CN105018385A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC？M？2015299，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)XK-2。并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2的筛选方法和在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用，以及一种解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂。解淀粉芽孢杆菌XK-2是一株西瓜内生菌株，对人、畜、农作物安全，对环境友好，具有较广的抑菌谱，对常见的土传病原菌，西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌菌丝生长均具有较好的抑制效果。解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂对西瓜枯萎病具有显著的防治效果，对西瓜枯萎病菌菌丝生长有明显抑制作用，使菌丝生长缓慢，出现畸形症状，在植物病害的生物防治中具有广阔的应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，特别是涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

西瓜枯萎病是一种由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.spniveum FON)引起的维管束土传病害，是西瓜产业中最普遍、危害最严重的病害之一，一般发病率为10％-30％，严重的达80％-90％，重茬地甚至造成绝产。病原菌从土壤根系侵入，引起维管束变褐坏死，导致瓜秧枯死，其厚垣孢子在土壤中可存活10年之久，严重影响西瓜的种植。目前，对该病害尚无有效的防治方法，传统的轮作虽在一定程度上能减轻病害发生，但随着市场对西瓜需求量的增长，西瓜种植面积逐年扩大，轮作防病措施难以实施。化学防治虽然具有一定的防治效果，但是病原菌对化学药剂的抗性逐年增强，药剂用量不断提高。化学药剂的长期大量使用，造成自然生态环境日益严重的污染。研究表明，在植物体内存在大量的益生菌，已在多种植物体内分离筛选到防病效果明显的内生细菌，有些内生细菌还具有促生、固氮等生物功能，是植物病害防治的重要资源，尤其对化学药剂难以控制的土传病害、维管束病害及***性病害发挥其独特的优势。因此，寻找防治西瓜枯萎病的拮抗微生物具有重要意义。

利用生防菌株防治植物病害在国内外均有报道，至今美国已有4种芽孢杆菌制备的生防菌剂获得了生产许可证；经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中检索到一些关于解淀粉芽孢杆菌的文献报道和专利。例如，专利申请号为2013100328384公开了“一种促生抑菌解淀粉芽孢杆菌、调理剂制备方法及应用”，报道多粘类解淀粉芽孢杆菌Pb-4对番茄等作物有明显的促生和抑菌防病作用。专利申请号为201210342838X公开了“解淀粉芽孢杆菌Ba168及其发酵培养方法和应用”，利用解淀粉芽孢杆菌Ba168制备菌剂，对尖孢镰刀菌引起的白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病等根腐病害具有很好的防治作用。专利申请号为2014100362727公开了“解淀粉芽孢杆菌噻枯唑复配可湿性杀菌粉剂及其应用”，利用解淀粉芽孢杆菌和噻枯唑复配可湿性杀菌粉剂，用于防治水稻细菌性条斑病和水稻白叶枯病。但目前并没有对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等重要植物病原菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的报道。

发明内容

为改进现有防治技术的不足，本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，该解淀粉芽孢杆菌对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等多种病原菌具有显著的拮抗作用。

本发明第一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015299，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)XK-2。

解淀粉芽孢杆菌XK-2的菌学特性：

a、形态特征：XK-2为革兰氏阳性菌，呈杆状，芽孢椭圆，在LB平板上形成的菌落成圆形，边齐，稍***，湿润，有光泽，乳白色，半透明。

b、生理生化特征：水解淀粉，周生鞭毛，氧化酶阴性，接触酶阳性。

解淀粉芽孢杆菌XK-2的16S rDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示，与Genbank上已报道序列进行比对，最终确定菌株XK-2为解淀粉芽孢杆菌。

本发明第二方面提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用。

本发明第三方面提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2的筛选方法，具体步骤包括：

(1)从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌；

(2)用平板对峙法从步骤(1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作用的菌株。

本发明第四方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，所述菌剂为解淀粉芽孢杆菌XK-2经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。

