CN104988086A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种解淀粉芽孢杆菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.10710。菌株TJ从土壤中分离获得，通过观察菌株TJ的形态学特征，分析其生理生化特性以及同时结合gyrB基因序列同源性分析鉴定该菌株TJ为解淀粉芽孢杆菌。本申请提供的解淀粉芽孢杆菌，对果树腐烂病具有防治效果，特别的，对苹果腐烂病具有良好的抑制作用，该菌株产生的反式-2-壬烯醛对苹果腐烂病具有较高的抑制率。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其用途
技术领域
本申请涉及微生物领域，具体的涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其用途。
背景技术
苹果(学名：Malus pumila)是一种属于蔷薇科(Rosaceae)、苹果属(Malus)植物的果实，其果肉多汁，清脆香甜，同时富含糖类、维生素、矿物质、有机酸、膳食纤维等多种营养物质。苹果原产欧洲、中亚和我国新疆西部，它在中国已经有两千多年的栽培历史，目前是我国最广泛栽培的水果之一。
然而由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Mayabe et Yamada)引起的苹果腐烂病(valsa canker of apple)的大面积发生，严重地威胁着我国苹果种植业的迅速发展和种植规模的不断扩大。
人们为了降低植物病害给人类带来的严重经济损失，长期以来，都在使用化学农药的方法进行防控。在2014年统计中发现中国单位面积平均化学农药使用量比世界平均水平高2.5～5.0倍，我国每年遭受农药残留污染的作物面积达12亿亩，随着化学农药对生态环境的肆意破坏，我国也相应的采取多种手段，大力研究推广高效、环保、安全、无污染的生物农药，希望实现构建“美丽中国”的宏伟目标。
解淀粉芽孢杆菌是一种***，能够广泛分布在不同环境、易于分离培养、贮藏期长、使用方便且体内能产生抗逆性较强的芽孢。另外，解淀粉芽孢杆菌具备生长快、营养简单、易于定殖在植物表面并大量繁殖，为植物形成防护层，阻绝多种病原菌的浸染等特征。正由于解淀粉芽孢杆菌的上述突出的特征，使得解淀粉芽孢杆菌现已成为炙手可热的研究对象。
发明内容
为了解决上述问题，本申请人进行了锐意研究，结果发现：从土壤中分离获得菌株TJ，通过观察菌株TJ的形态学特征，分析其生理生化特性以及同时结合gyrB基因序列同源性分析鉴定该菌株TJ为解淀粉芽孢杆菌，同时研究了菌株TJ在抑制果树腐烂病，特别是苹果腐烂病方面的作用，从而完成本申请。
本申请的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.10710。
本申请所提供的从土壤中分离出来的菌株TJ经过形态学鉴定、生理生化特征分析以及gyrB基因序列同源性分析被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株TJ已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.10710。
本申请提供的解淀粉芽孢杆菌产生烷烃、烯烃、苯的衍生物、酮、醚烯醛中的一种或多种。
作为烷烃的实例，具体可以举出辛烷。
作为烯烃的实例，具体可以举出苯乙烯。
作为苯的衍生物的实例，具体可以举出甲苯。
作为酮的实例，具体可以举出6-甲基-2-庚酮。
作为醚的实例，具体可以举出2-戊基呋喃。
作为烯醛的实例，具体可以举出反式-2-壬烯醛。
在上述所提及的物质中，反式-2-壬烯醛对果树腐烂病有抑制作用，当反式-2-壬烯醛的浓度为150～1000μl/mL时，抑制效果最佳。
本申请的另一目的在于提供一种果树腐烂病的抑制剂，其中，包含有保藏编号为CGMCC NO.10710的解淀粉芽孢杆菌。
特别的，所述抑制剂用于抑制由苹果黑腐皮壳菌引起的苹果腐烂病。
本申请还涉及反式-2-壬烯醛用于在果树腐烂病的抑制剂的制造中的用途。
所述反式-2-壬烯醛可为上述保藏编号为CGMCC NO.10710的解淀粉芽孢杆菌产生的反式-2-壬烯醛。
