CN105039480A - 一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：浸泡、去脂肪和酶解，酶解过程中将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；在盐析纯化过程中取粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明利用酶解的提取胶原蛋白并通过盐析纯化的方法进行纯化，不仅无环境污染，提取效率高，而且所得产品具有良好的生物学特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，属于天然活性物质领域。
背景技术
胶原蛋白是生物体内重要的结构蛋白，是支持组织和***的主要组成部分。胶原蛋白所特有的三重螺旋的氨基酸结构使它具有许多很有用的特性，如高拉伸强度、良好的生物相容性、低抗原性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞生长的性能。所具有的这些特性都使其成为一种理想的生物医用材料。以胶原蛋白为原料所衍生的生物医用材料，已成为医用材料领域最快的增长点之一，全球市场年销售额已达40余亿美元。
传统提取胶原蛋白所使用的原料主要来自猪和牛等动物的皮肤等***。但由于疯牛病、禽流感、***等问题，国家对动物组织来源的胶原蛋白产品实行严格控制，我国政府目前禁止所有以牛的组织为原料提取的进口胶原蛋白产品。寻找新来源的生物胶原蛋白是当前急需要解决的重要课题。与陆生动物相比，水产动物胶原即使在低温下也可溶于中性盐溶液或酸性溶液，比较容易制得可溶性胶原溶液，这为其利用提供了有利条件。
目前人们已经从多种水产品中提取到了胶原蛋白，相关报道也越来越多。但对于我国传统的营养滋补佳品，本身就富含胶原蛋白的水产动物——中华鳖作为新型生物胶原蛋白来源的研究却比较缺乏。中华鳖(Pelodiscussinensis)，俗称甲鱼，自古就是我国传统的滋补佳品，具有很高的营养价值和保健功效。鳖甲周围的结缔软组织通常被称为“裙边”，胶原蛋白含量十分丰富，经前期实验表明，其干重含量超过70％，经文献检索，关于中华鳖中胶原蛋白的研究仅限于其分离提取及结构表征的报道，但关于鳖源胶原蛋白的纯化工艺及生物学性能研究则未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种纯化工艺简单的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于4℃～10℃下放置24h～48h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后，他材料搜集好了再给我10％～15％异丙醇溶液于4℃～10℃浸泡24h～48h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；
(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。
进一步地，所述步骤(4)的盐析纯化过程中分别研究了时间、NaCl浓度、胶原蛋白浓度三个因素对胶原蛋白回收率的影响，其中，针对时间因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，均稀释粗提液胶原蛋白浓度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析1h、12h、24h、36h、48h；而针对NaCl浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L的NaCl，在4℃下盐析24h；而针对胶原蛋白浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别稀释粗提液胶原蛋白浓度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析24h。本发明的研究重点在于首次研究了胶原蛋白浓度对于分离纯化所起的作用，为其它纯化实验不常用的一个因素，原因在于：胶原蛋白浓度太高就会造成聚沉，需要有一个最佳盐析范围，中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响，同时还综合了时间和NaCl浓度两个因素，以通过对时间、NaCl浓度、胶原蛋白浓度三个因素的研究，以确定最佳的分离纯化效果。
作为优选，所述盐析的最佳组合为：时间为24h、NaCl浓度为3mol/L，胶原蛋白浓度为8g/L。
进一步地，所述步骤(4)的透析过程具体为：将所述沉淀溶解于乙酸后，用截留分子量分别为25KD、50KD、100KD的透析袋进行透析，透析液为纯水，在4℃～10℃下分别透析24h和48h，透析期间换水4～5次，取各透析时间的胶原蛋白溶液进行SDS-PAGE检测纯度，将透析后的胶原蛋白溶液冷冻干燥得胶原蛋白冻干品。
进一步地，所述步骤(1)中，所述碱性浸泡盐液的用量为所述中华鳖裙边质量的2倍～4倍。
进一步地，所述碱性浸泡盐液中含有NaCl和NaOH，所述碱性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2％～4％，所述碱性浸泡盐液中NaOH的浓度为0.5％～1.5％。
进一步地，所述步骤(3)中酶解处理的温度为30℃～50℃，酶解处理的pH值为2～4，酶解处理的时间为8h～12h。
与现有技术相比，本发明的优点在于:
1、本发明以中华鳖裙边为原料生产可广泛应用于食品、医药、化妆品、生物材料等领域的胶原蛋白，既延伸产业链，提高产品附加值，增加经济和社会效益；
2、胶原蛋白在机体内以胶原纤维的形式存在，具有较高的稳定性。传统胶原蛋白的提取大多采用盐、酸、碱、热水等方法，存在提取效率较低，环境污染大，产品质量不稳定等问题。本发明利用酶解的提取胶原蛋白并通过盐析纯化的方法进行纯化，不仅无环境污染，提取效率高，而且所得产品具有良好的生物学特性，并比较了不同规格分子截留量的透析袋对胶原蛋白粗提液的纯化效果，旨在为今后进一步对胶原蛋白纯品的理化性质作鉴定，并和其他来源的胶原蛋白进行比较，同时为综合开发利用鳖源胶原蛋白制备生物医药材料提供一定的理论依据。
