CN105026562A - 基因定量、序列分析用二维细胞阵列器件及装置 - Google Patents

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Abstract

为了对多个细胞中的多个基因进行基因表达，需要在分离细胞后提取基因，进行核酸扩增，通过序列分析进行基因表达分析。然而，细胞的分离对细胞造成损伤，需要使用昂贵的***。将细胞捕获部和核酸捕获部的一对结构在上下方向上配置，提取细胞的各个基因，在核酸捕获部合成cDNA，扩增核酸，通过第二代测序进行序列分析，从而高精度地进行各个细胞中的基因表达分析。

Description

基因定量、序列分析用二维细胞阵列器件及装置
技术领域
本发明涉及基因表达分析、细胞功能分析、生物体组织的分析方法和疾病的诊断、新药研发等。详细而言，涉及单细胞水平的mRNA分析方法。
背景技术
基因表达分析中，使用了下述方法：从细胞组中提取mRNA，制备作为互补链的cDNA并通过PCR等对其拷贝数进行扩增，使用DNA探针阵列(DNA芯片)捕获于对应于靶标的探针位置并进行荧光检测。然而，PCR扩增、使用DNA芯片的方法的定量分析精度低，期待精度高的基因表达剖面分析方法。随着人类基因组分析的完成，强烈需要对于基因表达的定量研究，近来，期望从单个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。作为定量性好的分析方法，有定量PCR，其为下述方法：准备具有与靶标相同的DNA序列的标准试样，在同样的条件下进行PCR扩增，利用荧光探针对扩增的进行情况进行监测并进行比较，从而进行定量分析。当靶标为单细胞时，初始的mRNA的数量少，难以进行定量分析。此外，为了进行多个基因表达的定量分析，将试样分割分别独立地进行定量分析，因此在作为对象的基因的数量多、包括表达量低的基因的情况下，有时无法通过试样分割进行测定。
在这样的状况下，发明人等考察了下述方法：将全部mRNA变更为cDNA，制作保持于珠子上的cDNA文库(包括全部cDNA的cDNA集合体)并用于定量分析。这表明，通过重复利用cDNA文库，消除了试样分割导致的微量表达基因的测定误差，能够正确地测定单细胞中所含的多个基因的表达量(非专利文献1)。
上述方法对于通过手工操作进行的反应试剂向含有样品的溶液中的混合、纯化等工艺全部通过手工操作进行。因此，由于分注精度和溶剂的蒸发的问题，反应溶液的体积限于数百纳升～微升等级以上。因此，在对单个细胞进行分析时，还必须使用浓度适当的试剂，因此，反应试剂量(摩尔数)与反应体积成比例增加，试剂成本与此成比例增加。在必须测定多个细胞获得具有统计学意义的数据时，其试剂成本成为非常大的数额。因此，需要利用没有分注精度和蒸发的问题的结构降低反应体积的方法。
为了解决这个问题，以往采用了使用组合有被称为微流路的小的流路的器件的方法。为了进行单细胞分析而应用微流路的例子记载于非专利文献2。非专利文献2中的图1记载了器件的结构图。其中记载的芯片配置有300个单个单元结构，从而能够同时处理300个细胞。该单元结构在芯片上配置有3×50个，是下述结构：单元结构为长方形，样品溶液在其长度方向上流动，一边流动一边逐级反应。关于反应体积，逆转录反应时为10nL，PCR反应时为50nL，减少了体积。
进而，为了同时处理大量细胞，需要一次性低成本地对多个细胞进行基因表达分析。为了实现该目的，专利文献1公开了利用多孔质膜等代替珠子来构成cDNA文库的方法。该方法中，使用了能够获得基因表达的二维分布、实现多个细胞中的基因表达分析的器件。使用该器件对单细胞中的基因进行表达分析时无需分离细胞，还可以直接从生物体组织的切片中的细胞提取mRNA进行基因表达分析。然而，为了增加能够分析的基因的数量，需要重复、与测定基因数成比例地进行荧光测定、化学发光测定。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2009-276883号公报
非专利文献
非专利文献1:自然方法第6卷第7期2009年p.503-506(NatureMethod vol.6,no.7,2009,p.503-506)
非专利文献2:美国科学院院刊第108卷、第34期2011年p.13999-14004(Proceeding of the National Academy of Sciences vol.108,no.34,2011p.13999-14004)
发明内容
发明所要解决的课题
对于再生医学、使用基因进行的诊断或生命现象的基本理解而言，不仅是组织的平均基因表达量、也开始重视对构成组织的一个个细胞的内容物定量地进行分析。对此，期望将细胞一个个地取出并详细地进行分析，同时为了获得具有统计意义的数据，对于多个细胞的细胞中的生物物质进行定量。尤其期望对各种基因的表达量进行定量监测。此时，作为定量对象的生物物质是细胞中的mRNA。这里，为了简便起见，认为基因与mRNA一一对应，对基因表达进行定量与对mRNA进行定量含义相同。一般而言，“测定基因表达”的含义更为宽泛。这种情况下，测定中考虑了从一个基因座读取的mRNA存在多个变异(突变体)、在mRNA的成熟过程、翻译成蛋白的过程中受到各种调控，需要根据需要增加测定对象物质，这里，为了简化讨论，是指对成熟的mRNA进行定量。
对应于单个细胞中表达的基因的mRNA有分布在数分子数程度至数万分子的可能性。为了高精度地对对应于分子数少的基因的mRNA进行定量，需要转变为效率高、能够定量的形式。因此，通过将来自单个细胞的cDNA文库有效地(80％以上)构建在非专利文献1中记载的珠子上表面，重复对其进行测定，从而能够高精度地对多个基因的基因表达进行定量，但其重复次数限于10～20次左右，因此存在能够测定的基因数也限于10～20个的问题。能够同时测定的细胞数在100细胞左右以下，所需试剂的费用也非常高。因此认为，能够针对多个细胞测定多个、且仅测定需要测定的基因数是产业上重要的技术。
此外，为了进行单细胞中的基因表达分析，需要一次性分离细胞并导入到各个反应孔中，进行细胞破碎、逆转录，进而将用于PCR扩增的试剂分注至这些反应孔。因此，为了进行分析的自动化，需要用于分注的机器人，分析装置会大型化，价格高。
进而，当为了避免利用机器人进行分注而使用微流路从细胞提取mRNA进行核酸扩增时，必须使反应液流路列状排列，因此芯片尺寸与排列数成比例地增大，因此，存在微流路器件的尺寸大型化、价格高的问题。
实际上，如非专利文献2的图1的左下所示，将作为分析对象的细胞导入到最左边的反应槽，使细胞破碎。随后，将样品溶液移至右侧的反应槽，进行逆转录反应，进一步向右移动，进行PCR反应，以这种方式，一边在一个方向上使样品在平面内移动，一边进行样品处理。最后，从最右边回收处理过的样品。当使用微流路时，需要使溶液在基板面内移动，因此单元结构的印记会增大。此外，为了配置向单元结构导入样品、试剂的流路体系；配置处理后的样品排出所需的流路体系，需要占用芯片面积，因此存在如果增加单元结构的序列数，则芯片面积增大、芯片的成本增加的问题。
该非专利文献2中，关于细胞中的mRNA中的何种程度的比例能够作为样品进行处理、测定、定量仍不明确，为了对单细胞分析中的mRNA等生物化学物质进行定量，本质上的课题在于，能够有效地对靶分子(尤其是mRNA)进行测定。例如，必须对在一个细胞中仅以10分子左右以下的量存在的mRNA进行测定，但如果以能够测定的方式进行了处理的样品的分子数少，则会产生本质上的测定误差(符合泊松分布的取样误差)。
此外，为了对多个细胞一次性低成本地实现基因表达分析，专利文献1中公开了使用cDNA文库片的方法。虽然能够进行多个细胞的批量测定，但是为了增加能够分析的基因的数量，需要重复使用cDNA文库进行荧光测定。因此，分析基因数量存在限制。
用于解决课题的方法
上述课题，即为了提供增加能够一次性测定的细胞数、同时有效地对细胞中的分子(这里是mRNA)进行样品处理的价格低廉的测定器件或装置，本发明中，设为如下所述的器件和装置构成。