本发明的有益效果是：(1)解淀粉芽孢杆菌XK-2是一株西瓜内生菌株，对人、畜、农作物安全，对环境友好。

(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌XK-2具有较广的抑菌谱，对常见的土传病原菌，西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、核桃根腐病菌(Fusarium solani)等菌丝生长均具有较好的抑制效果，其中对西瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌的抑菌率达80％以上。

(3)本发明的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂对西瓜枯萎病具有显著的防治效果，盆栽防治效果达75.8％，对西瓜枯萎病菌菌丝生长有明显抑制作用，使菌丝生长缓慢，出现末端细小，扭曲，崩溃等畸形症状，且生产周期短，工艺简单，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌XK-2在LB固体培养基上生长的菌落形态；

图2为解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌的拮抗作用示意图；

图3为解淀粉芽孢杆菌XK-2对水稻纹枯病菌的拮抗作用示意图；

图4为解淀粉芽孢杆菌XK-2对核桃根腐病菌的拮抗作用示意图；

图5为解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌菌丝生长的致畸作用示意图，其中，A为未经解淀粉芽孢杆菌XK-2处理的对照组，B为经解淀粉芽孢杆菌XK-2处理的实验组。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015299，命名为解淀粉芽孢杆菌XK-2。

所述解淀粉芽孢杆菌XK-2的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明第二方面提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用。

本发明第三方面提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株的筛选方法，具体步骤包括：

(1)从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌；

(2)用平板对峙法从步骤(1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作用的菌株。

优选的，步骤(1)所述西瓜植株的根部经过酒精浸泡、升汞浸泡、无菌水漂洗后，加入无菌水进行研磨，混合均匀制为悬浮液。所述分离芽孢杆菌是将悬浮液稀释后涂布于LB平板，28-30℃下培养23-26h，挑取芽孢杆菌单菌落；步骤(2)所述筛选为将西瓜枯萎病菌接种在PDA平板中心，将步骤(1)所得细菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心1-3cm，28℃下培养，得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保存。

本发明第四方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，所述菌剂为解淀粉芽孢杆菌XK-2经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。

优选的，所述活化为将解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于培养基中，于28-30℃下培养20-24h。

更加优选的，所述培养基为LB固体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉20g，用NaOH调pH至7.0-7.2，于121℃下高压灭菌20min。

优选的，所述种子培养为将经活化后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于培养基中，于28-30℃、115-125r/min下振荡培养20-24h。

优选的，所述发酵为将经种子培养后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株以5％的接种比例接种于培养基中，于28-30℃、115-125r/min下振荡培养40-44h。

更加优选的，所述培养基为LB液体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，用NaOH调pH至7.0-7.2，于121℃下高压灭菌20min。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁶-1.0×10⁸cfu/mL后使用，用于抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌。

下面将结合实施例对本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌及其应用予以进一步说明。

实施例1

一、解淀粉芽孢杆菌XK-2的获得与鉴定，及其对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌拮抗作用的测试。

本实施例所述西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌由长江大学农学院植物病理学研究室提供，其它方式获得的西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌也适用于本发明。

分离：从湖北荆州周边西瓜种植田块中采集长势旺盛的西瓜植株，取其幼嫩的根部，用清水洗净，剪成1cm左右的小段，置于灭菌的培养皿中，用75％酒精浸泡50s，再用0.1％升汞浸泡30s，然后无菌水漂洗4次。置于灭菌的研钵中，加入少许无菌水，研磨，取研磨后的菌液1mL，加到盛有9mL无菌水的试管中，振荡混匀，制成样品悬浮液。取1mL样品悬浮液加入盛有9mL无菌水的试管中依次进行10倍系列稀释，分别取10^-6、10^-7、10^-8的稀释液50μL涂布于LB平板，置于28℃培养24h。根据形态、大小、色泽等特点，共挑取单菌落236株，转接于LB平板上培养，保存备用。