附图说明
图1为本发明实施例中NaCl浓度对胶原蛋白回收率的影响；
图2为本发明实施例中胶原蛋白浓度对胶原蛋白回收率的影响；
图3为本发明实施例中时间对胶原蛋白回收率的影响；
图4为本发明实施例中中华鳖裙边胶原蛋白盐析的电泳图谱；
图5为本发明实施例中中华鳖裙边胶原蛋白透析的电泳图谱(A、a泳道分别为用截留分子量25KD的透析袋透析24h、48h的纯化效果；B、b泳道分别为用截留分子量50KD的透析袋透析24h、48h的纯化效果；C、c泳道分别为用截留分子量100KD的透析袋透析24h、48h的纯化效果)。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于4℃下放置24h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后的中华鳖裙边进行清洗，加入10％异丙醇溶液于4℃浸泡24h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，4℃下提取24h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；
(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。
实施例2
中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于10℃下放置48h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后的中华鳖裙边进行清洗，加入15％异丙醇溶液于10℃浸泡48h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，10℃下提取48h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；
(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。
实施例3
中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于8℃下放置30h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后的中华鳖裙边进行清洗，加入12％异丙醇溶液于8℃浸泡30h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，8℃下提取30h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；
(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。
实施例4盐析单因素试验-NaCl浓度
NaCl浓度对胶原蛋白回收率的影响的实验方法：取10mL粗提液，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/LNaCl，在4℃下盐析24h；
由图1可知，NaCl浓度对胶原蛋白回收率的影响：在NaCl浓度为1mol/L-3mol/L时,胶原蛋白回收率随NaCl浓度的增大而增长,在2mol/L之后增长缓慢，在3mol/L达到最大值，3mol/L之后有缓慢下降趋势，4mol/L之后显著下降。这可能是由于NaCl浓度较低时,随着NaCl浓度的增加,溶液中盐离子浓度的增大,因此,胶原蛋白的回收率也会增加；当溶液中盐离子浓度过大时就会造成胶原蛋白的聚沉，再增加NaCl浓度,胶原蛋白回收率就会下降，而且NaCl浓度过高,可能会影响胶原蛋白的活性。根据图中胶原蛋白回收率随NaCl浓度的变化趋势，选择NaCl浓度3mol/L为最优点。
实施例5盐析单因素试验-NaCl浓度
NaCl浓度对胶原蛋白回收率的影响的实验方法：取10mL粗提液，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/LNaCl，在4℃下盐析24h；
结果由图1可知，NaCl浓度对胶原蛋白回收率的影响：在NaCl浓度为1mol/L-3mol/L时,胶原蛋白回收率随NaCl浓度的增大而增长,在2mol/L之后增长缓慢，在3mol/L达到最大值，3mol/L之后有缓慢下降趋势，4mol/L之后显著下降。这可能是由于NaCl浓度较低时,随着NaCl浓度的增加,溶液中盐离子浓度的增大,因此,胶原蛋白的回收率也会增加；当溶液中盐离子浓度过大时就会造成胶原蛋白的聚沉，再增加NaCl浓度,胶原蛋白回收率就会下降，而且NaCl浓度过高,可能会影响胶原蛋白的活性。根据图中胶原蛋白回收率随NaCl浓度的变化趋势，选择NaCl浓度3mol/L为最优点。
实施例6盐析单因素试验-胶原蛋白浓度
胶原蛋白浓度对胶原蛋白回收率的影响的实验方法：取10mL粗提液，分别稀释粗提液胶原蛋白浓度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析24h；
结果由图2可知：在胶原蛋白浓度为2g/L-8g/L时,胶原蛋白回收率随胶原蛋白浓度的增大而增长,且增长趋势显著，在8g/L时达到最大值；在8g/L之后显著下降，这可能是由于胶原蛋白浓度较高,而盐浓度不够足以将胶原蛋白完全盐析所致。根据图中胶原蛋白回收率随胶原蛋白浓度的变化趋势，选择胶原蛋白浓度8g/L为最优点。
实施例7盐析单因素试验-时间
时间对胶原蛋白回收率的影响的实验方法：取10mL粗提液，均稀释粗提液胶原蛋白浓度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析1h、12h、24h、36h、48h；