将能够对各细胞进行样品处理的单元结构配置成二维平面状，该样品处理是：将细胞固定于规定的位置，从核酸提取作为定量对象分子的mRNA，进行逆转录，构建cDNA文库等。来自细胞的样品流动的方向垂直于平面状的器件面而将单元结构配置成芯片面状，从而实现了单元结构固定于芯片上的面积的减小。此外，关于样品溶液的回收，将用配置于平面上的单元结构处理过的样品混合并回收，在样品处理的过程中，导入通过对用哪个位置的单元结构处理过的各样品进行分析来辨别的标签序列(标签分子)。由此，不再需要用于按单元结构分别进行样品回收的机构。
即，本发明包括以下的发明。
(1)一种核酸提取器件，其特征在于，具有：
用于固定各个单个细胞的细胞捕获部，
用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路，
介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部，以及
将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路，
所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
(2)根据(1)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含固定有用于核酸捕获的DNA的珠子。
(3)根据(1)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含细孔中固定有用于核酸捕获的DNA的多孔质膜。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部固定有与细胞表面的物质化学结合的物质。
(5)根据(2)或(3)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含用于确定在芯片上的位置的序列。
(6)根据(2)或(3)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含根据所捕获的核酸分子的不同而不同的序列。
(7)根据(6)所述的核酸提取器件，其特征在于，具有导入用于对所述核酸捕获部所捕获的RNA进行逆转录的酶的单元。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方由光学透明的材料构成。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方设有核酸捕获部。
(10)根据(1)～(8)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方以外的区域设有核酸捕获部。
(11)一种核酸处理装置，其特征在于，具有(1)～(10)中任一项所述的核酸提取器件和导入用于构建cDNA文库的试剂的单元。
(12)一种核酸处理装置，其特征在于，具有(1)～(10)中任一项所述的核酸提取器件以及导入用于构建cDNA文库的试剂和用于核酸扩增的试剂的单元。
(13)一种核酸处理装置，其特征在于，具有(1)～(10)中任一项所述的核酸提取器件，以及用于利用微分干涉显微镜、相位差显微镜、拉曼显微镜或相干拉曼显微镜对捕获于细胞捕获部的细胞进行观察的显微镜部。
(14)一种方法，其特征在于，为利用具有细胞捕获部和配置于所述细胞捕获部下方的核酸捕获部的核酸提取器件从细胞提取核酸的方法，包括下述工序：
使细胞与所述细胞捕获部接触，从而将各个单个细胞捕获于所述细胞捕获部的工序，
使用于从细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部，通过从上至下连通的流路来流动的工序，
将提取的核酸固定于所述核酸捕获部的工序，以及
使核酸提取后的溶液从所述核酸捕获部介由流路在与所述细胞捕获部相反侧排出的工序，
所述核酸提取器件中，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
发明的效果
可以提供一种价格低廉的测定器件或装置，所述测定器件是在对单细胞中的核酸等生物体分子进行定量、或者进行序列确定、或者鉴定生物体分子的种类的器件中，增加了能够一次性测定的细胞数，同时能够有效地对细胞中的分子(例如mRNA)进行样品处理。
附图说明
图1是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图2是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图3是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图4是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
图5是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图6是显示本发明的核酸提取器件中使用的核酸的一个实施方式的概略图。
图7是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图8是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
图9是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
图10是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图11是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图12是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图13是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
图14是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
图15是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
图16是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图17是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图18是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
图19是显示本发明的核酸提取器件的处理方法的一个实施方式的概略图。
具体实施方式
本发明的核酸提取器件的具体结构例如可以例示于图1。图1(a)是垂直于面状器件的面的方向的剖面图，图1(b)是与面并排的、上面的图的点划线部分的位置处的剖面图。具有下述特征的核酸提取器件是本发明的基本结构：具有将导入到器件中的细胞1一个个固定的细胞捕获部2(图1中，细胞捕获部具有将细胞一个个固定的孔)、用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路3、介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部4、以及将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路5，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。根据需要，该结构还可追加构成于平面基板6上和内部的、用于导入细胞的上部反应区域7和用于将处理过的核酸排出的下部反应区域8。虚线箭头9是细胞的移动轨迹的例子，箭头10显示从细胞提取的核酸和处理过的样品的移动方向。
