CN105009941A - 冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬虫夏草技术领域，更具体而言，涉及冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法；按照以下步骤进行：a、伴生菌和冬虫夏草的母种纯化；b、伴生菌和冬虫夏草的发酵罐菌种培养；c、混合连续深层发酵；d、发酵液体的罐装灭菌；e、过滤固形物冻干磨粉；本发明在通过对青藏高原的野生冬虫夏草菌种分离、提纯，并通过连续深层发酵技术，提取出人工发酵的虫草液和虫草粉。多项关键指标都超过天然的冬虫夏草，并具有质量稳定药效的特性；本发明主要应用在人体保健治疗方面。

Description

冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法

技术领域

本发明涉及冬虫夏草技术领域，更具体而言，涉及冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法。

背景技术

冬虫夏草是一种特殊虫和真菌共生的生物体，其菌丝体通过各种方式感染蝙蝠蛾（鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫）的幼虫，以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳，从而形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。入药部位为菌核和子座的复合体。冬虫夏草首次记载使用是清代吴仪洛《本草丛新》，书中认为冬虫夏草性味甘，温。功能补肺益肾，化痰止咳。可用之于久咳虚喘，产后虚弱、阳痿阴冷等“虚”的病症。据研究：冬虫夏草主要含有冬虫夏草素、冬虫夏草酸、腺苷和多糖等成分；冬虫夏草素能抑制链球菌、鼻疽杆菌炭疽杆菌等病菌的生长，又是抗癌的活性物质，对人体的内分泌***和神经***有好的调节作用；虫草酸能改变人体微循环，具有明显的降血脂和镇咳祛痰作用；虫草多糖是免疫调节剂，可增强机体对病毒及寄生虫的抵抗力。由于优质天然虫草产量极其有限，无法满足需求，货源奇缺，价格昂贵，为满足广大消费者的需求，有必要对现有技术进行改进。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的不足，提供一种冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，按照以下步骤进行：

a、伴生菌和冬虫夏草的母种纯化；

b、伴生菌和冬虫夏草的发酵罐菌种培养；

c、混合连续深层发酵；

d、发酵液的制备；

e、发酵粉的制备。

所述a步骤中伴生菌母种纯化按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作培养基；3）分装试管；4）塞皮塞；5）试管包扎；6）培养基灭菌；7）摆放斜面；8）检查灭菌效果；9）母种接种；10）培养菌种；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L，无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl、0.01g CuSO4·5H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2；无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，PH自然；

上述制作培养基具体为：选择优质的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成长0.5毫米的薄片，称取200克，加水1000毫升，煮沸后微火保持30分钟，马铃薯煮熟而不酥，即8成熟左右，然后用2层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，最后依次加入蔗糖、葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、无机离子，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，即可进行分装。

所述a步骤中冬虫夏草母种纯化按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作培养基；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，琼脂18—20克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然；

上述制作培养基具体为：将马铃薯加入1000ml的水中，煮沸后微火保持30分钟，然后用双层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，再依次加入麦麸、葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，完成培养基制作。

所述b步骤中伴生菌发酵罐菌种培养按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L，无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3 g CaCl2·2H2O、1 g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl、0.01g CuSO4·5H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2；无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然；

上述制作为：将以上配方制成液体培养基，装入1000ml摇瓶，放入搅拌子，塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121℃-123℃，时间持续为30分钟，然后让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

所述b步骤中冬虫夏草发酵罐菌种培养按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然；

上述制作为：将以上配方制成液体培养基，装入1000ml摇瓶，放入搅拌子，塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121℃-123℃，时间持续为30分钟，然后让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

所述c步骤按照以下方式进行：1）发酵罐灭菌处理；2）混合连续深层发酵液体培养基；3）装料灭菌；4）接种；5）混合发酵液体的培养；

上述混合连续深层发酵液体培养基按照下列组分进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L；无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl，0.01g CuSO4·5H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2，无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然；

