CN102321769B - 鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用。本发明提供的PCR引物对组合物由引物对NDV、引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V组成；该PCR引物对组合物可用于制备诊断或辅助诊断新城疫和禽流感试剂，或制备鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒试剂。使用本发明所提供的PCR引物对组合物同时检测新城疫病毒、H3、H5和H9亚型禽流感病毒的特异性强，灵敏度分别为1EID₅₀/100μl、1EID₅₀/100μl、1×10^-2EID₅₀/100μl和1EID₅₀/100μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％，适合开发相应的多重RT-PCR试剂盒，以用于新城疫和禽流感的临床诊断和流行病控制。

Description

鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及一种鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用。

背景技术

禽流感和新城疫分别是由禽流感病毒和新城疫病毒引起的两种病毒性传染病。两种传染病发病急，传播快，发病率高，对养殖业可造成致命性的打击。流行于我国鸡群的禽流感病毒的亚型主要为H5和H9亚型。流感病毒极易发生基因变异，从而导致抗原性的改变。因此，虽然我国已全面采取免疫措施，但H5和H9亚型流感病毒仍然在鸡群中反复发生。H5和H9亚型禽流感病毒基因和抗原特性的变异，导致常规血清学方法及分子生物学监测方法无法检出流行毒株，因此需要建立一种能够检出当前流行毒株的通用性良好的检测方法。此外，流行病学调查表明，我国大部分地区鸡群存在H3亚型流感病毒的血清阳性抗体，且有从鸡群中分离到H3亚型禽流感病毒的报道，因此，H3亚型禽流感病毒也应作为流感病毒监测的对象之一。近年来，新城疫病毒和禽流感病毒引起鸡群发病的临床症状趋于相似，无法用常规临床诊断方法进行确诊，迫切需要建立一种检测方法用于新城疫和禽流感的鉴别诊断。

对于传统的检测方法，如病毒分离、血凝抑制试验、神经氨酸酶试验等，费时、费力，不能做出快速而及时的诊断；而且不能在同一检测反应中检测不同的对象，即无法同时进行鉴别诊断。RT-PCR方法具有敏感性高、特异性好、省时等特点，而且多重RT-PCR方法可以在一个反应中同时检测多种病原。目前，国内外还没有能够同时检测新城疫和H3、H5、H9亚型禽流感病毒的多重RT-PCR方法。因此，临床上，迫切需要一种能快速鉴别诊断新城疫和不同亚型禽流感病毒的检测方法，不但能够确定病毒是否为新城疫病毒或禽流感病毒，还能够确定禽流感病毒的亚型，而且对当前的流行毒株具有很好的检测覆盖性。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用。

本发明所提供的鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对为PCR引物对组合物A，是下述1)-4)中的任意一种：

1)所述PCR引物对组合物A由如下4个引物对组成：引物对NDV、引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述引物对NDV、引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V均由两条单链DNA组成；

所述引物对NDV为序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H3V为序列表中序列3所示的单链DNA和序列表中序列4所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H5V为序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H9V为序列表中序列7所示的单链DNA和序列表中序列8所示的单链DNA组成的引物对；

2)所述PCR引物对组合物A由如下3个引物对组成：所述引物对NDV、引物对H3V和引物对H5V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒中的至少一种；

3)所述PCR引物对组合物A由如下3个引物对组成：所述引物对NDV、引物对H3V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

4)所述PCR引物对组合物A由如下3个引物对组成：所述引物对NDV、引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒的PCR引物对组合物B，是下述5)-8)中的任意一种：

5)所述PCR引物对组合物B由如下3个引物对组成：所述引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

6)所述PCR引物对组合物B由如下2个引物对组成：所述引物对H3V和引物对H5V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒和H5亚型禽流感病毒中的至少一种；

7)所述PCR引物对组合物B由如下2个引物对组成：所述引物对H3V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

8)所述PCR引物对组合物B由如下2个引物对组成：所述引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种。

本发明还保护鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的所述引物对H5V。

所述1)的PCR引物对组合物A中序列表序列1、2、3、4、5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1；所述2)的PCR引物对组合物A中序列表序列1、2、3、4、5和6所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1；所述3)的PCR引物对组合物A中序列表序列1、2、3、4、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1；所述4)的PCR引物对组合物A中序列表序列1、2、5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1。

所述5)的PCR引物对组合物B中序列表序列3、4、5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1；所述6)的PCR引物对组合物B中序列表序列3、4、5和6所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1；所述7)的PCR引物对组合物B中序列表序列3、4、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1；所述8)的PCR引物对组合物B中序列表序列5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1∶1∶1∶1。

本发明保护下述a)-f)中的任意一种用途：

a)所述PCR引物对组合物A在制备诊断或辅助诊断新城疫和禽流感试剂或试剂盒中的应用；

b)所述PCR引物对组合物B在制备诊断或辅助诊断禽流感试剂或试剂盒中的应用；

c)所述PCR引物对H5V在制备诊断或辅助诊断H5亚型禽流感试剂或试剂盒中的应用。

d)所述PCR引物对组合物A在制备鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用；

e)所述PCR引物对组合物B在制备鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用；

f)所述PCR引物对H5V在制备鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用。

本发明还保护下述A)-C)中的任意一种试剂：

A)鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的试剂，所述试剂中含有所述PCR引物对组合物A；

B)鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒的试剂，所述试剂中含有所述PCR引物对组合物B；