非专利文献2中记载的器件中，面内配置有细胞捕获部(cell capturechamber)、逆转录部(RT chamber)和PCR部(qPCR chamber)。必须分别面向2种反应槽配置比细胞捕获所需的面积大的面积，进而，还必须在面内配置用于控制液流的阀门、流路。因此，用来配置用于对单个细胞进行处理的单元结构(非专利文献2的结构中，包括细胞捕获部、逆转录部、PCR部和流路体系的单个细胞处理涉及的结构)的器件上的面积会增大。器件成本大致与器件的面积成比例，因而如果增加同时处理的细胞数，则会导致器件成本的提高。
图1的实施方式中，为了解决该问题，将核酸捕获部设置于细胞捕获部的正下方，由提取的核酸在核酸捕获部构建cDNA文库，对该文库进行之后的处理，从而能够在单个反应区域内进行多个反应。
为了提高核酸捕获的效率，优选核酸捕获部填装有多个珠子的结构、多孔质结构。通过增大这样的单位容积中的作为反应场所的表面积，即使反应槽小，效率也高，能够在短时间内进行反应。
进而，以构建的cDNA为模板，在器件上进行通过PCR、转录反应等进行的核酸扩增后，回收样品，在通过使用了第二代测序的测序进行定量时，通过使构建的cDNA的序列根据被捕获的位置的不同而不同，对于回收的样品溶液的测序能够对是来自哪个细胞的基因表达量进行鉴定。
由此，不需要对单元结构进行隔离或用于控制样品的移动的阀门机构、流路。
图1的构成中，通过将核酸捕获部4所需的试剂从上部反应区域7供给，从而在核酸捕获部进行PCR反应，PCR扩增产物从下部反应区域8回收。此时，优选以使器件整体的温度成为适合于PCR反应的温度循环的机构设置于器件的外侧。
作为进一步优选的结构，可以例示采取下述结构：为了能够事先使用非侵入式显微镜对细胞的状态进行测定，对于同一细胞通过基因表达分析等对细胞中的生物物质进行定量，不在固定有细胞的正下方配置核酸捕获部，而是配置于周边。
具体而言，是如图2所示的结构。图2(a)是垂直于面状器件的面的方向的剖面图，图2(b)是与面并排的、上面的图的点划线部分的位置处的剖面图。为了在从细胞1提取核酸前进行显微镜观察，器件中的21、22、23部分使用光学透明的材料。显微镜观察可以使用透射型显微镜、微分干涉显微镜、相位差显微镜、相干反斯托克斯拉曼显微镜(CARS显微镜)等。
显微镜观察结束后，为了进行核酸提取和逆转录，使样品和试剂在箭头10的方向上流动。样品处理的工艺与不进行显微镜观察时相同。
实施例
(实施例1)
本实施例是涉及通过大量填装固定于珠子上的用于核酸捕获的DNA(DNA探针)来构成核酸捕获部的核酸提取器件和样品处理装置的实施例。
本实施例的核酸提取器件的单元结构的基本构成与图1所示的基本构成相同。然而，本实施例中，为如下那样的器件的构成：不仅从细胞提取核酸，捕捉mRNA，而且构建cDNA文库并将其作为模板，能够测序的末端具有已知序列且可获得足够量的核酸扩增产物。
将对应于本实施例的核酸提取器件中的用于处理一个细胞的单元结构的剖面图记载于图3(a)中。此外，图3、图4的(b)～(f)中记载了利用该器件能够进行的、从细胞的捕捉后的各细胞的核酸提取和核酸(mRNA)捕捉(b)、cDNA的合成(c)、核酸扩增(PCR)以及导入了测序所需的已知的末端序列的第二链的合成(d)、(e)和PCR扩增(f)的步骤的示意图。此外，图5中记载了核酸提取器件的整体构成图。图5(a)是对应于图1(a)、图3(a)的核酸提取器件的截面的整体图，图5(b)是图5(a)的A-A’截面，是对应于图1(b)的附图。此外，图5(c)是对应于图5(a)的B-B’截面的剖面图。
接下来，对于核酸提取器件的运行，按处理顺序进行说明。图3(a)中，为了将悬浮于溶液的细胞1固定于器件上的特定的位置(细胞捕获部(开口部))2，使溶液从上部反应区域7向下部反应区域8通过细胞捕获部来流动。细胞随着溶液的流动而移动，到达细胞捕获部，由于细胞捕获部的开口径比细胞的直径小，因此细胞被固定于此。捕捉的细胞发挥对溶液流的栓塞的作用，因而流体向尚未捕捉细胞的细胞捕获部移动。因此，剩余的细胞向尚未捕捉细胞的部分移动并被捕捉。捕捉了目标数量的细胞1后，上部反应区域7中流动的溶液变换为用于使细胞破碎的Lysis buffer等核酸提取液(例如Tween20等表面活性剂与蛋白分解酶的混合液)。同时，在11的方向上施加电场，使细胞中的核酸(mRNA)通过电泳移动至核酸捕获部4。核酸捕获部4是下述区域：在细胞捕获部2间的流路3和下部反应区域8间的流路5之间的区域填装了固定有用于捕获核酸的DNA探针31的珠子12的区域。
图3(b)显示固定有DNA探针31的珠子12表面的放大图。施加电场11，以使从细胞提取的mRNA32被捕捉至位于所捕捉的细胞的正下方的核酸捕获部中的珠子上。为了将捕捉的mRNA原始存在的细胞的位置信息以序列信息的形式保存，固定于珠子的DNA探针31含有根据核酸捕获部的位置的不同而不同的序列、即细胞识别序列。该DNA探针31的3’末端具有多聚T序列，通过与mRNA的3’末端的多聚A序列杂交来捕捉mRNA。配置于图1(b)和图5(c)的4所示的二维阵列上的核酸捕获部中填装有固定有具有各不相同的细胞识别序列的DNA探针31的珠子。
该mRNA捕捉用DNA探针31在本实施例中为稍为复杂的序列构成，如图3(b)所示，作为DNA探针31，从5’末端开始，包括：30个碱基的PCR扩增用共有序列(Forward方向)、5个碱基的细胞识别用标签序列、包含15个碱基的随机序列的分子识别用标签序列、以及18个碱基的寡聚(dT)序列+2个碱基的VN序列。通过将PCR扩增用共有序列导入到DNA探针31中，能够在后续的PCR扩增工序中用作公共引物。此外，关于细胞识别标签，例如当为5个碱基的随机序列时，能够对45＝1024个单细胞进行识别。即能够一次性地从1024个单细胞制备cDNA文库，在如上所述最终获得的第二代测序的序列数据中，能够对来自哪个细胞进行识别。进而，通过将分子识别用标签序列(例如7个碱基)导入到DNA探针31中，能够对47＝1.6x104分子进行识别，因此，能够由有关利用第二代测序获得的扩增产物的DNA序列数据，对来自相同细胞且具有同样的基因序列的扩增产物来自何种分子进行识别。即，由于能够对扩增工序中产生的基因间的扩增偏好进行校正，因此能够高精度地对试样中初始存在的mRNA量进行定量。然而，在单细胞中的同一基因的表达量比分子识别标签序列的变异更多的情况下，扩增偏好校正的准确性降低。位于最靠近3’侧的寡聚(dT)序列与添加在mRNA32的3’侧的多聚A末尾杂交，用于捕捉mRNA32(图3(b))。
本实施例中，为了对mRNA进行分析，在互补用DNA探针31的一部分使用了多聚T序列，毋庸置疑，为了进行microRNA、基因组分析，随机序列也可以使用与欲分析的序列互补的序列的一部分，以代替多聚T序列。
接下来，以由珠子上的DNA探针31捕捉的mRNA32为模板合成第一cDNA链33。本工序中，使含有逆转录酶和合成基质的溶液充满填装的珠子的空隙部分，缓慢升温至50℃，进行约50分钟的互补链合成反应，图3(c)。反应结束后，使RNase通过填装有珠子的区域来流动从而将mRNA32分解除去。接下来，使含有碱性改性剂的液体和洗涤液通过珠子的空隙部分来流动，将残留物和分解物除去。通过至此的工艺，在填装于核酸捕获部的珠子上，构建反映了捕捉于细胞捕获部的各个细胞的位置的如图5(c)所示的cDNA文库阵列。
