CN105039278B

CN105039278B - 突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105039278B
Application number: CN201510338457.8A
Authority: CN
Inventors: 邓艳华; 杨浩; 李泓彦
Original assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd; Fei Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Fei Peng Biological Co., Ltd.; Guangdong Peng Peng biological Co., Ltd.
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2035-06-17
Also published as: CN105039278A

Abstract

本发明公开了一种突变型Taq DNA聚合酶，将野生型Taq DNA聚合酶氨基酸序列突变，具体的为将野生型Taq DNA聚合酶的第605位由亮氨酸突变为精氨酸，第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，并将T3 DNA聚合酶的TBD区即262～337位氨基酸替代Taq DNA聚合酶拇指区的480～485位氨基酸。上述定点突变使得突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。这种突变型Taq DNA聚合酶，由于具有较高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中。本发明还公开了上述突变型Taq DNA聚合酶的制备方法及应用。

Description

突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由水生栖热菌中分离得到的。1969年在美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到一种水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1，它能生长在70℃～75℃极富含矿物质的环境中。1976年，A.Chien从水生栖热菌中分离纯化得到了耐热的Taq DNA聚合酶。1983年kary Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)，1988年RandallK.Saiki等也从水生栖热菌中分离纯化得到Taq DNA聚合酶并将它应用于PCR技术，实现了PCR过程自动连续循环。现有的研究表明，Taq DNA聚合酶属于DNA聚合酶I家族，酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD。Taq DNA聚合酶在70℃～75℃时具有最高的生物学活性，在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃持续5min～6min可保持约50％的酶活性。

在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶，由于Taq DNA聚合酶在高温下能保持一定的活性，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，大大降低了成本。然而，随着PCR技术的日益推广和应用，研究人员对Taq DNA聚合酶性能要求不断提高。野生型Taq DNA聚合酶结构上的缺陷，使其在许多应用领域受到限制。现有的Taq DNA聚合酶活性低、耐受性低，不能满足工业生产及科研应用的需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种酶活性高、耐受性高的突变型Taq DNA聚合酶，以及其制备方法和应用。

一种突变型Taq DNA聚合酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

一种突变型Taq DNA聚合酶，包括：

(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、提供用于表达突变型Taq DNA聚合酶的基因表达序列，所述突变型TaqDNA聚合酶包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽；

步骤二、将所述基因表达序列连接到基因表达载体中；

步骤三、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，得到重组细胞；

步骤四、对所述重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

步骤五、将所述菌体裂解，收集裂解粗产物；以及

步骤六、利用Ni-亲和柱纯化所述裂解粗产物，得到所述突变型Taq DNA聚合酶。

在一个实施例中，所述基因表达序列包括：

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列；或

(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述基因表达载体为pET-28a。

在一个实施例中，所述宿主细胞为原核细胞。

在一个实施例中，所述原核细胞为BL21。

一种酶制剂，包括权利要求上述的突变型Taq DNA聚合酶。

在一个实施例中，所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。

上述的突变型Taq DNA聚合酶在制备PCR反应试剂领域中的应用。

这种突变型Taq DNA聚合酶，将野生型Taq DNA聚合酶的第605位由亮氨酸突变为精氨酸，第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，并将T3 DNA聚合酶的TBD区即262～337位氨基酸替代Taq DNA聚合酶拇指区的480～485位氨基酸。上述定点突变使得突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。这种突变型TaqDNA聚合酶，由于具有较高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中。

附图说明

图1为一实施方式的突变型Taq DNA聚合酶制备方法的流程图；

图2a为实施例3中野生型Taq DNA聚合酶与本发明制得的突变型Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2b为实施例3中本发明制得的突变型Taq DNA聚合酶原酶液稀释20倍的样品与原酶液的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图3a为突变型Taq DNA聚合酶的活性检测结果；

图3b为野生型Taq DNA聚合酶的活性检测结果；

图4a为荧光定量PCR检测fermentas的Taq DNA聚合酶对核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果；

图4b为荧光定量PCR检测突变型Taq DNA聚合酶对免核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果；

图4c为荧光定量PCR检测野生型Taq DNA聚合酶对免核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用做进一步的解释说明。