在上述用途中，所涉及的反式-2-壬烯醛对果树腐烂病，特别是对由苹果黑腐皮壳菌引起的苹果腐烂病具有良好的抑制作用，抑制率可达到76.42％。
根据本申请，所提及的果树为仁果类果树。
仁果类果树属蔷薇科。果实主要有子房和花托共同发育而成，为假果。果实的外层是肉质化的花托，占果实的绝大部分，外中果皮肉质化与花托共同为食用部分，内果皮革质化。果实大多耐贮运。
作为仁果类果树的实例，具体可以举出：苹果、梨、海棠果、山楂和木瓜。根据本申请，所述苹果黑腐皮壳菌，属子囊菌亚门真菌。
本申请提供的一种解淀粉芽孢杆菌，对苹果腐烂病具有良好的抑制作用，且由该解淀粉芽孢杆菌产生的反式-2-壬烯醛对苹果腐烂病具有较高的抑制率，抑制率高达76.42％。
保藏说明
分类名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：(Bacillus amyloliquefaciens)
菌株编号：菌株TJ
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015.4.10
保藏中心登记入册编号：CGMCC.10710。
附图说明
图1为实施例1拮抗实验中的菌株TJ对苹果腐烂病菌的作用效果图；
图2为实施例1拮抗实验中的对比例中的对苹果腐烂病菌的作用效果图；
图3为实施例1形态学鉴定中的菌株TJ经过革兰氏染色后的效果图；
图4为实施例1形态学鉴定中的菌株TJ经过芽孢染色后的效果图；
图5为实施例1中的菌株TJ经过邻接法构建的***发育树；
图6为实施例3的一个实验例中的对苹果腐烂病菌的作用效果图；
图7为实施例3的一个对比例中的对苹果腐烂病菌的作用效果图；
图8为实施例2中的测定样品经过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析后的谱图。
具体实施方式
下面通过对本申请进行详细说明，本申请的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
在下述实施例中，如对所使用的材料、试剂以及仪器如没有特殊说明，则均可从商业途径获得。
在下述实施例中，如对所述方法没有特殊的说明，均为常规方法。
在下述实施例中，所用到的培养基以及试剂如下所述：
LB固体培养基：10g胰蛋白胨，5.0g酵母提取物，10g氯化钠，1000mL蒸馏水，18g琼脂；PDA培养基：200g土豆，20g葡萄糖，18g琼脂，1000mL蒸馏水；LB液体培养基：10g胰蛋白胨，5.0g酵母提取物，10g氯化钠，1000mL蒸馏水；格里斯试剂A液：0.5g对氨基苯磺酸，10％稀醋酸150mL；格里斯试剂B液：0.1gα-萘胺，10％稀醋酸150mL，20mL蒸馏水；苯胺试剂：0.5g二苯胺，100mL浓硫酸，20mL蒸馏水；液体培养液：5.0g蛋白胨，5.0g葡萄糖，5.0g氯化钠，1000mL蒸馏水，pH：7.0-7.2；明胶培养基：5.0g蛋白胨，150g明胶，1000mL蒸馏水，pH：7.2-7.4；酪素培养基：5.0g牛肉膏，1.5g可溶性淀粉，17.5g酪素水解物，15.0g琼脂，1000mL蒸馏水，pH为6.5；胰蛋白胨液体培养基：1％胰蛋白胨水溶液，1000mL蒸馏水，pH：7.2-7.6；石蕊牛奶液体培养基：4mL 2.5％石蕊水溶液，100mL脱脂牛奶，1000mL蒸馏水。
注：在上述培养基和试剂中，所涉及到百分数的含义均为质量分数。
实施例一解淀粉芽孢杆菌菌株TJ的分离以及鉴定
1、解淀粉芽孢杆菌菌株TJ的分离
(1)取10g土壤加入无菌水中，分别形成无菌水的稀释度为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀释液，充分振荡后，吸取上述不同稀释度的土壤稀释液各100μL分别涂布于LB固体培养基上，然后将LB固体培养基均置于28℃下培养1天；
(2)经过1天培养后，挑选出单菌落，然后在LB固定培养基上继续进行纯培养；
(3)纯培养结束后，进行拮抗实验，拮抗实验如下所述：在PDA培养基的左侧均放置直径为7mm大小的苹果腐烂病菌丝块，同时均在右侧点上步骤(2)进行纯培养的单菌落，然后均在26℃下培养3d，另外，设置对比例：将PDA培养基的左侧放置有直径为7mm大小的苹果腐烂病菌丝块，但是不添加步骤(2)中所挑选出的单菌落，然后也在26℃下培养3d，培养3d后，选取拮抗实验中的一个PDA培养基和对比例中的PDA培养基进行观察，结果分别如图1和图2所示，