接下来，为了将残留于细胞捕获部的细胞的破片去除，使Lysis buffer从下部反应区域8向上部反应区域7流动。接着，使添加有PCR扩增用共有序列(Reverse)的多个(～100种)靶基因特异性序列引物41与第一cDNA链退火(图4(d))，通过互补链延伸反应合成第二cDNA链42(图4(e))。即以多重条件进行第二cDNA链合成。由此，对于多个靶基因，合成两端具有扩增用共有序列(Forward/Reverse)、该序列中包含细胞识别标签、分子识别标签和基因特异性序列的双链cDNA链。此外，本实施例中，作为一个例子，20种(ATP5B、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27和OAZ1)基因特异性序列使用了从靶基因的多聚A末尾开始109±8碱基上游部分的20±5个碱基，这是因为在后续的PCR扩增工序中将PCR产物大小统一为约200碱基。通过使PCR产物大小统一，能够省去复杂的大小分级纯化工序(电泳→切胶→PCR产物的提取、纯化)，具有能够直接用于从1分子进行平行扩增(乳液PCR等)的效果。然后，使用扩增用共有序列(Forward/Reverse)进行PCR扩增，制备来自多种基因的PCR产物43(图4(f))。在该工序中，即使基因间或分子间产生扩增偏好，在取得第二代测序数据后，也可以利用分子识别标签进行扩增偏好的校正，因此能够获得高精度的定量数据。
每一个细胞的mRNA的数量为约106个，用于捕捉该mRNA的核酸捕获部分填装有1.1×105个磁珠12。磁珠表面固定有链霉亲和素，DNA探针31的5’末端经生物素修饰，从而通过链霉亲和素而被固定于磁珠表面。
至此，在生成于珠子表面的cDNA(第一cDNA)上，使用添加有PCR扩增用的共有序列的数十种基因特异性序列引物，合成第二cDNA，这里，公开了PCR扩增的例子。当然，也可以使用滚环扩增(RCA)、NASBA、LAMP法等其他扩增法。
接下来，对核酸提取器件的制作方法进行详细描述。关于填装有磁珠的核酸捕获部、细胞捕获部以及连接它们的流路，使用半导体工艺制作PDMS(聚二甲基硅氧烷)制的基板6。细胞捕获部使直径10μm的贯通孔以125μm间隔阵列状配置。基板的大小是边长为13mm的正方形，其中配置有104个细胞捕获部。在细胞捕获部的正下方，贯通孔的直径扩大至50μm，将磁珠填装于该部分。该贯通孔，在配置成阵列状的基板6之下，配置细孔阵列片(多孔质膜)35。该细孔阵列片的细孔的直径比磁珠的直径即1μm小。
然后，分别填充至喷墨打印头，将固定有不同的序列的珠子分别填充至核酸捕获部4，每个2nL。
细孔的内壁被加工为亲水表面，能够吸收水并将珠子保持于核酸捕获部。作为细孔阵列片，也可以使用由多孔质玻璃形成的整体片、将毛细管捆扎并切片而成的毛细管板、尼龙膜或凝胶薄膜等各种材料，这里，使用了对氧化铝进行阳极氧化而得的细孔阵列片。这样的片还可以通过阳极氧化来自行制作，孔径20nm～200nm、直径25mm的片也可以作为市售品获得。由其切出边长13mm的正方形来使用。片中形成的细孔是连通核酸捕获部与下部反应区域的流路5。
上述PDMS制基板和细孔阵列片通过等离子体粘接而粘接。
这里，也可以使用通过纳米压印技术、注射成型制作的树脂(聚碳酸酯、环状聚烯烃、聚丙烯)制的基板、市售的尼龙筛网、径迹蚀刻膜来代替PDMS制基板。与细孔阵列片的粘接也可以使用热粘接。
此外，毋庸置疑，该反应层也可以使用半导体工艺进行一体加工。
接下来，利用与喷墨打印机同样的技术，将固定有5’经生物素基团修饰的DNA探针的直径1μm的磁珠溶液(7×109个/mL)注入核酸捕获部4，每个区域2nL。此时，排出根据区域的不同而不同的具有细胞识别标签序列(1024种)的DNA探针。磁珠的溶液通过流路5被排出，仅留下珠子。这里，固定具有不同的细胞识别用标签序列的mRNA捕捉用DNA探针的方法是，在各反应管中将磁珠与DNA探针溶液混合，在含有1.5M NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)中混合，一边旋转10分钟，一边进行结合反应。
以下，制成如上所述记载的核酸提取器件并使用图5对用于利用第二代(大规模)测序仪获得基因表达谱的装置***进行说明。以不对细胞造成损伤的方式用500μL的1×PBS对1000个左右以下的细胞进行洗涤后，将溶液除去，尽量使PBS无残留，加入50μL冷却至4℃的1×PBS缓冲液。细胞从细胞入口308导入，将缓冲液从下部出口307排出，从而使细胞在细胞捕获部排列成阵列状。过量的细胞从上部出口306排出。接下来，从上部入口305导入Lysis缓冲液，使PBS缓冲液从流路306和307排出，将上部反应区域7中置换为Lysis缓冲液。核酸提取器件的上下被透明的上基板301和下基板302夹持。在这些基板内侧通过溅射形成透明(ITO)电极，施加电场，通过电泳使核酸向细胞正下方的核酸捕获部移动。使电极透明的理由是为了能够利用光学显微镜对细胞进行观察，本次使用的ITO透明电极在400-900nm的波长范围具有40％以上的透过特性。
将Lysis Solution 495uL(TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit；AppliedBiosystems Inc.)和DNase I 5uL从入口305注入。确认溶液已发生了凝胶化，使温度上升至20℃，反应8分钟，然后，在凝胶上添加50uL Stopping Solution(使DNase失活的溶液)，反应5分钟，冷却至4℃。接下来，加入含有分子量60万、0.03％的PEO(聚氧化乙烯)、分子量100万、0.03％的PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)以及0.1％的Tween 20的10mMTris Buffer(pH 8.0)0.5mL。此时，上部电极301与下部电极302间的距离设为2mm，上部反应区域7和下部反应区域8被所述Tris buffer完全充满。在使溶液温度维持在4℃的状态下，将上部电极301设为阴极(GND)、将下部电极302设为阳极，使用电源311施加2分钟+5V的电压，使带负电荷的mRNA从细胞内部向下部反应区域8的方向电泳。代替DC电压施加，电泳条件也可以使用开启水平10V、关闭水平0V、频率100kHz、占空比50％的脉冲电泳。该过程中，mRNA几乎全被固定于珠子的DNA探针的寡聚(dT)部分捕获。然而，一部分mRNA会由于二级结构而不被捕获，移动至珠子下部的下部反应区域8。为了利用DNA探针完全将mRNA捕获，使溶液的温度上升至70℃并保持5分钟后，一边每隔1分钟使施加于下部电极302的电压的极性反转，一边以-0.1℃/sec冷却至4℃(最初，施加1分钟-5V的电压，然后，以+5V→-5V的方式，每隔1分钟重复施加10次)。接下来，从入口305导入上述tris buffer，从出口306排出，从而一边对上部反应区域7中的溶液进行交换，一边使溶液的温度上升至35℃使琼脂糖凝胶溶解，对不需要的细胞组织和琼脂糖进行洗涤、除去。进而，将含有0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)585μL、10mM dNTP 40μL、5xRTBuffer(SuperScript III,Invitrogen公司)225μL、0.1M DTT 40μL、RNaseOUT(Invitrogen公司)40μL以及Superscript III(逆转录酶,Invitrogen公司)40μL混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口305注入。然后，使溶液的温度上升至50℃，保持50分钟，从而终止逆转录反应，合成具有与mRNA互补的序列的第一cDNA。
以文库的形式获得按细胞固定于大量珠子表面的cDNA。这应该被称为单个细胞cDNA文库阵列，与迄今为止的由大量细胞获得的平均化的cDNA文库在根本上是不同的。
由如此获得的cDNA文库阵列，对于各种基因，对各基因的表达量定量地进行测定。每个细胞有1万个细孔，因而平均每个细孔的cDNA的个数为100个。对于1种cDNA，当每一个细胞的cDNA拷贝数为1万个以下时，每个珠子平均为1个以下。