由于野生型Taq DNA聚合酶结构上的缺陷，使得其热稳定性和特异性较差，活性和耐受性较低，在许多应用领域受到限制。

因此，本发明提供一种突变型Taq DNA聚合酶，通过对野生型Taq DNA聚合酶定点突变，使得突变型Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性和特异性，并且活性、耐受性均有明显的提高。

一个实施方式的突变型Taq DNA聚合酶包括：

特别的，野生型Taq DNA聚合酶包括与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少99％同源性的多核苷酸编码得到的多肽。

另一实施方式的突变型Taq DNA聚合酶包括：

(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

特别的，野生型Taq DNA聚合酶包括与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少99％同源性的多肽。

由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此本申请中的突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列，包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码，也可由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的突变型TaqDNA聚合酶，因此，编码上述突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列并不仅限于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与突变型Taq DNA聚合酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、***、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、***和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、***或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、***或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白与突变型Taq DNA聚合酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

这种突变型Taq DNA聚合酶，包括由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽，或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。将野生型Taq DNA聚合酶氨基酸序列突变，具体的为将野生型Taq DNA聚合酶的第605位由亮氨酸突变为精氨酸，第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，并将T3 DNA聚合酶的TBD区(262～337位氨基酸)替代Taq DNA聚合酶拇指区的480～485位氨基酸。

具体的，野生型Taq DNA聚合酶编码序列如SEQ ID No.3所示，野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

Taq DNA聚合酶包括5’核酸外切酶区、3’核酸外切酶区和聚合酶区。其中聚合酶区执行酶的催化聚合功能。聚合酶区的形状就像人的右手一样，由拇指区、掌心区和手指区组成。掌心区的功能是催化磷酰基转移反应，手指区的功能则是促进三磷酸核苷酸碱基与模板配对反应，拇指区控制双链DNA的位置移动和子链延伸。第605位氨基酸和第617位氨基酸均位于Taq DNA聚合酶的掌心区，第605位由亮氨酸突变为精氨酸、第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸有助于催化磷酰基转移反应并提高Taq DNA聚合酶的活性。第667位氨基酸位于Taq DNA聚合酶的手指区，第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸，有助于提高Taq DNA聚合酶的忠实性，促进三磷酸核苷酸碱基与模板配对反应，降低碱基与模板的错误配对，从而提高Taq DNA聚合酶的特异性。同时，将T3 DNA聚合酶的TBD区(262～337位氨基酸)替代Taq DNA聚合酶拇指区的480～485位氨基酸，克服了野生型酶的结构上的缺陷，可以提高Taq DNA聚合酶的活性和耐受性，降低生物样本中各种PCR抑制剂的干扰。上述定点突变使得突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。这种突变型Taq DNA聚合酶具有较高的酶活性和耐受性，特别是在低浓度的模板检测中，突变型Taq DNA聚合酶比野生型的TaqDNA聚合酶灵敏度检出率高，且可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中，极大程度缩短生物样本的核酸检测时间，满足不断提高的工业及研究应用需求。

此外，本发明还提供如图1所示的上述突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：

S110、提供用于表达突变型Taq DNA聚合酶的基因表达序列。

一般的，基因表达序列可根据需要表达的突变型Taq DNA聚合酶，从基因库(GeneBank)中选取相应的基因序列，并根据需要设计突变引物，点突变其中的某个或某段碱基序列。

在一个实施方式中，基因表达序列包括：

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

在一个实施方式中，突变型Taq DNA聚合酶包括：

(a)、由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

本实施方式中，基因表达序列具体为将野生型Taq DNA聚合酶的第1438位～1455位碱基序列替换为T3 DNA聚合酶的TBD区的碱基序列，并将1813～1815位的cta突变为cga、将1849～1851位的agg突变为uuc、将1999～2001位的ttc突变为ttg。

在一个实施方式中，基因表达序列采用如下操作制得：

将含有野生型Taq DNA聚合酶基因(GenBank:D32013.1)的质粒模板、突变引物和/或拼接序列加入PCR反应体系中，进行PCR扩增，得到突变型Taq DNA聚合酶基因表达序列。