C)鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的试剂，所述试剂中含有所述PCR引物对H5V。

本发明还保护下述D)-F)中的任意一种PCR试剂盒：

D)鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒中含有所述A)试剂；

E)鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒中含有所述B)试剂；

F)鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒中含有所述C)试剂。

本发明还保护下述G)-I)中的任意一种制备方法：

G)所述制备方法包括将所述PCR引物对组合物A的单链DNA分别单独包装的步骤；

H)所述制备方法包括将所述PCR引物对组合物B的单链DNA分别单独包装的步骤；

I)所述制备方法包括将所述引物对H5V的单链DNA分别单独包装的步骤。

本发明还保护所述PCR试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将所述PCR引物对组合物A、所述PCR引物对组合物B或所述PCR引物对H5V的单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内：DNA聚合酶和下述4种dNTP：dATP，dTTP，dCTP和dGTP。

本发明所提供的PCR引物对可检测的病毒种类及其分支或基因型分别如下：PCR引物对NDV可检测不同基因型的新城疫病毒，具体可为II型、III型、VII型或IX型新城疫病毒；PCR引物对H3V可检测不同类型的H3亚型禽流感病毒，具体可为H3N8亚型禽流感病毒；PCR引物对H5V可检测不同类型及不同分支的H5亚型禽流感病毒，具体可为2.3.2分支、2.3.4分支或7分支的H5N1亚型禽流感病毒；PCR引物对H9V可检测不同类型及不同分支的H9亚型禽流感病毒，具体可为G1-like分支或BJ/94-like分支的H9N2亚型禽流感病毒；但不限于上述病毒的上述类型及其分支或基因型。

本发明所提供的PCR引物对可检测的病毒来源分别如下：PCR引物对NDV可检测鸡源和鸭源的新城疫病毒，PCR引物对H3V可检测鸭源的H3亚型禽流感病毒，PCR引物对H5V可检测鸡源、鸭源和麻雀源的H5亚型禽流感病毒；PCR引物对H9V可检测鸡源、鸭源或鹌鹑源的H9亚型禽流感病毒；但不限于上述病毒的上述来源。

使用本发明所提供的4种引物对同时用于检测新城疫病毒、H3、H5和H9亚型禽流感病毒的特异性强，灵敏度分别为1EID₅₀/100μl、1EID₅₀/100μl、1×10^-2EID₅₀/100μl和1EID₅₀/100μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明与现有技术相比，具有单一RT-PCR技术的灵敏度高、特异性强、准确率高，一次RT-PCR可以实现对临床样品中4种病毒即新城疫病毒、H3、H5和H9亚型禽流感病毒的检测，且能够检出近年来我国禽群中的流行毒株，成本更低，适合开发相应的多重RT-PCR试剂盒，以用于新城疫和禽流感的临床诊断和流行病控制。

附图说明

图1为引物对NDV的特异性检测。其中，M为Maker，1-6分别为感染新城疫病毒F48E9、Chicken/Henan/2009、Chicken/ShangDong/2010、Chicken/Hebei/2010、Duck/ShangDong/2011或HG/Beijing/2009的样品，7-11分别为感染H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的样品，12为阴性鸡胚尿囊液对照。

图2为引物对H3V的特异性检测。其中，M为Maker，1-6分别为感染H3亚型禽流感病毒A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005或A/Duck/BeiJing/61/2005的样品，7-11分别为感染H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的样品，12为阴性鸡胚尿囊液对照。

图3为引物对H5V的特异性检测。其中，M为Maker，1-6分别为感染H5亚型禽流感病毒A/Chicken/Huabei/202/2010、A/Duck/Huabei/1/2011、A/treesparrow/Jiangsu/1/2008、A/Chicken/Huabei/204/2010、A/Duck/Huabei/7/2009或A/Chicken/Huabei/7/2011的样品，7-11分别为感染H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的样品，12为阴性鸡胚尿囊液对照。

图4为引物对H9V的特异性检测。其中，M为Maker，1-6分别为感染H9亚型禽流感病毒A/Quail/HongKong/G1/1997、A/Chicken/Beijing/3/1999、A/Chicken/FX/01/2010、A/Duck/ShangDong/2CP/2010、A/Chicken/Sichuan/8/2011或A/Duck/ZhuCheng/1/2011的样品，7-11分别为感染H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的样品，12为阴性鸡胚尿囊液对照。

图5为四重RT-PCR的特异性检测。其中，M为Maker，1为分别感染H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999、H5亚型禽流感病毒A/treesparrow/Jiangsu/1/2008、H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004和新城疫病毒HG/Beijing/2009的cDNA样品的混合物，2-5分别为感染H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999、H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008、新城疫病毒HG/Beijing/2009和H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004的cDNA样品，6-10分别为感染H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、IBV、IBDV和呼肠孤病毒的样品，11为阴性鸡胚尿囊液对照。