上述接种是将培养好的伴生菌发酵菌种与冬虫夏草发酵菌种进行混合接种。

所述d步骤按照以下方式进行：使用过滤机在温度25～28℃开始过滤，回流过滤液10分钟，收集澄清的滤液，即得冬虫夏草发酵液；过滤所得的液体经超高温瞬时杀菌机杀菌，杀菌温度(110±5)℃，时间10秒，杀菌过的液体放至暂存罐急速冷却到50～55℃，进行浓缩；在真空度0.096～0.099兆帕、液体温度50～55℃、蒸汽压力0.196～0.294兆帕下浓缩，浓缩至可溶性固形物达42％～45％后进行二次杀菌；将浓缩好的液体用液体灌装机将液体装入专用瓶（袋）中，然后在90℃杀菌30分钟；将成品在-18～-25℃冷库中恒温冷藏。

所述e步骤按照以下方式进行：把过滤后的发酵固形物用低温冻干设备全部干燥后，再用低温磨粉设备磨成120目的细粉, 即得冬虫夏草发酵粉，再进行真空包装保存。

与现有技术相比本发明所具有的有益效果为：

本发明在通过对青藏高原的野生冬虫夏草菌种分离、提纯，并通过连续深层发酵技术，提取出人工发酵的虫草液和虫草粉。多项关键指标都超过天然的冬虫夏草，并具有质量稳定药效的特性。所含的虫草硒是抗癌、抗氧化生理活性中极其重要的微量元素之一，在虫草素中达0.21gm，远高于天然虫草的0.0049gm。核苷是虫草中的主要有效成分之一，具有抗癌、抗病毒、抗菌等作用，优等天然虫草可达0.1%数量级，虫草素甚至可达0.30%。天然虫草与虫草素菌丝氨基酸含量的分析比较结果，虫草素菌丝氨基酸含量比天然虫草高出一倍。冬虫夏草发酵液和冬虫夏草发酵粉经部分人群服用后对久咳虚喘，劳嗽咯血，阳瘘遗精，腰膝酸痛，失眠，便秘，贫血，通风，高血糖等具有很好的疗效。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

本发明的工艺流程按照如下方式进行：1）伴生菌和冬虫夏草的母种纯化；2）伴生菌和冬虫夏草的发酵罐菌种培养；3）混合连续深层发酵；4）发酵液的制备；5）发酵粉的制备。

冬虫夏草菌种是一个特殊的菌种，为伴生菌和冬虫夏草共生性菌类，在生产前首先要先分别培养伴生菌母种及伴生菌液体发酵罐菌种和冬虫夏草母种及冬虫夏草液体发酵罐菌种，最后将其两种发酵液菌种混合接种再进一步连续深层发酵即可得到冬虫夏草发酵液和发酵粉。

一、母种纯化

（一）、伴生菌母种培养

1、配方:1000ml 为例

  蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L；无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O，1g KH2PO4，0.5g MgSO4·7H2O，1g NaCl，0.01g CuSO4·5H2O，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnCl2·4H2O，0.01g ZnCl2。无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18—20克，PH自然。

2、培养基制作。选择优质的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成长0.5毫米的薄片，称取200克，加水1000毫升，煮沸后微火保持30分钟，马铃薯煮熟而不酥，即8成熟左右。然后用2层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，最后依次加入蔗糖、葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、无机离子，继续加热并搅拌至全部溶化。最后用清水补足至1000毫升，即可进行分装。

 3、分装试管。左手持5支试管管口朝上，下端整齐，上移试管至漏斗软管，***试管内约3厘米。右手捏紧软管止流夹，使培养基液体流入试管 ，每支试管装量约为试管长度的1/5即可。此时松开止流夹液体停止流入。将试管下移离开软管，再分装第2支试管，依此方法分装其他试管，直至全部装完。分装试管要求速度要快，尤其在低温季节，以防止培养基凝固。装量要准确，因为装量偏多摆成的斜面变短，又浪费培养基，装入量偏少则使摆成的斜面太薄，营养少，菌丝难以正常生长。注意避免将培养基黏附到试管管口，以免造成粘着皮塞的现象，还易引起皮塞上孳生杂菌，给菌种质量留下隐患。