具体的，突变引物设计规则如下：引物中必须包含突变的位点，其它序列和原基因序列完全互补，且设计时引物长度控制在25bp～45bp，退火温度≥78℃，使得引物可以很好的和Taq DNA聚合酶基因结合，并且可以减少引物二聚体的形成。拼接引物设计规则如下：引物序列必须与拼接片段的序列完全互补，引物长度控制在30bp～45bp，相邻的上下游引物间必须有重叠碱基，且重叠碱基的数量控制在15bp～20bp，重叠碱基区段的退火温度差值一般小于2℃，引物自身不形成发卡结构。

具体的，PCR反应体系为50μL，PCR反应体系包括10×buffer(100mM KCl，100Mm(NH4)₂SO₄，200mM Tris-HCl pH8.8，20mM MgSO₄，1％TritonX-100，1mg/mL BSA)5μL，10mMdNTP 0.5μL，突变引物(拼接引物)各125ng，1U pfu酶，含50ng质粒模板1μL，加ddH₂O至50μL。

具体的，PCR扩增的条件为95℃变性30s，循环周期为95℃，30s，55℃，1min，68℃，14min，25个循环。

一般的，PCR反应结束后可将反应管放在冰上使其温度≤37℃。然后加入1μL的限制性内切酶Dpn I放置在37℃的恒温箱中酶解1小时，消化掉原来未突变的模板。

由于合成的寡核苷酸即突变引物和拼接序列，包含了需要突变的位点及需要***位点的序列，且已经替换了所需要突变的碱基。扩增后，利用酶消化原来的母板，即消化作为初始模板的未突变的Taq DNA聚合酶基因模板。得到的用于表达突变型Taq DNA聚合酶的基因序列。

S120、将S110得到的基因表达序列连接到基因表达载体中。

一般的，将基因表达序列酶切后接到用相应的酶切处理之后的表达载体中，得到可表达突变型Taq DNA聚合酶的基因表达载体。

一般的，酶切处理可采用BamHI/EcoRI双酶切。

一般的，可根据突变型Taq DNA聚合酶的基因表达序列的特点及常规的分子克隆实验指南，选用各种常规标准表达载体。

在一个实施方式中，基因表达载体为pET-28a。

S130、将S120中的基因表达载体转化到宿主细胞中，得到重组细胞。

一般的，基因表达载体转化操作参见试剂盒生产厂家推荐的方法实现，宿主细胞为感受态细胞，例如大肠杆菌感受态细胞，将构建好的基因表达载体加入感受态细胞，热激处理，使感受态细胞的细胞膜结构扰动，细胞膜上出现空隙以便基因表达载体进入细胞，之后恒温培养，使宿主细胞复苏。

宿主细胞一般选择原核细胞，例如：大肠杆菌。

在一个实施方式中，宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞BL21。

一般的，基因表达载体转化到宿主细胞后，还需要对转化后的宿主细胞进行抗性筛选，如在培养基中加入氨苄西林钠或卡那霉素。

S140、对S130得到的重组细胞进行诱导表达，收集菌体。

一般的，可在一定温度条件下，培养重组细胞至对数期，然后加入诱导剂对重组细胞进行诱导表达，诱导剂可以为一定浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

本实施例中，诱导条件为50mM的IPTG，培养过夜，之后离心收集菌体。

S150、将S140得到的菌体裂解，收集裂解粗产物。

一般的，裂解操作为将菌体溶解，加入溶菌酶和去污剂，振荡混匀后离心收集裂解粗产物。

本实施例中，按每100mL培养物收集的菌体中加入5mL Binding buffer(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，pH8.0)的比例将菌体溶解，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置1h，4℃振荡10min，加入TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)至终浓度为1％，剧烈振荡混匀，4℃振荡10min，之后5,000rpm离心30min，收集上清，将收集的上清置于75℃水浴1h，不时振荡，再5,000rpm离心30min，收集上清，得到裂解粗产物。

