CN104981697A - 促染色质转录复合物(fact)在癌症中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明尤其涉及测量促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分以用于评价肿瘤,包括例如确定肿瘤的侵袭性以及指导治疗。
Description
优先权
本申请要求于2013年2月11日提交的美国临时申请61/763,266和于2013年9月27日提交的美国临时申请61/883,802的优先权,所述专利都通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明部分涉及适用于评价人类样品中的肿瘤的方法和用于选择个人化的治疗方案的方法。
背景技术
当前癌症治疗的主要限制是对于患者的适当活性剂的选择。通常,向患者提供次最优的化疗法,从而导致治疗失败,包括死亡、疾病进展、不必要的毒性和较高的健康护理费用。此外,一些患者在不使用化疗法时应答更佳,例如使用新辅助或辅助疗法与手术。
已经开发出用于个体化和优化癌症治疗的测定,诸如化疗应答测定,以便预测化疗剂在施用之前对给定患者的潜在功效。然而,所述测定方法并未得到普遍使用,部分是由于难以通过临床上有意义的方式解释所述数据。例如,据认为许多所述测定不适于提供在特定治疗方案的情况下对患者存活期的准确估计(参见例如Fruehauf等,Endocrine-Related Cancer 9:171-182(2002))。
因此,对适用于评价癌症和相关疾病的方法仍然存在需要。具体地说,需要能够基于对患者肿瘤特性的了解来指导卫生保健提供者对癌症患者的治疗计划的方法。
发明简述
因此,本发明涉及用于评价癌症的方法,包括例如用于确定癌症的侵袭性的方法和所述信息用于指导对癌症患者的治疗的用途。
在一个方面,本发明提供一种用于评价肿瘤的方法,所述方法包括测量人受试者肿瘤标本(包括例如活检组织)或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平,其任选地还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组。在一些实施方案中,将表达FACT的恶性细胞的百分比定量并用于将患者分类为低风险组和高风险组。
在一个方面,本发明提供一种用于评价肿瘤细胞的方法,所述方法包括测量人受试者肿瘤标本(包括例如活检组织)或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平,其任选地还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在,将肿瘤细胞分类为包含癌干细胞。
在另一个方面,本发明提供一种用于治疗癌症的方法,所述方法包括向人受试者施用有效量的抗癌剂,其中所述癌症通过人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平来表征。在另一个方面,本发明提供抗癌剂用于癌症治疗的用途,其中所述癌症被表征为FACT+。
在另一个方面,本发明提供一种用于治疗癌症的方法,所述方法包括(a)测量人受试者肿瘤标本(例如,标本的恶性成分)或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平;(b)基于(例如,标本的恶性成分中)FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组;以及(c)对评定为FACT+的人受试者施用有效量的疗法。在另一个方面,本发明提供一种疗法用于癌症治疗的用途,其包括(a)测量人受试者肿瘤标本(例如,标本的恶性成分)或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平;(b)基于(例如,标本的恶性成分中)FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组;以及(c)对评定为FACT+的人受试者施用有效量的所述疗法。
在以下所附描述中列举了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料,但如今描述了说明性的方法和材料。通过描述和通过权利要求书本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。在说明书和所附权利要求书中,单数形式还包括复数,除非上下文另外清楚地指出。除非另有说明,否则文中所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的一般技术人员所正常理解的相同意义。
附图简述
图1A、1B和1C示出FACT在人和小鼠成纤维细胞的体外转化、但不永生化时升高。
