CN105021817A - 一种人体液的显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无热源水、标准品及质控品，反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质，其中多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽，通过采用凝固酶酶切此种多肽显色基质，产生游离的对硝基苯胺(PNA)后，用酶标仪直接进行检测，缩短了检测路线，降低了成本，由于酶标仪进行速率法酶动力学检测法，相对浊度法检测法，灵敏度更高，而且反应主剂不易受到体液标本中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度，使本发明的检测结果假阳性的概率降低，检测准确度更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。
技术背景
近年来，原发性和继发性侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的患病率持续上升。IFI作为院内感染在恶性肿瘤患者、接受化疗的血液病患者、AIDS患者、器官移植患者和接受抑制免疫力治疗的患者中十分常见，致使越来越多的患者产生严重的并发症甚至死亡。许多真菌疾病是由于吸入污染物、植物碎屑、空气中或暴露表面的真菌孢子引起，另有一些常见真菌存在于人类皮肤、肠道和粘膜中也可作为致病菌造成感染。目前侵袭性真菌感染和真菌血症的诊断通常采用非特异性诊断或者放射学技术，阳性率低，检测周期长，不能及时的为临床提供诊断依据。
1，3-β-D葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，而原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖，当真菌进入人体血液或深部组织后，经中性粒细胞及吞噬细胞的处理，1，3-β-D-葡聚糖可从真菌细胞壁释放出来进入血液及其他体液中，在浅部真菌感染中，1，3-β-D-葡聚糖未被释放出来，故在体液中的量不增高。因此，1，3-β-D-葡聚糖在血液及无菌体液中的含量成为侵袭性真菌感染诊断标准。
通常人原发性真菌病原体有念珠菌属和曲霉菌属，继发性真菌病原体包括梭霉菌属、梭霉菌属、酿酒酵母、支顶孢属、粗球孢子菌、夹膜组织胞浆菌、卡氏肺孢子菌等。1，3-β-D-葡聚糖都存在于这些真菌的细胞壁中，因此，通过检测人体液中1，3-β-D-葡聚糖含量即可有效的筛查侵袭性真菌感染。目前中、美、日三国基于鲎的血凝集反应原理，利用鲎的血细胞裂解物，通过一系列酶反应来实现1，3-β-D-葡聚糖检测。
鲎血液包含两类细胞，其中一类为颗粒细胞(granμLar hemocyte或granμLocyte)或称之为变形细胞(amebactye)，成年鲎只含有这类细胞。鲎血液凝集与哺乳动物的血液凝集相似，是一系列级联酶反应。1981年，Morta从鲎血变形细胞中分离出一种酶，成为G因子，同年日本学者kakinuma等证明霉菌细胞壁中普遍存在CMPS，它可活化G因子，活化G因子又可使凝固酶产生凝集反应，从而证明了鲎试剂凝集反应的一条途径，即在G因子和凝固酶原的存在下，可与CMPS类物质产生凝集作用，可用于临床1，3-β-D-葡聚糖检测。
公布日为2012年1月4日，公布号为102305787的中国发明专利申请《真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法》公开了一种通过利用(1-3)-β-D葡聚糖来激活鲎血G因子，进一步水解显色基质后，通过分光光度计进行吸光度检测来达到检测(1-3)-β-D葡聚糖的目的。该方法的问题在于所需配置显色试剂较多，操作繁琐，且中间过程中容易有外界 细菌污染介入，影响检测结果。
公告日为2013年1月9日，公布号为102866255的中国发明专利申请《一种人体液真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法》公开了一种通过利用传统的鲎试剂制备方法制备，浊度法检测真菌(1，3)-β-D葡聚糖的试剂盒。此真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒所依据的浊度法检测灵敏度较低，另外反应主剂易受到体液标本中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度，从而使检测结果假阳性升高，检测准确度较低。
专利201010221407.9提供了一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法，所述试剂盒组成包括：(1)G试剂：为鲎血球细胞溶解物与发色物质的混合物；(2)缓冲液：0.02～0.1mol/L Tris-HCl；(3)标准品：(1-3)-β-D-葡聚糖；(4)重氮化试剂；(5)血液处理液。通过对样品、标准品进行处理，配制G试剂溶液，分装、加温、终止，然后测定吸光值，作出标准曲线，计算样品中的(1-3)-β-D-葡聚糖含量。该试剂盒能快速、准确地定量人体血液及体液标本中的微量(1-3)-β-D-葡聚糖，此专利中发色物质为Boc-LGR-pNA，使用重氮化试剂将反应终止后，终点法检测吸光度，此设计检测步骤线路长，引入干扰物的几率大，使得检测时间延长，灵敏度较差。
发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种操作简单、设计合理、检测快速、准确度高的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：
