CN105018539B - 一种培养裂殖壶菌高产dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，属于微生物发酵领域。本发明方法包括如下步骤：将通过药瓶培养达到细胞干重为18～22g/L裂殖壶菌种子液接种到种子罐，培养至转接水平后，再接种到发酵罐中，采用前期高温22～33℃进行高密度培养，后期进行低温18～22℃胁迫的方式进行诱导培养110～130小时，期间通过流加葡糖糖溶液、氮源溶液和碱溶液维持发酵过程中葡糖糖、总氮含量保持一定浓度和pH在5.5～6.5区间。通过本发明方法得到的发酵液中细胞干重达到120～150g/L，DHA达到40～50g/L，比已见报道的DHA生产率高出1.2～1.5倍，非常适合应用于DHA的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及DHA的生产，具体涉及一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(22:6n-3,docosahexaenoic acid,DHA)是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸(ω-3polyunsaturated fatty acids)，其既能够促进婴幼儿智力和视力发育，又具有预防老年人心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效。传统的提取多不饱和脂肪酸的方法是从深海鱼油获取，随着环境污染以及海洋渔业资源的逐渐匮乏，从深海鱼中提取不饱和脂肪酸显露出存诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高等，鱼油中含有的EPA和胆固醇也使其不适于添加入孕婴食品中。相反，随着微生物发酵技术的不断成熟，以及微生物发酵油脂技术的深入研究，从微生物中获取油脂不但容易实现大规模生产，而且还可以克服了传统鱼油普遍存在受地域和气候条件制约的问题，应用前景非常广阔。
裂殖壶菌(Schizochytrium)是目前工业化生产DHA的理想物种之一，其属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，通过高密度发酵培养，其体内可积累大量脂肪，且70％以甘油三酯形式存在，其中DHA可以占到总脂肪酸的45～55％。
裂殖壶菌属于异养型微生物，葡萄糖、果糖和甘油是裂殖壶菌发酵生产DHA的良好碳源，其中葡萄糖为最适碳源。传统工业化生产藻油DHA主要用葡萄糖作为碳源，但是生产1吨DHA油脂大约需要消耗5吨葡萄糖，这种转化是低效率的，加之生产过程中需输入大量能量，设备投资与维护费用不菲，使得当前藻油DHA的生产成本非常高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌菌种接种至装有培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h。
(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)。
(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L。
(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有培养基的种子罐中进行发酵培养；通过氨水或液碱控制发酵过程pH值维持在5.5～6.5之间，培养温度控制在25～35℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，培养至发酵液中葡萄糖耗尽，停止培养；
(5)将步骤(4)种子罐中的发酵液以5～10％的接种量接种到装有培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养温度控制在22～33℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，通过流加葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度维持在30～50g/L，通过流加混合氮源溶液控制发酵过程中总氮的浓度维持在15～25g/L，该混合氮源中包含酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠、蛋白胨中的一种或多种；通过流加氨水或液碱控制发酵过程pH维持在5.5～6.5；发酵培养至70～100h后进行低温胁迫培养，将温度降低为18～22℃，其余条件不变，继续培养30～50h。
上述步骤(1)、(2)和(3)中的培养基的配方为：葡萄糖40～50g/L、酵母抽提物10～25g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。
上述步骤(4)和(5)中的培养基的配方为：葡萄糖75.0～85.0g/L、玉米浆干粉15～20g/L、酵母抽提物2.9～3.lg/L、谷氨酸钠5.0～15.0g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。
步骤(1)中所述的裂殖壶菌菌种优选为裂殖壶菌ATCC20888。更优选的，步骤(1)为：将用甘油保存的裂殖壶菌ATCC20888菌种接种到装有50mL培养基的250m摇瓶中，于25～30℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养25～35h。
步骤(4)和(5)中所述的氨水的浓度优选为28～30％(V/V)，所述的液碱的浓度优选为30～40％(W/V)。
步骤(5)中所述的葡萄糖溶液的浓度优选为700～750g/L，所述的混合氮源溶液的浓度优选为200～500g/L。
步骤(4)中所述的种子罐的体积优选为200L，罐体装液量优选为150L；步骤(5)中所述的发酵罐的体积优选为3000L，罐体装液量优选为1500L。
本发明通过对裂殖壶菌发酵生产DHA的培养基和培养条件进行优化，釆用传统的好氧发酵法，在3000L发酵罐发酵前中期采用相对较高温进行高密度培养，发酵后期进行低温胁迫培养，该培养方法既降低了发酵成本，又降低发酵过程的控制难度，发酵结束后发酵液的细胞干重达到120～150g/L，DHA达到40～50g/L，比已见报道的DHA生产率高出1.2～1.5倍，非常适合应用于DHA的工业化生产。本发明培养裂殖壶菌高产DHA的方法具有以下优势：