图1A示出正常的和永生化的成纤维细胞具有相当水平的FACT亚基。以所指定的抗体探测的肿瘤(HT1080)、正常人(WI38)或小鼠(MEFwt)成纤维细胞和以端粒酶的酶亚基永生化的人成纤维细胞(WI38-T)或来自p53敲除动物的小鼠成纤维细胞(MEFp53KO)的提取物的蛋白印迹。
图1B示出突变H-Ras12V致癌基因在永生化人BJ成纤维细胞中的表达伴随有FACT亚基水平的升高。具有他莫昔芬(TMX)调节的H-Ras12V表达的BJ细胞的提取物的蛋白印迹。
图1C示出在以H-RasV12致癌基因转化的细胞所形成的病灶中,SSRP1增加。使用H-RasV12cDNA或对照空载体以慢病毒属感染MEFp53KO细胞并且允许这些细胞生长直到汇合与病灶形成。以H-RasV12病毒或对照空病毒转导的板上不同密度区域的SSRP1抗体(绿色)进行的免疫荧光染色。DNA以Hoechst33342(蓝色)复染。
图2A、2B和2C示出在人乳腺上皮细胞的转化过程中,FACT亚基水平升高。
图2A示出利用SSRP1抗体的情况下,原代细胞(184、240L)、永生细胞(184Dp16sMY、240Lp16sMY、184B5)和完全转化细胞(184FMY2、184AA3)的免疫荧光(IF)染色。示出了相同视野的IF和相差图像。
图2B示出以所指示抗体探测的相同细胞的提取物的蛋白印迹。
图2C示出在184谱系细胞中的SSRP1和SPT16mRNA的qPCR分析。
图3A和3B示出在不同样品中的SSRP1 mRNA表达。
图3A示出呈解剖学和病理学排序形式的所有分析样品(X轴)与标准化表达水平(Y轴)的点制图。上色的样品(根据顶部图例的颜色)是以下情况的样品:组织类型的表达水平1标准偏差高于相同类型的所有组织(健康的、癌症或其它疾病)的平均表达,或者组织中的第90百分位表达等于或高于相同类型的四分位距加上第75百分位的2倍。然而,如果每个组织类型不足十个数据点,那么不对解剖结构或癌症类型上色。
图3B示出各种肿瘤类型中的SSRP1 mRNA水平。
图4A、4B、4C、4D和E示出不同类型的人肿瘤表达SSRP1蛋白。图片4A-4D示出各种癌症的正常(N)和肿瘤(T)组织中使用SSRP1抗体的IHC染色的实例。
图4A示出肺癌的情况。
图4B示出结肠癌的情况。
图4C示出胰腺癌的情况。
图4D示出乳腺癌的情况。
图4E示出来自不同器官癌症当中所分析的相同器官的所有样品的具有SSRP1表达(“阳性”–表示>1,“高”表示>4)的样品比例。
图5A、5B、5C、5D示出乳腺癌中的SSRP1 mRNA和蛋白表达。
图5A示出在正常乳腺(1)、乳腺导管(2)、小叶(3)、髓(4)和其它(5)癌瘤的样品中SSRP1 mRNA水平的箱线图。
图5B示出基于基因表达签名分类的乳腺癌样品;
图5C示出不同等级和时期的肿瘤样品。示出了所指示样品之间Mann-Whitney-Wilcoxon检验的P值。P值>0.05未示出。
图5D示出基于IHC染色,在乳腺癌的不同类别内的患者当中SSRP1阳性样品的比例的比较。示出了不同类别之间精确Fisher卡方检验的P值。
图6A-6F示出SSRP1阴性肿瘤的患者具有更好的总存活期。所有癌症和不同癌症部位的Kaplan-Meier存活曲线。使用Long Rank检验计算P值:
图6A示出所分析的所有癌症患者。
图6B示出肺癌患者的情况。
图6C示出胰腺导管患者的情况。
图7A-7H示出在FACT亚基敲除(KD)后肿瘤(HT1080、RCC45、MCF7)和正常(WI38、NKE、MCF10A)细胞的生长。已所指示的慢病毒shRNA转导的且在嘌呤毒素存在下选择的细胞的亚甲基蓝染色(A)或集落数目(B、C)。条形图是相对于相同类型的shGFP细胞的平均数目。误差条—实验中三次重复之间的标准偏差。星号表示与对应对照物存在显著不同的样品(p值<0.05)。D-F示出在使用蛋白印迹法检测嘌呤毒素选择之后在图片A上显示的细胞中的FACT亚基水平。G示出在以针对SSRP1的shRNA转导之后HT1080细胞120和144当中使用免疫荧光染色检测的具有高水平和低水平SSRP1蛋白的细胞分布(上面的图片)。三个下面的图片示出以针对GFP或SSRP1的shRNA转导的HT1080细胞中的DNA含量。分别分析了具有低水平和高水平SSRP1的细胞。H示出在以所指示的慢病毒shRNA转导3天后在不同细胞中的EDU并入。I.示出在以所指示的慢病毒shRNA转导5天后HT1080细胞当中使用膜联蛋白(Annexin)V和碘化丙啶染色(双阳性)检测的死亡细胞比例。
图7A示出甲基蓝染色。
图7B示出以所指示的慢病毒shRNA转导且在嘌呤毒素存在下针对RCC45和NKE选择的细胞的集落数目。
图7C示出以所指示的慢病毒shRNA转导且在嘌呤毒素存在下针对MCF7和MCF10A选择的细胞的数目。
图7D-F示出在使用蛋白印迹法检测嘌呤毒素选择之后在图片7A上显示的细胞中的FACT亚基水平。