合成第一cDNA链后，在85℃保温1.5分钟使逆转录酶失活，冷却至4℃后，将10mL含有RNase和0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)从入口305注入并从出口306、307排出，从而使RNA分解，使等量的碱性改性剂同样地流动，对残留物和分解物进行除去、洗涤。然后，将灭菌水690μL、10x Ex Taq Buffer(TaKaRa Bio公司)100μL、2.5mM dNTP Mix 100μL、添加有各10μM的20种PCR扩增用共有序列(Reverse)的基因特异性序列引物Mix100μL以及Ex Taq Hot start version(TaKaRa Bio公司)10μL混合，将充满器件的溶液从出口306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口305注入。然后，进行95℃3分钟→44℃2分钟→72℃6分钟的反应，以第一cDNA链为模板，与引物的基因特异性序列退火后(图4(d))，进行互补链延伸反应，合成第二cDNA链(图4(e))。
然后，将灭菌水495μL、10x High Fidelity PCR Buffer(Invitrogen)100μL、2.5mM dNTP mix 100μL、50mM MgSO440μL、10μM的PCR扩增用共有序列引物(Forward)100μL、10μM的PCR扩增用共有序列引物(Reverse)100μL以及Platinum Taq Polymerase High Fidelity(Invitrogen公司)15μL混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口306和307排出，立即将上述溶液从入口305注入。然后，使溶液在94℃保持30秒，重复40个循环的94℃30秒→55℃30秒→68℃30秒的3阶段工序，最后在68℃保持3分钟后，冷却至4℃，从而进行PCR扩增工序(图4(f))。为了实现这样的温度循环，也可以追加带加热器的热块(铝合金或铜合金)309和温度控制器310。由此，扩增了20种靶基因的目的部分，PCR产物大小大体均匀，均为200±8碱基。对蓄积于溶液中的PCR扩增产物溶液进行回收。以将该溶液中所含的游离的PCR扩增用共有序列引物(Forward/Reverse)、酶等残留试剂除去为目的，使用PCRPurificationKit(QIAGEN公司)进行纯化。对该溶液应用emPCR扩增或桥接扩增后，应用于各公司(Life Technologies(Solid/Ion Torrent)、Illumina(High Seq),Roche 454)的第二代测序进行分析。
接下来，对使用了分子识别标签的扩增偏好的降低方法进行说明。图6示意性显示，获得分子识别区域以外设为同样的序列而测序得到的数据的状态(示意性图示获得的测序数据的相关部分)。图6中显示下述情况：601、602、603、604、605包括作为随机序列的分子识别标签序列且为同样的序列，分别获得了1、7、4、2、2个读数。这些序列在图4(e)中合成第二链时均为1分子，在之后的PCR扩增中，在分子数增加的同时，具有了不同的分子数。因此，分子识别标签相同的读数可视为同样的分子，均视为1分子。其结果是，合成了第二链后的工序的PCR扩增、在将溶液取出至外部时因在细孔阵列片内部的吸附导致的各序列分子数的偏差基于上述同样的观点来消除。
这里，作为获得的数据，1、7、4、2、2是表观(分子识别标签以外同样的序列的)计数。细胞中的分子数分别计为1个计数，合计为5个计数(1、7、4、2、2分别对应于1个计数)。即，推测相当于分子标签以外的序列的分子在扩增前为5分子。实际上，数据中，分子识别标签以外的序列不同的读数也作为测序结果而获得。此时，通过对分子识别标签不同但其他序列相同的读数分别进行计数，能够进行对欲知序列的计数。可以推测为最初的样品中含有与该计数成比例的分子数的mRNA。
这里制作的片可以重复利用，对于需要知道表达量的基因群，制作添加有PCR扩增用共有序列引物(Reverse)的基因特异性序列引物Mix溶液，与上述同样地实施第二cDNA链的合成、PCR扩增和emPCR，利用第二代测序进行分析即可。即，通过重复利用cDNA文库，能够对所需种类的基因进行高精度的表达分布测定。
(实施例2)
本实施例是由配置成阵列状的细胞组将各个细胞中所含的mRNA在保持了来自哪个细胞的信息的状态下构建cDNA文库，因此并非是具有使用了珠子的核酸捕获部的核酸提取器件，而是使用固定有DNA探针的细孔阵列片作为核酸捕获部。此外，作为构建cDNA文库后的核酸扩增，没有使用PCR扩增，而是使用T7启动子。
将本实施例中的核酸提取器件的结构及使用其的提取、处理方法示于图7、8、9。
图7(a)显示核酸提取器件的单元结构的剖面图。细胞1通过使含有细胞的缓冲液溶液以从上部反应区域7至下部反应区域8贯穿器件的方式流通而被捕捉于细胞捕获部2。细胞捕获部2在PDMS制的细胞阵列器件6中。该细胞捕捉部的直径设为比细胞的直径稍大，为16μm。通过该直径的设定，防止了2个以上的细胞被捕捉于该细胞捕获部。作为核酸捕获部的细孔阵列片71大量形成有贯穿片的细孔72，DNA探针固定于细孔72的内壁。细胞捕获用的PDMS制的细胞阵列器件6和核酸捕获用的细孔阵列片(多孔质膜)71是核酸提取器件的基本要素。这两个要素直接重叠，这些要素还兼具连接两者的流路的作用。与实施例1同样地，细胞捕获后，将含有细胞的缓冲液置换为Lysis缓冲液，一边在与器件垂直的方向上施加电场，一边使细胞破碎。由此，破碎的细胞中的mRNA通过与细胞捕获位置的正下方的细孔72内壁上的DNA探针73杂交而被捕捉。
固定于细胞阵列片内部的DNA探针73从5’末端方向开始，由T7启动子序列、emPCR扩增用共有序列(Forward方向)、细胞识别用标签序列、分子识别用标签序列、以及寡聚(dT)序列构成。通过将T7启动子序列导入到DNA探针中，能够通过后续的利用IVT(In Vitro Transcription)进行的cRNA83扩增工序(图8(e))来进行靶标序列的扩增。
如后所述，在核酸扩增工序中，当进行利用转录因子进行的从cDNA到cRNA的转录反应时，优选DNA探针进一步含有转录因子的启动子序列。作为那样的启动子序列，除了使用T7以外，还可以列举SP6、T3等。核酸的扩增利用了T7RNA聚合酶的活性。
本实施例中，使用T7启动子序列，该序列由T7RNA聚合酶识别，从其下游序列开始转录(cRNA83扩增)反应。
由于使用了转录因子的启动子序列的核酸扩增是等温扩增，因此不仅不需要用于施加温度循环的温度控制器，还能够降低在高温时固定于器件表面的探针DNA发生脱离的可能性。
通过同样地导入PCR扩增用共有序列，从而可以在后续的emPCR扩增工序中作为公共引物进行利用。此外，通过将细胞识别标签导入到(例如5个碱基)DNA探针中，能够识别45＝1024个单细胞，这与实施例1是同样的。进而，通过将分子识别用标签序列(例如7个碱基)导入到DNA探针中，能够识别47＝1.6x104个分子，因此，能够对利用第二代测序获得的庞大的解析数据来自何种分子进行识别，这也与实施例1同样。即，能够对IVT/emPCR等扩增工序中产生的基因间的扩增偏好进行校正，因此，能够高精度地对试样中初始存在的mRNA量进行定量。位于最3’侧的寡聚(dT)序列与添加于mRNA的3’侧的多聚A末尾杂交，用于捕捉mRNA(图7(a))。
接下来，对构成核酸捕获部的细孔阵列片的制作方法进行记述。
作为细孔阵列片，可获得通过阳极氧化法制作的市售品，这里，对使用孔径200nm、厚度为60μm、13mm见方(从直径25mm的片切下并利用)的细孔阵列片71的例子进行说明。形成于细孔阵列片71中的细孔72贯穿细孔阵列片71的厚度方向，细孔彼此完全独立。细孔72兼具流路5的功能。表面为亲水性，蛋白质向表面的吸附极少，酶反应有效地进行。首先，对细孔阵列片71的表面进行硅烷偶联等处理并将DNA探针73固定于细孔表面。DNA探针73按平均30～100nm2一个的比例固定于表面，因而1个孔固定有4～10x106个DNA探针。接下来，为了防止表面吸附，用表面涂层剂对表面进行涂覆。该表面涂覆可与探针固定同时进行。该DNA探针密度是能够将通过该空间的mRNA以大体100％的效率捕获于DNA探针的密度。