通过图1和图2可以的得知：本申请提供的菌株TJ能够有效抑制苹果腐烂病菌；
(4)经过观察后，筛选出对苹果腐烂病有强抑制作用的菌株且编号为菌株TJ。
另外，经过研究发现，菌株TJ的保藏方式如下所示：菌株TJ以菌液的形式同15％的甘油混合保存于-80℃的温度条件下，特别的选用冰柜进行保藏。
2、解淀粉芽孢杆菌菌株TJ的形态学鉴定
将步骤1中得到的菌株TJ在LB固体培养基平板上划线培养后，观察菌株TJ单菌落在平板上的培养特征。然后挑取单菌落加入到含有LB液体培养基的试管中，在28℃的条件下摇培16h，再选用革兰氏染色法和芽孢染色法进行染色，然后在显微镜下观察菌体形态并测量菌体大小，同时观察是否有芽孢产生，结果分别如图3和图4所示。
由图3和图4可以得知：本申请中分离出的菌株TJ为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，菌体大小为(0.7-0.9)×(1.8-3.0)μm，伴随有椭圆形芽孢，在LB固体培养基上单菌落为淡黄色，湿润，菌落中央略微***，有皱缩，边缘光滑，呈不规则状。
3、解淀粉芽孢杆菌菌株TJ的生理生化特征分析
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)以及下述具体试验方法，同时参照《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物研究所细菌分类组.北京：科学出版社，1978.)对菌株TJ进行生理生化鉴定。
菌株TJ种子液的制备：将在28℃的条件下，在LB固体培养基上划线培养24h后的菌株TJ单菌落接种到5mL的LB液体培养基中，再在28℃和200r/min的条件下振荡培养12h，即得到菌株TJ种子液；
(1)接触酶试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液，涂在已滴有质量分数为3％的过氧化氢溶液的载玻片上，有气泡产生为阳性，反之为阴性；
(2)硝酸盐还原试验：配制格里斯试剂A液和B液备用，取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于已灭菌的含有硝酸盐液体的试管中，其中，在1L的LB液体培养基中加入1.0g硝酸钾，pH值为7.0-7.6，另外，以不接种有菌株TJ种子液，只含有硝酸盐液体的试管为对照例，然后均在28℃的条件下培养1d和2d后进行观察。在摇培后的试管中加入格利斯试剂A液以及B液，若出现红色、橙色、棕色等，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，可加一至二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，为硝酸盐还原阴性；如不呈蓝色反应，为硝酸盐还原阳性反应；
(3)产硫化氢试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于已灭菌的含有的硝酸盐液体试管中，其中，在1L的LB液体培养基中加入1.0g硝酸钾，pH：7.0-7.6，同时取一条蘸过浓度为5％-10％的醋酸铅滤纸条，用棉塞塞紧，使之悬挂于管中，下端接近培养基表面，不接触液面，在28℃条件下培养3d、7d和14d后，观察结果。纸条变黑色者为阳性，不变色者为阴性；
(4)柠檬酸盐试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在斜面试管上划线接种，在28℃条件下培养3d和7d，观察结果，培养基变蓝色或桃红色为阳性，不变色者为阴性，其中，在斜面试管中含有1.0g氯化钠，0.2g硫酸镁，0.5g磷酸二氢铵，2.0g柠檬酸钠，10mL 0.04％酚红水溶液，18g琼脂和990mL蒸馏水，pH为7.0，然后加入溴麝香草酚蓝指示剂，分装试管，再在121℃下灭菌15min，摆斜面；
(5)精氨酸双水解酶试验：首先，配制试管培养基，该培养基：1.0g蛋白质，0.01g酚红，5.0g氯化钠，10.0g L-精氨酸盐，0.3g磷酸氢二钾，6.0g琼脂，1000ml蒸馏水，pH为7.0-7.2，在上述培养基上穿刺接种菌株TJ，以没有接种菌株TJ的培养基为对照例，然后均在28℃条件下培养3d、7d和11d，再观察结果，与对照例相比培养基变红色为阳性，不变色者为阴性；