图7G示出在以shRNA至SSRP1转导之后HT1080细胞120和144当中使用免疫荧光染色检测的具有高水平和低水平SSRP1蛋白的细胞分布(上面的图片)。三个下面的图片示出以shRNA至GFP或SSRP1转导的HT1080细胞中的DNA含量。分别分析了具有低水平和高水平SSRP1的细胞。
图7H示出在以所指示的慢病毒shRNA转导3天后在不同细胞中的EDU并入。
图7I示出在以所指示的慢病毒shRNA转导5天后HT1080细胞当中使用膜联蛋白V和碘化丙啶染色(双阳性)检测的死亡细胞比例。
图8A示出针对FACT亚基和表面癌干细胞标志物(CD44高/CD24低)的人乳腺上皮细胞的提取物的蛋白印迹。
图8B示出以针对存在于胰腺CSC上的表面标志物(CD44+/CD24+/CD326+)和FACT的SSRP1亚基的抗体共染色的胰腺导管腺癌细胞PANC1和MIA PaCa的流式细胞术分析。
发明详述
本发明部分基于以下发现:恶性细胞中促染色质转录复合物(FACT)的存在可用于评价肿瘤,包括例如提供关于肿瘤的侵袭性、肿瘤抵抗常规药物和/或可能在治疗后再发的可能性的指示,并因此驱动患者的治疗决定。
在一个方面,本发明提供一种用于评价肿瘤的方法,所述方法包括测量人受试者肿瘤标本(包括例如活检组织)或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平,其任选地还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组。在一些实施方案中,特别地基于恶性细胞中FACT的相对水平,将肿瘤标本评定为FACT+或FACT-。
在另一个方面,本发明提供一种用于治疗癌症的方法,其包括向人受试者施用有效量的抗癌剂,其中所述癌症被表征为FACT+。在另一个方面,本发明提供一种抗癌剂用于癌症治疗的用途,其中所述癌症通过人受试者肿瘤标本中或恶性细胞中或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平来表征。
在另一个方面,本发明提供一种用于治疗癌症的方法,所述方法包括(a)测量人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平;(b)基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组;以及(c)对人受试者施用有效量的疗法。在另一个方面,本发明提供一种疗法用于癌症治疗的用途,所述方法包括(a)测量人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平;(b)基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将受试者分类为高风险组或低风险组;以及(c)对人受试者施用有效量的疗法。在一些实施方案中,患者如本文所述被分类为FACT+或FACT-并且这种分类用于确定此患者的治疗。
在一个实施方案中,所述评价包括诊断、预后以及对治疗的应答中的任一种。
在另一个实施方案中,肿瘤是原发或再发肿瘤或转移病灶中的一种或多种。在一些实施方案中,肿瘤为乳腺、***、胰腺、肺、肝、肾、膀胱、结肠直肠、卵巢、宫颈、头颈、皮肤、中枢和外周神经***肿瘤中的任一种。
在另一个实施方案中,FACT的成分包括SSRP1和SPT16中的一种或多种。
在另一个实施方案中,测量包括评价蛋白质的存在、缺乏或水平。在另一个实施方案中,测量包括评价编码FACT成分的核酸的存在、缺乏或表达水平(例如PCR或核酸杂交测定)。在一些实施方案中,测量包括对特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂的使用并且所述药剂例如可以为抗体。在各种实施方案中,SSRP1和SPT16蛋白水平中的一种或多种的测量为免疫组织化学染色、蛋白印迹、细胞内蛋白印迹(in cell western)、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)中的任一种。
在一些实施方案中,人肿瘤标本为活检组织和/或为新鲜组织样品、冷冻的肿瘤组织标本、培养的细胞(例如,来自肿瘤标本、循环肿瘤细胞的原代培养物),和***固定的石蜡包埋的肿瘤组织标本中的任一种。
在另一个实施方案中,高风险或低风险分类为对新辅助和/或辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对新辅助和/或辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
在另一个实施方案中,高风险分类包括高水平的癌症侵袭性,其中侵袭性可通过高肿瘤等级、侵袭性组织亚型、低的总生存期、高的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的存在中的一种或多种来表征。