筛选：将西瓜枯萎病菌接种在PDA平板中心，用灭菌的牙签将上述分离纯化的细菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心约2cm，28℃培养观察对峙培养抑菌情况。将抑菌作用明显的菌株XK-2转入LB平板上培养，保存备用，解淀粉芽孢杆菌XK-2在LB固体培养基上生长的菌落形态见附图1，解淀粉芽孢杆菌XK-2在LB平板上形成的菌落成圆形，边齐，稍***，湿润，有光泽，乳白色，半透明。所述PDA培养基的配制方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，补足蒸馏水至1000mL，121℃湿热灭菌20min。

鉴定：对筛选的菌株XK-2进行生理生化鉴定，确定为芽孢杆菌属，然后提取菌株的总基因组DNA为模板扩增其16S rDNA序列。所用正向和反向引物分别为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，即序列表SEQ ID No.2；1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，即序列表SEQ ID No.3。PCR反应体系为15μL反应体系，包括：DNA模板0.6μL；H₂O 8.57μL；buffer 1.65μL；Mg²⁺2.75μL；dNTP 0.66μL；27F：0.33μL；1429R 0.33μL；Tsg 0.11μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，50℃45s，72℃100s，35个循环；72℃7min。回收并纯化PCR产物，测序，根据测序结果将菌株XK-2鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

进一步的，进行了解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌拮抗作用的测试。

将筛选出的抑菌作用最明显的菌株XK-2接入LB液体培养基中，于28℃下130r/min振荡培养24-28h，制成菌悬液。在不同PDA平板中心分别接入西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等病原真菌，用移液器将XK-2菌悬液呈三角状对称接入PDA平板，每点接入10μL，距离中心约2cm，以无菌水为对照，28℃培养观察对峙培养抑菌情况，4d后测量菌落半径，解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌的抑菌情况见附图2、对水稻纹枯病菌的抑菌情况见附图3、对核桃根腐病菌的抑菌情况见附图4。

采用以下公式计算菌株XK-2对病原真菌生长的相对抑菌率，每处理重复三次。

相对抑制率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％

解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等几种重要土传病原真菌均具有明显的拮抗作用，结果见表1，其相对抑制率分别为80.8％、81.6％、75.0％。通过镜检观察解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用，见附图5，发现菌株XK-2处理的菌丝生长缓慢，末端细小，扭曲，崩溃等畸形症状，而对照菌丝生长均匀。

表1：解淀粉芽孢杆菌XK-2对几种不同病原真菌的拮抗作用

二、解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂的制备

按照以下主要步骤完成菌株XK-2菌剂的制备：

(1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于LB固体培养基，于29℃下培养22h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉20g，NaOH调pH至7.1，121℃、20min高压灭菌。

(2)将步骤(1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于29℃下120r/min振荡培养22h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调pH至7.1，121℃、20min高压灭菌。

(3)将步骤(2)所获的种子发酵液按体积比5％接种于LB液体发酵培养基中，于29℃下120r/min振荡培养42h。

按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂。

三、解淀粉芽孢杆菌XK-2在防治西瓜枯萎病中的应用

将实施例2所制备的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至1.0×10⁸cfu/mL，OD₆₀₀＝0.78-0.80，用于西瓜枯萎病的盆栽防治试验。

玉米砂培养基制作：取干燥无霉变的玉米粒粉碎物淘洗干净后浸泡24h，滤干水后装入250mL三角瓶中，121℃、灭菌30min，冷却后备用。

含病原菌盆栽土的准备：将PDA平板中活化的西瓜枯萎病菌丝块接入上述盛有玉米砂培养基的三角瓶中，每瓶4-5块，置于25℃培养箱中培养。10d后将病原菌接种物与灭菌土以1:15的质量比例混合均匀，制成含病原菌盆栽土，分装于营养钵，每钵约1.0Kg。