(1)采用前中期高温培养，后期短时间的低温胁迫诱导培养，与传统的低温发酵相比，能耗至少降低30％，大大减少了发酵过程对能量的需求，以及对制冷设备的要求。
(2)本发明中所用培养基配方相比于传统发酵，生产水平较高，并且成本大幅度降低，能够在增加收益的同时降低发酵风险。
(3)通过高密度好氧发酵法培养裂殖壶菌生产DHA等多不饱和脂肪酸(PuFA)可減少因市场需求过大而导致的大量捕捞带来的环境影响，因此该发明对环境资源的保护具有潜在的意义，同时通过微生物发酵法生产二十二碳六烯酸等产品，生产过程中产生的三废较少，工厂的建设和投资成本相对较低。
(4)尽管目前发现的高密度培养裂殖壶菌发酵生产的脂质含量通常比传统鱼油低，但微生物发酵生产的油脂含有大量必须脂肪酸，而且通过微生物发酵法获得的脂肪酸组成比较简单，多不饱和脂肪酸的含量非常高，富集也比从传统鱼油提取容易得多，这种高纯度对后续提取工艺极为有利，能够简化提纯过程，在工业生产中可以极大地降低生产成本。
(5)通过微生物发酵法获得多不饱和脂肪酸的工艺不受季节及气候变化的因素限制，可以全年进行生产，并且不受原料和产地的限制，增加了多不饱和脂肪酸生产的灵活性。
(6)通过微生物发酵法提取得到的油脂不像鱼油制品那样含有较多的胆固醇，增加了产品的纯度及产品的适用面，使产品的品质更有保证。
(7)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA，其菌种裂殖壶菌富含蛋白质、微量元素、维生素、抗氧化剂等，在膳食配方中可以作为大量营养素和微量营养素的来源。
(8)通过微生物进行发酵的不仅可以提高产品的质量，而且可以利用基因工程手段并结合微生物产多不饱和脂肪酸的代谢途径，利用代谢调控的方法来控制PuFA的组成，从而可以实现产品生产的人工控制。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)配制培养基
摇瓶培养基的配制方法如下：将配方中的组分四水氯化锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜、二水钼酸钠、六水氯化钴称量后，用无菌水充分溶解，制备成母液，酸性条件下，121℃高压蒸汽灭菌20min；其他成分称量之后，用无菌水充分溶解后分装至摇瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min。
摇瓶培养基配方如下：葡萄糖45g/L、酵母抽提物10g/L、硫酸钠8.0g/L、氯化钾0.7g/L、硫酸镁2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、氯化钙0.15g/L、硫酸铵1.0g/L、四水氯化锰1.7mg/L、七水硫酸锌3.0mg/L、五水硫酸铜1.5mg/L、二水钼酸钠0.05mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
发酵罐培养基的配制方法如下：将配方中的所有组分按比例称量后，用无菌水充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌20min，降温后备用。
发酵罐培养基配方如下：葡萄糖80.0g/L、玉米浆干粉15g/L、酵母抽提物3.0g/L、谷氨酸钠10.0g/L、硫酸钠8.0g/L、氯化钾0.7g/L、硫酸镁2.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、氯化钙0.15g/L、硫酸铵1.0g/L、四水氯化锰1.7mg/L、七水硫酸锌3.0mg/L、五水硫酸铜1.5mg/L、二水钼酸钠0.05mg/L、六水氯化钴0.05mg/L。
(2)取保藏于超低温冰箱的甘油管裂殖壶菌ATCC20888菌种，接种至2支装有50mL摇瓶培养基的250mL揺瓶中，在25℃的揺床中以150rpm的转速，培养24h；然后以5％的接种量接种至300支装有50mL培养基的250mL揺瓶中传代培养，在25℃的揺床中以150rpm的转速，培养19.5h，测定种子液中的细胞干重为18.7g/L，收集种子液。
(3)将揺瓶种子液按照10％的按种量按种到装有150L发酵罐培养基的200L一级种子罐中进行发酵培养，培养温度为28℃，通气量为0.5vvm，整个发酵过程利用30％氨水控制发酵液的pH在5.5～6.0之间，发酵至35～45h期间发酵液中葡萄糖含量低于5g/L时，停止发酵。
(4)将一级种子罐中的种子液150L全部接种至装有1500L发酵罐培养基的3000L发酵罐中进行发酵培养，培养温度为28℃，通气量为0.5vvm，整个发酵过程利用30％氨水控制发酵液的pH在5.5～6.0之间。发酵至20h时开始流加750g/L的葡萄糖溶液和230g/L的混合氮源溶液(该溶液包含30g/L酵母抽提物、100g/L谷氨酸钠、100g/L玉米浆干粉)，隔3h取样检测发酵液中葡萄糖和总氮含量，通过流加速率控制发酵液中葡萄糖浓度始终维持在30～50g/L、总氮含量维持在15～25g/L，发酵培养至115h时，结束发酵。通过冷冻干燥检测放罐时发酵液中细胞干重为121.9g/L；通过有机溶剂萃取法检测混合油脂含量占细胞干重的61.02％，气相分析检测混合油脂中DHA含量占混合油脂干重的51.12％，发酵液中DHA的含量可达38.02g/L。本批次发酵后所得混合油脂的组成成分分析见表1：
表1
| 脂肪酸种类 | 质量百分组成(％) |
| C12:0 | 0.06 |
| C14:0 | 0.57 |
| C16:0 | 32.16 |
| C16:1 | 0.06 |
| C18:0 | 1.44 |
| C18:1 | 0.05 |
| C18:2 | 0.05 |
| C18:3 | 0.07 |
| C20:3 | 0.36 |
| 角鲨烯 | 0.45 |
| C20:5 | 0.39 |
| C22:0 | 0.27 |
| C22:5 | 12.97 |
| C22:6 | 51.12 |
实施例2
实施例2与实施例1相比除了在3000L发酵罐中发酵培养的方法不同，其余均相同，具体为：将实施例1一级种子罐中的种子液150L全部接种至装有1500L发酵罐培养基的3000L发酵罐中进行发酵培养，培养温度为28℃，通气量为0.5vvm，整个发酵过程利用30％氨水控制发酵液的pH在5.5～6.0之间。发酵至20h时开始流加750g/L的葡萄糖溶液和和230g/L的混合氮源溶液(该溶液包含30g/L酵母抽提物、100g/L谷氨酸钠、100g/L玉米浆干粉)，隔3h取样检测发酵液中葡萄糖和总氮含量，通过流加速率控制发酵液中葡萄糖浓度始终维持在30～50g/L、总氮含量维持在15～25g/L。发酵培养至77h时进行低温胁迫培养，30min内将培养温度降低至20℃，继续培养37h，结束发酵。经检测，放罐时发酵液中细胞干重达到138.5g/L，混合油脂含量占细胞干重的63.5％，DHA含量占混合油脂干重的56.85％，发酵液中DHA的含量可达49.99g/L。本批次发酵后所得混合油脂的组成成分分析见表2：
