CN105001666A

CN105001666A - 一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用

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Publication number: CN105001666A
Application number: CN201510425675.5A
Authority: CN
Inventors: 傅南雁; 王桂美
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-07-20
Also published as: CN105001666B

Abstract

本发明公开了一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用，是将间氨基苯酚衍生物和方酸混合，溶于适当溶剂中，并在氮气保护下回流分水处理；然后将所得反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂，所得粗产品用二氯甲烷洗涤后经硅胶柱层析纯化，得所述非对称近红外方酸染料。本发明通过氧醚链的引入可有效提高方酸染料在水溶液中的溶解性，所得非对称近红外方酸染料稳定性好，光学性能优异，可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物，用于生物分子标记、分析和分离等多个领域。

Description

一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用。

背景技术

近红外荧光染料的发射波长在650-900 nm之间，在该范围内生物分子自身荧光较弱，可避免生物背景干扰而获得较高的分析灵敏度（施锋; 李宏洋; 彭孝军. 生物分析用近红外荧光染料研究进展. 精细化工 2003, 20 (5), 268-272.），且波长>650 nm的红光可以穿透动物皮肤和组织，因此，将近红外染料作为荧光探针应用于生物分析和细胞成像中已引起了广泛关注。

方酸染料是由方酸与富电子芳基化合物或苯胺类化合物缩合生成的1,3-二取代衍生物。该类化合物的显著特征是在可见光至近红外光区有狭窄而强的吸收带和较高的量子产率。这种光电特性主要来源于分子内强烈的供体-受体-供体（donor-acceptor-donor）间的电荷迁移作用。近年来，方酸染料以其优异的光学性能、良好的光稳定性备受关注，成为功能染料研究的热点之一。由于方酸染料具有的平面结构使其在极性溶剂中容易聚集，从而引起吸收带展宽和荧光淬灭；而在解聚集过程中荧光信号通常会发生恢复或者增强，这为设计“荧光增强型”探针提供了一种有趣的新途径。早期Buncel和McKerrow等人通过吸收光谱观察了方酸染料在不同比例有机溶剂与水的混合相中形成的聚集态吸收峰，在随后的研究中又指出发色团的结构会影响染料分子在溶液中的聚集模式（Buncel, E.; McKerrow, A. J.; Kazmaier, P. M. Solvent-controlled aggregation of a photoconductive dye. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992, (17), 1242-1243; McKerrow, A. J.; Buncel, E.; Kazmaier, P. M. Aggregation of squaraine dyes: structure-property relationships and solvent effects. Can. J. Chem. 1995, 73 (10), 1605-1615.）。2010年，Pang等人通过分子结构微小的变化，使方酸染料在含微量表面活性剂的溶液中组装得到H-聚集体和J-聚集体。形成的聚集态与生物大分子蛋白间的非共价作用力使得染料解聚集，释放荧光信号，实现了蛋白的选择性识别（Xu, Y.; Li, Z.; Malkovskiy, A.; Sun, S.; Pang, Y. Aggregation control of squaraines and their use as near-infrared fluorescent sensors for protein. J. Phys. Chem. B 2010, 114 (25), 8574-8580.）。本课题组利用配体二硫代氨基甲酸酯（dithiocarbamate，DTC）对重金属离子良好的亲和能力，设计了汞离子配位诱导解聚集型方酸染料比色荧光双响应探针。Hg²⁺与染料分子侧链DTC的结合形成空间位阻，引起染料解聚集，并使得溶液颜色由***变为蓝色，溶液荧光强度增强700倍，对汞离子的检测限可达到7.1 nM（Chen, C.; Wang, R.; Guo, L.; Fu, N.; Dong, H.; Yuan, Y. A squaraine-based colorimetric and “turn on” fluorescent sensor for selective detection of Hg²⁺ in an aqueous medium. Org. Lett. 2011, 13 (5), 1162-1165.）。但由于生物大分子大多是水溶性的，所以方酸染料在生物医学领域的应用不仅需要具有良好的光谱性能，更需要具有良好的水溶性。但是目前大多数方酸染料的水溶性较差，限制了其在生物医学方面的应用。