(6)赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验：首先配制试管培养基，其中，试管培养基：5.0g蛋白胨，0.625mL 1.6％溴甲酚紫，5.0g牛肉膏，2.5mL 0.2％甲酚红，0.5g D-葡萄糖，5mg维生素B6，6.0g琼脂，1000mL蒸馏水，pH为6.0，然后将培养基分装试管，每支试管5mL，再在试管中分别加入赖氨酸、鸟氨酸，并使两者的最终质量百分浓度为2％，然后均进行穿刺接种菌株TJ，另外，设置没有接种菌株TJ的培养基为对照例，然后均在28℃条件下培养7d，持续观察结果，与对照例相比培养基呈紫色或带红色调的紫色为阳性，不变色者为阴性；
(7)V.P.试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于含有液体培养液的试管中，在28℃的条件下培养1d、2d、4d、6d后进行观察。取上述液体培养液和质量分数为40％NaOH等体积量相混后，加入少量肌酸，剧烈震荡2-10min，培养液出现红色或放置更长时间才出现红色反应，即为阳性反应，反之为阴性；
(8)苯丙氨酸脱氨酶试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在斜面试管上划线，在28℃条件下培养4h或8-24h后，滴加4-5滴试剂(试剂为10％(W/V)的FeCl3溶液)到生长单菌落的斜面试管上，当斜面试管上和冷凝水中产生绿色时为阳性，不变色者则为阴性，其中，斜面试管中含有3.0g酵母膏，5.0氯化钠，1.0g磷酸氢二钠，1.0g L-苯丙氨酸，12.0g琼脂，1000mL蒸馏水，且整个体系pH为7.0；
(9)耐盐性测定：配制含有不同质量分数的NaCl的LB液体培养基，使LB液体培养基中的NaCl最终质量分数分别为0、5％、7％、10％、12％、15％，然后在121℃下灭菌20min，取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于上述LB液体培养基中，设置未接种有菌株TJ种子液的LB液体培养基作为对照例，在28℃和200r/min条件下摇培1d，观察生长状况；
(10)淀粉水解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落，点接于淀粉培养基平板上，在28℃下培养1d后，将卢戈氏碘液滴加在淀粉培养基平板中，如果菌落周围出现无色透明的圆形区域，说明淀粉被水解，为阳性；若淀粉没有被水解，则为阴性，其中，淀粉培养基为下述：在LB液体培养基中加入可溶性淀粉，可溶性淀粉的添加量为LB液体培养基的总重量的0.2％；
(11)明胶液化试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液穿刺接种于明胶培养基试管中，设置未穿刺接种有菌株TJ种子液的明胶培养基为对照例，然后均在28℃下培养1d-2d，持续观察明胶培养基有无液化现象及液化后形状。若明胶培养基在20℃下不凝固的，为阳性，反之阴性；
(12)七叶苷水解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在斜面试管上划线接种，然后在28℃下培养3d、7d和14d，再观察结果，产黑褐色色素者为阳性，反之为阴性，其中，斜面试管中含有LB固体培养基、七叶苷和柠檬酸铁，七叶苷的添加量为LB固体培养基的总重量的0.1％，柠檬酸铁的添加量为LB固体培养基的总重量的0.05％；
(13)酪素水解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落，点接于酪氨酸培养基平板上，在28℃下培养1d和2d，持续观察结果，若菌落边缘有透明现象说明能够水解，为阳性，反之阴性；
(14)酪氨酸水解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落，点接于酪氨酸培养基平板上，在28℃下培养1d和2d，持续观察结果，菌落边缘有透明现象说明能够水解，为阳性，反之阴性，其中，酪氨酸培养基为下述：在LB培养基中加入0.5g酪氨酸；