图6为四重RT-PCR分别检测新城疫、H3、H5或H9亚型禽流感病毒的不同毒株感染的鸡胚尿囊液样品结果。其中图(a)为H3亚型禽流感病毒，图(b)为H5亚型禽流感病毒，图(c)为H9亚型禽流感病毒，图(d)为新城疫病毒；图(a)-(d)中的M为分子量Maker，1同图5中1的样品；图(a)-(d)中的2-7分别同图2、3、4、1中1-6的样品；8为阴性鸡胚尿囊液对照。

图7为引物对H3V、H5V、H9V及NDV分别对H3、H5、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒的灵敏度测定。其中，H3代表H3亚型禽流感病毒，H5代表H5亚型禽流感病毒，H9代表H9亚型禽流感病毒，ND代表新城疫病毒；图中1-7分别为不同含量的H3、H5、H9亚型禽流感病毒或新城疫病毒，依次为1×10⁴EID₅₀/100μl、1×10³EID₅₀/100μl、1×10²EID₅₀/100μl、1×10EID₅₀/100μl、1EID₅₀/100μl、1×10^-1EID₅₀/100μl、1×10^-2EID₅₀/100μl，8为阴性鸡胚尿囊液对照。

图8为四重RT-PCR方法的灵敏度检测。其中，图(a)为四重RT-PCR分别对不同含量的H3、H5、H9亚型禽流感病毒或新城疫病毒的样品检测，其中的H3代表H3亚型禽流感病毒，H5代表H5亚型禽流感病毒，H9代表H9亚型禽流感病毒，ND代表新城疫病毒，1-7分别为不同含量的H3、H5、H9亚型禽流感病毒或新城疫病毒的样品，样品的各病毒含量依次为1×10⁴EID₅₀/100μl、1×10³EID₅₀/100μl、1×10²EID₅₀/100μl、1×10¹EID₅₀/100μl、1EID₅₀/100μl、1×10^-1EID₅₀/100μl、1×10^-2EID₅₀/100μl，8为阴性鸡胚尿囊液对照；图(b)为四重RT-PCR方法对含H3、H5、H9亚型禽流感病毒或新城疫病毒的样品的混合物的灵敏度检测，M为Maker；1-5分别为不同稀释度的病毒样品混合物，每种样品混合物中各病毒的含量依次为1×10³EID₅₀/100μl、1×10²EID₅₀/100μl、1×10¹EID₅₀/100μl、1EID₅₀/100μl、1×10^-1EID₅₀/100μl，6为阴性鸡胚尿囊液对照。

图9为二重和三重RT-PCR方法对禽流感病毒和新城疫病毒的检测。其中，M为Maker；1为引物对H9V、H5V和NDV组合，2为引物对H9V、H3V和NDV组合，3为引物对H5V、H3V和NDV组合，4为引物对H9V、H5V和H3V组合，5为引物对H5V和H3V组合，6为引物对H9V和H3V组合，7为引物对H3V和NDV组合，8为引物对H9V和H5V组合，9为引物对H5V和NDV组合，10为引物对H9V和NDV组合，11为阴性鸡胚尿囊液对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所使用的病毒毒株信息如下：

