CN105026553A - 用于获得富集的间充质干细胞培养物的组合物和方法 - Google Patents

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CN105026553A CN201480012572.XA CN201480012572A CN105026553A CN 105026553 A CN105026553 A CN 105026553A CN 201480012572 A CN201480012572 A CN 201480012572A CN 105026553 A CN105026553 A CN 105026553A
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Abstract

本公开提供一种培养间充质细胞谱系细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。本公开也提供一种培养来自骨髓和/或密质骨的细胞，以使所述细胞富集间充质细胞谱系细胞的方法，其包括使所述细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。本公开也提供细胞培养基，其包含CSF1R激酶抑制剂，且可用于培养间充质细胞谱系细胞和/或富集间充质细胞谱系细胞。

Description

用于获得富集的间充质干细胞培养物的组合物和方法
技术领域
本公开涉及使来自骨髓或密质骨的间充质干细胞培养物中富集间充质干细胞的方法。本公开也涉及用于所述富集的培养基。
发明背景
骨髓(BM)是一种存在于长骨空腔内的柔软海绵状组织，且占总体重的约4％。血细胞正是在BM内从多能造血干细胞(HSC)产生，一种称为造血作用的过程。间充质干细胞(MSC)也正是存在于BM内并衬于密质骨(CB)的壁。MSC负责产生机体的各种细胞，包括成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和内皮细胞。除HSC、造血单核细胞和MSC以外，还有几类存在于BM和CB内的其它类型的细胞，这使得这些组织本质上高度异质。
骨髓为造血及间充质干细胞、成骨细胞、内皮细胞以及其它细胞提供共存和发挥功能所必需的特定微环境或生态位。干细胞变得静止、增殖、分化及响应外界信号的决定就是在这些生态位内发生。最近的一些报告已显示，不同干细胞生态位间发生交叉对话(cross-talk)，以在体内引起适当反应(7、8、9、10)。因此，BM源性细胞以及衬于CB内壁的细胞在体外培养***中共存并相互影响并不出人意料。BM及CB中存在大量细胞类型及生态位，且它们中发生的相互联系通常转化为含几种成功和谐共存的细胞类型的异质性体外培养物。来自BM或碾碎的CB的间充质干细胞(MSC)培养物的一个反复出现的问题是，大量不需要的污染巨噬细胞、造血细胞及可能的其它非间充质细胞群体倾向于相对于培养物中更罕见的MSC群体过度生长。BM及CB源性MSC的培养物通常过度生长巨噬细胞，巨噬细胞常常存在于生长的MSC集落顶部，从而干扰MSC在培养物中的增殖及行为。这种体外异质性通常是MSC研究中不需要的，因为实验测定被设计成在没有其它细胞干扰的情况下研究或利用那种特定细胞类型。
CSF-1是一种与CSF1R寡聚，从而导致这种受体转磷酸化(trans-phosphorylation)，以促进单核吞噬细胞谱系的细胞存活、增殖及分化成巨噬细胞的细胞因子(4、6)。与其调节巨噬细胞谱系的作用一致，外源性CSF-1导致小鼠中单核细胞及巨噬细胞产量增加(11)，而非功能性CSF-1(12)或CSF1R(13)小鼠显示巨噬细胞数量不足，这导致炎症反应减少。
造血单核细胞的一种表型特性是在其细胞表面膜上表达CSF1R。在这些细胞上，激活CSF1R导致增殖及分化。这种受体的激活是通过使CSF-1配体结合至CSF1R而介导。这种寡聚作用引起三磷酸腺苷(ATP)-依赖性酪氨酸激酶介导的转导信号，其最终引导造血单核细胞增殖和/或分化。
GW2580[5-(3-甲氧基-4-((4-甲氧基苄基)氧基)苄基)嘧啶-2,4-二胺]及KI20227{N-{4-[(6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基]-2-甲氧基苯基}-N0-[1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]脲}属于一类通过与ATP竞争结合至CSF1R激酶而特异性抑制CSF1R激酶活性的小分子(14)。已显示，GW2580在60nM下完全抑制人类CSF1R激酶，但保持对26种其它测试的激酶无活性(3)。此外，在700nM下，GW2580完全抑制小鼠骨髓细胞的CSF-1-依赖性生长，而CSF-1-非依赖性细胞系、人类成纤维细胞及其它内皮细胞对GW2580保持高度抗性(3)。
发明概述
本发明人已表明，在人类及小鼠BM及CB细胞培养物中用小分子及其它具有类似性质的化合物特异性抑制CSF1R激酶可减少培养物中成熟巨噬细胞的数量，其进而得到富集的MSC培养物。此外，这些分子或化合物对培养物中存在的其它非间充质细胞或衍生的祖细胞也有影响。总之，使用此类化合物可富集间充质细胞，同时移除分化的非间充质细胞或抑制其存在。
因此，本公开涉及一种培养间充质细胞谱系细胞的方法，该方法包括使细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
本公开也涉及一种培养来自骨髓和/或密质骨的细胞以使细胞培养物富集间充质细胞谱系细胞的方法，其包括使细胞培养物与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
在一实施方案中，方法包括：
a)从得自受试者的组织样本收获细胞，其中所收获的细胞包含间充质细胞谱系细胞，及
b)使所收获的细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
在一实施方案中，方法还包括c)得到富集间充质细胞谱系细胞的细胞群体。
任选地，CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。
在另一实施方案中，所收获的细胞还包含非间充质细胞。在另一实施方案中，非间充质细胞为巨噬细胞。
在另一实施方案中，方法是在体外进行。
在另一实施方案中，间充质细胞谱系细胞包含间充质干细胞、间充质细胞祖细胞及基质源性细胞中的至少一种。
在另一实施方案中，组织样本包括骨髓、密质骨、脂肪组织或存在MSC的任何组织。
在另一实施方案中，使细胞与培养基接触至少一小时、至少一天或至少一周。
在另一实施方案中，在使细胞与培养基接触之前，间充质细胞谱系细胞的浓度为至少10个细胞/cm2。
在另一实施方案中，间充质细胞谱系细胞保留其形成脂肪形成、软骨形成及成骨细胞谱系的能力。
在一实施方案中，来自骨髓和/或密质骨的细胞包含间充质细胞谱系细胞及非间充质细胞。
本公开还涉及一种可用于培养间充质细胞谱系细胞和/或富集间充质细胞谱系细胞的细胞培养基。
在一实施方案中，细胞培养基包含CSF1R激酶抑制剂。
在另一实施方案中，CSF1R激酶抑制剂是一种通过与ATP竞争结合至CSFR1激酶而抑制CSF1R激酶活性的小分子。
在另一实施方案中，CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。任选地，培养基包含1-10μM GW2580。
在另一实施方案中，培养基还包含至少一种生长因子。任选地，至少一种生长因子选自由FGF、EGF及IGF组成的列表。
在另一实施方案中，培养基包括基础培养基。任选地，基础培养基选自达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、高级DMEM、BiogroTM、SkGMTM、Ham’s F10、Ham’s F12、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基(Iscove's modified Dulbecco's medium)、neurobasal培养基、RPMI 1640及MCDB120培养基。
在另一实施方案中，培养基还包含补充剂。任选地，补充剂选自：
·胰岛素、转铁蛋白及***盐(ITS)；
·B27；
·***(dexamethasone)、胰岛素、EGF、胎球蛋白及白蛋白；及
·***、bFGF、白蛋白及胰岛素。
在另一实施方案中，培养基还包含脂质。任选地，脂质是花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸中的至少一种。
附图简述
现在将参照附图详细地描述本公开，其中：
图1显示，用1μM GW2580处理的BM源性细胞的集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)培养物的巨噬细胞污染减少，且MSC集落的数量及尺寸较大。A，以所示密度将细胞接种于6孔板中，并用媒介物(对照)或1μM GW2580处理14天。固定培养物并用甲苯胺蓝染色，并评估MSC CFU-F。对照培养物显示更小的MSC CFU-F，这些培养物过度生长深色高度致密的巨噬细胞。用1μM GW2580处理的培养物显示较大的富集的MSC CFU-F，其基本上不含巨噬细胞。B，计算对照培养物及经GW2580处理的培养物中的集落数量。当与对照培养物相比时，经GW2580处理的培养物的集落数量增加至少20％。