S160、利用Ni-亲和柱纯化S150得到的裂解粗产物，得到突变型Taq DNA聚合酶。

一般的，纯化裂解粗产物的操作如下：先用平衡缓冲液平衡Ni-亲和柱，将裂解粗产物加入Ni-和柱中，粗产物中的蛋白与Ni-亲和柱中的金属离子Ni²⁺结合，留在Ni-亲和柱中，之后再加入一定洗脱缓冲液冲洗Ni-亲和柱，使蛋白液流出，收集纯化了的突变型TaqDNA聚合酶。

一般的，洗脱缓冲液为不同浓度的咪唑缓冲溶液。

本实施例中，采用Ni-凝胶纯化粗产物，将Ni-凝胶轻轻混匀，取1mL至柱中，1mLddH₂O洗涤两次，用1mL Binding buffer(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、pH8.0)平衡柱子，将多余的Binding buffer除去，将平衡好的Ni-凝胶加入到粗酶液中，于4℃轻摇1h，上柱，收集的流出液重复上柱2次，收集流出液。洗脱缓冲液(Washing buffer)的配方为：50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0。用1mL洗脱缓冲液洗涤5～10次。之后再加入Elutionbuffer洗涤，配方为：50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，分管收集流出液。

Binding buffer的作用是为了增强洗脱柱对酶蛋白的结合能力，Wash solution的作用是洗掉柱子里除目的酶蛋白以外的杂质，Elution buffer的作用是把目的酶蛋白从柱子上洗脱下来。

一般的，可在分管收集流出液加入两倍体积的饱和硫酸铵，4℃振荡15min，5,000rpm，4℃离心30min，使的流出液中的突变型Taq DNA聚合酶沉淀，收集沉淀。加入1mL酶溶解液溶解，透析后得到突变型Taq DNA聚合酶。

该方法制备的突变型Taq DNA聚合酶，通过对野生型Taq DNA聚合酶氨基酸序列突变，改变野生型Taq DNA聚合酶的分子结构，制备得到的上TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高，可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中。

本发明还提供一种包括上述突变型Taq DNA聚合酶的酶制剂。

特别的，上述酶制剂中还包括用于提高酶活性的金属阳离子，如Mg²⁺、Ba²⁺和Ca²⁺等。

上述突变型Taq DNA聚合酶还可以应用于制备PCR反应试剂领域。

下面为具体实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。

实施例1 突变型Taq DNA聚合酶基因表达载体的制备

选取野生型Taq DNA聚合酶基因(GenBank:D32013.1)的质粒模板、突变引物和/或拼接序列。准备PCR反应体系，PCR反应体系为50μL，包括10×buffer(100mM KCl，100mM(NH4)₂SO₄，200mM Tris-HCl pH8.8，20mM MgSO₄，1％TritonX-100，1mg/mL BSA)5μL，10mMdNTP 0.5μL，突变引物(拼接引物)各125ng，1U pfu酶，含50ng质粒模板1μL，加ddH₂O至50μL。突变引物和拼接序列为人工合成的寡核苷酸，包含了需要突变的位点及需要***位点的序列，且已经替换了所需要突变的碱基。PCR扩增的条件为95℃变性30s，循环周期为95℃，30s，55℃，1min，68℃，14min，25个循环。PCR反应结束后将反应管放在冰上使其温度≤37℃。然后加入1μL的限制性内切酶Dpn I放置在37℃的恒温箱中酶解1小时，消化掉原来未突变的模板。然后加入1μL的限制性内切酶Dpn I放置在37℃的恒温箱中酶解1小时，消化掉原来未突变的模板。经基因测序后，得到的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，完成突变的TaqDNA聚合酶碱基序列与设计的突变序列完全一致。之后将突变好的Taq DNA聚合酶基因表达序列转化到pET-28a载体(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中，得到突变型Taq DNA聚合酶基因表达载体。

