9952-241,9952-242,9952-243,9952-244,9952-245,9952-246,9952-247,9952-248,9952-249,9952-250,9952-251,9952-252,9952-253,9952-254,9952-255,9952-256,9952-257,9952-258,9952-259,9952-260,9952-261,9952-262,9952-263,9952-264,9952-265,9952-266,9952-267,9952-268,9952-269,9952-270,9952-271,9952-272,9952-273,9952-274,9952-275,9952-276,9952-277,9952-278,9952-279,9952-280,9952-281,9952-282,9952-283,9952-284,9952-285,9952-286,9952-287,9952-288,9952-289,9952-290,9952-291,9952-292,9952-293,9952-294,9952-295,9952-296,9952-297,9952-298,9952-299,9952-300,9952-301,9952-302,9952-303,9952-304,9952-305,9952-306,9952-307,9952-308,9952-309,9952-310,9952-311,9952-312,9952-313,9952-314,9952-315,9952-316,9952-317,9952-318,9952-319,9952-320,9952-321,9952-322,9952-323,9952-324,9952-325,9952-326,9952-327,9952-328,9952-329,9952-330,9952-331,9952-332,9952-333,9952-334,9952-335,9952-336,9952-337,9952-338,9952-339,9952-340,9952-341,和9952-342,或者它们药物可接受的盐。
14.权利要求12-13的任意一项所述的方法，其中所述的方法用于治疗糖尿病。
15.权利要求12-13的任意一项所述的方法，其中所述的方法用于限制糖尿病的发展。
16.权利要求12-15的任意一项所述的方法，其中所述的受试对象处于发展成1型糖尿病的风险下。
17.权利要求12-15的任意一项所述的方法，其中所述的受试对象处于发展成2型糖尿病的风险下。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的受试对象患有2型糖尿病。
19.权利要求12-18的任意一项所述的方法，其中所述的方法包含向相对于对照而言过表达apoCIII的受试对象给药所述的apoCIII抑制剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022017530A1 (zh) * 2020-07-24 2022-01-27 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3256118A1 (en) 2015-02-09 2017-12-20 BioCrine AB Methods for treating and/or limiting development of diabetes in subjects with amyotrophic lateral sclerosis
CA2996064C (en) * 2015-08-18 2024-02-13 Novation Pharmaceuticals Inc. Benzopyran derivatives and uses thereof
EP3383869B1 (en) 2015-11-30 2023-06-28 Merck Sharp & Dohme LLC Aryl sulfonamides as blt1 antagonists
WO2017095724A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Aryl sulfonamides as blt1 antagonists
DE202017007491U1 (de) * 2016-12-02 2022-01-07 Sophion Bioscience A/S Dichtungsverstärker

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030055019A1 (en) * 1998-09-28 2003-03-20 Shimkets Richard A. Genes and proteins predictive and therapeutic for stroke, hypertension, diabetes and obesity
WO2004080385A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Compositions and methods for diagnosing and treating an inflammation
US20040224304A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Biostratum, Inc. ApoCIII and the treatment and diagnosis of diabetes
CN101296704A (zh) * 2005-09-16 2008-10-29 科内尔研究基金会 用于减少cd36表达的方法
WO2009128734A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Vialactia Biosciences (Nz) Limited Marker assisted identification of mammals for desired phenotypic trait

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002080499A (ja) * 2000-09-01 2002-03-19 Suntory Ltd カルシウムチャンネル阻害作用を有する新規ペプチド
EP1562605A4 (en) 2002-10-08 2006-07-12 Massachusetts Inst Technology COMPOUNDS FOR MODULATING CHOLESTER INTRANSPORT
US8557513B2 (en) * 2011-06-27 2013-10-15 Biocrine Ab Methods for treating and/or limiting development of diabetes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030055019A1 (en) * 1998-09-28 2003-03-20 Shimkets Richard A. Genes and proteins predictive and therapeutic for stroke, hypertension, diabetes and obesity
WO2004080385A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Compositions and methods for diagnosing and treating an inflammation
US20040224304A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Biostratum, Inc. ApoCIII and the treatment and diagnosis of diabetes
CN101296704A (zh) * 2005-09-16 2008-10-29 科内尔研究基金会 用于减少cd36表达的方法
WO2009128734A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Vialactia Biosciences (Nz) Limited Marker assisted identification of mammals for desired phenotypic trait

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REBECKA HOLMBERG，ET AL: "Lowering apolipoprotein CIII delays onset of type 1 diabetes", 《PNAS》 *
SHAO-NIAN YANG 和 PER-OLOF BERGGREN: "CaV2.3 channel and PKCλ:new players in insulin secretion", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》 *
SHAO-NIAN YANG 和 PER-OLOF BERGGREN: "The Role of Voltage-Gated Calcium Channels in Pancreatic β-Cell Physiology and Pathophysiology", 《ENDOCRINE REVIEWS》 *
方玲娜 等: "B类1型清道夫受体基因多态性与2型糖尿病下肢血管病变的相关性", 《苏州大学学报( 医学版)》 *
杜娟和张素华: "清道夫受体与糖尿病", 《国外医学内分泌学分册》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022017530A1 (zh) * 2020-07-24 2022-01-27 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途

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