图2显示，用1μM GW2580处理的CB源性细胞的CFU-F培养物的巨噬细胞污染减少，且MSC集落的数量及尺寸较大。A，以所示密度将细胞接种于6孔板中，并用媒介物(对照)或1μM GW2580处理14天。固定培养物并用甲苯胺蓝染色，并评估MSC CFU-F。对照培养物显示更小的MSC CFU-F，这些培养物过度生长深色高度致密的巨噬细胞。用1μM GW2580处理的培养物显示较大的富集的MSC CFU-F，其基本上不含巨噬细胞。B，计算对照培养物及经GW2580处理的培养物中的集落数量。当与对照培养物相比时，经GW2580处理的培养物的集落数量增加至少24％。
图3显示，源自BM或CB并用1μM GW2580处理的MSC培养物的巨噬细胞污染减少，且富集MSC。BM及CB的处于第2代(P2)的对照未处理培养物过度生长巨噬细胞(小的高折射性细胞)，而用1μM GW2580处理的MSC培养物是富集的，且基本上无巨噬细胞污染。
图4显示，将BM及CB-源性MSC培养物暴露于1μM GW2580导致巨噬细胞在P1时分别减少20％及50％。对暴露于1μM GW2580的BM的P1培养物进行流式细胞术分析，结果表明全部活细胞中有62％是由CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞组成。在BM对照培养物中，这个群体占全部活细胞的82％，因此代表经GW2580处理的培养物中的巨噬细胞减少20％。同样地，用1μM GW2580处理CB培养物，结果表明这些培养物包含34％CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞，代表与含有84％巨噬细胞的对照培养物相比减少50％。
图5显示，在整个传代过程中(P0-P3)用1μM GW2580连续处理BM培养物可大大减少巨噬细胞数量，同时维持富集的MSC群体。对照培养物显示大量小的具有折射性的污染巨噬细胞，而用1μMGW2580处理的培养物含有的这些污染巨噬细胞的数量大幅减少。此外，经GW2580处理的培养物呈现具有MSC特征的成纤维样细胞的数量较多。
图6显示，从P0到P2将BM源性培养物暴露于1μM GW2580导致CD45+细胞总体减少18％，且分化为CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞的CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞减少36％，这是由流式细胞术分析证实。对培养物中的CD45+细胞进行门控(gated)，并在这个群体中分析CD11b及Sca1的表达。在对照培养物中，92％的CD45+细胞也是CD11b+(成熟巨噬细胞)，且8％的细胞是CD11b+/Sca1+。在经GW2580处理的培养物中，56％的CD45+细胞是CD11b+/Sca1-，且44％的细胞是CD11b+/Sca1+，由此表明，与对照培养物相比时，36％的造血单核细胞未分化成巨噬细胞。
图7显示，从P0到P3将BM源性培养物暴露于1μM GW2580导致CD45+细胞总体减少64％，且分化为CD45+/CD11b+/Sca1-巨噬细胞的CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞减少52％，这是由流式细胞术分析证实。对培养物中的CD45+细胞进行门控，并在这个群体中分析CD11b及Sca1的表达。在对照培养物中，99％的CD45+细胞也是CD11b+(分化的巨噬细胞)，且<1％的细胞是CD11b+/Sca1+造血单核细胞。在经GW2580处理的培养物中，41％的CD45+细胞是CD11b+/Sca1-，且52％的细胞是CD11b+/Sca1+，由此表明，与对照培养物相比时，52％的单核细胞祖细胞未分化成巨噬细胞。
图8显示，在整个传代过程中(P0-P3)用1μM GW2580连续处理CB培养物可大大减少巨噬细胞数量，同时维持富集的MSC群体。对照培养物显示大量小的具有折射性的污染巨噬细胞，而用1μMGW2580处理的培养物含有的这些污染巨噬细胞的数量大幅减少。此外，经GW2580处理的培养物呈现具有MSC特征的成纤维样细胞的数量较多。
图9显示，从P0到P2将CB源性培养物暴露于1μM GW2580导致CD45+细胞总体减少15％，且分化为CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞的CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞减少22％，这是由流式细胞术分析证实。对培养物中的CD45+细胞进行门控，并在这个群体中分析CD11b及Sca1的表达。在对照培养物中，94％的CD45+细胞也是CD11b+(分化的巨噬细胞)，且6％的细胞是CD11b+/Sca1+造血单核细胞。在经GW2580处理的培养物中，62％的CD45+细胞是CD11b+/Sca1-，且28％的细胞是CD11b+/Sca1+，由此表明，与对照培养物相比时，22％的单核细胞未分化成巨噬细胞。
图10显示，从P0到P3将CB源性培养物暴露于1μM GW2580导致CD45+细胞总体减少55％，且分化为CD45+/CD11b+/Sca1-巨噬细胞的CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞减少8％，这是由流式细胞术分析证实。对培养物中的CD45+细胞进行门控，并在这个群体中分析CD11b及Sca1的表达。在对照培养物中，88％的CD45+细胞也是CD11b+(分化的巨噬细胞)，且12％的细胞是CD11b+/Sca1+(造血单核细胞)。在经GW2580处理的培养物中，76％的CD45+细胞是CD11b+/Sca1-，且20％的细胞是CD11b+/Sca1+，由此表明，与对照培养物相比时，8％的单核细胞未分化成巨噬细胞。
图11显示，向BM或CB培养物添加浓度范围为1至10μM的GW2580可减少培养物中的巨噬细胞污染，且对MSC群体无负面影响。将BM或CB源性细胞培养物暴露于1、5及10μM GW2580，且无论所用浓度如何，与对照培养物相比时都观察到巨噬细胞显著减少，且MSC呈现健康的成纤维细胞外观。
图12显示，将BM源性培养物暴露于1、5或10μM GW2580导致CD45+及造血单核细胞中剂量-反应减少。CD45+的数量从对照培养物中的52％分别减少至用1、5及10μM GW2580处理的培养物中的45％、33％及28％。意外地，CD45+/CD11b+/Sca1+的数量也以剂量-反应方式分别在用1、5及10μM GW2580处理的培养物中从55％、减少至40％及至34％。
图13显示，将CB源性培养物暴露于1、5或10μM GW2580导致CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞中剂量-反应减少，而CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞呈现类似剂量-反应增加。CD45+的数量从对照培养物中的78％分别减少至用1、5及10μM GW2580处理的培养物中的64％、36％及30％。CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞的数量以剂量-反应方式从对照培养物中的7％分别增加至用1、5及10μMGW2580处理的培养物中的25％、39％及48％。
图14显示，在P2时提早移除GW2580导致CB培养物中再次出现巨噬细胞。CB骨培养物在1μM GW2580存在下维持2代(P0-P1)，然后在媒介物存在下又维持2代(P2-P3)。在P3时进行流式细胞术分析。对培养物中的CD45+细胞进行门控，并在这个群体中分析CD11b及Sca1的表达。分析显示，在贴壁培养物中，97％的CD45+细胞是CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞，且仅有2％仍然是CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞。在非贴壁培养物中，99％的CD45+细胞是CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞，且<1％仍然是CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞。
图15显示在P0至P2传代期间维持在含0.1％v/v DMSO的对照培养基中，然后在P3至P4期间维持在含1μM GW2580的培养基中的CB源性培养物。出于比较的目的，利用EasySep分离来自小鼠密质骨的间充质祖细胞(STEMCELL)，P4对照培养物富集间充质祖细胞。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，在经GW2580处理的样本及EasySep富集的样本中，活性CD45+细胞占全部细胞的<0.2％。在这些CD45+细胞中，两种培养物中仅有约25％的细胞是CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞，而约75％的CD45+细胞是CD11+/Sca1+单核细胞。
图16显示，用1μM GW2580或1μM KI20227处理BM及CB源性培养物导致CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞中类似减少，表明这种活性是由于CSF1R受体抑制所引起。
图17显示在对照培养基或含1μM GW2580的培养基中扩增至P2，然后暴露于脂肪形成及成骨分化培养基3周的人类BM源性MSC。固定脂肪形成培养物，并用油红O染色。固定成骨培养物，并用硝酸银染色。对照培养物及经GW2580处理的培养物都同样良好地分化，表明GW2580不会影响MSC的分化能力。