实施例2 突变型Taq DNA聚合酶的表达和纯化

将突变型Taq DNA聚合酶基因表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(克劳宁(北京)生物科技有限公司，目录号BL21-100)中。抗性筛选后取50μL菌种接于5mL LB液体培养基中摇培6～8h，然后转接于250mL LB液体培养基中，摇培4～6h后，加入IPTG至终浓度为50mM后继续摇培过夜。250mL菌液于50mL离心管中5000rpm离心10min收集菌体，每100mL培养物加入5mL Binding buffer，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置1h，4℃振荡10min，加入TritonX-100至终浓度为1％，剧烈振荡混匀，4℃振荡10min，5000rpm离心30min，取上清(留样20μL菌体破碎产物)，75℃水浴1h，不时振荡，5000rpm离心30min，取上清(留样20μL粗酶液)。将Ni-凝胶轻轻混匀，取1mL至柱中，1mL ddH2O洗涤两次，用1mLBinding buffer(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、pH8.0)平衡柱子，将多余的Binding buffer除去，将平衡好的Ni-凝胶加入到粗酶液中，于4℃轻摇1h，上柱，收集的流出液重复上柱2次，收集流出液(收集每次留出液20μL)。用1mLWashing buffer(50mM NaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0)洗涤(每次都使介质悬浮起来)5-10次，直到洗出液的A280小于0.01。加入0.5mL Elution buffer(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑)，当液体流尽后关闭流液口，然后加入1mL Elution buffer浸泡5min，打开流液口收集洗脱液，重复数次洗脱，分管收集。洗脱至OD值最小为止(收集最后一次洗涤液20μL)。收集的酶液中加入两倍体积的饱和硫酸铵，4℃振荡15min，5000rpm，4℃离心30min使突变改造Taq DNA聚合酶沉淀，去上清，保留沉淀。加入1mL酶溶解液溶解，置于Taq store buffer中透析12h，每6h换一次液，收集终产品，得到纯化的突变型Taq DNA聚合酶。

实施例3 SDS-PAGE蛋白电泳验证突变型Taq DNA聚合酶的蛋白大小和纯度

将上述得到的突变型Taq DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，鉴定突变型Taq DNA聚合酶蛋白的大小和纯度。

(1)取突变型和野生型的Taq DNA聚合酶蛋白样品各40μL，加5×Loading Buffer10μL，沸水浴10min，同蛋白Marker(Premixed Protein Marker(Low)，3595A，Takara)上样各5μL。SDS-PAGE蛋白电泳，浓缩胶恒压100V，分离胶恒压180V，跑胶结束后用考马氏亮蓝染色。结果如图2-a所示，图中Marker泳道为蛋白Marker，2a-1泳道为野生型Taq DNA聚合酶，2a-2泳道为突变型TaqDNA聚合酶，从图2-a可以看出，各电泳条带在浓缩胶中被压成一条直线，从图中条带位置，结合测序结果初步判断，突变型Taq DNA聚合酶大小正确。

(2)将突变型Taq DNA聚合酶原酶液稀释20倍，取稀释后酶液和原酶液各40μL，加5×Loading Buffer 10μL，沸水浴10min，上样10μL。SDS-PAGE蛋白电泳，浓缩胶恒压100V，分离胶恒压180V，跑胶结束后用考马氏亮蓝染色考马氏亮蓝染色。结果如图2-b所示，图中2b-1泳道为20倍稀释样品,2b-2泳道为原酶样品。通过比较原酶中杂带与稀释后主带的强度，从图2-b可以看出，胶面背景干净，样品条带清晰，原酶中杂带强度<稀释后主带的强度，说明突变型Taq DNA聚合酶纯度大于95％，纯度合格。