一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：
反应主剂；
主剂复溶液：0.01-1mol/mL Tris-HCl缓冲液和0.01-0.3mol/mLMg2+；
样本处理液：o.5M-2mol/mL KCl和0.05M-0.5mol/mL KOH；
无热源水；
标准品；
质控品；
所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质。
所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：
1)采血与分离细胞：将活体鲎清洗，使用酒精或碘酒将心门消毒，使用无热原不锈钢针采血，600-1500rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；
2)裂解：向步骤1)收集的鲎血细胞中加入加入裂解液重悬细胞，加入裂解液和鲎血细胞的体积比1∶2-9∶10，-20℃冷冻12小时以上，然后解冻，解冻后即得鲎血细胞溶解物；
3)提取分离：向步骤2)制得的鲎血细胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿与鲎血细胞溶解物的体积比1∶0.5-1∶1，搅拌混合5-20分钟，4℃，6000-8000rpm下离心20-30分钟，取上清液；
4)制剂：向步骤3)制得的上清液中加入B、C因子抑制剂和多肽显色基质，使每毫升上清液中B、C因子抑制剂含量为0.5-3mg，多肽显色基质0.5-2mg，冰浴搅拌3-5min；所述B、C因子抑制剂为对B、C因子特异性相对较高的丝氨酸蛋白抑制剂，所述多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽；
5)真空冷冻干燥：将步骤4)得到的液体分装至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷冻干燥，得到反应主剂。
所述多肽显色基质为Boc-Leu-Gly-Arg-PNA或Boc-Ile-Gly-Arg-PNA。
所述样本处理液的制备方法，采用无热源水配制0.05mol-0.5mol/mL KOH和0.5mol-2mol/mL KCl，使用时将已配制的两种溶液等体积混合即为样本处理液。
所述主剂复溶液的制备方法，按处方用显分别称取Tris-HCl和MgCl2，置投料容器内，添加无热源水至配制量，使得每毫升溶液含Tris-HCl0.01-1mol和MgCl20.01-0.3mol，混合均匀后，用稀盐酸调pH，过滤分装。
所述主剂复溶液的pH值在6.0-8.0之间。
所述无热源水为无菌无热原水。
所述标准品的制备方法为1，3-β-D-葡聚糖标准品与1-8％(重量比)的赋形剂混合，40℃～55℃冷冻5h，真空冻干，制得。
所述质控品的制备方法，1，3-β-D-葡聚糖标准品与为10％(重量比)的小牛血清及1-8％(重量比)的赋形剂混合，零下40℃～55℃冻干，封口即得成品。
一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的检测方法，鲎血细胞中G因子被待检测样本中1，3-β-D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的对硝基苯胺(PNA)，PNA在405nm波长具有明显吸收峰并且在一定时间内其生成速率及含量与1，3-β-D-葡聚糖含量线性相关，所以通过检测一定时间内405nm吸光度的变化率对样本中1，3-β-D-葡聚糖进行定量检测(速率法)，具体实施步骤包括：标准曲线制作、样本处理、检测。
本发明具有的优点和有益效果为：由于鲎血细胞中G因子能够被1，3-β-D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶能够特异性的酶切多肽显色基质产生游离的对硝基苯胺(PNA)，PNA在405nm波长具有明显吸收峰，并且在一定时间内其生成速率及含量与1，3-β-D-葡聚糖含量线性相关，所以能够通过检测一定时间内405nm 吸光度的变化率对样本中1，3-β-D-葡聚糖进行定量检测(速率法)，这种通过采用凝固酶酶切多肽显色基质(Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽)，产生游离的对硝基苯胺(PNA)后，再用酶标仪直接进行检测，缩短了检测路线，降低了成本，减低了多步反应容易引入干扰物的可能性；而且由于酶标仪进行速率法酶动力学检测，相对浊度法检测，灵敏度更高，使反应主剂不易受到体液标本中蛋白及药物的干扰，产生非特异性浊度，从而使检测结果假阳性的概率降低，检测准确度更高；再有整个过程中使用的显色试剂用量少，节约成本，更具市场竞争力。
附图说明
图1为试剂盒1，3-β-D-葡聚糖标准曲线；
图2为标准曲线各浓度点OD405nm变化曲线图。
其中曲线A为浓度为500pg/mL葡聚糖OD405nm变化曲线；曲线B为浓度为250pg/mL葡聚糖OD405nm变化曲线；曲线℃为浓度为125pg/mL葡聚糖OD405nm变化曲线；曲线D为浓度为62.5pg/mL葡聚糖OD405nm变化曲线；曲线E为浓度为31.25pg/mL葡聚糖OD405nm变化曲线；曲线F为阴性对照OD405nm变化曲线。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：
以下结合附图以检测血液1，3-β-D-葡聚糖检测应用为例对本发明做进一步说明。