图18显示，在扩增期间将小鼠BM-及CB-MSC培养物暴露于GW2580导致比对照培养物更强烈及更稳健地分化成成骨及脂肪形成谱系，且需要更少细胞。
表1显示，向BM-或CB-MSC的CFU-F培养物添加GW2580导致培养物中MSC集落数量增加。进行三次测定。在测定1中，使用的GW2580的浓度为1uM，而在测定2及3中，GW2580是以2.5uM的浓度使用。在所有测定中，当与对照培养物相比时，暴露于任一浓度的GW2580 14天的培养物显示MSC集落数量总体上最少增加20％。
表2显示，当与对照培养物相比时，将BM-及CB-MSC的培养物暴露于2.5uM GW2580导致CD45-/CD29+/Sca1+MSC的数量分别增加26％(0.75至1.01倍)及310％(0.8至2.46倍)，这是由流式细胞术证实。
发明详述
本公开的方法
富集间充质干细胞
本发明人发现，特异性抑制CSF1R激酶的小分子及化合物可防止巨噬细胞及其它造血细胞的增殖及分化，其进而产生及扩增富集的间充质干细胞(MSC)培养物，诸如那些得自骨髓或碾碎的骨样本的培养物。MSC培养物中分化的成熟巨噬细胞及非间充质细胞的损失使得MSC扩增及增殖。
因此，本公开提供一种培养间充质细胞谱系细胞的方法，该方法包括使细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
本公开也提供一种培养来自骨髓和/或密质骨的细胞以使细胞培养物富集间充质细胞谱系细胞的方法，其包括使细胞培养物与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
在一实施方案中，本公开提供一种培养间充质细胞谱系细胞的方法，其包括：
a)从受试者的组织样本收获细胞，其中所收获的细胞包含间充质细胞谱系细胞及巨噬细胞，及
b)使所收获的细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
如此处所使用，术语“间充质干细胞”(MSC)是指通常见于(但不限于)骨髓的成体干细胞。MSC可从机体任何组织分离得到，包括(但不限于)密质骨、脂肪组织、脐带血、外周血、输卵管、胎儿肝及肺。MSC是见于可分化成多种细胞类型(包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞)的器官的基质内衬中的多能细胞。术语“间充质细胞谱系细胞”指源自间充质细胞(干细胞或祖细胞)的细胞。间充质谱系细胞包括间充质干细胞、间充质细胞祖细胞(能分化成间充质干细胞的非造血干细胞)及基质源性细胞。基质细胞包括见于给定组织或器官，且区别于组织或器官的功能要素的所有不同类型支持细胞(“实质细胞”)。
如本文中所使用，术语“巨噬细胞”是指在吞噬临死或死亡细胞及细胞碎片中起作用的细胞。巨噬细胞是由组织中单核细胞分化所产生。它们通常见于骨髓及密质骨。成熟巨噬细胞可通过C45+/CD11b+表型识别。
如本文中所使用，“组织样本”可为含有间充质细胞谱系细胞的任何组织样本。组织样本可得自任何哺乳动物，包括(但不限于)人类及小鼠。在一实施方案中，组织样本是骨髓样本、密质骨样本或脂肪组织样本。小鼠中用于获得间充质细胞谱系细胞的优选组织包括骨髓及密质骨。人类中用于获得间充质细胞谱系细胞的优选组织包括骨髓及脂肪组织。
如本文中所使用，术语“收获细胞”是指从组织样本(诸如骨髓或密质骨)分离或提取细胞。从组织样本收获细胞的方法是本领域中所熟知的。
从骨髓、密质骨(例如，衬于密质骨壁的细胞)及脂肪细胞收获的细胞含有间充质干细胞。然而，所收获的细胞通常受到其它非所需细胞类型的污染。因此，从骨髓、密质骨及脂肪组织收获的细胞也可含有巨噬细胞及非间充质源性细胞，诸如造血细胞及成纤维细胞。
本发明人发现，CSF1R激酶抑制剂促进得自骨髓及密质骨样本的细胞培养物中的间充质细胞谱系细胞的扩增及增殖。因此，本发明方法包括使细胞培养物与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
如本文中所使用，术语“CSF1R激酶抑制剂”包括抑制CSF1R活性的任何试剂、化合物、小分子或生物制品。
集落刺激因子-1(CSF-1)是一种通过酪氨酸激酶集落刺激因子1受体(CSF1R)传递信号，以刺激单核吞噬细胞或巨噬细胞的细胞存活、增殖及分化的细胞因子。
巨噬细胞的存活、增殖及分化依赖于通过CSF-1激活CSF1R受体。因此，在一实施方案中，CSF1R抑制剂是一种通过与ATP竞争结合至CSF1R激酶受体而特异性抑制CSF1R激酶活性，从而防止巨噬细胞存活、增殖及分化的小分子。
在另一实施方案中，CSF1R抑制剂是GW2580[5-(3-甲氧基-4-((4-甲氧基苄基)氧基)苄基)嘧啶-2,4-二胺]或KI20227{N-{4-[(6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基]-2-甲氧基苯基}-N0-[1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]脲}。其它CSF1R抑制剂包括HY-13075{4-氰基-N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(4-甲基哌啶-1-基)苯基]-1H-吡咯-2-甲酰胺}、cFMS受体抑制剂II{4-(3,4-二甲基苯胺基)-7-(4-吡啶基)喹啉-3-甲酰胺}、cFMS受体抑制剂III{4-(3,4-二甲基苯胺基)-7-(4-(甲基磺酰基)苯基)喹啉-3-甲酰胺}、cFMS受体抑制剂IV{5-氰基-N-(2,5-二(哌啶-1-基)苯基)呋喃-2-甲酰胺，CSF-1受体抑制剂IV}及ARRY-382。
上文所列的许多化合物的CAS号如下：
如本文中所使用，措辞“使所收获的细胞与培养基接触”是指所收获的细胞借以在培养基中培养或孵育的任何方式。
如本文中所使用，术语“培养基”是指设计用于支持细胞(特定而言间充质细胞谱系细胞)生长的介质。本领域中已知各种培养基。在一实施方案中，培养基是基础培养基，诸如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、高级DMEM、BiogroTM、SkGMTM、Ham’s F10、Ham’sF12、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基、neurobasal培养基、RPMI 1640及MCDB120培养基。培养基可含有血清或不含血清。
任选地，使所收获的细胞与含CSF1R抑制剂的培养基接触至少一小时，至少一天、三天或五天，至少一周或超过一周。在另一实施方案中，使所收获的细胞与含CSF1R抑制剂的培养基接触至少一代、两代、三代、四代或五代。在另一实施方案中，使所收获的细胞与含CSF1R抑制剂的培养基连续接触至少一小时，至少一天、三天或五天，至少一周或超过一周或者至少一代、两代、三代、四代或五代。
在一实施方案中，在使细胞与培养基接触之前，间充质细胞谱系细胞的浓度为至少1、2、5、10、15或20个细胞/cm2或约10个细胞/cm2。本公开的方法任选地包括得到富集间充质细胞谱系细胞的细胞群体。
当所含间充质细胞谱系细胞百分比大于对照细胞群体时，那么细胞群体或细胞培养物富集间充质细胞谱系细胞。在一实施方案中，对照细胞群体是尚未与含CSF1R抑制剂的培养基接触的细胞群体。
在另一实施方案中，当所含间充质细胞集落的数量和/或尺寸相比于对照细胞群体增加时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。
在一些实施方案中，当所含间充质细胞集落比对照细胞群体多至少5％、10％、20％、50％或75％时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。
在另一实施方案中，当间充质细胞集落的平均尺寸比对照细胞群体中间充质细胞集落的平均尺寸大至少5％、10％、20％、50％或75％时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。
在另一实施方案中，当所含巨噬细胞数量相比于对照细胞群体减少时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。在一些实施方案中，当细胞群体中巨噬细胞的数量相比于对照细胞群体减少至少5％、10％、20％、50％或75％时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。在一实施方案中，巨噬细胞是C45+/CD11b+巨噬细胞。
在另一实施方案中，当所含已从造血单核细胞分化成的成熟巨噬细胞相比于对照细胞群体更少时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。换句话说，当巨噬细胞分化受到抑制及维持造血单核细胞时，那么细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。当细胞群体中造血单核细胞的数量相比于对照细胞群体增加至少5％、10％、20％、50％或75％和/或细胞群体中成熟巨噬细胞的数量相比于对照细胞群体减少至少5％、10％、20％、50％或75％时，那么细胞群体可能富集间充质细胞谱系细胞。造血单核细胞任选地通过CD45+/CD11b+/Sca1+表型识别。成熟巨噬细胞任选地通过CD45+/CD11b+/Sca1-表型识别。
本公开的培养基