血清白蛋白是血液缓冲***的组分之一，具有营养作用，是维持血液胶体渗透压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体。牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）作为血浆的主要成分蛋白（0.38 g/mL），由于其分子量小、成本低、结构稳定、优异的结合性能以及与人血清白蛋白（Human Serum Albumin）的结构同源性而引起广泛的研究。本发明通过在方酸染料的侧链引入亲水性基团氧醚链，以增强其水溶性，所得非对称近红外方酸染料纯度高、稳定性好，可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物，用于血清蛋白等的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用，通过在方酸染料的侧链引入亲水性基团氧醚链，以增强其水溶性，所得染料稳定性好，光学性能优异，且合成方法简单，反应条件容易控制，产物纯度高，可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物，用于血清蛋白等的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种非对称近红外方酸染料，其结构式为：

。

所述非对称近红外方酸染料的制备方法包括以下步骤：

1）将方酸于溶剂中溶解后加入和，并在氮气保护下进行回流分水处理；

2）反应结束后，将所得反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；

3）所得粗产品经二氯甲烷洗涤后，采用硅胶柱层析进行梯度洗脱，得所述非对称近红外方酸染料。

上述步骤1）中所用、与方酸的摩尔比为2:4:3；所用溶剂为正丁醇和苯按体积比2:1混合而成。

步骤3）中所述梯度洗脱是先用二氯甲烷进行洗脱，再将二氯甲烷与甲醇按体积比100:1混合后进行洗脱。

其中，所述的合成方法包括如下步骤：

1）将间氨基苯酚、和碳酸钠混合，溶于异丙醇与水按体积比1:1混合的溶液中，在氮气保护下搅拌加热至85℃，然后回流反应48小时，反应完毕冷却至室温；

2）加入饱和食盐水混匀后，用二氯甲烷萃取，所得有机相用无水硫酸镁干燥后，旋蒸除去溶剂得粗产物；

3）将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。

所述的合成方法包括如下步骤：

1）将间氨基苯酚、溴乙烷和碳酸钠混合，溶于异丙醇与水按体积比1:1混合的溶液中，在氮气保护下搅拌加热至85℃，然后回流反应24小时，反应完毕冷却至室温；

3）将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。

所得非对称近红外方酸染可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物用于血清蛋白等的检测。

本发明的显著优点在于：本发明通过向苯胺侧链接入氧醚链，调节了染料的溶解性能和聚集行为，改善了其在水中的溶解性，从而影响了染料的光物理性质。所得非对称近红外方酸染料稳定性好，光学性能优异，可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物，用于生物分子标记、分析和分离等多个领域。

附图说明

图1为本发明非对称近红外方酸染料在不同溶剂中的吸收光谱变化图。

图2为本发明非对称近红外方酸染料在不同比例的乙醇-水溶液中的吸收光谱变化图。

图3为本发明非对称近红外方酸染料在pH 7.0的PB缓冲液（10 mM）中对不同浓度BSA的吸收光谱图（A）和荧光光谱图（B）（λ_ex=620 nm，PMT=650 V，slit=5 nm/5 nm）。

图4为本发明非对称近红外方酸染料在纯水中的粒径分布图（A）与滴加BSA后的粒径分布图（B）。

图5为本发明非对称近红外方酸染料在660 nm处荧光强度对BSA的响应随pH值变化趋势图（λ_ex=620 nm，PMT=650 V，slit=5 nm/5 nm）。

图6为本发明非对称近红外方酸染料在pH 7.0的PB缓冲液（10 mM）中滴加BSA及其它生物干扰物时的荧光光谱图（λ_ex=620 nm，PMT=650 V，slit=5 nm/5 nm）。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