表1 本发明所使用的毒株信息

实施例1、PCR引物对设计

利用GenBank中的新城疫病毒和禽流感病毒最新序列，针对H3亚型、H5亚型和H9亚型禽流感病毒HA基因以及新城疫病毒F基因设计4对引物如下：

以新城疫病毒F基因为靶基因设计的引物对NDV：

上游引物NDV-275F：5’-TCACTCCTCTTGGCGACTC-3’(序列表序列1序列)；

下游引物NDV-556R：5’-CAAACTGCTGCATCTTCC-3’(序列表序列2序列)；

以H3亚型禽流感病毒HA基因为靶基因的引物对H3V：

上游引物H3-622F：5’-TTCACCACCCGAGCACAA-3’(序列表序列3序列)；

下游引物H3-837R：5’-GGGCGATTAGGTTTCCATTA-3’(序列表序列4序列)；

以H5亚型禽流感病毒HA基因为靶基因的引物对H5V：

上游引物H5-299F：5’-ACCCAGCCAATGACCTCT-3’(序列表序列5序列)；

下游引物H5-718R：5’-CACTTTGCCCGTTTACTT-3’(序列表序列6序列)；

以H9亚型禽流感病毒HA基因为靶基因的引物对H9V：

上游引物H9-544F：5’-ATTCAAGACGCCCAATACAC-3’(序列表序列7序列)；

下游引物H9-1092R：5’-TGACCAACCTCCCTCTATGA-3’(序列表序列8序列)。

上述4对引物的退火温度均为51℃。

引物对NDV的靶序列为Genbank HQ917083的第275-293和第539-556位。

引物对H3V的靶序列为Genbank EU492531的第622-639位和第818-837位。

引物对H5V的靶序列为Genbank DQ993028的第299-316位和第701-718位。

引物对H9V的靶序列为Genbank HM773439的第544-563位和第1073-1092位。

实施例2、PCR引物对的特异性检测

一、引物对NDV的特异性检测

1、总RNA提取及质量控制

分别取感染新城疫病毒F48E9、Chicken/Henan/2009、Chicken/ShangDong/2010、Chicken/Hebei/2010、Duck/ShangDong/2011或HG/Beijing/2009(Rui，Z.，Juan，P.，Jingliang，S.，Jixun，Z.，Xiaoting，W.，Shouping，Z.，Xiaojiao，L.and Guozhong，Z.，2010a.Phylogenetic characterization of Newcastle disease virus isolatedin the mainland of China during 2001-2009.Vet Microbiol 141，246-57.)的鸡胚尿囊液以及感染类似新城疫病毒的H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的鸡胚尿囊液及阴性鸡胚尿囊液，分别提取总RNA(方法同实施例4)。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

2、反转录合成cDNA

用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将步骤1的总RNA样品进行反转录，得到cDNA；DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系(20μL)：1μL Oligo引物(20pmol/μL)，4μL Reaction(5×)，1μLRibolock^TM Rnase Inhibitor(20U/μL)，2μL 10mM dNTPMix，1μL RevertAid^TM M-MuLVReverse Transcriptase(200U/μL)，650ng总RNA，DEPC水补足至20μL。

反应条件：加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65℃ 5min后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37℃ 1h，再70℃ 5min，4℃保存。

3、PCR扩增检测引物对的特异性

以引物对NDV为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，cDNA2μL，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图1)，F48E9、Chicken/Henan/2009、Chicken/ShangDong/2010、Chicken/Hebei/2010、HG/Beijing/2009和Duck/ShangDong/2011感染的鸡胚尿囊液样品中均得到一条大小在200-300bp之间的PCR产物条带，经测序得知该条带的大小均为282bp；阴性鸡胚尿囊液及H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV和REO感染的鸡胚尿囊液样品中在200-300bp之间无PCR产物条带。结果表明，引物对NDV的特异性很好，可以特异检测新城疫病毒。

二、引物对H3V的特异性检测

1、总RNA提取及质量控制

分别取感染H3亚型禽流感病毒A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005或A/Duck/BeiJing/61/2005(Pu，J.，Liu，Q.F.，Xia，Y.J.，Fan，Y.L.，Brown，E.G.，Tian，F.L.and Liu，J.H.，2009.Genetic analysis ofH3 subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern Chinaduring 2004-2005.Virus Genes 38，136-42.)的鸡胚尿囊液和感染类似H3亚型禽流感病毒的H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的鸡胚尿囊液及阴性鸡胚尿囊液，分别提取总RNA(方法同实施例4)。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的步骤2。

3、PCR扩增检测引物对的特异性

以引物对H3V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列3引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列4引物0.5μL，cDNA2μL，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图2)，A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005或A/Duck/BeiJing/61/2005感染的鸡胚尿囊液样品中均得到一条大小在200-300bp之间的PCR产物条带，经测序得知该条带的大小均为216bp。阴性鸡胚尿囊液及H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV或REO感染的鸡胚尿囊液样品中在200-300bp之间无PCR产物条带。结果表明，引物对H3V的特异性很好，可以特异检出H3亚型禽流感病毒。

三、引物对H5V的特异性检测

1、总RNA提取及质量控制

分别取感染H5亚型流感病毒A/Chicken/Huabei/202/2010、A/Duck/Huabei/1/2011、A/Chicken/Huabei/204/2010、A/Duck/Huabei/7/2009、A/Chicken/Huabei/7/2011或A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008(Liu，Q.，Ma，J.，Kou，Z.，Pu，J.，Lei，F.，Li，T.and Liu，J.，2010b.Characterization of a highlypathogenic avian influenza H5N1 clade 2.3.4 virus isolated from a tree sparrow.Virus Res 147，25-9.)的鸡胚尿囊液和感染类似H5亚型禽流感病毒的H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)的鸡胚尿囊液及阴性鸡胚尿囊液，分别提取总RNA(方法同实施例4)。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的步骤2。

3、PCR扩增检测引物对的特异性

以引物对H5V为引物，对步骤2)得到的cDNA样品进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列5引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列6引物0.5μL，cDNA2μL，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图3)，A/Chicken/Huabei/202/2010、A/Duck/Huabei/1/2011、A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008、A/Chicken/Huabei/204/2010、A/Duck/Huabei/7/2009或A/Chicken/Huabei/7/2011感染的鸡胚尿囊液样品中均得到一条大小在400-500bp之间的PCR产物条带经测序得知该条带的大小均为420bp。阴性尿囊液及H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV或REO感染的鸡胚尿囊液样品中在400-500bp之间无PCR产物条带。结果表明，引物对H5V的特异性很好，可以特异检出H5亚型禽流感病毒。