接下来，详细地对向细孔内部的DNA探针固定化方法进行说明。细孔阵列片内部的细孔的表面需要在高密度固定有DNA探针的同时为不吸附mRNA、PCR扩增用引物等核酸以及逆转录酶、聚合酶等蛋白质的表面。本实施例中，通过共价键，将用于固定DNA探针的硅烷偶联剂和防止吸附的经硅烷化的MPC聚合物按适当的比例同时固定于细孔表面，实现DNA的高密度固定和核酸、蛋白质的稳定的吸附抑制。实际上，首先将氧化铝制的细孔阵列片在乙醇溶液中浸渍3分钟后，进行5分钟UVO3处理，用超纯水洗涤3次。接着，在含有3mg/ml作为平均分子量9700(聚合度40)的硅烷化MPC聚合物的MPC0.8-MPTMSi0.2(MPC:2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱/MPTMSi:3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)(例如，Biomaterials 2009,30:4930-4938、和Lab Chip 2007,7:199-206)和0.3mg/ml的硅烷偶联剂GTMSi(GTMSi：3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷信越化学)、以及作为酸催化剂的0.02％乙酸的80％乙醇溶液中浸渍2小时。用乙醇洗涤后，在氮气气氛下干燥，利用烘箱在120℃加热处理30分钟。接着，为了使DNA固定化，通过与喷墨打印机同样的技术，将含有1μM 5’氨基经修饰的DNA探针、7.5％甘油和0.15M NaCl的0.05M硼酸缓冲液(pH 8.5)在细孔阵列片上，在每个25μm×25μm的区域排出含有不同的细胞识别用标签序列(1024种)的DNA探针，每种100pL。然后，在加湿室内在25℃反应2小时。最后，对未反应的缩水甘油基进行封端，为了除去过量的DNA探针，用足够量的含有10mM Lys、0.01％SDS和0.15M NaCl的硼酸缓冲液(pH 8.5)洗涤5分钟，除去该洗涤液后，用含有0.01％SDS和0.3M NaCl的30mM柠檬酸钠缓冲液(2xSSC,pH 7.0)在60℃进行洗涤，除去过量的DNA。由此，完成DNA探针的固定和表面处理。
接下来，依次对反应的各步骤进行说明。如图7(a)所示，与前面的实施例同样地，mRNA74通过与作为mRNA3’末端的多聚A序列互补的序列的18个碱基的多聚T序列被捕捉。接下来，合成第一cDNA链79，构建cDNA文库(图7(b))。接下来，使对应于欲定量的基因的多个(～100种)靶基因特异性序列引物80与第一cDNA链79退火(图8(c))，通过互补链延伸反应，合成第二cDNA链81(图8(d))。即在多重条件下进行第二cDNA链合成。由此，对于多个靶基因，合成两端具有扩增用共有序列(Forward/Reverse)、序列中包含细胞识别标签、分子识别标签和基因特异性序列的双链cDNA。此外，本实施例中，作为一例，20种(ATP5B、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27和OAZ1)基因特异性序列使用了距离靶基因的多聚A末尾的109±8碱基上游部分的20±5个碱基，这是为了在后续的通过IVT进行的扩增工序中将扩增产物大小统一为约200碱基。通过使PCR产物大小统一，能够省去复杂的大小分级纯化工序(电泳→切胶→PCR产物的提取、纯化)，具有能够直接用于从1分子进行的平行扩增(乳液PCR等)的效果。然后，将T7RNA聚合酶导入到细孔中，合成cRNA83(图8(e))。通过该过程，合成约1000拷贝左右的cRNA。进而，为了合成用于emPCR的双链DNA，以扩增的cRNA为模板，与添加有PCR扩增用共有序列(Reverse)的多个(～100种)靶基因特异性序列引物91杂交(图9(f))，合成cDNA(图9(g))。进而，与前面的实施例同样地使用酶使cRNA分解后，使用Forward公共引物合成第二链92，从而合成了emPCR用双链DNA93(图9(h))。该扩增产物长度一致，可直接进行emPCR、第二代测序。在该工序中，即使在基因间或分子间发生扩增偏好，也能够在取得第二代测序数据后，利用分子识别标签对扩增偏好进行校正，因此能够获得高精度的定量数据，这与前面的实施例是同样的。
接下来，以具有图7记载的核酸提取器件的单元结构的图10所示的装置构成，记述一系列的工序的具体情况。图10(b)是图10(a)的A-A’截面，图10(c)是对应于图10(a)的B-B’截面的剖面图。从细胞入口308导入细胞1并将细胞捕捉于细胞捕获部2，合成第一cDNA链，至此，与实施例1是同样的。合成第一cDNA链后，在85℃保温1.5分钟使逆转录酶失活，冷却至4℃后，将10mL含有RNase和0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)从入口305注入并从出口306、307排出，从而使RNA分解，使等量的碱性改性剂同样地流动，对细孔内的残留物和分解物进行除去、洗涤。然后，将灭菌水690μL、10x ExTaq Buffer(TaKaRa Bio公司)100μL、2.5mM dNTP Mix 100μL、各10μM的添加有PCR扩增用共有序列(Reverse)的20种基因特异性序列引物Mix100μL以及Ex Taq Hot start version(TaKaRa Bio公司)10μL混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口305注入。然后，进行95℃3分钟→44℃2分钟→72℃6分钟的反应，使引物的基因特异性序列以第一cDNA链为模板进行退火后，进行互补链延伸反应，合成第二cDNA链。
然后，使10mL含有0.1％Tween20的10mM Tris Buffer(pH＝8.0)从入口305注入并从出口306、307排出，从而对细孔内的残留物和分解物进行除去、洗涤。进而，将灭菌水340μL、AmpliScribe 10X Reaction Buffer(EPICENTRE公司)100μL、100mM dATP 90μL、100mM dCTP 90μL、100mM dGTP 90μL、100mM dUTP 90μL、100mM DTT以及AmpliScribe T7Enzyme Solution(EPICENTRE公司)100μL混合，使充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口305注入。然后，使溶液的温度提高至37℃，保温180分钟，从而完成逆转录反应，进行cRNA扩增。由此，20种靶基因的目的部分被扩增，cRNA扩增产物大小大体均匀，均为200±8碱基。回收膜的细孔内部和外部的溶液中蓄积的cRNA扩增产物溶液。以将该溶液中所含的酶等残留试剂除去为目的，使用PCR PurificationKit(QIAGEN公司)纯化，悬浮于50μL灭菌水。将10mM dNTPmix 10μL和50ng/μL的随机引物30μL与该溶液混合，94℃加热10秒后，以0.2℃/秒的速度使温度降低至30℃，30℃加热5分钟，进一步降低至4℃。然后，与5xRT Buffer(Invitrogen公司)20μL、0.1M DTT 5μL、RNase OUT 5μL以及SuperScript III 5μL混合，30℃加热5分钟，以0.2℃/秒使温度上升至40℃。以将该溶液中所含的酶等残留试剂除去为目的，使用PCRPurificationKit(QIAGEN公司)纯化，应用于emPCR扩增后，应用于各公司(LifeTechnologies、Illumina,Roche)的第二代测序进行分析。
(实施例3)