实施例4 突变型Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶的性能比较

(1)酶活性比较

将本发明制备的突变型Taq DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶用荧光定量PCR方法进行酶活比较。将突变型Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶在同一实验条件下进行检测，具体的，将两种酶各自在模板浓度为10⁴copies/ml和50copies/ml条件下进行检测，在本例中，将两种酶分别在模板浓度为104copies/ml的高浓度模板和50copies/ml低浓度模板下各进行了2次和6次重复检测。结果如图3a和图3b所示，其中图3a为突变型Taq DNA聚合酶的活性检测结果，图3b为野生型Taq DNA聚合酶的活性检测结果。图中每条曲线代表一个PCR反应，图中的横坐标表示PCR的循环次数，纵坐标表示荧光值。图3a中的3a-1为突变型Taq DNA聚合酶在高浓度模板下的一组曲线，3a-2为突变型Taq DNA聚合酶在低浓度模板下的一组曲线。图3b中的3b-1为野生型Taq DNA聚合酶在高浓度模板下的一组曲线，3b-2为野生型Taq DNA聚合酶在低浓度模板下的一组曲线。图中每组曲线中所含有的曲线条数代表该酶在同一个浓度模板进行重复检测的次数，每条曲线的高度则代表检测时在该浓度下该酶的PCR的扩增效率。本例中，高浓度模板下重复2次检测，低浓度模板下重复6次检测。对比图3a和图3b可知，在高浓度模板的检测中，3a-1组与3b-1组曲线的高度相差不大，即该条件下突变型Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶的PCR扩增效率相差不大；但在低浓度模板的检测中，3a-2组与3b-2组的荧光值和检出率存在明显差异，突变型Taq DNA聚合酶检测的荧光值和检出率明显高于野生型，即突变型Taq DNA聚合酶的扩增效率远大于野生型TaqDNA聚合酶。由此可得，本发明得到的突变型Taq DNA聚合酶的活性比野生型Taq DNA聚合酶的活性有明显的提高。

(2)酶耐受性比较

选择HBV血清样品稀释至500IU/mL。分为三组实验，第一组：取10管10μL样品进行核酸提取，在含fermentas的Taq DNA聚合酶的体系中扩增；第二组：取10管10μL样品，不进行核酸提取操作，直接加入含本申请中突变型Taq DNA聚合酶的体系进行扩增；第三组：取10管10μL样品不进行核酸提取操作，直接加入含野生型Taq DNA聚合酶的体系中扩增。通过三组实验的灵敏度模板的检出率的比较来评估本申请中突变型Taq DNA聚合酶对生物样本中PCR抑制剂的耐受程度。

结果如图4a、图4b和图4c所示。其中，图4a为荧光定量PCR检测fermentas的TaqDNA聚合酶对核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果(10/10)，图4b为荧光定量PCR检测突变型Taq DNA聚合酶对免核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果(10/10)，图4c为荧光定量PCR检测野生型Taq DNA聚合酶对免核酸提取后的HBV灵敏度模板检出率结果(2/10)。同上，图中每条曲线代表一个PCR反应，图中的横坐标表示PCR的循环次数，纵坐标表示荧光值。对比图4a和图4b可知，在灵敏度模板相同时，采用核酸提取后用fermentas的Taq DNA聚合酶再扩增与免核酸提取用该突变型Taq DNA聚合酶直接扩增的检测方法二者的检出率一致，说明同一浓度的生物样本免核酸提取用突变型Taq DNA聚合酶直接扩增的检测结果可以达到传统核酸提取后再扩增的检测效果，同时，免核酸提取缩短了检测时间，简化了操作流程，具有一定的优越性。对比图4b和图4c可知，免核酸提取用野生型Taq DNA聚合酶直接扩增的对HBV灵敏度模板的检出率明显低于免核酸提取用突变型Taq DNA聚合酶直接扩增的检出率，且荧光曲线较差，荧光值较低，说明突变型的Taq DNA聚合酶对PCR抑制剂有较好的耐受性。

在其他的生物样品(如血清、血浆、体液、分泌物或***物等，如棉拭子、粪便等样本须进行预处理后使用)中，不进行核酸提取操作，直接加入含本申请中突变型Taq DNA聚合酶的体系，也能实现PCR扩增，并具有良好的重复性和检测灵敏度。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型Taq DNA聚合酶为：

由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。

2.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型Taq DNA聚合酶为：

由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽。

3.一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、提供用于表达突变型Taq DNA聚合酶的基因表达序列，所述突变型Taq DNA聚合酶为：由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

步骤二、将所述基因表达序列连接到基因表达载体中；

步骤四、对所述重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

步骤五、将所述菌体裂解，收集裂解粗产物；以及

4.根据权利要求3所述的突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述基因表达序列为：

SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述基因表达载体为pET-28a。

6.根据权利要求3所述的突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

7.根据权利要求6所述的突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述原核细胞为BL21。

8.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2中所述的突变型Taq DNA聚合酶。

9.根据权利要求8所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。

10.根据权利要求1或2所述的突变型Taq DNA聚合酶在制备PCR反应试剂领域中的应用。