四、引物对H9V的特异性检测

1、总RNA提取及质量控制

分别取感染H9亚型禽流感病毒A/Chicken/FX/01/2010、A/Duck/ShangDong/2CP/2010、A/Chicken/Sichuan/8/2011、A/Duck/ZhuCheng/1/2011、A/Quail/HongKong/G1/1997或A/Chicken/Beijing/3/1999(Sun，Y.，Pu，J.，Jiang，Z.，Guan，T.，Xia，Y.，Xu，Q.，Liu，L.，Ma，B.，Tian，F.，Brown，E.G.and Liu，J.，2010.Genotypic evolution and antigenic drift ofH9N2 influenza viruses in China from 1994 to 2008.Vet Microbiol 146，215-25.)的鸡胚尿囊液和感染类似H9亚型禽流感病毒的H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV、或呼肠孤病毒的鸡胚尿囊液及阴性鸡胚尿囊液样品，分别提取总RNA(总RNA提取方法同实施例4)。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的步骤2。

3、PCR扩增检测引物对的特异性

以引物对H9V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列7引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列8引物0.5μL，cDNA2μL，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图4)，A/Quail/HongKong/G1/1997、A/Chicken/Beijing/3/1999、A/Chicken/FX/01/2010、A/Duck/ShangDong/2CP/2010、A/Chicken/Sichuan/8/2011或A/Duck/ZhuCheng/1/2011感染的鸡胚尿囊液样品中均得到一条大小在500-600bp之间的PCR产物条带经测序得知该条带的大小均为549bp。阴性尿囊液及H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV或REO感染的鸡胚尿囊液样品中在500-600bp之间无PCR产物条带。结果表明，引物对H9V的特异性很好，可以特异检出H9亚型禽流感病毒。

五、引物对NDV、H3V、H5V和H9V混合后的特异性检测

将引物对NDV、H3V、H5V和H9V同时加入同一个PCR反应体系，分别对新城疫病毒HG/Beijing/2009、H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004、H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008、H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999、H4N6亚型禽流感病毒A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/1/2003、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO)感染的鸡胚尿囊液的cDNA样品及分别感染上述前4个病毒毒株的鸡胚尿囊液的cDNA样品的混合物进行检测(结果如图5所示)；并对上述步骤一至四中的cDNA样品进行检测(结果如图6(a)-(d)所示)。

反应体系(25μL)：反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列3引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列4引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列5引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列6引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列7引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列8引物0.5μL，8μL cDNA(4种样品的cDNA各2μL混合)或2μL cDNA(一种毒株感染的样品)，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5和图6。在新城疫病毒HG/Beijing/2009、H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004、H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008和H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999分别感染的混合样品中同时扩增出4条PCR产物条带，经测序分别为216bp、282bp、420bp、549bp，4种病毒的不同毒株分别感染的样品中均可扩增出步骤一至四中相应的条带，在阴性尿囊液及H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、IBV、IBDV和呼肠孤病毒感染的样品中无任何特异条带。

上述结果表明：引物对NDV、H3V、H5V和H9V混合后对各引物对的特异性无影响，可在一个样品一个反应中同时特异检测新城疫病毒、H3亚型、H5亚型和H9亚型禽流感病毒。

实施例3、PCR引物对的灵敏度检测

一、引物对NDV的灵敏度检测

1、总RNA提取和各个稀释液的制备

取感染新城疫病毒HG/Beijing/2009的鸡胚尿囊液，采用Reed-Muench法进行病毒EID₅₀的测定，获得此新城疫病毒在鸡胚尿囊液中的含毒量。根据此病毒含量，用无菌PBS将此鸡胚尿囊液稀释为病毒浓度为10⁶EID₅₀/100μl(如鸡胚尿囊液的病毒浓度为10⁷EID₅₀/100μl，则进行10倍稀释(10⁷/10⁶＝10))，然后在此基础上进行10倍倍比稀释，各个稀释液中，病毒含量分别为10⁵EID₅₀/100μl、10⁴EID₅₀/100μl、10³EID₅₀/100μl、10² EID₅₀/100μl、10¹EID₅₀/100μl、10⁰EID₅₀/100μl、10^-1 EID₅₀/100μl、10^-2EID₅₀/100μl。测定病毒浓度在10⁴EID₅₀/100μl-10^-2 EID₅₀/100μl之间样品的检测敏感性。取10⁴EID₅₀/100μl-10^-2 EID₅₀/100μl之间各稀释度的尿囊液样品，分别提取总RNA(总RNA提取方法同实施例4)。

2、反转录合成cDNA

用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将各个稀释液中提取的总RNA进行反转录，得到cDNA；阴性鸡胚尿囊液的反转录产物作为总RNA的对照。

反应体系(20μL)：1μL Oligo引物(20pmol/μL)，4μL Reaction(5×)，1μL Ribolock^TMRnase Inhibitor(20U/μL)，2μL 10mM dNTP Mix，1μL RevertAi^TM M-MuLV ReverseTranscriptase(200U/μL)，11μL总RNA，DEPC水补足至20μL。

反应条件：加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65℃ 5min后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37℃ 1h，再70℃ 5min，4℃保存。