利用实现了按单个细胞进行的基因分析的核酸提取器件，能够对细胞的个性/状态进行识别。另一方面，在非侵入式显微镜观察中，能够以活细胞状态对细胞的形态、化学组成进行测定。然而，仅通过来自显微镜图像的信息对细胞的状态进行识别时，细胞的个性/状态多样且不稳定，因此是极为困难的。本实施例中，显示了用于组合通过按单个细胞进行的基因分析来识别细胞个性与非侵入成像的器件和装置构成。当以使用具有图3(a)、图7(a)那样的器件结构的设备捕捉了细胞的状态进行显微镜观察时，即使珠子、细孔片是由透明的材料制成的，其材料的折射率一般也与溶液的折射率不同，因此，激发光、照射光发生散射，产生解析度的降低、背景光水平的上升的问题。在本实施例中，显示组合了以图2的构成为典型例的核酸提取器件和光学显微镜的例子。
图11显示本实施例中的核酸提取器件的结构和装置。图11(b)是图11(a)的A-A’截面，图11(c)是对应于图11(a)的B-B’截面的剖面图。在本例中，研究了PDMS制的基板6的形状，虽然核酸捕获部在细胞的下方，但并非配置于正下方，设置周围为环状的区域并将磁珠12填装于该部分。通过在垂直于基板平面的方向上施加电场，从而mRNA等核酸通过电泳被导入填装成环状的珠子部分，被珠子表面的DNA探针捕捉。以下的工艺与实施例1的情况是同样的。用PDMS制作的细胞捕获部的直径设为16μm，细胞捕获部的正下方的显微镜窗1101的直径设为25μm、高度设为15μm。此外，关于细孔阵列片35，也以对应于细胞捕获部正下方的部分未形成细孔的方式，在阳极氧化时利用抗蚀剂掩模进行保护。这里，未进行阳极氧化的图案化，使显微镜窗1101的厚度比垂直于显微镜光学***的器件面的方向的焦点深度厚，从而也能够减小细孔阵列片导致的散射的影响。
此外，如图12所示，还可以不将核酸捕获部配置于细胞的周围，而是配置于旁边。图12(b)是图12(a)的A-A’截面，图12(c)是对应于图12(a)的B-B’截面的剖面图。在该例子中，1201为核酸捕获部。这种情况也是将DNA探针固定于珠子上并捕捉mRNA。其他器件的构成和样品制备方法与实施例1是同样的。
此外，图11、12中，将填装有珠子的区域作为核酸捕获部，毋庸置疑，通过与将细孔阵列片作为核酸捕获部的实施例2同样地对形成细孔的部分进行限制，能够不使用珠子来制作与图11和12所示构成同样的构成。
使用这样的核酸提取器件，为了进行基因表达分析而将细胞破碎并进行详细的基因表达分析，在此基础上，进行高解析度的活细胞状态下的形状、通过荧光染色进行的基因、蛋白质的定量或拉曼成像，能够使这些成像数据与基因表达分析数据相对应。以下对用于实现上述目的的***构成进行说明。
首先，图13显示，对于为了构成核酸提取器件而配置于平面状的器件(细胞阵列1320和细孔阵列片1321等)上的细胞样品，将利用光学显微镜进行的测定与使用上述器件得到的基因表达分析结果针对各个细胞的数据相对应，从而用于详细地测定细胞的动态的最小的***构成。
1200表示核酸提取器件和配置于该器件上的细胞样品。1201是图11所代表的用于从细胞提取mRNA和进行核酸扩增的流通***。该流通***中，通过对来自细胞的mRNA进行处理，获得为利用第二代(大规模)DNA测序仪1205来确定序列所需的量、且具有一定长度、末端包含记录了核酸处理前的信息的标签序列的扩增产物。这里，箭头1211也表示扩增产物的移动。另一方面，器件上的细胞以事先确定了细胞在器件上的位置的形式利用光学显微镜1203进行观察。这里，细箭头表示信息的移动。作为光学显微镜1203，包括相位差显微镜、微分干涉显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜、拉曼显微镜、非线性拉曼显微镜(CARS显微镜、SRS显微镜、RIKE显微镜)、IR显微镜等。利用这些光学显微镜获得的信息仅与基因信息相关，获得的信息少。然而，基本上，能够进行活细胞状态下的测定，能够测定细胞的经时变化，能够实时测定细胞对刺激的应答。通过利用保存有器件上的位置信息的器件，能够使有关基因表达的详细信息与通过显微镜获得的包括时间变化的信息相对应。为了实现上述目的，需要在***内设置对来自第二代(大规模)DNA测序仪的序列信息1212、光学显微图像的信息1213以及对应于标签序列的位置信息1214进行整合的信息***1206。本发明中，对上述说明的细胞的测定信息进行整合的***的最小构成是第二代(大规模)DNA测序仪1205以外的部分的***1207，是具有DNA测序仪的信息的输入和样品(核酸扩增产物)的输出的***。
图13显示组合有荧光显微镜作为光学显微镜的***构成例。1203是荧光显微镜。细胞1中，在欲测定的蛋白质(例如p53)中表达GFP，或者通过免疫染色在特定蛋白中导入荧光体。如此操作获得的各个细胞中的表达蛋白质量的数据，通过在细胞破碎后在核酸提取器件中对样品进行处理、DNA测序进行定量而获得的基因表达数据可与各个细胞相关。此时，为了对细胞进行识别，通过利用DAPI对核酸进行染色从而对细胞核进行识别，利用荧光显微镜来识别细胞位置。蛋白质的量通过GFP的表达来测定，因此能够追踪经时变化，能够同时测定的蛋白质的种类为数种左右。另一方面，利用测序进行的基因表达分析可以为一次100种左右，如果准备了探针，则能够进行1000种的分析。因此，可针对各个细胞获得细胞内的详细的基因表达控制的相关信息。然而，其并不能获得经时变化。然而，如果通过将两者组合，事先获得何种蛋白质表达时是何种基因表达的数据，则能够仅从蛋白质的表达数据推测基因控制相关信息。这样，利用信息***1206，进行荧光显微镜数据与基因表达数据的比对以及基因控制相关信息的推测。
接下来，显示荧光显微镜1203的构成的详细情况。1300是光源，在这里，是水银灯。1301是决定激发波长的激发滤光片，1302是分光镜，1303是选择接收光波长的发射滤光片。当在细胞中导入多种荧光体并同时进行测定时，用控制器1304对1301、1302、1303进行选择，从而仅测定来自特定荧光体的光。细胞的荧光成像利用物镜1305、成像透镜1306、CCD相机1307进行。对它们进行控制、取得图像数据的控制计算机是1308。
接下来，对流通***1201的控制体系进行说明。流通***的控制计算机是1309，其控制XY平台1310从而使显微图像移动。此时，在控制计算机上，能够使使用细孔阵列片上的位置坐标、细胞识别标签的序列数据和XY平台位置坐标计算出的显微图像上的位置坐标对应。该控制计算机1309对下述装置进行适当的控制：控制细胞的流动池***的细胞导入的细胞导入控制装置1311，控制改变细胞的状态的分化诱导剂、调节细胞的应答的试剂、用于使细胞破碎的裂解液、用于样品处理的试剂的导入的试剂控制装置1312，控制细胞培养条件、PCR时的温度循环的温度、CO2浓度控制装置1313，多余的试剂、细胞、培养基更换等所使用的上部试剂排出装置1314，用于将制备的核酸扩增产物排出的下部试剂排出装置1315。最终获得的核酸扩增产物被传递至第二代(大规模)DNA测序***1205，进行序列分析。此时，设为用于测序的emPCR、桥接扩增在该***中进行。在控制计算机上验证过的图像的位置信息和细胞识别标签序列信息被输送至整合信息***1206，进行由荧光图像获得的蛋白量与基因表达量的比对。进而，利用同一***进行基因表达分析数据的经时变化推测。由此，可以对基因表达网络的动力学进行测定。
此外，该荧光显微镜不仅用于细胞内的测定，还可以用于对导入到细孔阵列片中的、用抗体捕捉的细胞因子等由细胞分泌的物质进行免疫荧光染色并对其量进行测定。当然，还可以同样地操作，用于破碎后的基因表达量的分析。
图14显示组合微分干涉显微镜来代替荧光显微镜的例子。微分干涉显微图像不使用荧光试剂，仅对形状进行测定，是再生医学等需要将细胞体输回体内的情况下对细胞的影响最小的测定方法之一。是能够对由该图像获得的细胞形状的变化与基因表达的变化之间进行比对的情况下细胞损伤最少、能够进行详细的细胞分类的测定***。
1401是光源，在这里，是卤素灯。1402是偏光镜，1403、1404分别是Wollaston滤光片和Wollaston棱镜。1405是聚光镜，1406是物镜。