(15)尿素分解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在斜面尿素培养基试管中划线，在28℃下连续培养4d，观察结果，变红为阳性，反之不变色为阴性，其中，斜面尿素培养基的制备如下：尿素培养基含有1.0g蛋白胨，5.0g氯化钠，1.0g葡萄糖，2.0g磷酸二氢钾，0.012g酚红，15.0g琼脂和1000mL蒸馏水，且尿素培养基的pH为6.8-6.9，然后将尿素培养基分装到试管中，在121℃下灭菌20min，待上述培养基冷却至45-50℃时，加入已经过0.22μm无菌水系滤膜过滤后的质量分数为20％尿素水溶液，尿素最终的质量分数为2％，最后摆斜面；
(16)土温20和吐温80降解试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在培养基平板上划线，在28℃下连续培养7d，观察结果，菌落边缘有模糊的晕圈为阳性，反之阴性，其中，培养基制备如下所示：基础培养基：1.0g蛋白陈，5.0g氯化钠，1.0g葡萄糖，2.0g磷酸二氢钾，0.2％酚红水溶液6mL，20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH：6.8-6.9，基础培养基在121℃下灭菌20min后，冷却至45-50℃时，分别加入吐温20、吐温80，并使两者的最终质量分数为1％；
(17)糖、醇发酵产酸试验：选取蔗糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、L-树胶醛糖、淀粉、D-海藻糖、肌醇、果糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、糖原、甘油等药品进行下述试验，
取新鲜培养的TJ种子液穿刺培养于相应培养基试管中，在28℃下培养1d、3d、5d、7d，观察结果。变黄色，表示产酸，为阳性；若不变色，则为阴性，其中，相应培养基制备如下所示：基础培养基：1.0g磷酸氢二铵，0.2g氯化钾，0.2g硫酸镁，0.2g酵母膏，20mL0.04％溴甲酚紫，6.0g琼脂，在上述基础培养基中分别加入10g上述糖类或醇类物质，且相应培养基的pH为7.0-7.2；
(18)吲哚试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于胰蛋白胨液体培养基试管中，在28℃下培养1d、2d、4d、7d后观察结果。向培养后试管中慢慢加入3-5mm的试剂(试剂为8.0g对二甲基氨基苯甲醛，760mL 95％乙醇以及160mL浓HCl的混合液)于培养液表面，在液层界面出现红色，即为阳性反应，若红色不明显，可在培养液中加入***约1ml，充分震荡，静置片刻，待***浮至液面后再加吲哚试剂，在***和试剂液层界面出现红色，即为阳性反应；
(19)在0.001％溶菌酶中的生长试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接入液体培养基试管中，在28℃下培养，观察生长情况，液体培养基制备如下所示：在LB液体培养基中加入溶菌酶，溶菌酶的最终质量分数为0.001％；
(20)卵磷脂酶试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落，点接于卵磷脂培养基平板上，在28℃下培养18-24h后观察结果，如果菌落周围和下面出现不透明的区域，为阳性；反之则为阴性，其中，卵磷脂培养基制备如下所示：在已灭菌后的LB固体培养基中加入在无菌条件下取出的卵黄，其中，卵黄的添加量为LB固体培养基的总重量的1％；
(21)厌氧试验：在厌氧罐中进行，在无氧条件下，挑取新鲜培养的菌株TJ在LB固体培养基平板中划线，在28℃下培养，不生长则为阴性，反之为阳性；
(22)β-半乳糖苷酶试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在加入含有含量为20mg/mL的X-gal的LB固体培养基平板上进行划线，在28℃下培养，观察结果，如果菌落周围变蓝，则为阳性，反之阴性；
(23)氧化酶试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液，滴在氧化酶试纸上，10s内出现红色为阳性，反之为阴性，