合成的具体步骤：

在50 mL的洁净三口烧瓶中加入间氨基苯酚（0.196 g，1.80 mmol），（0.988 g，3.60 mmol），碳酸钠（0.267 g，2.52 mmol），再加入30 mL异丙醇-水混合液（1:1，v/v）溶解、混匀，在氮气保护下搅拌加热至85℃，然后回流反应48小时，TLC跟踪至原料点完全消失，即为反应终点。反应结束后，旋蒸除去反应混合液中的异丙醇。然后将生成物转移至100 mL的分液漏斗中，加入少量的饱和食盐水，然后用30 mL的二氯甲烷萃取三次，合并有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，静置，过滤除去硫酸镁，母液经旋蒸除去多余的二氯甲烷。所得物质用硅胶柱提纯，先以石油醚：乙酸乙酯（1.5:1，v/v）为洗脱剂除去杂质和单取代间羟基苯胺衍生物，再将洗脱剂极性增大为石油醚：乙酸乙酯（1:1，v/v），得到淡黄色的油状物0.200 g，即为目标的双取代间羟基苯胺衍生物，产率35 %。¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）：δ 7.01（t，J=8.4 Hz，1H），6.23（d，J=6.3 Hz，2H），6.17（d，J=8.1 Hz，1H），3.60（t，J=6.3 Hz，8H），3.53（dd，J=13.4，6.4 Hz，8H），3.39（s，6H）。¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）：δ 157.43，149.29，130.21，104.02，103.42，99.02，72.02，70.48，68.44，58.92，50.99。

实施例2

合成的具体步骤：

在100 mL的洁净三口烧瓶中加入间氨基苯酚（1.96 g，18.0 mmol）、碳酸钠（2.76 g，26.0 mmol）、溴乙烷（3.92 g，36.0 mmol），再加入60 mL异丙醇-水混合液（1:1，v/v）溶解、混匀，在氮气保护下搅拌加热至85℃，然后回流反应24小时，TLC跟踪至原料点完全消失，即为反应终点。反应结束后，旋蒸除去反应混合液中的异丙醇。然后将生成物转移至250 mL的分液漏斗中，加入少量的饱和食盐水，然后用30 mL的二氯甲烷萃取三次，合并有机层。用无水硫酸镁干燥有机层，静置，过滤除去硫酸镁，然后旋蒸除去多余的二氯甲烷。所得物质用硅胶柱提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯（10:1，v/v），得到***的油状物1.81 g，产率61%。¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）：δ 7.11（t，J=8.1 Hz，1H），6.36（d，J=8.3 Hz，1H），6.28（s，1H），6.24（d，J=7.9 Hz，1H），5.67（s，1H），3.34（q，J=7.0 Hz，4H），1.18（t，J=7.0 Hz，6H）。¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）：δ 156.95，149.53，130.25，105.58，103.67，100.20，44.62，12.43。

实施例3

非对称近红外方酸染料的具体制备方法如下：

在100 mL的三口瓶中分别加入方酸（43.3 mg，0.38 mmol），30 mL的正丁醇和15 mL的苯，在氮气保护下加热回流约1小时，当分水器中没有明显的水分离出来时，开始缓慢加入少量正丁醇溶解的（81.5 mg，0.26 mmol），反应20分钟之后加入少量正丁醇溶解的（84.3 mg，0.51 mmol），搅拌条件下分水回流2小时，停止反应，将反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂后，所得到的产物采用硅胶柱纯化，先用二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱，然后用二氯甲烷：甲醇（100:1，v/v）的洗脱液进行洗脱，得到目标产物57.5 mg，产率40%，熔点：154-156 ℃。¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）：δ 12.13（s，1H），11.43（s，1H），7.89（s，2H），6.41（dd，J=9.2，2.4 Hz，1H），6.38（dd，J=9.3，2.3 Hz，1H），6.17（d，J=2.4 Hz，1H），6.16（d，J=2.2 Hz，1H），3.70（dd，J=9.7，4.3 Hz，8H），3.60（dd，J=5.6，3.2 Hz，4H），3.52（dd，J=6.2，3.0 Hz，4H），3.48（q，J=7.1 Hz，4H），3.38（s，6H），1.26（t，J=7.1 Hz，6H）。¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）：δ 182.91，173.45，172.10，164.95，164.22，156.47，156.43，132.78，132.23，110.13，110.04，107.76，107.58，98.91，98.38，71.93，70.77，68.54，59.10，51.61，45.47，12.97。ESI-MS: m/z 579.5（[M+Na]⁺）。