本公开也提供可用于培养间充质细胞谱系细胞的培养基组合物。培养基组合物也可用于使细胞群体富集间充质细胞谱系细胞。
在一实施方案中，培养基包含CSF1R激酶抑制剂。在一实施方案中，CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。
任选地，培养基包含0.1至20uM GW2580、0.5至15uMGW2580、1至10uM GW2580或约0.1μM、0.5μM、1uM、5uM、10uM、15uM或20uM GW2580。在另一实施方案中，培养基包含0.1至20uM KI20227、0.5至15uM KI20227、1至10uM KI20227或约0.1μM、0.5μM、1uM、5uM、10uM、15uM或20uM KI20227。
在一实施方案中，含CSF1R激酶抑制剂的培养基使得间充质细胞谱系细胞以高于不含CSF1R激酶抑制剂的培养基的速率增殖。
在另一实施方案中，培养基包含至少一种生长因子。任选地，生长因子为FGF、EGF、IGF或bFGF或者其任何组合。
培养基可为可用于培养间充质细胞谱系细胞的任何培养基。在一实施方案中，培养基包括基础培养基。基础培养基是本领域中所已知，且包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、高级DMEM、BiogroTM、SkGMTM、Ham’s F10、Ham’s F12、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基、neurobasal培养基、RPMI 1640及MCDB120培养基。
培养基可不含血清或可含有血清。
在另一实施方案中，培养基包含补充剂或补充剂组合。补充剂的实例包括(但不限于)胰岛素、转铁蛋白、***盐、B27、***、胰岛素、胎球蛋白及白蛋白以及生长因子(诸如FGF、EGF、IGF或bFGF)。可包含在培养基中的具体补充剂组合包括(但不限于)：
·胰岛素、转铁蛋白及***盐(ITS)；
·B27；
·***、胰岛素、EGF、胎球蛋白及白蛋白；及
·***、bFGF、白蛋白及胰岛素。
在另一实施方案中，培养基还包含脂质。脂质的实例包括(但不限于)花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸。
富集MSC群体的用途
可根据本文所述方法得到富集MSC群体。富集MSC群体的应用及用途包括(但不限于)MSC扩增、MSC分化为间充质谱系(诸如成骨、软骨形成、脂肪形成或成肌(myogenic)谱系)及MSC分化为非间充质谱系(诸如上皮、成心肌、神经或肝源性谱系)。分化谱系可用于体外或体内目的。
以上公开大体上描述本公开。通过参考以下具体实施例可获得更全面理解。这些实施例仅是出于说明目的进行描述，且不旨在限制本公开范围。涵盖等效物的形式及替代变化，根据具体情况可以建议或提出权宜之计。虽然本文已采用具体术语，但此类术语意在描述意义而非限制目的。
以下非限制性实施例说明本公开：
实施例
实施例1：获得成年小鼠的MSC
就小鼠细胞而言，过程涉及使用刚刚进行安乐死(例如，安乐死后0至24小时)的成年小鼠的后肢作为BM及CB源性MSC的来源。将安乐死小鼠的后腿(包括髋骨)剥皮，并从动物移除。完全移除毗邻的软组织及骨骺，并刮下骨头。清洁骨头，然后转移至含清洗缓冲液(PBS，2％FBS，1mM EDTA)的研钵，并用研杵轻轻碾压，以释放出骨髓。将含骨髓的清洗缓冲液转移至试管，并重复该过程，直到移除所有骨髓，并且缓冲液不含红血球。然后使含骨髓的缓冲液离心沉降，将P0细胞重悬浮于扩增培养基中，并在1μM GW2580存在下以6.7x105个细胞/cm2(5千万个细胞/T75烧瓶)涂铺以扩增MSC，或者在1μM GW2580存在下以2.5-10x105个细胞/cm2范围的密度涂铺于6孔板中用于CFU-F测定。然后将研钵中碾碎的骨头转移至含2ml胶原酶的培养皿中，并用解剖刀仔细切碎。然后使切碎的骨头在37℃下于胶原酶中消化1小时，同时以100rpm作圆周运动。使经消化的骨头通过40μm过滤器，以产生单细胞溶液。然后以300x g使该过滤溶液离心沉降5分钟，将P0细胞重悬浮于扩增培养基中，并在1μMGW2580存在下以2.7x104个细胞/cm2(2百万个细胞/T75烧瓶)涂铺以扩增MSC，或者在1μM GW2580存在下以5-25x103个细胞/cm2范围的密度接种于6孔板中用于CFU-F测定。BM及CB的P0扩增培养物在37℃及5％CO25％O2下于增湿室中孵育10至14天，以使得MSC扩增及富集。然后使培养物在1μM GW2580存在下以6.7x103个细胞/cm2传代及涂铺，直到它们达到70至80％汇合度(confluence)。每7天重复传代，至多传代10次或者直到获得足够富集的MSC进行下游应用。固定CFU-F测定培养物，并在第14天用甲苯胺蓝染色，以评估集落形成。出于比较的目的，在DMSO媒介物而非GW2580存在下建立用于扩增及CFU-F测定的对照培养物。
分离小鼠BM及CB源性MSC细胞
1.用70％异丙醇清洁研钵及研杵。将异丙醇移出研钵及研杵，并使得在无菌生物安全柜(sterile biohazard safety cabinet)中风干30分钟。然后在临使用前用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗研钵及研杵。
2.用酒精棉清洁剪刀及镊子，并使得完全风干。
3.处死小鼠后，用70％异丙醇充分浸泡皮毛，然后剪掉并向后剥，以露出后肢。使用锋利的无菌剪刀，平行于脊柱并尽可能靠近脊柱做出小的切口。固定脚，并朝向头拉腿，以从动物移除整个完整腿(髂骨、股骨及胫骨)。针对剩下的腿重复这个过程。使用解剖刀，正好在踝关节顶部切除胫骨，以移除脚。放置腿，使得髂骨面朝上。将股骨固定在膝盖附近，并用解剖刀朝着髂骨向下刮股骨，以使髋关节脱臼，并露出股骨头。切除剩余的肌肉，以移除髂骨，并在中间切割膝关节，以移除韧带及多余组织。
4.使用解剖刀，充分刮擦骨头，以移除肌肉，并切割移除骨骺。清洁骨头，并充分刮擦以确保未附上残余肌肉组织。
5.将干净骨头置于含10mL PBS加2％FBS(STEMCELL目录#07905)及1mM EDTA的研钵中。然后将PBS加2％FBS及1mMEDTA的溶液称为‘缓冲液’。
6.用研杵轻轻碾压骨头，使用仅足以使骨头裂开的力。轻轻搅动骨头，以从骨碎片中释放出骨髓(BM)，并将含骨髓的缓冲液转移至试管中，并将试管保持在冰上。
7.必要时向研钵添加10mL新鲜缓冲液，并进一步轻轻碾压骨头接着搅动，以释放出骨髓，并将缓冲液收集在试管中。将BM管保持在冰上，直到完成所有清洗。重复清洗步骤，直到移除大部分BM(骨碎片颜色变白)。注意，当剧烈研磨骨头时，观察到细胞丧失活力及过量碎屑。重要的是只使用温和压力使骨头裂开。
8.将骨碎片转移至含有2mL含于含20％FBS的PBS中的0.25％I型胶原酶(STEMCELL目录#07902)的100mm器皿中，确保骨头完全浸没在溶液中。使骨头在胶原酶溶液中静置3至5分钟，以使骨头软化，以便可较容易地切碎。
9.使用解剖刀，将剩余的骨碎片切成细小片状物(1-2mm碎片)，需要适当的骨碎片才能释放出足量细胞。
10.将骨碎片及胶原酶溶液转移至50mL聚丙烯管中，并进一步添加0.25％I型胶原酶(STEMCELL目录#07902)，直到每只小鼠使用的最终体积为2mL或最少10mL。
11.用密封管盖，并将试管置于以最大速度振荡的37C水浴中，持续45分钟。亦可使用在～200rpm下的细菌培养振荡器。
12.45分钟后，将试管移出振荡器，并添加缓冲液(称为步骤6)，至最终体积为30mL。收集上清液，并滤过70μm细胞过滤器(Falcon，目录#352350)。通过与另外10mL缓冲液混合清洗骨碎片，并让碎片静置3-4分钟。使洗透的物质(wash through)滤过70μm过滤器(Falcon，目录#352350)，并与先前收集的细胞合并(得到40mL的最终体积)。
13.取出步骤7的BM管，并使BM悬浮液滤过70μm细胞过滤器。
14.CB及BM管都以300x g在室温(15-25C)下离心10分钟，开启制动器。移除上清液，并将细胞沉淀物重悬浮于～200-500μLMesenCultTM完全培养基(小鼠)(STEMCELL目录#05511)中。注意，细胞悬浮液中可看到小的颗粒及碎片。
15.将细胞置于冰上，直到准备使用。
16.移除一小等份细胞，并在3％亚甲蓝乙酸(目录#07060)中稀释1/20至1/100，并用血细胞计数器计数有核细胞。
17.BM及CB源性细胞准备在GW2580存在下进行扩增及CFU-F测定，然后可用于特定应用。
实施例2：获得人类细胞的MSC
就人类细胞而言，BM通常是用于提取及富集MSC的优选组织。这些细胞是通过Ficoll提取获得，以移除红血球。在这个过程中，新鲜的BM在分离缓冲液(PBS+2％FBS+2mM EDTA)中以5:14稀释，并以300x g离心沉降30分钟。然后移除含单核细胞的界面层，并重悬浮于40ml冷的分离缓冲液中，然后再次以300x g离心10分钟。移除上清液，并将细胞重悬浮于2ml扩增培养基中并计数。然后将这些P0细胞重悬浮于扩增培养基中，并在1μM GW2580存在下以6.7x105个细胞/cm2(5千万个细胞/T75烧瓶)涂铺以扩增MSC，或者在1μM GW2580存在下以2.5-10x105个细胞/cm2范围的密度涂铺于6孔板中用于CFU-F测定。人类BM培养物在37℃下于含5％CO2的增湿室中孵育10至14天，以使得MSC扩增及富集。然后培养物在1μM GW2580存在下以6.7x103个细胞/cm2传代及涂铺，直到它们达到70至80％汇合度。每7天重复传代，至多传代10次或者直到获得足够富集的MSC进行下游应用。固定CFU-F测定培养物，并在第14天用甲苯胺蓝染色，以评估集落形成。出于比较的目的，在DMSO媒介物而非GW2580存在下建立用于扩增及CFU-F测定的对照培养物。