将西瓜种子常丰新西农8号(中度抗病)催芽后育苗，当西瓜苗长至3片真叶时准备移栽，移栽前将西瓜苗在上述XK-2菌剂稀释液中浸泡30min，并在盛有病原物接种土的营养钵中打下约10cm×5cm大小的孔穴，接入50mL上述XK-2菌剂稀释液，以无菌水为空白对照。三次重复，每处理20株，一个月后，拔起西瓜苗，纵剖维管束，观察发病情况，根据西瓜枯萎病的分级标准调查各处理的病情，根据以下公式计算病情指数和相对防效。

病情指数＝Σ[病级数×该级病株数]/(调查总数×最高病级数)×100

相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

西瓜枯萎病的分级标准：

0级：茎内维管束正常，无变色；

1级：茎内维管束20％以下变色；

2级：茎内维管束20％-40％变色；

3级：茎内维管束40％-60％变色；

4级：茎内维管束60％-80％变色；

5级：茎内维管束80％以上变色。

为经XK-2菌剂处理的对照组均达到了西瓜枯萎病的分级标准的5级，其茎内维管束变色严重，采用XK-2菌剂处理的实验组的茎内维管束变色严重程度有明显减轻，为西瓜枯萎病分级标准1级。解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病的室内盆栽防治试验结果见表2，对照的病情指数为86.7，XK-2菌剂处理的西瓜枯萎病病情指数为23.3，其相对防治效果达73.1％。

表2：解淀粉芽孢杆菌XK-2对西瓜枯萎病的室内防治效果

实施例2

实施例2与实施例1基本相同，区别在于：

本实施例按照以下主要步骤完成菌株XK-2菌剂的制备：

(1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于LB固体培养基，于30℃下培养24h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉20g，NaOH调pH至7.2，121℃、20min高压灭菌。

(2)将步骤(1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于30℃下120r/min振荡培养24h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调pH至7.2，121℃、20min高压灭菌。

(3)将步骤(2)所获的种子发酵液按体积比5％接种于LB液体发酵培养基中，于30℃下120r/min振荡培养44h。

按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，将所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁷cfu/mL后使用。

实施例3

实施例3与实施例1基本相同，区别在于：

本实施例按照以下主要步骤完成菌株XK-2菌剂的制备：

(1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于LB固体培养基，于28℃下培养20h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉20g，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。

(2)将步骤(1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于28℃下120r/min振荡培养20h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。

(3)将步骤(2)所获的种子发酵液按体积比5％接种于LB液体发酵培养基中，于28℃下120r/min振荡培养40h。

按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，将所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁶cfu/mL后使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2015299，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)XK-2。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌XK-2的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1或2所述解淀粉芽孢杆菌在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用。

4.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其步骤包括：

(1)从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌；

(2)用平板对峙法从步骤(1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作用的菌株。

5.如权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2的筛选方法，其特征在于：步骤(1)所述西瓜植株的根部经过酒精浸泡、升汞浸泡、无菌水漂洗后，加入无菌水进行研磨，混合均匀制为悬浮液，所述分离芽孢杆菌是将悬浮液稀释后涂布于LB平板，28-30℃下培养23-26h，挑取芽孢杆菌单菌落；步骤(2)所述平板对峙法具体步骤为：将西瓜枯萎病菌接种在PDA平板中心，将步骤(1)所得细菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心1-3cm，28℃下培养，得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保存。

6.一种解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，其特征在于：所述菌剂为解淀粉芽孢杆菌XK-2经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。

7.如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，其特征在于：所述活化为将解淀粉芽孢杆菌XK-2接种于LB培养基中，于28-30℃下培养20-24h。

8.如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，其特征在于：所述种子培养为将经活化后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于培养基中，于28-30℃、115-125r/min下振荡培养20-24h。

9.如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，其特征在于：所述发酵为将经种子培养后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株以5％的接种比例接种于培养基中，于28-30℃、115-125r/min下振荡培养40-44h。

10.如权利要求6至9任一项权利要求所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂，其特征在于：所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁶-1.0×10⁸cfu/mL后使用。