表2
| 脂肪酸种类 | 质量百分组成(％) |
| C12:0 | 0.02 |
| C14:0 | 0.58 |
| C16:0 | 26.27 |
| C16:1 | 0.06 |
| C18:0 | 1.26 |
| C18:1 | 0.05 |
| C18:2 | 0.08 |
| C18:3 | 0.05 |
| C20:3 | 0.27 |
| 角鲨烯 | 0.65 |
| C20:5 | 0.32 |
| C22:0 | 0.30 |
| C22:5 | 13.24 |
| C22:6 | 56.85 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌ATCC20888菌种接种至装有培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h；
(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)；
(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L；
(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有培养基的种子罐中进行发酵培养；通过氨水或液碱控制发酵过程pH值维持在5.5～6.5之间，培养温度控制在25～35℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，培养至发酵液中葡萄糖耗尽，停止培养；
(5)将步骤(4)种子罐中的发酵液以5～10％的接种量接种到装有培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养温度控制在22～33℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，通过流加葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度维持在30～50g/L，通过流加混合氮源溶液控制发酵过程中总氮浓度维持在15～25g/L，该混合氮源中包含酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠、蛋白胨中的一种或多种；通过流加氨水或液碱控制发酵过程pH维持在5.5～6.5；发酵培养至70～100h后进行低温胁迫培养，将温度降低为18～22℃，其余条件不变，继续培养30～50h；
上述步骤(1)、(2)和(3)中的培养基的配方为：葡萄糖40～50g/L、酵母抽提物10～25g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L；
上述步骤(4)和(5)中的培养基的配方为：葡萄糖75.0～85.0g/L、玉米浆干粉15～20g/L、酵母抽提物2.9～3.lg/L、谷氨酸钠5.0～15.0g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。
2.根据权利要求1所述的培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于：步骤(1)为：将用甘油保存的裂殖壶菌ATCC20888菌种接种到装有50mL培养基的250mL摇瓶中，于25～30℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养25～35h。
3.根据权利要求1所述的培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于：步骤(4)和(5)中所述的氨水的浓度为28～30％(V/V)，所述的液碱的浓度为30～40％(W/V)。
4.根据权利要求1所述的培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的葡萄糖溶液的浓度为700～750g/L，所述的混合氮源溶液的浓度为200～500g/L。
5.根据权利要求1所述的培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的种子罐的体积为200L，罐体装液量为150L；
步骤(5)中所述的发酵罐的体积为3000L，罐体装液量为1500L。
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|---|---|---|---|---|
| EP1707055A2 (en) * | 2000-01-28 | 2006-10-04 | Martek Biosciences Corporation | Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors |
| CN104312929A (zh) * | 2014-10-27 | 2015-01-28 | 山东广博生物技术服务有限公司 | 一株高产dha裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Production of structured phospholipids by lipase-catalyzed acidolysis:optimization using response surface methodology;Lifeng Peng,et al.;《Enzyme and Microbial Technology》;20020902;第31卷(第4期);第523–532页 |
| 低温胁迫对裂殖壶菌DHA生物合成及SOD表达的影响;刘静等;《药物生物技术》;20100131;第17卷(第1期);第50-55页 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105018539A (zh) | 2015-11-04 |
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