分离人类BM源性MSC细胞
移除红血球
1.使用无菌组分或使分离缓冲液滤过0.2微米过滤器制备500mL分离缓冲液(PBS+2％FBS+2mM EDTA)。制成后，将分离缓冲液储存在2-8℃下。
2.BM样本中有核细胞的总数量的计数方法为，取10μL BM，并用3％亚甲蓝乙酸(STEMCELL目录#07060)将它稀释1/50-1/100。用血细胞计数器计数细胞。
3.在使用前将50mL分离缓冲液温至室温，持续20分钟，并用室温分离缓冲液稀释骨髓得到5/14最终稀释液(例如，用45mL分离缓冲液稀释25mL BM，得到70mL总体积)。
4.在三个50mL锥形管(BD目录#352070)中，用移液管将17mLFicoll-PaqueTMPLUS(目录#07907/07957)添加至各管中。小心地将来自步骤3的约23mL稀释的BM置于各管中Ficoll-PaqueTMPLUS的顶部。
5.在关闭制动器的台式离心机中，这些管在室温(15-25℃)下以300x g离心30分钟。
6.移除顶部血浆层，并弃去，但不要扰动血浆:Ficoll-PaqueTMPLUS界面。小心移除位于界面层的单核细胞，并置于新的50mL锥形管中。用40mL冷的(2-8℃)分离缓冲液重悬浮单核细胞，并通过移液管轻轻混合。
7.在开启制动器的台式离心机中，使细胞在室温下以300x g离心10分钟。移除上清液，并将细胞沉淀物重悬浮于1-2mL冷的分离缓冲液中。
8.细胞以1/50稀释于3％亚甲蓝乙酸中，并用血细胞计数器计数有核细胞的总数量。
9.将细胞稀释于人类-增殖完全培养基(STEMCELL目录#05411)，最终浓度为1x106个细胞/mL。
10.BM源性细胞准备在GW2580存在下进行扩增及CFU-F测定，然后可用于特定应用。
实施例3：制备CSF1R抑制剂原液
为证实CSF1R激酶抑制剂防止巨噬细胞在BM及CB源性MSC培养物中的分化、增殖及存活的有效性，选择GW2580。GW2580[5-(3-甲氧基-4-((4-甲氧基苄基)氧基)苄基)嘧啶-2,4-二胺]属于一类通过与ATP竞争结合至CSF1R激酶而特异性抑制CSF1R激酶活性的小分子(11)。已显示，GW2580在60nM下完全抑制人类CSF1R激酶，但保持对26种其它测试的激酶无活性。此外，使用KI20227{N-{4-[(6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基]-2-甲氧基苯基}-N0-[1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]脲}(另一种CSF1R激酶抑制剂)证实，防止巨噬细胞在BM及CB源性MSC培养物中的分化、增殖及存活并不限于GW2580，而是观察到这类CSF1R抑制剂分子所具有的活性。
GW2580(C20H22N4O3)得自LC实验室或BioVision，且它的分子量是366.41。制备浓缩1,000倍的原液的等份样品，并保持在-20C下，以备立即使用或如下进行稳定性测试：
10.0mM原液：将3.6641mg溶解于1mL DMSO中。
5.0mM原液：将500μL 10.0mM原液稀释于500μL DMSO中。
2.5mM原液：将500μL 5.0mM原液稀释于500μL DMSO中。
1.0mM原液：将200μL 5.0mM原液稀释于800μL DMSO中。
KI20227(C24H24N4O5S)得自Cedarlane，且它的分子量是480.54。KI20227是以1μM使用，且1,000倍原液是如下制备并储存在-20C下：
1.0mM原液：将4.8054mg溶解于1mL DMSO中，然后将100μL这种原液稀释于900μL DMSO中。
针对未经处理的培养物，以总体积的0.1％使用纯DMSO作为媒介物对照。
实施例4.测定BM及CB源性细胞
a.小鼠BM及CB源性CFU-F测定
1.使用如部分2)中所示收获的小鼠BM源性细胞，一式两份以2.5、5.0及10.0x105个细胞/cm2接种于6孔板的2ml含DMSO或1μMGW2580的MesenCultTM完全培养基(小鼠)(STEMCELL目录#05511)中。类似地，将如部分2)中所示收获的CB源性细胞一式两份以5.0、10.0及25.0x103个细胞/cm2接种于6孔板的2ml含DMSO或1μMGW2580的MesenCultTM完全培养基(小鼠)中。
2.在细胞培养箱中，培养物在正常(5％CO2)或缺氧条件(5％CO2/5％O2)及37C下孵育10-14天，直到形成集落。
3.移除培养基，用2mL PBS清洗培养物。
4.通过添加2mL甲醇/孔固定细胞，并在室温下孵育5分钟。
5.移除甲醇，并使得板风干5分钟。
6.向各孔添加2mL甲苯胺蓝溶液，并在室温下孵育30分钟。
7.移除甲苯胺蓝溶液，并用水冲洗孔。
8.移除水，并使板干燥。
9.通过计数及集落尺寸评估集落形成。
b.人类BM源性CFU-F测定
1.将如部分3)中所示收获的人类BM源性细胞一式两份以2.5、5.0及10.0x105个细胞/cm2接种于6孔板的2ml含DMSO或1μMGW2580的MesenCultTM完全培养基(人类)(STEMCELL目录#05411)中。
2.在增湿细胞培养箱中，培养物在5％CO2及37C下孵育10-14天，直到形成集落。
3.移除培养基，并用2mL PBS清洗培养物。
4.通过添加2mL甲醇/孔固定细胞，并在室温下孵育5分钟。
5.移除甲醇，并使得培养物风干5分钟。
6.向各孔添加2mL甲苯胺蓝溶液，并在室温下孵育30分钟。
7.移除甲苯胺蓝溶液，并用水冲洗孔。
8.移除水，并使得板干燥。
9.通过计数及集落尺寸评估集落形成。
c.人类BM以及小鼠BM及CB源性细胞扩增测定
1.小鼠BM及CB源性细胞以及人类BM源性细胞的扩增测定是如下进行：在含DMSO或1μM GW2580的MesenCultTM完全培养基(人类或小鼠培养基)中，就小鼠及人类BM源性细胞而言在P0时接种5x107个细胞/T75烧瓶，且就小鼠CB源性细胞而言在P0时接种2x106个细胞/T75烧瓶。
2.使得培养物生长10-14天，直到贴壁细胞达到70至80％汇合度。在细胞培养箱中，将小鼠培养物保持在正常(5％CO2)或缺氧条件(5％CO2/5％O2)及37C下。在增湿细胞培养箱中，将人类培养物保持在5％CO2及37C下。
3.通过从烧瓶释放培养物使贴壁细胞传代。用5mL PBS清洗培养物，然后添加5mL 0.25％胰蛋白酶溶液(STEMCELL目录#07901)，且烧瓶在37C下孵育10min。向各烧瓶添加5mL完全培养基，以停止胰蛋白酶活性。
4.将释放的细胞收集在试管中，并以300x g离心5分钟。
5.将细胞重悬浮于2mL培养基中，并用血细胞计数器计数。
6.通过将1.5至3.0x103个细胞/cm2接种在分别含有2或12mL含DMSO或1μM GW2580的完全培养基的6孔板或T75烧瓶中建立1代(P1)培养物。
7.培养P1培养物，直到它们达到70至80％汇合度。
8.根据需要，传代培养物可在从P0至P10的任何时间用于不同应用。
d.流式细胞术分析
1.用胰蛋白酶处理BM及CB源性细胞培养物10分钟，并向培养物添加等体积的完全培养基，以停止胰蛋白酶活性
2.使细胞悬浮液滤过40μm过滤器，并用血细胞计数器计数细胞
3.以300x g使悬浮液离心沉降5分钟。
4.移除上清液，并将细胞沉淀物重悬浮于FACS缓冲液(PBS加2％FBS及1mM EDTA)中
5.各流式细胞术分析管使用含于300μL FACS缓冲液的总共1x105个细胞，包括未经染色、活力、补偿及同种型对照。
6.用抗CD45、CD11b及Sca1、CD29及死活细胞鉴定染料(viability dye)的荧光团标记抗体给细胞悬浮液染色。
7.在流式细胞仪上分析细胞悬浮液，使用补偿及同种型对照确定激光电压及设门(gating)。
8.对样本中的活性CD45+细胞进行门控，并收集10,000个事件/样本。或者，对细胞中的活性CD45+细胞进行门控，并获得这个门外的CD29+/Sca1+细胞的比例。
实施例5.小鼠BM源性细胞的CFU-F测定显示，当将培养物暴露于1μM GW2580时，MSC集落的数量及尺寸增加，且巨噬细胞污染减少。
如先前所述分离小鼠BM源性细胞，并如上所述建立CFU-F测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中14天作为对照或维持在含1μM GW2580的培养基中14天。然后用甲苯胺蓝给培养物染色，并评估集落形成及外观。
在用1μM GW2580处理的培养物中，观察到当与对照培养物相比时，MSC集落的尺寸更大，且巨噬细胞的数量大大减少。在对照培养物中，巨噬细胞表现为生长在MSC集落顶部的小的深色且高度致密的细胞。在密度较低的培养物中，集落尺寸差异最为明显，其中单个集落具有清楚界限，且不会相互长在一起(图1，A)。此外，用1μM GW2580处理的培养物比对照培养物多至少20％集落(图1，B)。
这些结果表明，MSC支持巨噬细胞生长，进而干扰CFU-F形成。另一方面，用1μM GW2580处理这些培养物导致培养物中巨噬细胞数量减少，且MSC集落尺寸及数量增加。
实施例6.小鼠CB源性细胞的CFU-F测定显示，当将培养物暴露于1μM GW2580时，MSC集落的数量及尺寸增加，且巨噬细胞污染减少。