3、PCR扩增检测引物对的灵敏度

以引物对NDV为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，cDNA 2μL，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图7中的ND)，1EID₅₀/100μl及以上病毒浓度样品的总RNA中可观察到282bp的扩增条带。结果表明，引物对HDV的检测灵敏度可达1 EID₅₀/100μl，即检测样本的病毒含量下限为1 EID₅₀/100μl。

二、引物对H3V的灵敏度检测

1、总RNA提取和各个稀释液的制备

取感染H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004的鸡胚尿囊液，制备方法同步骤一中的1。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的2。

3、PCR扩增检测引物对的灵敏度

以引物对H3V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增，方法同步骤一中的3。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图7中的H3)，1EID₅₀/100μl及以上病毒浓度样品的总RNA中可观察到216bp的扩增条带。结果表明，引物对H3V的检测灵敏度可达1EID₅₀/100μl，即检测样本的病毒含量下限为1EID₅₀/100μl。

三、引物对H5V的灵敏度检测

1、总RNA提取和各个稀释液的制备

取感染H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008的鸡胚尿囊液，制备方法同步骤一中的1。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的2。

3、PCR扩增检测引物对的灵敏度

以引物对H5V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增，方法同步骤一中的3。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图7中的H5)，1×10^-2EID₅₀/100μl及以上病毒浓度样品的总RNA中可观察到420bp的扩增条带。结果表明，引物对H5V的检测灵敏度可达1×10^-2EID₅₀/100μl，即检测样本的病毒含量下限为1×10^-2EID₅₀/100μl。

四、引物对H9V的灵敏度检测

1、总RNA提取和各个稀释液的制备

取感染H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999的鸡胚尿囊液，制备方法同步骤一中的1。

2、反转录合成cDNA

方法同步骤一中的2。

3、PCR扩增检测引物对的灵敏度

以引物对H9V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增，方法同步骤一中的3。

电泳：取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图7中的H9)，1EID₅₀/100μl及以上病毒浓度样品的总RNA中可观察到549bp的扩增条带。结果表明，引物对H9V的检测灵敏度可达1EID₅₀/100μl，即检测样本的病毒含量下限为1EID₅₀/100μl。

五、引物对NDV、H3V、H5V和H9V混合后各引物对的灵敏度检测

1、将引物对NDV、H3V、H5V和H9V同时加入同一个PCR反应体系，分别对上述一至四中不同病毒感染的不同病毒含量的cDNA样品分别单独进行检测。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列3引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列4引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列5引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列6引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列7引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列8引物0.5μL，2μL cDNA，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 45s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 10h。

电泳：取PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图8(a))，对H3亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液各稀释度样品的检测中，10⁴EID₅₀/100μl-10¹EID₅₀/100μl之间稀释度的样品可以观察到216bp的PCR产物条带，10⁰EID₅₀/100μl-10^-2EID₅₀/100μl之间稀释度的样品未观察到216bp的PCR产物条带；对H5亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液各稀释度样品的检测中，10⁴EID₅₀/100μl-10^-1EID₅₀/100μl之间稀释度的样品可以观察到420bp的PCR产物条带，10^-2EID₅₀/100μl稀释度的样品未观察到420bp的PCR产物条带；对H9亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液各稀释度样品的检测中，10⁴EID₅₀/100μl-10⁰EID₅₀/100μl之间稀释度的样品可以观察到549bp的PCR产物条带，10^-1EID₅₀/100μl-10^-2EID₅₀/100μl稀释度的样品未观察到549bp的PCR产物条带；对新城疫病毒感染的鸡胚尿囊液各稀释度样品的检测中，10⁴EID₅₀/100μl-10⁰EID₅₀/100μl之间稀释度的样品可以观察到282bp的PCR产物条带，10^-1EID₅₀/100μl-10^-2EID₅₀/100μl稀释度的样品未观察到282bp的PCR产物条带(上述4种产物条带的大小均经测序得知)。

结果表明，引物对H3V、H5V、H9V和NDV混合后各引物对的灵敏度分别为：10¹EID₅₀/100μ、10^-1EID₅₀/100μl、1 EID₅₀/100μl和1 EID₅₀/100μl。

2、将引物对NDV、H3V、H5V和H9V同时加入同一个PCR反应体系，分别对不同浓度的混合样品进行检测，方法及结果如下：

首先根据步骤一至四中步骤1中测得的各病毒含量，通过计算，将各含毒尿囊液分别进行稀释，并将稀释后的分别含各病毒的鸡胚尿囊液混合，使各病毒在混合液中含量均达10⁶EID₅₀/100μl，然后在此基础上进行10倍倍比稀释，得到8种混合液，每种混合液中的各病毒含量均为10⁵EID₅₀/100μl、10⁴EID₅₀/100μl、10³EID₅₀/100μl、10²EID₅₀/100μl、10¹EID₅₀/100μl、10⁰EID₅₀/100μl、10^-1EID₅₀/100μl或10^-2EID₅₀/100μl的。测定混合的引物对对病毒浓度在10³EID₅₀/100μl-10^-1EID₅₀/100μl之间的样品的敏感性。首先，取10³EID₅₀/100μl-10^-1EID₅₀/100μl之间各稀释度的尿囊液样品，分别提取总RNA(总RNA提取方法同实施例4)。