4、塞皮塞，用手把专用皮塞塞入试管，皮塞要紧贴管壁不起皱纹，皮塞塞入管中的部分约为2.5厘米，外露部分约占皮塞总长的1/3。

5、试管包扎。试管塞好皮塞后，取10支同样规格的试管，用牛皮纸或双层报纸将棉塞包住，并向下延伸到试管中部，用粗棉线将其扎成一把。

6、培养基灭菌。母种培养基多采用手提式高压灭菌锅进行灭菌，灭菌过程是：检查高压蒸汽灭菌锅的压力表及各部位是否灵活、可靠；尤其注意检查安全阀是否发生堵死或锈死。在锅内加入约3千克自来水，加至支架下缘。将捆好的培养基棉塞向上垂直放入菌筐（桶），将锅盖上垂下的排气管***套筒内壁的导气管中，然后双手同时用力，分别将对角线方向的两个螺丝拧紧。封盖后关闭排气阀开始加热，当加热至压力达0.05兆帕时，打开排气阀，排尽冷空气，待压力降至0后，即可关闭排气阀。最好依上法排2次。继续加热，当压力上升至0.11兆帕时开始计时，在0.11～0.14兆帕压力下保持30分钟，停止加热，使其自行冷却降至0℃。打开排气阀，再将锅门打开一条10厘米左右的缝隙散热。

7、摆放斜面。观察到报纸干燥后，打开锅盖，当培养基温度降到60℃左右时及时取出摆放斜面。注意培养基要盖住试管底部，斜面长度应以试管长度的五分之三。当试管内培养基完全凝固后收起备用。制备好的培养基应放置在通风干燥处保存。

如果温度很高时就摆放斜面，培养基凝固后表面会出现较多的冷凝水，不利菌丝生长。在摆放好斜面后，用厚实的棉布盖住培养基，使培养基缓慢降温冷却，也可减少冷凝水出现。

8、灭菌效果检查。随机取部分试管斜面，放在28℃下进行空白培养，3天后，检查斜面上有无细菌和霉菌菌落。如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要重新灭菌。

9、母种接种

接种前把培养基放入接种箱中进行消毒，消毒要求按前述进行。接种时，手和接种钩用75％的酒精棉球揩擦，点燃酒精灯，使火焰周围空间形成无菌区，左手平行并排拿起母种试管和供接种用的斜面试管，两支试管斜面向上，管口要齐平，右手大拇指和食指持接种钩，在酒精灯的火焰上燃烧灭菌。把接种钩上方可进入试管的部分都要进行灼烧。将左手试管移至火焰旁，用右手的小指、无名指和手掌，在火焰旁分别夹下两支试管的棉塞，将试管口在火焰上稍微烤一下，以杀灭管口上的杂菌，随后将管口移至距火焰1～2厘米处，将灼烧过的接种耙伸入菌种管内，先接触试管内壁，使其冷却，再将其爬壁的气生菌丝钩掉，并将培养基前端最薄处切断，连同气生菌丝一并钩出管外。再用接种钩（铲、耙）将母种纵横割成许多小方块，然后挑取一小块，迅速移入接种的试管斜面的中前部，轻轻抽出接种钩，再烤一下试管口，迅速塞上过火焰的棉塞 ，一支母种一般可扩接试管30～40支。

技术要点：整个过程均须在火焰旁边进行无菌操作，母种上的接种块以及周边已老化的要去除，挑选菌龄短的菌丝块进行生产。试管从接种箱取出之前，应逐支试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期。

10、菌种培养 

将接好种的斜面试管，放入生化培养箱内，将温度设定到16--18℃温度下培养90天，在培养过程中，每天都要仔细逆光观察，发现有任何疑常现象都要淘汰。

   （二）、冬虫夏草母种纯化

1、配方:1000ml 为例

麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，琼脂18—20克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然。

2、制作

冬虫夏草母种培养基的制作方法同伴生菌。

3、接种

将所用母种及新制的斜面试管放入接种箱（或洁净工作台），消毒20-30 分钟后将手用75%的医用酒精擦洗(消毒)，伸入接种箱（或洁净工作台）等待5分钟后再开始接种 (接种前所有接种工具都要在酒精灯火焰上灼烧灭菌)，在酒精灯火焰上方切取0.5cm2一小块菌丝，放入新制的斜面试管培养基上，塞好试管口即可。