如先前所述分离小鼠CB源性细胞，并如上所述建立CFU-F测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中14天作为对照或维持在含1μM GW2580的培养基中14天。然后用甲苯胺蓝给培养物染色，并评估集落形成及外观。
在用1μM GW2580处理的培养物中，观察到当与对照培养物相比时，MSC集落的尺寸更大，且巨噬细胞的数量大大减少。在对照培养物中，巨噬细胞表现为生长在MSC集落顶部的小的深色且高度致密的细胞。在密度较低的培养物中，集落尺寸差异最为明显，其中单个集落具有清楚界限，且不会相互长在一起(图2，A)。此外，用1μM GW2580处理的培养物比对照培养物多至少24％集落(图2，B)。
这些结果表明，MSC支持巨噬细胞生长，进而干扰CFU-F形成。另一方面，用1μM GW2580处理这些培养物导致培养物中巨噬细胞数量减少，且MSC集落尺寸及数量增加。
实施例7.小鼠BM及CB源性细胞培养物扩增显示，当用1μMGW2580处理培养物时，巨噬细胞污染数量显著减少。
如上所述分离BM及CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中作为对照或维持在含1μM GW2580的培养基中。在P1时进行流式细胞术分析，并在P2时收集图像。
BM及CB源性细胞培养物的分析显示，对照培养物过度生长呈小的具有高折射性的细胞的巨噬细胞。然而，在用1μM GW2580处理的培养物中，观察到巨噬细胞数量大大减少，且存在的贴壁细胞呈现MSC的成纤维细胞形态特征(图3)。
如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活细胞进行门控，且分析显示，在对照BM源性培养物中，82％的细胞是CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞，而用1μM GW2580处理的BM源性培养物包含60％CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞。在CB源性培养物中，对照培养物中84％的细胞是CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞。在用1μM GW2580处理的CB源性培养物中，这个数量下降至34％。这些结果表明，在BM源性培养物中，在用1μM GW2580处理的培养物中成熟巨噬细胞减少20％，而在CB源性培养物中，成熟巨噬细胞的这种减少达到50％(图4)。
这些结果表明，向BM及CB源性细胞添加1μM GW2580使得这些培养物中的巨噬细胞数量大大减少，从而富集MSC群体。
实施例8.将小鼠BM源性培养物的扩增培养物连续暴露于1μMGW2580至少3代导致MSC群体的富集增加，同时大大减少污染巨噬细胞的分化。
如上所述分离BM源性培养物，并如上所述建立扩增测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中P0至P3代作为对照或维持在含1μM GW2580的培养基中P0至P3代。获取各代的图像，且这些图像显示，对照培养物在各代时都过度生长污染巨噬细胞。然而，用1μM GW2580处理的培养物的巨噬细胞数量减少，且培养物中大多数贴壁细胞呈现MSC典型的成纤维细胞形态特征(图5)。
如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，并在P2时的BM源性培养物的分析显示，在对照培养物中，92％的CD45+细胞也是CD11b+成熟巨噬细胞，且仅有8％的维持CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞表型。用1μM GW2580处理的培养物显示，56％的CD45+细胞也是CD11b+成熟巨噬细胞，且44％的细胞维持CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞表型。因此，这些结果表明，在用1μM GW2580处理的BM源性培养物中，同时为Sca1+的CD45+/CD11b增加36％。这表明，用1μM GW2580处理这些培养物防止巨噬细胞分化(CD45+/CD11b+/Sca1-)，同时使这些细胞维持为造血单核细胞CD45+/CD11b+/Sca1+(图6)。在P3时，用1μM GW2580处理这些培养物导致CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞分化减少>50％，且Sca1+细胞出现类似增加。这些结果表明，当与对照培养物相比时，用1μM GW2580处理BM源性培养物防止超过50％的CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞分化成CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞(图7)。
总之，这些结果证实，用1μM GW2580处理BM源性培养物防止CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞分化成CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞(图6及7)，进而得到富集的MSC培养物(图5)。
实施例9.将小鼠CB源性培养物的扩增培养物连续暴露于1μMGW2580至少3代导致MSC群体的富集增加，同时大大减少污染巨噬细胞的分化。
如上所述分离CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中P0至P3代作为对照或维持在含1μM GW2580的培养基中P0至P3代。获取各代的图像，且这些图像显示，对照培养物在各代时都过度生长污染巨噬细胞。然而，用1μM GW2580处理的培养物的巨噬细胞数量减少，且培养物中大多数贴壁细胞呈现MSC典型的成纤维细胞形态特征(图8)。
如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，并在P2时的CB源性培养物的分析显示，在对照培养物中，94％的CD45+细胞也是CD11b+成熟巨噬细胞，且仅有6％的细胞维持CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞表型。用1μM GW2580处理的培养物显示，62％的CD45+细胞也是CD11b+成熟巨噬细胞，且28％的细胞维持CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞表型。因此，这些结果表明，在用1μM GW2580处理的CB源性培养物中，同时为Sca1+的CD45+/CD11b+增加22％。这表明，用1μM GW2580处理这些培养物可防止巨噬细胞分化成CD45+/CD11b+/Sca1-(图9)。在P3时，用1μMGW2580处理这些培养物导致CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞分化减少12％，且Sca1+细胞增加8％。这些结果表明，当与对照培养物相比时，用1μM GW2580处理CB源性培养物防止小部分CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞分化成CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞(图10)。
总之，这些结果证实，用1μM GW2580处理CB源性培养物防止CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞分化成CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞(图9及10)，进而得到富集的MSC培养物(图8)。
实施例10.在CB源性培养物而非BM源性培养物中，将小鼠BM及CB源性细胞扩增培养物暴露于范围自1至10μM渐增浓度的GW2580导致防止培养物中巨噬细胞分化以浓度-依赖性方式渐增，且MSC的富集以浓度-依赖性方式渐增。
如上所述分离BM及CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。将测定物维持在含0.1％v/v DMSO的培养基中作为对照或者用1、5或10μM GW2580处理。培养物的图像显示，对照培养物过度生长污染巨噬细胞，而用1、5或10μM GW2580处理的培养物的污染巨噬细胞数量减少。此外，当与对照培养物相比时，BM及CB源性培养物中的大多数贴壁细胞呈现MSC典型的健康成纤维细胞形态特征(图11)。
如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，活性CD45+细胞从对照培养物中的52％分别减少至用1、5及10μM GW2580处理的培养物中的45％、33％及28％。另外，在对照培养物中，92％的CD45+细胞也是CD11b+成熟巨噬细胞，且仅有8％维持CD45+/CD11b+/Sca1+单核细胞表型。意外地，CD45+/CD11b+/Sca1+的数量也以剂量-反应方式分别在用1、5及10μM GW2580处理的培养物中从55％减少至40％及至34％。