在另一个实施方案中,低风险分类包括低水平的癌症侵袭性,其中侵袭性可通过低肿瘤等级、高的总生存期、较低侵袭性的组织亚型、低的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的缺乏和/或减少中的一种或多种来表征。
在另一个实施方案中,高风险分类指示并指导新辅助和/或辅助疗法的提供。在另一个实施方案中,向具有高风险分类的患者提供新辅助和/或辅助疗法。
在另一个实施方案中,低风险分类指示并指导新辅助和/或辅助疗法的停止。在另一个实施方案中,不向具有低风险分类的患者提供新辅助和/或辅助疗法。
在一个方面,本发明提供一种用于评价肿瘤细胞的方法,所述方法包括测量人受试者肿瘤标本(包括例如活检组织)的恶性细胞或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平,其任选地还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在,将肿瘤细胞分类为包含癌干细胞。
在另一个实施方案中,肿瘤为原发或再发肿瘤或转移病灶中的一种或多种。在一些实施方案中,肿瘤为乳腺、***、胰腺、肺、肝、肾、膀胱、结肠直肠、卵巢、宫颈、头颈、皮肤、中枢和外周神经***肿瘤中的任一种。
在另一个实施方案中,FACT的成分包括SSRP1和SPT16中的一种或多种。
在另一个实施方案中,测量包括评价蛋白质的存在、缺乏或水平。在另一个实施方案中,测量包括评价核酸的存在、缺乏或表达水平。在一些实施方案中,测量包括对特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂的使用并且所述药剂例如可以为抗体。在各种实施方案中,SSRP1和SPT16蛋白水平中的一种或多种的测量为免疫组织化学染色、蛋白印迹、细胞内蛋白印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)中的任一种。
在一些实施方案中,人肿瘤标本为活检组织和/或为冷冻的肿瘤组织标本、培养的细胞(例如,来自肿瘤标本、循环肿瘤细胞的原代培养物),和***固定的石蜡包埋的肿瘤组织标本中的任一种。
在一些实施方案中,FACT为癌干细胞的代用标志物,其可用作针对此类细胞的已知标志物的替代或补充。在一些实施方案中,所述使用补充FACT的其它使用用于本文所述的肿瘤评价(例如作为肿瘤侵袭性的指示)。
在一些实施方案中,通过FACT检测将肿瘤细胞类型分类为包括癌干细胞指示了对常规化疗表现出抗性的癌症类型(例如癌干细胞)。在一些实施方案中,向具有通过FACT检测被分类为包括癌干细胞的肿瘤的患者提供化疗,所述化疗是针对癌干细胞和/或已知有效抵抗癌干细胞。
在一些实施方案中,通过FACT检测将肿瘤细胞类型分类为包括癌干细胞指示了可能复发的癌症类型。在一些实施方案中,已针对肿瘤进行治疗的患者中检测到FACT可指导治疗后的进一步监测。在一些实施方案中,已针对肿瘤进行治疗的患者中检测到FACT可指导因为复发可能性而进行的辅助或新辅助疗法。
促染色质转录(FACT)复合物为两个亚基的异二聚体:80kDa亚基和140kDa亚基。这些亚基为结构特异性识别蛋白1(SSRP1)和Ty抑制剂(SPT16或SUPT16H)。如本文所用的FACT是指SSRP1和SPT16的异二聚体或者单独的SSRP1和SPT16亚基。在不希望受到理论约束情况下,FACT通过调节核小体稳定性来涉及染色质重塑。FACT可涉及包括染色质的很多过程,例如像转录、复制、重组、DNA损害以及修复。FACT与组蛋白H2A/H2B特异性相互作用以影响核小体分解和转录延伸。Curaxin(例如Curaxin-137)为在不同癌症模型中具有广泛抗癌活性的小分子(参见国际专利公开号WO 2010/042445,所述专利的内容特此以引用的方式整体并入),它引起FACT的功能失活(参见Gasparian等,Sci.Trans.Med.3:95ra74(2011),所述参考的内容特此以引用的方式整体并入)。
由结构特异性识别蛋白1(SSRP1)的基因(人的mRNA:NM_003146.2,该序列特此以引用的方式整体并入,小鼠的mRNA:NM_001136081.1,该序列特此以引用的方式整体并入)编码的蛋白质为连同SPT16形成FACT的异二聚体的亚基。SSRP1为80kDa亚基。FACT和顺铂损害的DNA对于顺铂的抗癌机制可为至关重要的。SSRP1编码的蛋白质(在人中为:NP_003137.1,该序列特此以引用的方式整体并入,在小鼠中:NP_001129553.1,该序列特此以引用的方式整体并入)包含高迁移率族蛋白,所述高迁移率族蛋白在不希望受到理论约束的情况下可构成顺铂修饰的DNA的结构识别元素。SSRP1也是在UV照射之后形成的CK2-SPT16-SSRP1复合物的成分,所述复合物包含SSRP1、SUPT16H、CSNK2A1、CSNK2A2以及CSNK2B。SSRP1已显示与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶NEK9相互作用。SSRP1蛋白质还作为转录活化剂p63的共活化剂(包括例如TP63的同种型γ)起作用。SSRP1增大全长p63的活性,但是它对N-末端缺失的p63(δN-p63)变体没有作用。SSRP1还与FYTTD1/UIF和SRF相互作用。