1、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的构成包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无热源水、标准品及质控品。
显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的生产制造：
1.2、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的反应主剂的制备工艺，主要是通过对鲎血细胞溶解物的提取制备，具体包括以下步骤：
1)采血与分离细胞：将活体鲎清洗，使用酒精或碘酒将心门消毒，使用无热原不锈钢针采血，600-1500rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞。
2)裂解细胞：向步骤去1)收集的鲎血细胞中加入裂解液重悬细胞，加入裂解液和鲎血细胞的体积比1∶2-9∶10，-20℃冷冻12-18小时，解冻，解冻后即得鲎血细胞溶解物；
3)提取分离：向步骤2)制得的鲎血细胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿与鲎血细胞溶解物的体积比1∶0.5-1∶1，搅拌混合5-20分钟，4℃，6000-8000rpm离心20-30分钟，取上清液；制得反应主剂G因子、凝固酶、凝固酶原活性成分。
4)制剂：向步骤3)制得的上清液中加入B、C因子抑制剂-丝氨酸蛋白抑制剂和多肽显 色基质Boc-Ile-Gly-Arg-PNA，使每毫升溶液中丝氨酸蛋白抑制剂的含量为0.5-3mg，多肽显色基质的含量为0.5-2mg；
5)真空冷冻干燥：分装至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷冻干燥，制得反应主剂成品。
1.3、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的主剂复溶液的制备方法：按处方用量分别称取Tris-HCl和MgCl2，置投料容器内，添加无热源水至配制量，使得每毫升溶液含Tris base-HCl0.01-1mol和MgCl20.01-0.3mol，混合均匀后，用稀盐酸调节PH值为6-8，再通过0.1um滤膜，过滤分装。
1.4、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的样本处理液的制备方法：按处方用量分别称取KOH、KCl化学试剂，采用无热源水配制0.05mol-0.5mol/mL KOH和0.5mol-2mol/mL KCl，使用时将已配制的两种溶液等体积混合即为样本处理液。
1.5、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的质控品的制备方法：用1，3-β-D-葡聚糖国家标准品稀释到需要的浓度，加入一定的牛血清保护剂和赋形剂混合均匀，使小牛血清重量含量为10％及赋形剂的重量含量为1-8％，然后分装，零下40℃～55℃冻干，封口即得成品，每支质控品按标示量稀释使用。
1.6、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的标准品制备方法为：1，3-β-D-葡聚糖标准品与1-8％的赋形剂(重量比)混合，40℃～55℃冷冻5h，真空冻干。
1.7、无热源水：为注射用水的重蒸馏水，分装12mL/支，封口、灭菌后，检测不得有细菌内毒素或1，3-β-D-葡聚糖，合格，用作质控品或1，3-β-D-葡聚糖标准品的复溶剂。
2、显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的应用实现步骤包括标准曲线制作、血清1，3-β-D-葡聚糖的提取纯化、样本阳性液的制备、上机检测，以血液1，3-β-D-葡聚糖检测应用为例，其具体步骤如下：
2.1、标准曲线的制作：
1)标准溶液的准备
取1，3-β-D-葡聚糖标准品1支，用75％酒精消毒后，开启，取出标准品加入无热源水溶解，配制成100pg/mL，置漩涡混合器混合5min，然后将葡聚糖标准品用无热源水梯度稀释到50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL，无热源水水为阴性对照。
2)加样
取出1支反应主剂，用75％酒精消毒后，开启，加入3mL主剂复溶液复溶主剂，振荡溶解。取出无热原微孔板每孔加入25μL标准溶液，阴性对照孔加入25μL无热源水，同时加入100μL复溶后反应主剂。
3)检测并绘制标准曲线
加样完毕，将无热原微孔板放入酶标仪中振荡混匀，进行动力学检测，反应时间为40min，并按仪器要求输入相关信息，将所测得的反应浓度值(x)与反应速率(y)进行线性回归分析(表1)，计算标准曲线的线性系数(r)：
表1：标准品测试数据
根据上述数据拟合标准曲线：y＝0.0634x+1.6513，r＝0.9975，符合实验标准要求，标准曲线制作有效(图1)。
2.2、检测样本的制备
1)血液阳性样本的制备
将1，3-β-D-葡聚糖标准品用血清样本稀释成100pg/mL，备用。
2)质控样本的制备
加入1mL无热源水复溶质控样本，备用。
3)样本的前处理
在微孔板中依次加入血液阳性样本、血清样本和质控样本，三种样本均为每孔加入5μL，之后加入20μL样本处理液振荡混匀10s，37℃温浴10min。
4)加样
取反应主剂1支，用75％酒精消毒后，开启，加入3mL主剂复溶液复溶主剂，振荡溶解，在每孔中加入100μL反应主剂，同时参照1进行标准曲线制作。
5)上机检测及结果判断分析