CB源性培养物的流式细胞术分析显示，在对照培养物中，93％的CD45+细胞是CD11b+成熟巨噬细胞，且仅有7％维持CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞表型。用1、5或10μM GW2580处理的培养物的CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞分别显示从75％至60％及至50％的剂量-反应减少。这种巨噬细胞分化的减少转化为CD45+/CD11b+/Sca1+造血单核细胞以剂量-反应方式分别从18％增加至32％及至41％。因此，这些结果表明，在用一系列GW2580浓度处理的CB源性培养物中，同时为Sca1+的CD45+/CD11b+细胞增加26至47％。这表明，用渐增浓度1、5及10μM的GW2580处理这些培养物可防止巨噬细胞以剂量-依赖性方式分化(CD45+/CD11b+/Sca1-)(图13)。
实施例11.用1μM GW2580连续处理CB源性细胞扩增培养物是防止巨噬细胞分化及增殖所必需。
如上所述分离CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。在P0至P1代期间将测定物维持在含1μM GW2580的培养基中，然后在P2至P3期间维持在含0.1％v/v DMSO的对照培养基中。在P3结束时，收集贴壁及非贴壁细胞，并如上所示进行流式细胞术分析。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，并对贴壁及非贴壁细胞的分析显示，97％的贴壁细胞及99％的非贴壁细胞是CD45+/CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞。这些结果表明，连续暴露于1μM GW2580是防止培养物中巨噬细胞分化所必需(比较图14和图10中的对照处理)。
实施例12.在P3至P4期间用1μM GW2580处理CB源性培养物在减少培养物中CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞的数量同时维持MSC方面与利用EasySep分离来自小鼠密质骨的间充质祖细胞(STEMCELL目录#19771)来富集这些培养物一样有效。
如上所述分离CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。培养物在P0至P2代期间维持在含0.1％v/v DMSO的对照培养基中，然后在P3至P4期间维持在含1μM GW2580的培养基中。出于比较的目的，按照制造商说明，利用EasySep分离来自小鼠密质骨的间充质祖细胞(STEMCELL目录#19771)，P4对照培养物富集间充质祖细胞。收集细胞，并如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活性CD45+细胞进行门控，在经GW2580处理且经EasySep富集的样本中，活性CD45+细胞占全部细胞的<0.2％。在这些CD45+细胞中，两种样本中都仅有约25％的细胞是CD11b+/Sca1-成熟巨噬细胞。此外，两种样本中都有约75％的CD45+细胞是CD11+/Sca1+造血单核细胞(图15)。
这些结果表明，用1μM GW2580处理CB源性培养物与使用EasySep富集***在减少培养物的CD45+/CD11b/Sca1-成熟巨噬细胞方面一样有效。
实施例13.用1μM KI20227处理BM及CB源性培养物与用1μM GW2580处理在减少培养物中CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞数量方面一样有效。
如上所述分离BM及CB源性培养物，并如上所述建立扩增测定。培养物在含1μM KI20227的培养物中或在含1μM GW2580的培养物中维持最多至P2。收集细胞，并如上文所示进行流式细胞术分析。对样本中的活细胞进行门控，且分析显示，在经GW2580处理的培养物中，这些细胞中<1％是CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞。在经KI20227处理的培养物中，<2％是CD45+/CD11b+成熟巨噬细胞(图16)。
不受理论的束缚，这些结果表明，抑制巨噬细胞在BM及CB源性培养物中的增殖及分化并不限于GW2580，而是观察到这类CSF1R受体抑制剂所具有的活性。
实施例14.用1μM GW2580处理人类BM源性MSC培养物并不妨碍这些细胞的分化潜力。
如上所述分离BM源性培养物，并如上所述建立扩增测定。将这些P2扩增培养物维持在含0.1％v/v DMSO的对照培养基中或维持在含1μM GW2580的培养基中。在P2结束时，通过胰蛋白酶消化使这些细胞解离，并以3x104个细胞/cm2重涂铺于12孔板中进行分化测定。使分化培养物维持在脂肪形成或成骨分化培养基中3周。在3周时间结束时，固定培养物，并用油红O染色，以评估脂肪形成分化，或用硝酸银染色，以评估成骨分化。在1μM GW2580存在下扩增的培养物与在对照培养基中扩增的培养物的脂肪形成及成骨分化水平类似(图17)。
这些结果证实，将BM源性MSC培养物暴露于1μM GW2580不会妨碍其分化能力。
实施例15.暴露于GW258014天的BM-及CB-MSC的CFU-F测定显示培养物中MSC集落的数量增加。
如实施例4a及4b中一样建立BM-及CB-MSC两者的三种独立测定物CFU-F测定。在测定1中，将培养物暴露于1uM GW2580或媒介物对照。在测定2及3中，将培养物暴露于2.5uM GW2580或媒介物对照。使这些测定物维持14天不改变培养基。在第14天结束时，固定培养物，并用甲苯胺蓝染色，并计算MSC集落的数量。在这些分析中，当与对照培养物相比时，将BM-或CB-MSC的原始培养物暴露于1或2.5uM GW258014天导致CFU-F测定中观察到的MSC集落数量总体上最少增加20％(表1)，这表明，GW2580不仅通过减少造血细胞数量来富集MSC，而且增强MSC自我更新。
实施例16.当在P0期间暴露于2.5uM GW258014天时，BM-及CB-MSC培养物的CD45-细胞显著富集，同时CD29+/Sca1+细胞增加。
除通过减少暴露于2.5uM GW2580的MSC培养物中观察到的CD45+群体富集CD45-细胞群体以外，还联合流式细胞术进行总细胞计数分析，以调查培养物中MSC的实际数量。在流式细胞术之前，通过胰蛋白酶消化使对照及经GW2580处理的BM-及CB-MSC培养物从组织培养瓶分离，并借助血细胞计数器计数细胞总数量。进行流式细胞术分析，并将CD45-细胞和CD45-/CD29+/Sca1+细胞的比率应用至细胞总数量，以得到培养物中这些细胞的实际数量(表2)。这个分析显示，在BM-MSC培养物中，CD45-细胞数量从对照培养物中的632,800边际增加至暴露于GW2580的培养物中的665,331(括号中记为从对照培养物的倍数诱导)。然而，CD45-/CD29+/Sca1+部分从对照培养物中的473,841个细胞增加至经GW2580处理的培养物中的639,450个细胞，暴露于GW2580的培养基中BM-MSC实际增加0.25倍。在CB-MSC培养基中，观察到从对照培养物中的206,400个细胞显著增加至暴露于GW2580的培养物中的530,702个细胞，导致CD45-细胞的实际数量增加2.57倍。类似地，在这个培养***中，当将CB-MSC暴露于GW2580时，CD45-/CD29+/Sca1+MSC增加2.46倍。总之，这些结果表明，GW2580通过移除非所需造血CD45+细胞富集培养物中的MSC，同时大幅增加CD45-/CD29+/Sca1+MSC扩增。
实施例17.在扩增期间将BM-及CB-MSC培养物暴露于 GW2580促进这些细胞的下游分化，且比暴露于媒介物对照的培养物 需要更少细胞
在MSC培养、扩增或维持过程中，有必要维持这些细胞的功能性质，以便可将它们用于特定下游应用，包括通过分化进行表征。为证实将BM-及CB-MSC培养物暴露于GW2580不会影响它们的分化能力，将BM-及CB-MSC培养物维持在对照培养基或含GW2580的培养基中2代，然后以不同密度涂铺，以分化成成骨及脂肪形成谱系(图18)。以3种不同密度(图18A)将起初暴露于含媒介物或GW2580的培养基中的BM-MSC涂铺于MesenCult增殖培养基中，并使得贴壁至板过夜。然后使培养物在MesenCult成骨培养基中分化14天，并且每3天更换培养基。然后固定成骨培养物，并针对碱性磷酸酶(ALP)活性(红色区域)及矿化作用(黑色区域)染色。在对照培养物(图8A)中，只有在培养物是以最高密度1.2x105个细胞/cm2接种时才观察到适度分化成成骨谱系。然而，在暴露于1uM GW2580的培养物中，在以低密度4.0x104个细胞/cm2接种时观察到培养物中成骨分化显著稳健增加，这是由红色区域(APL活性)及矿化的骨基质染色(黑色区域)证实。在类似测定中，BM-及CB-MSC都在2.5uM GW2580存在下扩增2代，然后以4.0x104个细胞/cm2涂铺。然后培养物分化14天，分化成脂肪形成及成骨谱系(图18B)。这些培养物中观察到大量脂肪形成及成骨分化，这分别是由油红O及ALP/矿化染色证实。总之，这些数据表明，将BM-及CB-MSC培养物暴露于GW2580促进它们强烈分化成不同谱系的能力，有可能是因为当与对照培养物相比时，在暴露于GW2580的培养物中观察到MSC富集及增殖增强。
表1
表2
参考文献
1.Yu W.，Chen J.，Xiong Y.，Pixley F.J.，Yeung Y.G.，Stanley E.R.Macrophage proliferation is regulated through CSF-1receptor tyrosines544，559，and 807.J Biol Chem.2012；287(17)：13694-704.