4、培养

将接好种的斜面试管，放入生化培养箱内，将温度设定到16--18℃温度下培养90天，在培养过程中，每天都要仔细逆光观察，发现有任何疑常现象都要淘汰。

二、发酵罐菌种培养

（一）伴生菌发酵菌种培养

蔗糖50 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物3 g/L；无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3 g CaCl2·2H2O，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，1 g NaCl，0.01 g CuSO4·5H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，0.01 g MnCl2·4H2O，0.01 g ZnCl2。无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然。

2、制作

将以上配方制成液体培养基，装入1000ml摇瓶，放入搅拌子。塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀， 温度升至121℃-123℃后，计时30分钟，让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

3、接种

将液体瓶瓶及纯化好的母种一起放入接种箱（或洁净工作台）消毒后，去掉防潮纸，扭松棉寨，在酒精灯火焰上方，挑取3平方厘米的菌丝块，左手拿起摇瓶封口棉寨，右手迅速将菌丝接入，然后立刻盖上棉塞即可。

4、培养

将接好种的摇瓶放入生化培养箱内，将温度设定到该菌最适合生长的温度下静止培养4天，逆光观察，没有任何杂菌，然后放在电磁恒温摇床上18℃搅拌培养60天即可。伴生菌发酵菌种培养好后要与冬虫夏草发酵菌种再进一步混合接种进行深层发酵。

（二）、冬虫夏草发酵菌种培养

1、配方

麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然。

2、制作

将以上配方制成液体培养基，装入1000㏕摇瓶，放入搅拌子。塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀， 温度升至I21℃—123℃后，计时30分钟，让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

3.接种

将液体瓶瓶及纯化好的母种一起放入接种箱（或洁净工作台）消毒后，去掉防潮纸，扭松棉寨，在酒精灯火焰上方，挑取3平方厘米的菌丝块，左手拿起摇瓶封口棉寨，右手迅速将菌种接入，然后立刻盖上棉塞即可。

4、培养

将接好种的摇瓶放入生化培养箱内，将温度设定到该菌最适合生长的温度下静止培养4天，逆光观察，没有任何杂菌，然后放在电磁恒温摇床上16—18℃搅拌培养60天。冬虫夏草发酵菌种培养好后要与伴生菌发酵菌种再进一步混合接种进行深层发酵。

三、混合连续深层发酵

1、发酵罐灭菌处埋

将灭菌补料罐加水至总体积的70%。打开补料罐电源开关，将温度设定到121℃—125℃， 打到此温度后，关闭空气总管道阀门，打开蒸气阀门，让蒸气通过二级过滤器依次进入三级、四级，最后到发酵罐；当发酵罐温度达ll8℃—120℃后，将接种阀、取样阀;排气阀打开一点，让蒸气慢慢排出一点，对其进行灭菌(在整个过程中每3—5分钟要排一次过滤器下部产生的冷凝水)，保持30分钟后，先打开发酵罐后面的排气阀门，然后将灭菌补料罐出料口阀门慢慢打开一点，让高温高压水流出少许，对其三通预热后，打开进入过料管道的蒸气阀门，当发酵罐后面的排气阀门有大量蒸气排出后，关闭发酵罐后面的排气阀门，打开发酵罐后面的进料口阀门，然后关闭取样阀，迅速将取样金属管头***甲醛瓶内，关闭发酵罐顶上接种与排气阀门；先打开接种抢开关阀门，再将发酵罐出种口阀门慢慢打开一点，让高温高压水流出少许，对其三通预热后，打开进入出种管道的蒸气阀门，当接种抢出种口有大量蒸气排出后，将出气量调小，有少量蒸气排出即可，灭菌30分钟后关闭接种枪开关及出菌种口阀门，用无菌袋子密封备用。将温度设定到低于室温，打开气泵，关闭蒸气分阀门，打开空气总阀门，吹干滤芯，让无菌空气进入罐内，调整罐压在0.03—0.05MPa，关闭过滤器下面的排气阀门，让整个***保持正压。结束后用75%医用酒精棉球把发酵罐顶部中心的接种口阀门封好。

2、混合连续深层发酵液体培养基

蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L；无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl，0.01g CuSO4·5H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2。无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然。