结果由图3可知：在1h-24h，胶原蛋白回收率随时间的延长而增大，这是因为胶原蛋白需要足够的时间盐析；在24h之后显著下降，这可能是由于胶原蛋白在长时间的盐析条件下，会造成胶原蛋白的变性。根据图中胶原蛋白回收率随时间的变化趋势，选择时间24h为最优点。
实施例8盐析正交试验
在单因素试验基础上，考察了NaCl浓度、胶原蛋白浓度、时间为研究对象，设计了3因素3水平的正交试验，以胶原蛋白回收率为指标(见表1)，用SDS-PAGE检测盐析纯化效果，分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％。
表1正交试验设计表
Tab.1Orthogonaldesignofexperiment
表2正交试验结果
Tab.2Resultoforthogonalexperiment
由表2可知，三种因素极差大小依次为RB＞RC＞RA，即NaCl浓度对胶原蛋白回收率影响最大，其次为胶原蛋白浓度，时间影响效果最小，最优提取条件为：A2B1C2，即时间为24h、NaCl浓度为2mol/L，胶原蛋白浓度为8g/L时胶原蛋白回收率最大。在此最后条件下做了三组平行实验，得到胶原蛋白回收率为81.22％、80.65％、82.31％，可见最优条件是可行的。
实施例9粗提液透析纯化
取10mL粗提液分别置于截留分子量为25KD、50KD、100KD的透析袋中，透析液为纯水，在4℃下透析24h、48h，取各时间的胶原蛋白溶液进行SDS-PAGE检测纯度，胶浓度为：分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％。
结果由图4的胶原蛋白盐析SDS-PAGE图谱可以看出中华鳖裙边胶原蛋白粗提液在经过盐析之后可得到明显的纯化，而且中华鳖裙边胶原蛋白粗提液杂带也不是很多，更加验证了中华鳖裙边中胶原蛋白含量很高。
由图5胶原蛋白透析SDS-PAGE图谱可以看出100KD的透析袋相对于另外两种规格的透析袋的纯化效果最好，而且时间对纯化效果也有一定的影响，48h的纯化效果比24h好，相较于盐析其纯化效果更好。可见，用透析袋直接对粗提液进行纯化操作简单方便、经济；还可以省去盐析胶原蛋白、透析除盐这一步骤，减少了工作量和缩短了试验时间。
Claims (7)
1.一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)浸泡：取中华鳖裙边匀浆打碎，用碱性浸泡盐液中于4℃～10℃下放置24h～48h，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(2)去脂肪：将步骤(1)浸泡后的中华鳖裙边进行清洗，加入10％～15％异丙醇溶液于4℃～10℃浸泡24h～48h，以去除脂肪，蒸馏水反复洗涤，用纱布充分沥干后备用；
(3)酶解：将已去杂的中华鳖裙边置于0.5mol/L乙酸，料液比1:25，加入胃蛋白酶酶解液中进行酶解处理，4℃～10℃下提取24h～48h，得到中华鳖裙边胶原蛋白粗提液；
(4)盐析纯化：取步骤(3)的粗提液溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液；将沉淀溶解于0.5mol/L的乙酸中，透析后，冷冻干燥，即得中华鳖胶原蛋白冻干品。
2.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)的盐析纯化过程中分别研究了时间、NaCl浓度、胶原蛋白浓度三个因素对胶原蛋白回收率的影响，其中，针对时间因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，均稀释粗提液胶原蛋白浓度至10g/L，并且均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析1h、12h、24h、36h、48h；而针对NaCl浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别加入1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L的NaCl，在4℃下盐析24h；而针对胶原蛋白浓度因素的研究方法为：取10mL的所述粗提液，分别稀释粗提液胶原蛋白浓度至2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L，均向其中加入3mol/LNaCl，在4℃下盐析24h。
3.根据权利要求2所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述盐析的最佳组合为：时间为24h、NaCl浓度为3mol/L，胶原蛋白浓度为8g/L。
4.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)的透析过程具体为：将所述沉淀溶解于乙酸后，用截留分子量分别为25KD、50KD、100KD的透析袋进行透析，透析液为纯水，在4℃～10℃下分别透析24h和48h，透析期间换水4～5次，取各透析时间的胶原蛋白溶液进行SDS-PAGE检测纯度，将透析后的胶原蛋白溶液冷冻干燥得胶原蛋白冻干品。
5.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述碱性浸泡盐液的用量为所述中华鳖裙边质量的2倍～4倍。
6.根据权利要求5所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述碱性浸泡盐液中含有NaCl和NaOH，所述碱性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2％～4％，所述碱性浸泡盐液中NaOH的浓度为0.5％～1.5％。
7.根据权利要求1所述的中华鳖源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中酶解处理的温度为30℃～50℃，酶解处理的pH值为2～4，酶解处理的时间为8h～12h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151111 |