(24)甲基红试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于含有液体培养液的试管中，在28℃下培养1d后观察结果，向液体培养液中加入一滴甲基红试剂，红色表示甲基红试验为阳性反应，黄色为阴性反应；
(25)生长温度测定：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落在LB固体培养基平板上划线，然后分别在14℃、18℃、40℃、50℃、55℃、60℃下培养，1d、2d分别观察其生长情况；
(26)运动性试验：挑取新鲜培养的菌株TJ单菌落穿刺接种于LB半固体培养基中，在28℃下培养，观察结果，如在穿刺线边缘呈云状生长，则为有运动性，反之则无；
(27)石蕊牛奶试验：取新鲜培养的菌株TJ种子液10μL接种于含有石蕊牛奶液体培养基试管中，在28℃下培养1d、3d、5d、7d、14d后观察结果，相关解释如下所示：还原-石蕊褪色变白；胨化-牛奶变清；产酸-石蕊变红；产碱-变蓝；酸凝-变红和凝固；酶凝-不变色或蓝色，牛奶结块、凝固，为阳性；
(28)唯一碳源利用试验：选取淀粉、肌醇、L-树胶醛糖、甘油、胱氨酸、抗坏血酸、脯氨酸、精氨酸、柠檬酸、蔗糖、木糖、麦芽糖、酪氨酸、甘露醇、D-海藻糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇、甘氨酸、缬氨酸、鼠李糖、果糖、草酸、苏氨酸、半乳糖、核糖、糖原等药品进行下述碳源利用试验，
取新鲜培养的菌株TJ种子液接种于含有相应液体培养基试管中，在28℃下连续培养3次，如果仍无浑浊，则证明此碳源不可被菌株TJ利用，其中，相应液体培养基的制备如下所示：基础培养基为：2.0g硫酸二铵，0.5g磷酸二氢钠，0.5g磷酸氢二钾，0.2g硫酸镁，0.1g氯化钙，然后向基础培养基中分别加入碳源水溶液和1000mL蒸馏水，碳源水溶液的最终质量百分浓度为1％，相应液体培养基的pH为6.5。
步骤1中分离得到的菌株经过上述相关试验，结果如下表1所示。
表1
注：在上述表1中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
由上述表1可以得知：菌株TJ在接触酶、甲基红、V.P.试验、产硫化氢试验中为阳性，在氧化酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、卵磷脂酶试验中为阴性，能够利用柠檬酸盐，具有运动性，糖酵解以及硝酸盐还原能力，还能水解淀粉、明胶、七叶苷、酪蛋白、吐温20，但不能水解酪氨酸、尿素，能在小于10％的NaCl、0.001％溶菌酶以及15℃-50℃中生长，不能厌氧生长，能利用淀粉、肌醇、L-树胶醛糖、甘油、脯氨酸、蔗糖、木糖、麦芽糖、甘露醇、D-海藻糖、葡萄糖、山梨醇、果糖、半乳糖、核糖和糖原，不能利用抗坏血酸、胱氨酸、苏氨酸、结氨酸、精氨酸、柠檬酸、草酸、鼠李糖和甘露糖。
4、利用gyrB基因序列鉴定菌株TJ：
在本申请中，利用gyrB基因序列，通过构建***发育树，分析菌株TJ的进化关系，鉴定步骤如下所示：
1)菌株TJ的DNA的提取
采用北京索拉宝公司提供的细菌基因组提取试剂盒提取菌株TJ的基因组DNA；
2)选用细菌gyrB基因序列进行PCR扩增
采用细菌gyrB基因的一对通用引物进行PCR扩增，PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，将PCR产物回收，回收产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，其中，引物序列为up1(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和up2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’)，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃-60℃复性40s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min，