SPT16(SUPT16H)为在人体内由SUPT16H基因(人的mRNA:NM_007192.3,该序列特此以引用的方式整体并入,小鼠的mRNA:NM_033618.3,该序列特此以引用的方式整体并入)编码的蛋白质。SPT16蛋白(在人中为:NP_009123.1,该序列特此以引用的方式整体并入,在小鼠中为:NP_291096.2,该序列特此以引用的方式整体并入)为FACT复合物中的140kDa亚基。SPT16也是在UV照射之后形成的CK2-SPT16-SSRP1复合物的成分,所述复合物包含SSRP1、SUPT16H、CSNK2A1、CSNK2A2以及CSNK2B。另外,SPT16为WINAC复合物的组分,所述复合物至少包含SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCD1、SMARCE1、ACTL6A、BAZ1B/WSTF、ARID1A、SUPT16H、CHAF1A以及TOP2B。SPT16已显示与酪氨酸蛋白激酶BAZ1B相互作用。SPT16还与NEK9、通用转录因子IIE亚基2(GTF2E2)相互作用并且结合组蛋白H2A-H2B。
在各种方面,本发明包括评价肿瘤。在各种实施方案中,所述评价可选自诊断、预后以及对治疗的应答。
诊断是指试图确定或鉴定可能的疾病或病症例如像癌症的过程。预后是指疾病或病症例如像癌症的可能结果的预测。完整预后通常包括预期的持续时间、功能以及疾病病程的描述,如进行性减退、间歇性危机或者突然的不可预测的危机。对治疗的应答为患者在接受治疗时的医疗结果的预测。对治疗的应答可为(作为非限制性实例)病理学的全应答、存活期以及再发可能性。
在一个实施方案中,高风险或低风险分类为对新辅助和/或辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对新辅助和/或辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
在某些实施方案中,新辅助疗法是指在任何手术之前收缩和/或降级肿瘤的化疗。因此,如本文所用的术语新辅助化疗是指在手术之前对癌症患者施用的化疗。通常被认为使用新辅助疗法的癌症类型包括例如乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、***、膀胱癌以及肺癌。
辅助疗法也被称为辅助护理,是除初始治疗、主要治疗或起始治疗之外给予的治疗。作为非限制性实例,辅助疗法可为通常在手术之后给予的额外治疗(例如化疗),在手术中除去所有可检测疾病但是其中由于隐匿性疾病而存在统计的复发风险。
在各种实施方案中,本发明提供肿瘤在高风险和低风险组中的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的肿瘤评价和分类。在各种实施方案中,在患者的标本中测量FACT和/或SSRP1和/或SPT16,包括例如分选/计数正常和恶性细胞以及将表达FACT和/或SSRP1和/或SPT16的恶性细胞数目定量为例如百分比。在各种实施方案中,此类测量可评估针对FACT和/或SSRP1和/或SPT16染色的接近性。在各种实施方案中,测量是基于计算机的。
在一些实施方案中,高风险分类包括高水平的癌症侵袭性,其中侵袭性可通过高肿瘤等级、侵袭性组织亚型、低的总生存期、高的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的存在中的一种或多种来表征。
在另一个实施方案中,低风险分类包括低水平的癌症侵袭性,其中侵袭性可通过低肿瘤等级、较低侵袭性的组织亚型、高的总生存期、低的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的缺乏和/或减少中的一种或多种来表征。
肿瘤等级是用于根据在显微镜下看起来多么异常以及肿瘤可能多么快速生长和扩散来分类癌细胞的一种***。确定肿瘤等级时会考虑许多因素,包括细胞的结构和生长模式。用于确定肿瘤等级的具体因素可随每种癌症类型而变化并且是本领域已知的。
组织学等级,又称作分化,是指肿瘤细胞类似于相同组织类型的正常细胞的程度。细胞核等级是指肿瘤细胞中细胞核的大小和形状以及正***的肿瘤细胞的百分比。
基于癌细胞的显微镜下外观,病理学家通常按四个严重程度描述肿瘤等级:等级1、2、3和4。等级1肿瘤的细胞类似于正常细胞并且往往缓慢地生长和增殖。等级1肿瘤通常被认为具有最低侵袭性的行为。相反,等级3或等级4肿瘤的细胞看起来不像相同类型的正常细胞。等级3和等级4肿瘤往往比更低等级的肿瘤生长得更快且扩散得更快。美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)建议了对肿瘤评级的以下准则:GX—等级无法评定(未确定的等级);G1—分化良好的(低等级);G2—适度分化的(中间等级);G3—分化不良的(高等级);和G4—未分化的(高等级)。