通过向苯胺侧链接入氧醚链，可以调节染料的溶解性能和聚集行为，改善其在水中的溶解性，从而影响染料的光物理性质。该染料在纯水体系中处于聚集态，荧光淬灭，处于聚集态的染料与BSA间的非共价作用力使得染料解聚集，释放荧光信号，实现了荧光和比色双响应的蛋白标记。

图1为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在不同溶剂中的吸收光谱。从图1中可以看出，该染料在不同有机溶剂中的最大吸收位于638-654 nm 范围内，随溶剂极性增强，染料的最大吸收波长有所红移，表现出较小的正向溶剂化效应。在甲酸溶液中，标记物在450-600 nm处出现山峰状吸收峰，是方酸染料质子化后的吸收峰。在纯水体系中，单体吸收峰有明显的降低，在波长500 nm处出现明显的宽峰，这表明在纯水体系中染料以聚集态形式存在。

图2为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在不同比例的乙醇-水溶液中的吸收光谱。从图2中可以看出，当含水量为90%时，单体吸收峰开始有明显的降低，在波长500 nm处出现明显的宽峰，这表明体系中染料发生聚集，同时由此可以判断氧醚链的接入能够有效地提高方酸染料在水溶液中的溶解性并阻止聚集体的生成。

图3分别为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在pH 7.0的PB缓冲液（10 mM）中对不同浓度BSA水溶液的吸收光谱和荧光光谱变化图。从图中可以看出，向测试体系中加入BSA后，650 nm处的紫外吸收逐渐增强，而500 nm处的紫外吸收却逐渐减弱，表明方酸染料从聚集态逐渐解聚为单体形态，且染料的颜色从聚集态的***转变为解聚后的青蓝色。同时随着BSA的滴加，体系的荧光逐渐增强，因此该染料可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物。根据所测荧光强度的变化（λex=630 nm，slit: 5 nm/5 nm，PMT Volts: 750），绘制BSA浓度与荧光强度的关系曲线，并得到拟合曲线（k=2.68 × 10⁷ au/M，R²⁼0.9982），由此计算得检测限（LOD）为1.5 μg·mL^-1（3σ/k）。

图4分别为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在纯水中与加入BSA后溶液的粒径分布图。实验结果表明，该方酸染料在纯水中以聚集体形式存在，平均粒径约为581 nm，加入BSA后，平均粒径降为338 nm，证明染料在BSA的作用下发生了解聚集。

图5为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在660 nm处对BSA的荧光强度随pH值变化的趋势图。由图5可以看出，在pH=7.0的情况下，荧光强度最强，效果最好，说明该染料在中性的条件下可以与BSA有效地结合并提高荧光强度，有望在生物体系内实现对蛋白的标识。

图6为本发明非对称近红外方酸染料（浓度为1.0 μM）在pH 7.0的PB缓冲液（10 mM）中对滴加BSA及胰蛋白酶、脂肪酶等蛋白酶，脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸等小分子氨基酸及谷胱甘肽等其它干扰物时的荧光光谱变化图。由图6可知，该染料可以与BSA通过非共价作用引起染料的解聚集，从而导致吸收光谱的红移和荧光的释放，且该蛋白标记物仅对BSA有光谱响应，而对胰蛋白酶、脂肪酶等蛋白酶，脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸等小分子氨基酸及谷胱甘肽等多种干扰物无响应，可以实现对BSA的特异性识别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种非对称近红外方酸染料，其特征在于：其结构式为：

。

2.一种如权利要求1所述非对称近红外方酸染料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述非对称近红外方酸染料的制备方法，其特征在于：所述的合成方法包括如下步骤：

3）将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。

4.根据权利要求2所述非对称近红外方酸染料的制备方法，其特征在于：所述的合成方法包括如下步骤：

3）将所得粗产物经硅胶柱层析纯化即得成品。

5.根据权利要求2所述非对称近红外方酸染料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所用、与方酸的摩尔比为2:4:3；所用溶剂为正丁醇和苯按体积比2:1混合而成。

6.根据权利要求2所述非对称近红外方酸染料的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述梯度洗脱是先用二氯甲烷进行洗脱，再将二氯甲烷与甲醇按体积比100:1混合后进行洗脱。

7.一种如权利要求1所述非对称近红外方酸染料的应用，其特征在于：作为荧光和比色双响应的蛋白标记物。