解淀粉芽孢杆菌菌株TJ的gyrB基因序列详见序列表中序列1；
3)gyrB基因序列***发育进化关系：
将测序获得的DNA序列提交GenBank，获得序列号为：KF501049，再通过Blast(Basic Local Alignnent Search Tool)进行序列同源性检索分析。序列先采用ClustralX 2.0进行多重序列比对，然后用MEGA 5.0软件，同时采用邻接法(Neighbour-joining)构建***发育树，从而确定菌株TJ的分类学地位，结果如图5所示。
由图5可以得知：菌株TJ与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)同源性高达99％。
注：GenBank是美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，
MEGA5.0为专用于构建***发育树的软件，
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具，
一般以同源性≥99％作为种水平的鉴定标准。
鉴于上述对菌株TJ的形态学鉴定、生理生化特征分析和gyrB基因序列同源性分析结果，将步骤1中分离得到的细菌TJ鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该解淀粉芽孢杆菌菌株TJ已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.10710。
实施例二菌株TJ产生的挥发性物质的成分鉴定
1、选用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析菌株TJ产生的挥发性物质的成分
(1)样品萃取：
1)配置测定样品：将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿皿底中，取新鲜的菌株TJ菌液100μL涂布于培养皿中，
2)设置空白样品：将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿皿底中，
3)将配置好的测定样品和设置好的空白样品均分别进行下述处理：在40℃下平衡15min，将SPME萃取头***到顶空萃取瓶中，拔出纤维头，使其置于样品瓶顶空部位的中间部位。吸附40min后，收回纤维头，萃取瓶中拔出萃取头并立即***GC进样口中，在250℃下解吸附5min后，进行GC-MS分析，然后拔出萃取头。其中，萃取头的型号为：50/3021mDVB/CAR/POMS。
其中，气相色谱检测条件和质谱检测条件如下所述：
气相色谱(GC)检测条件
进样方式为：进样口温度设置为250℃，载气设置为高纯氦气，柱流速为1.2mL/min，自动进样器进样，进样量为1μl，不分流进样。
程序升温条件：起始温度设定为40℃，停留3min后，以3℃/min的速度升温至160℃，在该温度下停留2min，再以8℃/min的速度升至220℃，运转3min。
其中，装柱型号为HP-5MS.M.。
质谱(MS)检测条件：
离子源温度设置为230℃，四极杆温度为150℃。电离方式：电子轰击EI源，电子13能量70eV，全扫描质量(m/z)范围为30至550原子质量单位(amu)。
然后，选用计算机自动谱库NIST08进行自动检索，让其对菌株TJ产生的挥发性物质定性。
注：美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)直属美国***，从事物理、生物和工程方面的基础和应用研究，以及测量技术和测试方法方面的研究，提供标准、标准参考数据及有关服务，在国际上享有很高的声誉。
(2)GC-MS结果分析
1)选用气相色谱-质谱联用仪进行测定后，将所得到的挥发性物质的成分的质谱与NIST数据库进行比对鉴定，分析鉴定出菌株TJ产生40种挥发性物质。
这40种物质分别如下所示：烷烃如辛烷，烯烃如苯乙烯，苯的衍生物如甲苯，酮如6-甲基-2-庚酮，醚如2-戊基呋喃以及烯醛如反式-2-壬烯醛。
2)将在测定样品中所检测到的含有的挥发性物质中去除在空白样品中测到的挥发性物质的成分，同时保留波峰面积积分大于1的主要气体成分，结果如图8所示。
对图8的具体分析如下表2所示：
表2
实施例三、菌株TJ对苹果腐烂病的抑制效果