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列3引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列4引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列5引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列6引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列7引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列8引物0.5μL，2μL cDNA，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 45s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 10h。

电泳：取PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳(结果如图8(b))，同时检测H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒或新城疫病毒感染的鸡胚尿囊液各稀释度混合样品中，10³EID₅₀/100μl-10¹EID₅₀/100μl之间稀释度的样品均可观察到216bp、282bp、420bp、549bp的PCR产物条带，在1EID₅₀/100μl稀释度的样品中只观察到420bp的PCR产物条带，阴性鸡胚尿囊液和10^-1EID₅₀/100μl稀释度的样品均未观察到上述4种PCR产物条带的任意一种(上述4种条带的大小均经测序得知)。

结果表明，引物对H3V、H5V、H9V和NDV混合后同时检测H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒的混合物的灵敏度为10EID₅₀/100μl。

实施例4、引物对检测的准确率

一、四种引物对混合检测的准确率

以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为新城疫病毒HG/Beijing/2009、H3亚型禽流感病毒A/Duck/BeiJing/40/2004、H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008或H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999感染的鸡的肺组织样品各10个、从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的组织样品和PBS为阴性对照，以上述4种病毒分别感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，提取总RNA，反转录后，将引物对NDV、H3V、H5V和H9V同时加入同一个PCR反应体系，进行PCR反应，过程如下：

1、样品的采集和处理

鸡的组织样品：取肺的组织；鸡和鸭的棉拭子样品：取咽拭子和泄殖腔拭子；2-8℃保存，送实验室检测。要求送检样品新鲜。

2、样本液的制备：

(1)组织样品：称取100mg组织样品置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)研磨，把研磨好的组织样品移至1.5ml离心管中，4℃ 8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl上述裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。

(2)棉拭子样品：将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4℃ 8000rpm离心5min，取上清液250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。

(3)阴性对照(PBS)：取灭菌双蒸水250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。

3、总RNA提取

1)取处理后的样本液(鸡胚尿囊液无需处理即可作为样本液)300μl，加900ulTRIZOL(15596-018，Invitrogen)，轻轻颠倒混匀数次，冰浴10min。

2)加200μl氯仿，颠倒混匀15s，冰浴5min，4℃离心，13000r/m，15min。

3)取700ul上清移入新的离心管，加入等量的异丙醇，轻轻颠倒混匀，混匀后，4℃离心，13000r/m，15min。

4)弃上清，贴壁缓缓加1ml 75％DEPC处理过的酒精，加完后轻转两圈。

5)4℃，13000r/m，5min。

6)倒上清，置于冰上风干5-10min。

7)用15μL DEPC水和1μL RNA酶抑制剂(200U/μL，#k1622，Fermentas)溶解沉淀，即用或-80℃保存备用。

4、反转录

用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将步骤3获得的总RNA样品进行反转录，得到cDNA；DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系(20μL)：1μL Oligo引物(20pmol/μL)，4μL Reaction(5×)，1μL Ribolock^TMRnase Inhibitor(20U/μL)，2μL 10mM dNTP Mix，1μL RevertAid^TM M-MuLV ReverseTranscriptase(200U/μL)，11μL总RNA，DEPC水补足至20μL。

反应条件：加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65℃ 5min后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37℃ 1h，再70℃ 5min，4℃保存。

5、四重RT-PCR检测

反应体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer(AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μL序列表序列1引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列2引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列3引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列4引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列5引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列6引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列7引物0.5μL，浓度为20pmol/μL序列表序列8引物0.5μL，2μL cDNA，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 45s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

6、电泳

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果：新城疫病毒HG/Beijing/2009、H3亚型禽流感病毒A/Duck/BeiJing/40/2004、H5亚型禽流感病毒A/treesparrow/Jiangsu/1/2008或H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999感染的鸡胚尿囊液混合物出现216bp、282bp、420bp和549bp扩增带，空白对照PBS、健康鸡和鸭的样品无上述4种扩增带，被检样品中部分出现549bp、420bp、282bp或216bp扩增带，表明样品中含有H9亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒或H3亚型禽流感病毒，各被检样品的检测结果如下：

H3亚型禽流感病毒感染的鸡的肺组织样品10个全部呈阳性；H5亚型禽流感感染的鸡的肺组织样品10个全部呈阳性；H9亚型禽流感感染的鸡的肺组织样品10个全部呈阳性；新城疫病毒感染的鸡的肺组织样品10个全部呈阳性。380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中，检测到H3亚型禽流感病毒1个；H5亚型禽流感病毒4个；H9亚型禽流感病毒2个；新城疫病毒2个；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％。

二、引物对H5V的准确率

以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为H5亚型禽流感病毒A/treesparrow/Jiangsu/1/2008感染的鸡的组织样品以及从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的组织样品为阴性对照，PBS为空白对照，以H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，以引物对H5V为引物进行PCR反应，检测方法同步骤一。