加样完毕，将无热原微孔板放入酶标仪中振荡混匀，进行动力学检测，反应时间为40min，并按仪器要求输入相关信息(样品稀释倍数设定为5倍，其它设定为1倍)，将标准曲线所测得的反应浓度值(x)与反应速率(y)进行线性回归分析，计算标准曲线的线性系数(r)：和样本浓度，将数据进行分析，计算回收率：
回收率在50％～200％范围内时，供试品检测结果有效。
6)实验结果分析
实验结果标准曲线(图2)计算样本浓度值见表2：
表2样本测试数据
可见，回收率为116.45％，在50％～200％范围内，且阴性对照检测值不大于标准曲线的最低值，同时质控样本浓度值分别为98.64pg/mL和101.16pg/mL，在指控范围90-110pg/mL之间，本次试验检测结果有效。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：
反应主剂；
主剂复溶液：0.01-1mol/mL Tris-HCl缓冲液和0.01-0.3mol/mL Mg2+：
样本处理液：0.5M-2mol/mL KCl和0.05M-0.5mol/mL KOH；
无热源水；
标准品；
质控品；
所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质。
2.如权利要求1所述一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：
1)采血与分离细胞：将活体鲎清洗，使用酒精或碘酒将心门消毒，使用无热原不锈钢针采血，600-1500rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；
2)裂解：向步骤1)收集的鲎血细胞中加入加入裂解液重悬细胞，加入裂解液和鲎血细胞的体积比1∶2-9∶10，-20℃冷冻12小时以上，然后解冻，解冻后即得鲎血细胞溶解物；
3)提取分离：向步骤2)制得的鲎血细胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿与鲎血细胞溶解物的体积比1∶0.5-1∶1，搅拌混合5-20分钟，4℃，6000-8000rpm下离心20-30分钟，取上清液；
4)制剂：向步骤3)制得的上清液中加入B、C因子抑制剂和多肽显色基质，使每毫升上清液中B、C因子抑制剂含量为0.5-3mg，多肽显色基质0.5-2mg，冰浴搅拌3-5min；所述B、C因子抑制剂为对B、C因子特异性相对较高的丝氨酸蛋白抑制剂，所述多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽；
5)真空冷冻干燥：将步骤4)得到的液体分装至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷冻干燥，得到反应主剂。
3.如权利要求1-2任一所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述多肽显色基质为Boc-Leu-Gly-Arg-PNA或Boc-Ile-Gly-Arg-PNA。
4.如权利要求1所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述样本处理液的制备方法，采用无热源水配制0.05mol-0.5mol/mLKOH和0.5mol-2mol/mL KCl，使用时将已配制的两种溶液等体积混合即为样本处理液。
5.如权利要求1所述的一种人体液的显色法真菌1.3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述主剂复溶液的制备方法，按处方用量分别称收Tris-HCl和MgCl2，置投料容器内，添加无热源水至配制量，使得每毫升溶液含Tris-HCl0.01-1mol和MgCl20.01-0.3mol，混合均匀后，用稀盐酸调pH，然后过滤分装。
6.如权利要求5所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述主剂复溶液的pH值控制在6.0-8.0之间。
7.如权利要求1所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述无热源水为无菌无热源水。
8.如权利要求1所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述标准品的制备方法为1，3-β-D-葡聚糖标准品与1-8％(重量比)的赋形剂混合，零下40℃～55℃冷冻5h，真空冻干，制得。
9.如权利要求1所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于所述质控品的制备方法，1，3-β-D-葡聚糖标准品与为10％(重量比)的小牛血清及1-8％(重量比)的赋形剂混合，零下40℃～55℃冻干，封口即得成品。
10.如权利要求1-2所述的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的检测方法，其特征在于鲎血细胞中G因子被待检测样本中1，3-β-D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的对硝基苯胺(PNA)，PNA在405nm波长具有明显吸收峰并且在一定时间内其生成速率及含量与1，3-β-D-葡聚糖含量线性相关，所以通过检测一定时间内405nm吸光度的变化率对样本中1，3-β-D-葡聚糖进行定量检测，具体实施步骤包括：标准曲线制作、样本处理、检测。
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