(1)实验例：将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿皿底中，一部分培养皿皿底中间接种新鲜的苹果腐烂菌丝块(苹果腐烂菌丝块直径为7mm)，另一部分培养皿皿底中，取新鲜的菌株TJ菌液100μL涂布于培养皿中，将两个去除皿盖的培养皿皿底口对口扣在一起，上层为含有苹果腐烂菌丝块的皿底，下层为含有菌株TJ菌液的皿底，对接处用封口膜封口，在26℃下培养3天后观察抑菌效果，观察抑菌效果。
(2)对比例：重复实验例，其中，下层为不含有菌株TJ菌液的皿底，其余条件均相同。
重复上述实验例和对比例，设置3对平行试验。
选取一对实验例和对比例的效果图，结果分别如图6和图7所示。
由图6和图7可以得知：在图6和图7中，位于中间部位的黑点为菌斑，在图6中，位于培养皿中间部位的菌斑直径为0.7cm，在图7中，位于培养皿中间部位的菌斑直径为3.5cm，图6中的菌斑小于图7中的菌斑，因此，由本申请提供的菌株TJ对苹果腐烂病具有有效的抑制作用。
实施例四、反式-2-壬烯醛对苹果腐烂病的抑制效果
针对实施例二中的GC-MS图谱分析结果，本申请针对反式-2-壬烯醛，进行下述试验：
(1)将购买的相应的反式-2-壬烯醛标品用乙醇配制成下述12个浓度梯度的溶液：1μl/mL、30μl/mL、60μl/mL、90μl/mL、120μl/mL、150μl/mL、180μl/mL、200μl/mL、400μl/mL、600μl/mL、800μl/mL、1000μl/mL；
(2)将上述12个浓度梯度的溶液均进行下述实验例：将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿皿底中，一部分培养皿皿底中间接种新鲜的苹果腐烂菌丝块，另一部分培养皿皿底中，取配置好的梯度的溶液100μL涂布于培养皿中，将两个去除皿盖的培养皿皿底口对口扣在一起，上层为含有苹果腐烂菌丝块的皿底，下层为含有菌株TJ菌液的皿底，对接处用封口膜封口，在26℃下培养3天后观察抑菌效果，观察抑菌效果，并测量出抑菌后的苹果腐烂菌丝块的直径；其中，每一个梯度的浓度重复处理3次；
(3)对比例：重复实验例，其中，下层为不含有反式-2-壬烯醛的皿底，其余条件均相同，培养完成后，测量苹果腐烂菌丝块的直径；将对比例重复3次。
对所选取的物质的相应的标品经过上述试验后，通过下述计算公式算出各个相应的标品的抑菌率，从而得出反式-2-壬烯醛对苹果腐烂病具有抑菌效果，另外，抑菌率可以作为抑菌效果强弱的指标。
抑菌率＝[(对比例的菌落平均直径-实验例相应浓度下的菌落平均直径)/对比例的菌落平均直径]×100％
反式-2-壬烯醛的相关试验数据以及抑菌率如下表3所示。
表3
由上述表3可以得知：反式-2-壬烯醛对苹果腐烂病具有良好的抑制作用，并且在浓度为150～1000μl/mL时抑菌率高达76.42％。
根据上述说明书的揭示，本申请所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.10710。
2.一种果树腐烂病的抑制剂，其特征在于，包含有保藏编号为CGMCCNO.10710的解淀粉芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的果树腐烂病的抑制剂，其特征在于，所述果树为仁果类果树。
4.根据权利要求3所述的果树腐烂病的抑制剂，其特征在于，所述仁果类果树为苹果、梨、海棠果、山楂和木瓜。
5.根据权利要求2～4任一项所述的果树腐烂病的抑制剂，其特征在于，所述腐烂病为由苹果黑腐皮壳菌引起的苹果腐烂病。
6.一种由保藏编号为CGMCC NO.10710的解淀粉芽孢杆菌产生的反式-2-壬烯醛用于在果树腐烂病的抑制剂的制造中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述果树为仁果类果树。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述仁果类果树为苹果、梨、海棠果、山楂和木瓜。
9.根据权利要求6～8任一项所述的用途，其特征在于，所述腐烂病为由苹果黑腐皮壳菌引起的苹果腐烂病。
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