图15显示使用CARS显微镜作为光学显微镜的例子。CARS显微镜与拉曼显微镜、IR显微镜同样，可获得对应于激光激发部分的化学种类的光谱，因此能够使有关细胞状态的信息量比微分干涉显微镜更多。而CARS为非线性过程，与拉曼信号相比信号强度强，可以以较弱的激光激发强度获得充分的信号，因此具有对细胞的损伤小的优点。通过使这样的CARS图像与基因表达分析数据相对应，从而能够进行更为详细的细胞状态的判断。
1501是光源，在这里，是脉冲激光(微芯片激光)。利用光束分离器1502将其分为两束，一束导入至非线性纤维(光子晶体光纤)1503，生成斯托克斯光。另一束光直接用作泵浦光和探针光，利用水浸物镜1504聚光于样品(细胞中)，生成反斯托克斯光。利用高通滤光片1505仅使反斯托克斯光透过，通过分光器1506，利用分光器用CCD相机1507取得相干反斯托克斯拉曼光谱。
(实施例4)
本实施例显示，细胞捕获部并非由与细胞同等程度大小的开口部构成、而是由固定有化学捕捉细胞表面的物质，即与细胞表面的物质化学结合的物质的区域构成的例子。将针对实施例1(图1)改变了细胞捕获部的例子示于图16。配置了在核酸捕获(捕捉)中使用的珠子上的一部分区域固定有与细胞表面结合的抗体等蛋白质的珠子。珠子上的抗体可以附加捕捉特定种类的细胞的功能。例如，被称为CD(cluster of differentiation)抗体的一组抗体是对应于以白细胞为中心的细胞的膜蛋白的种类的抗体组。将该抗体生物素化并用珠子上的链霉亲和素固定，使用喷墨打印技术打印在图16的细胞捕获部2上，从而能够捕捉具有特定CD分类的抗原的细胞。当然，毋庸置疑，也可以不直接将CD抗体固定于珠子上，而是通过生物素修饰了的第二抗体固定于珠子上。此外，可以将CD抗体以外的抗体固定于珠子上，也可以将结合于细胞上的受体的分子固定。作为这样的分子的例子，有纤连蛋白。已知纤连蛋白与细胞上的整联蛋白相结合。通过将纤连蛋白固定于珠子上，可以捕捉粘接性的细胞。
作为与细胞表面的物质化学结合的物质的其他例子，可以列举细胞外基质，例如胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白等。
接下来，显示对应于实施例3(图2)的器件构成中化学地进行细胞捕捉的例子。这是在核酸提取器件的透明区域的一部分固定用于捕捉细胞的物质的例子。捕捉用物质可以使用与上述同样的抗体，也可以使用其他物质。图17显示核酸提取器件的构成例。将细胞捕捉用抗体1702固定于细胞捕获部2。固定方法是利用将生物素化的抗体和链霉亲和素固定于该区域。能够仅捕捉具有对应于抗体的抗原1703的细胞。
进而，显示对应于实施例2(图7)的例子。如图18所示，在细孔阵列片71上的用于捕捉细胞的区域1801固定抗体，从而形成了能够捕捉具有对应于抗体的抗原1802的细胞的细胞捕获部。为了将抗体固定于特定位置，使用喷墨打印头对经生物素化的抗体进行打印，每次为数十pL左右。通过实施例3所示的方法，器件整个表面被链霉亲和素覆盖，因而仅在特定区域固定有抗体。
(实施例5)
实施例1～4中，描述第二链形成工序(图2(d)-(e)和图8(c)-(d)所示的工序)和PCR扩增工序(图2(f)和图8(e))也在图5、图10、图11或图12所示那样的装置中进行的例子。其中，可如下进行：对于核酸提取器件1901的全部或将核酸提取器件分割为多个器件的器件，将器件如图19所示***到树脂制的管1902(一般使用的0.2mL、1.5mL容量等的管)或96孔、384孔板中，通过使第二链合成和PCR扩增所需的试剂1903在该管中混合来进行。通过设为这样的构成，关于这些工序的条件，不仅使用者能够自由地对条件进行改变，而且，从第二链合成开始在管中进行，从而还能够将细胞识别标签、分子识别标签从与实施例1-4所示的位置相反侧的末端***。
本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。
产业可利用性
根据本发明，能够对多个培养细胞、多个免疫细胞、(血中)癌细胞等进行生物体分子的定量、序列确定、分子鉴定，能够对处于何种状态的细胞组以何种程度的数量在生物体中存在进行测定。其还可以进行癌症等的早期诊断、测定iPS细胞的非均质性。
符号说明
1：细胞
2：细胞捕获部
3：流路
4：核酸捕获部
5：流路
6：平面基板
7：上部反应区域
8：下部反应区域

Claims (14)

1.一种核酸提取器件，其特征在于，具有：
用于固定各个单个细胞的细胞捕获部，
用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路，
介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部，以及
将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路，
所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
2.根据权利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含固定有用于核酸捕获的DNA的珠子。
3.根据权利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含细孔中固定有用于核酸捕获的DNA的多孔质膜。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部固定有与细胞表面的物质化学结合的物质。
5.根据权利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含用于确定在芯片上的位置的序列。
6.根据权利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含根据所捕获的核酸分子的不同而不同的序列。
7.根据权利要求6所述的核酸提取器件，其特征在于，具有导入用于对所述核酸捕获部所捕获的RNA进行逆转录的酶的单元。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方由光学透明的材料构成。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方设有核酸捕获部。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方以外的区域设有核酸捕获部。
11.一种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1～10中任一项所述的核酸提取器件和导入用于构建cDNA文库的试剂的单元。
12.一种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1～10中任一项所述的核酸提取器件以及导入用于构建cDNA文库的试剂和用于核酸扩增的试剂的单元。
13.一种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1～10中任一项所述的核酸提取器件，以及用于利用微分干涉显微镜、相位差显微镜、拉曼显微镜或相干拉曼显微镜对捕获于细胞捕获部的细胞进行观察的显微镜部。
14.一种方法，其特征在于，为利用具有细胞捕获部和配置于所述细胞捕获部下方的核酸捕获部的核酸提取器件从细胞提取核酸的方法，包括下述工序：
使细胞与所述细胞捕获部接触，从而将各个单个细胞捕获于所述细胞捕获部的工序，
使用于从细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部，通过从上至下连通的流路来流动的工序，
将提取的核酸固定于所述核酸捕获部的工序，以及
使核酸提取后的溶液从所述核酸捕获部介由流路在与所述细胞捕获部相反侧排出的工序，
所述核酸提取器件中，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
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