3、装料灭菌

首先关闭灭菌补料罐蒸气总阀门与出料口阀门，将补料罐内加入所需装量70%的水(若水质太差需进行净化处理)，打开灭菌补料罐电源开关，温度设定到95℃，把所有原料用热水溶解在一起，当补料罐内温度升到95℃时，打开出料口阀门通入少量空气，在空气的搅拌下先加入消泡剂，当料液温度接近95℃时，关闭出料口阀门，超过95℃后关闭补料罐上所有阀门；将温度设定到121℃，打开计时器(灭菌时间设定30分钟)；将热交换器循环水管道接好，达到灭菌温度后，将灭菌罐顶部的加料口阀门，排气阀门都打开一点，让蒸气排出少许，对其灭菌，达到灭菌时间后，关闭加热电源及灭菌罐顶部所有阀门。先从灭菌补料罐下面的排污口排出500mL-1000mL料液，再将降温循环水通上，然后打开补料罐出料口阀门，将灭好菌的培养料，通过热交换器降温后进入发酵罐，将灭菌温控仪温度控制在25℃以下。

4、接种

提前2个小时用臭氧把培养室所有环境进行消毒，然后取出培养好的摇瓶种子，在酒精火焰保护下从接种阀门将菌种接入，一般二人配合进行，用浸湿酒精的火环套在接种口上，关闭进气阀门，打开排气阀门，让发酵罐内压力归零，第一人点着火环，用镊子拿掉接种阀门口的酒精棉球，打开接种阀门，第二人手持摇瓶，将金属管口放入火焰内，第一人用镊子拔掉管头内的棉塞，第二人将管子***接种阀门内，斜提摇瓶把冬虫夏草菌种和伴生菌混合接入发酵罐内，接完后拔出管子，关闭阀门，去掉火环，接种口重新用75%医用棉球封好，打开进气阀门，通入无菌空气发酵培养。

5、混合发酵液的培养

接种后以180转/分的叶轮速度搅拌培养 72小时,中间每隔12小时取样检测糖、氮、pH值、液体无菌度。放罐标准是发酵液pH值下降 至5,残糖含量降至2.5左右,氨态氮不超过30毫克/升,菌球浓度达到1000～1500个/毫升,或经3000转/分离心10分,固形物湿重在20～25克/100毫升。检查发酵液质量项目包括:纯度检查,镜检或平板培养无细菌、霉菌；活力检查,镜检菌球边缘菌丝分枝细密,用结晶紫染色时着色深,菌丝细胞原生质尚未出现凝集现象,醪液静止5分,固形物不下沉;菌球大小,80%菌球直径小于1毫米; 将温控仪温度设定到23—25℃，罐内压力保持0.03—0.04MPa，通气量：料：气在1：（0.2—0.5）v/v发酵10天即可。

四、冬虫夏草菌液体分离过滤包装 （发酵液的制备）

1、使用专用过滤机在温度25～28℃开始过滤，回流过滤液10分钟，收集澄清的滤液。即得冬虫夏草发酵液。

2、一次杀菌：过滤所得的液体经超高温瞬时杀菌机杀菌，杀菌温度(110±5)℃，时间10秒。杀菌过的液体放至暂存罐急速冷却到50～55℃，进行浓缩。

3、真空浓缩：在真空度0.096～0.099兆帕、液体温度50～55℃、蒸汽压力0.196～0.294兆帕下浓缩，浓缩至可溶性固形物达42％～45％后进行二次杀菌。

4、二次杀菌：将浓缩好的液体用液体灌装机将液体装入专用瓶（袋）中，然后在90℃杀菌30分钟。

5、冷藏：将成品在-18～-25℃冷库中恒温冷藏。

6、产品质量指标

（1）．感官指标

　　色泽：黑褐色液体，半透明；滋味及气味：具有桦褐孔菌特有的香气及气味，稀释到原汁浓度时无焦糊味，无异味；组织形态：组织为半透明均匀液体，五分层、沉淀现象；杂质：无外来杂质。

（2）．理化指标

　　可溶性固形物42％±1％；pH值5.0～7.0。

（3）．微生物指标

　　细菌总数≤3000个／毫升；大肠菌群、致病菌不得检出。

五、过滤固形物冻干磨粉（发酵粉的制备）

1、将冬虫夏发酵液过滤固形物固形物平铺于冻干盘内，滤上物平铺于冻干盘时应保持其高度均匀，以减少冻干后含水量的批内差，高度不可大于2cm，以免影响冻干效果；

2、冻干盘内待冻干物高度不能低于1.5cm；

3、开启冻干机，运行情况见下表：

  