结果：阳性对照可观察到420bp扩增带，空白对照和阴性对照无此扩增带，10个H5亚型禽流感病毒感染的鸡的肺组织样品全部呈阳性，380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中检测到4个呈阳性；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％。

三、引物对NDV的准确率

以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为新城疫病毒HG/Beijing/2009感染的鸡的组织样品以及从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的组织样品为阴性对照，PBS为空白对照，以新城疫病毒HG/Beijing/2009感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，以引物对NDV为引物进行PCR反应，检测方法同步骤一。

结果：阳性对照可观察到282bp扩增带，空白对照和阴性对照无此扩增带，10个新城疫病毒感染的鸡的肺组织样品全部呈阳性；380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中检测到2个呈阳性；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％。

四、引物对H9V的准确率

以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999感染的鸡的组织样品以及从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的肺组织样品为阴性对照，PBS为空白对照，以H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，以引物对H9V为引物进行PCR反应，检测方法同步骤一。

结果：阳性对照可观察到549bp扩增带，空白对照和阴性对照无此扩增带，10个H9亚型禽流感病毒感染的鸡的组织样品全部呈阳性；380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中检测到2个呈阳性；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％。

五、引物对H3V的准确率

以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004感染的鸡的组织样品以及从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的肺组织样品为阴性对照，PBS为空白对照，以H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，以引物对H3V为引物进行PCR反应，检测方法同步骤一。

结果：阳性对照可观察到216bp扩增带，空白对照和阴性对照无此扩增带，10个H3亚型禽流感病毒感染的鸡的组织样品全部呈阳性；380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中检测到1个呈阳性；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％。

实施例5、不同引物对组合的检测

以引物对H9V、H5V、H3V和NDV中的任意三种或任意两种组合引物为引物，以H9、H5、H3亚型禽流感病毒或新城疫病毒分别感染的鸡胚尿囊液的cDNA样品中的三种或两种混合物为模板，进行三重或二重PCR反应，各反应中的引物、模板及结果见表2和图9。

表2 不同引物对组合的三重或二重PCR反应结果

引物对组合	混合的样品	结果(图9中对应的泳道)
			H9V、H5V和NDV	H9、H5和ND	1
H9V、H3V和NDV	H9、H3和ND	2
			H5V、H3V和NDV	H5、H3和ND	3
H9V、H5V和H3V	H9、H5和H3	4
			H5V和H3V	H5和H3	5
H9V和H3V	H9和H3	6
			H3V和NDV	H3和ND	7
H9V和H5V	H9和H5	8
			H5V和NDV	H5和ND	9
H9V和NDV	H9和ND	10

注：H9、H5、H3、ND分别代表H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/3/1999、H5亚型禽流感病毒A/tree sparrow/Jiangsu/1/2008、H3亚型禽流感病毒A/Duck/Beijing/40/2004、新城疫病毒HG/Beijing/2009分别感染的鸡胚尿囊液的cDNA样品。

PCR扩增体系(25μL)：12.5μL 2×MIX buffer，各引物对组合所对应的引物(20pmol/μL)各0.5μL，cDNA(每种cDNA各2μL)，DEPC水补足至25μL，每个cDNA设置2个重复。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；51℃ 45s；72℃ 45s，从第二步开始进行30个循环，72℃ 10min；4℃ 1h。

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图9所示)，所有两两或三三组合的引物在对应样品cDNA的混合物(表2)检测中均得到预期大小的PCR产物条带，阴性鸡胚尿囊液样品检测中无PCR产物条带。

结果表明，引物对NDV、H3V、H5V和H9V三三或两两混合后可以在一个样品一个反应中同时特异检测相应的新城疫病毒、H3亚型、H5亚型或H9亚型禽流感病毒。

Claims (6)

1.鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的PCR引物对组合物A，由如下4个引物对组成：引物对NDV、引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述引物对NDV、引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V均由两条单链DNA组成；

所述引物对NDV为序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H3V为序列表中序列3所示的单链DNA和序列表中序列4所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H5V为序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H9V为序列表中序列7所示的单链DNA和序列表中序列8所示的单链DNA组成的引物对。

2.鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒的PCR引物对组合物B，是由如下3个引物对组成：所述引物对H3V、引物对H5V和引物对H9V；所述多亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述引物对H3V为序列表中序列3所示的单链DNA和序列表中序列4所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H5V为序列表中序列5所示的单链DNA和序列表中序列6所示的单链DNA组成的引物对；

所述引物对H9V为序列表中序列7所示的单链DNA和序列表中序列8所示的单链DNA组成的引物对。

3.根据权利要求1所述的PCR引物对组合物A，其特征在于：所述序列表序列1、2、3、4、5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1:1:1:1:1:1:1:1。

4.根据权利要求2所述的PCR引物对组合物B，其特征在于：所述序列表序列3、4、5、6、7和8所示单链DNA的摩尔比为1:1:1:1:1:1。

5.权利要求1或3所述的PCR引物对组合物A在制备鉴定或辅助鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用。

6.权利要求2或4所述的PCR引物对组合物B在制备鉴定或辅助鉴定多亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用。

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