2.Tagliani E.，Shi C.，Nancy P.，Tay C.S.，Pamer E.G.，Erlebacher A.Coordinate regulation of tissue macrophage and dendritic cell populationdynamics by CSF-1.J Exp Med.2011；208(9)：1901-16.
3.Conway JG，McDonald B，Parham J，Keith B，Rusnak DW，Shaw E，Jansen M，Lin P，Payne A，Crosby RM，Johnson JH，Frick L，Lin MH，Depee S，Tadepalli S，Votta B，James I，Fuller K，Chambers TJ，Kull FC，Chamberlain SD，Hutchins JT.Inhibition of colony-stimulating-factor-1signaling in vivo with the orally bioavailable cFMS kinase inhibitorGW2580.Proc Natl Acad Sci U S A.2005；102(44)：16078-83.
4.Pixley FJ，Stanley ER.CSF-1regulation of the wandering macrophage：complexity in action.Trends Cell Biol.2004；14(11)：628-38.
5.Dewar AL，Cambareri AC，Zannettino AC，Miller BL，Doherty KV，HughesTP，Lyons AB.Macrophage colony-stimulating factor receptor c-fms is anovel target of imatinib.Blood.2005；105(8)：3127-32.
6，Bourette RP，Rohrschneider LR.Early events in M-CSF receptor signaling.Growth Factors.2000；17(3)：155-66.
7.Kaplan RN，Psaila B，Lyden D.Niche-to-niche migration of bone-marrow-derived cells.Trends Mol Med.2007；13(2)：72-81.
8.Yin T，Li L.The stem cell niches in bone.J Clin Invest.2006；116(5)：1195-201.
9.Lo Celso C，Scadden DT.The haematopoietic stem cell niche at a glance.J Cell Sci.2011；124(Pt 21)：3529-35.
10.Wilson A，Trumpp A.Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches.NatRev Immunol.2006；6(2)：93-106.
11.Hume DA，Pavli P，Donahue RE，Fidler IJ.The effect of humanrecombinant macrophage colony-stimulating factor(CSF-1)on the murinemononuclear phagocyte system in vivo.J Immunol.1988；141(10)：3405-9.
12.Wiktor-Jedrzejczak W，Bartocci A，Ferrante AW Jr，Ahmed-Ansari A，SellKW，Pollard JW，Stanley ER.Total absence of colony-stimulating factor 1in the macrophage-deficient osteopetrotic(op/op)mouse.Proc Natl AcadSci U S A.1990；87(12)：4828-32.
13.Dai XM，Ryan GR，Hapel AJ，Dominguez MG，Russell RG，Kapp S，Sylvestre V，Stanley ER.Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis，mononuclearphagocyte deficiency，increased primitive progenitor cell frequencies，andreproductive defects.Blood.2002；99(1)：111-20.
14.Shewchuk，L.M.，Hassell，A.M.，Holmes，W.D.，Veal，J.M.，Emmerson，H.K.，Musso，D.L.，Chamberlain，S.D.&Peckham，G.E.2004；U.S.Pat.Appl.Publ.79 pp.US 2004002145.

Claims (31)

1.一种培养间充质细胞谱系细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
a)从得自受试者的组织样本收获细胞，其中所收获的细胞包含所述间充质细胞谱系细胞，及
b)使所收获的细胞与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括c)得到富集所述间充质细胞谱系细胞的细胞群体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述收获的细胞还包含非间充质细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述非间充质细胞包括巨噬细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法是在体外进行。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞谱系细胞包含间充质干细胞、间充质细胞祖细胞及基质源性细胞中的至少一种。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述组织样本包括骨髓、密质骨或脂肪组织。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述培养基接触至少一小时、至少一天或至少一周。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在使所述细胞与所述培养基接触之前，所述间充质细胞谱系细胞的浓度为至少10个细胞/cm2。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞谱系细胞保留其形成脂肪形成、软骨形成及成骨细胞谱系的能力。
13.一种培养来自骨髓和/或密质骨的细胞以使细胞培养物富集间充质细胞谱系细胞的方法，所述方法包括使所述细胞培养物与含CSF1R激酶抑制剂的培养基接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述来自骨髓和/或密质骨的细胞包含所述间充质细胞谱系细胞及非间充质细胞。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述方法是在体外进行。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞谱系细胞包含间充质干细胞、间充质细胞祖细胞及基质源性细胞中的至少一种。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述培养基接触至少一小时、至少一天或至少一周。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞谱系细胞保留其形成脂肪形成、软骨形成及成骨细胞谱系的能力。
20.一种细胞培养基，其包含CSF1R激酶抑制剂。
21.根据权利要求20所述的细胞培养基，其中所述CSF1R激酶抑制剂是一种通过与ATP竞争结合至CSF1R激酶而抑制CSF1R激酶活性的小分子。
22.根据权利要求20或21所述的细胞培养基，其中所述CSF1R激酶抑制剂为GW2580、KI20227、HY-13075、cFMS受体抑制剂II、cFMS受体抑制剂III、cFMS受体抑制剂IV或ARRY-382。
23.根据权利要求20所述的细胞培养基，其中所述培养基包含1-10uM GW2580。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基还包含至少一种生长因子。
25.根据权利要求24所述的细胞培养基，其中所述至少一种生长因子选自由FGF、EGF及IGF组成的列表。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基包括基础培养基。
27.根据权利要求26所述的细胞培养基，其中所述基础培养基选自达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、高级DMEM、BiogroTM、SkGMTM、Ham’s F10、Ham’s F12、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基、neurobasal培养基、RPMI 1640及MCDB120培养基。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基还包含补充剂。
29.根据权利要求28所述的细胞培养基，其中所述补充剂选自：
·胰岛素、转铁蛋白及***盐(ITS)；
·B27；
·***、胰岛素、EGF、胎球蛋白及白蛋白；及
·***、bFGF、白蛋白及胰岛素。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基还包含脂质。
31.根据权利要求30所述的细胞培养基，其中所述脂质是花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸中的至少一种。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111868231A (zh) * 2017-12-01 2020-10-30 斯特姆里姆有限公司 外胚层间充质干细胞及其产生方法
CN113215085A (zh) * 2021-05-07 2021-08-06 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用
CN113215085B (zh) * 2021-05-07 2024-05-10 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201705941UA (en) * 2015-02-25 2017-08-30 Agency Science Tech & Res Methods and compositions for expansion and differentiation of skeletal muscle stem cells or progenitor cells
WO2017146468A1 (ko) * 2016-02-23 2017-08-31 경희대학교 산학협력단 줄기세포의 효능 개선을 위한 조성물 및 방법
WO2017176804A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Massachusetts Institute Of Technology Compositions of crystallized hydrophobic compounds and methods of making and using same
EP3534940A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
CN111201438A (zh) 2017-06-02 2020-05-26 朱诺治疗学股份有限公司 与和细胞疗法相关的毒性有关的制品和方法
AU2018275894A1 (en) 2017-06-02 2019-12-12 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
CA3067602A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 Juno Therapeutics, Inc. Mouse model for assessing toxicities associated with immunotherapies
EP3676403A1 (en) 2017-09-01 2020-07-08 Juno Therapeutics, Inc. Gene expression and assessment of risk of developing toxicity following cell therapy
US11564946B2 (en) 2017-11-01 2023-01-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS FOR TARGETING CCR2 AND CSF1R AND THEIR USES
JP2022513685A (ja) 2018-11-30 2022-02-09 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 養子細胞療法を用いた処置のための方法
WO2020113188A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment of b cell malignancies in adoptive cell therapy
KR20220132527A (ko) 2019-12-06 2022-09-30 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｂ 세포 악성 종양을 치료하기 위한 세포 요법과 연관된 독성 및 반응과 관련된 방법
CN114058585A (zh) * 2021-12-03 2022-02-18 无锡市第二人民医院 一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FELIX I.L. CLANCHY，ET AL: "HUVEC co-culture and haematopoietic growth factors modulate human proliferative monocyte activity", 《CYTOKINE》 *
KATIA MARESCHI,ET AL: "Multipotent Mesenchymal Stromal Stem Cell Expansion by Plating Whole Bone Marrow at a Low Cellular Density: A More Advantageous Method for Clinical Use", 《STEM CELLS INTER NATIONAL》 *
吴燕峰: "《实用医学细胞培养技术[M]》", 31 January 2010 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111868231A (zh) * 2017-12-01 2020-10-30 斯特姆里姆有限公司 外胚层间充质干细胞及其产生方法
CN113215085A (zh) * 2021-05-07 2021-08-06 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用
CN113215085B (zh) * 2021-05-07 2024-05-10 澳门大学 一种脂类物质添加剂及其应用

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