4、把过滤后的发酵固形物用低温冻干设备全部干燥后，再用低温磨粉设备磨成120目的细粉，再进行真空包装保存。

Claims (8)

1.冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

a、伴生菌和冬虫夏草的母种纯化；

b、伴生菌和冬虫夏草的发酵罐菌种培养；

c、混合连续深层发酵；

d、发酵液的制备；

e、发酵粉的制备。

2.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述a步骤中伴生菌母种纯化按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作培养基；3）分装试管；4）塞皮塞；5）试管包扎；6）培养基灭菌；7）摆放斜面；8）检查灭菌效果；9）母种接种；10）培养菌种；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L，无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl、0.01g CuSO4·5H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2；无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，PH自然；

上述制作培养基具体为：选择优质的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成长0.5毫米的薄片，称取200克，加水1000毫升，煮沸后微火保持30分钟，马铃薯煮熟而不酥，即8成熟左右，然后用2层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，最后依次加入蔗糖、葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、无机离子，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，即可进行分装。

3.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述a步骤中冬虫夏草母种纯化按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作培养基；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，琼脂18—20克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然；

上述制作培养基具体为：将马铃薯加入1000ml的水中，煮沸后微火保持30分钟，然后用双层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，再依次加入麦麸、葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，完成培养基制作。

4.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述b步骤中伴生菌发酵罐菌种培养按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L，无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3 g CaCl2·2H2O、1 g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl、0.01g CuSO4·5H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2；无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然；

上述制作为：将以上配方制成液体培养基，装入1000ml摇瓶，放入搅拌子，塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121℃-123℃，时间持续为30分钟，然后让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

5.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述b步骤中冬虫夏草发酵罐菌种培养按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作；3）接种；4）培养；

上述配制原料具体为：按照下列组分分别进行配置，麦麸50克，马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾l.5克，硫酸镁0.75克，PH自然；

上述制作为：将以上配方制成液体培养基，装入1000ml摇瓶，放入搅拌子，塞好瓶口，包上防潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121℃-123℃，时间持续为30分钟，然后让其自然冷却，压力回零时，打开灭菌锅盖取出液体瓶。

6.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述c步骤按照以下方式进行：1）发酵罐灭菌处理；2）混合连续深层发酵液体培养基；3）装料灭菌；4）接种；5）混合发酵液体的培养；

上述混合连续深层发酵液体培养基按照下列组分进行配置，蔗糖50g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母提取物3g/L；无机离子（初始pH为5.6-6.0）：0.3g CaCl2·2H2O、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、1g NaCl，0.01g CuSO4·5H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnCl2·4H2O、0.01g ZnCl2，无机离子可配成10×母液在4℃保存，马铃薯200克，葡萄糖20克，PH自然；

上述接种是将培养好的伴生菌发酵菌种与冬虫夏草发酵菌种进行混合接种。

7.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述d步骤按照以下方式进行：使用过滤机在温度25～28℃开始过滤，回流过滤液10分钟，收集澄清的滤液，即得冬虫夏草发酵液；过滤所得的液体经超高温瞬时杀菌机杀菌，杀菌温度(110±5)℃，时间10秒，杀菌过的液体放至暂存罐急速冷却到50～55℃，进行浓缩；在真空度0.096～0.099兆帕、液体温度50～55℃、蒸汽压力0.196～0.294兆帕下浓缩，浓缩至可溶性固形物达42％～45％后进行二次杀菌；将浓缩好的液体用液体灌装机将液体装入专用瓶（袋）中，然后在90℃杀菌30分钟；将成品在-18～-25℃冷库中恒温冷藏。

8.根据权利要求1所述的冬虫夏草连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，其特征在于，所述e步骤按照以下方式进行：把过滤后的发酵固形物用低温冻干设备全部干燥后，再用低温磨粉设备磨成120目的细粉, 即得冬虫夏草发酵粉，再进行真空包装保存。