对于每种类型的癌症,评级***有所不同。例如,病理学家使用Gleason***描述***癌细胞的分化程度。Gleason***使用范围从等级2至等级10的评分。较低的Gleason评分描述分化良好的较低侵袭性的肿瘤。较高的评分描述分化不良的较高侵袭性的肿瘤。其它评级***包括例如用于乳腺癌的Bloom-Richardson***和用于肾癌的Fuhrman***。
在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的存在和/或高水平指示较高等级癌症。在这些实施方案中,患者遭受侵袭性癌症并且采用了侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗,诸如辅助和新辅助疗法。或者,这些情形可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
相反,在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的缺乏和/或低水平指示较低等级癌症。在这些实施方案中,患者遭受较低侵袭性癌症并且采用了较低侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗。在这些实施方案中,辅助和新辅助疗法可被缩短或完全避免。
在各种实施方案中,侵袭性治疗可包括手术与放射和化疗的组合或手术与放射的组合或手术与化疗的组合。
组织学亚型是指使用组织学来分类癌症亚型。例如,在乳腺癌中,示例性亚型为粘质的和管状的。这些亚型被视为有利的或较低侵袭性的。
在一些实施方案中,本发明方法替代或增强组织学亚型在指导癌症治疗中的使用。
癌症存活率或存活统计值可指对于某种类型的癌症可存活特定时间的人的百分比。癌症统计值经常使用总的五年存活率。例如,膀胱癌的总的五年存活率为80%,即诊断出膀胱癌的每100个人中80个在诊断后存活五年,而每100个人中20个在诊断出膀胱癌的五年内死亡。可使用其它类型的存活率,例如:无病存活率(达到缓解的癌症患者人数)和无进展存活率(仍有癌症、但他们的疾病没有进展的人数)。
在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的存在和/或高水平指示较低的总存活期可能性。在这些实施方案中,患者遭受侵袭性癌症并且采用了侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗,诸如辅助和新辅助疗法。或者,这些情形可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
相反,在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的缺乏和/或低水平指示较高的总存活期可能性。在这些实施方案中,患者遭受较低侵袭性癌症并且采用了较低侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗。在这些实施方案中,辅助和新辅助疗法可被缩短或完全避免。
转移可能性是指癌症将会呈现转移特性的可能性。
在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的存在和/或高水平指示较高的转移可能性。在这些实施方案中,患者遭受侵袭性癌症并且采用了侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗,诸如辅助和新辅助疗法。或者,这些情形可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
相反,在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的缺乏和/或低水平指示较低的转移可能性。在这些实施方案中,患者遭受较低侵袭性癌症并且采用了较低侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗。在这些实施方案中,辅助和新辅助疗法可被缩短或完全避免。
癌细胞标志物是指癌症或恶性肿瘤的特性,包括指示癌症的某些基因/蛋白的表达。这些标志物在本领域是已知的。在一些实施方案中,某些癌细胞标志物指示侵袭性癌症,而其它癌细胞标志物不指示侵袭性癌症。例如,在乳腺癌中:基底型、三阴性、ER阴性和Her2阳性指示侵袭性癌症。相反,管腔型、激素受体阳性、ER阳性和Her2阴性指示较低侵袭性的癌症。
对于非小细胞肺癌(NSCLC),未分化的大细胞癌瘤指示侵袭性癌症,而其它类型的肺癌暗示较低侵袭性的癌症。对于肾细胞癌瘤(RCC),***状和肉瘤样癌瘤指示侵袭性癌症,而缺少这些癌瘤指示较低侵袭性癌症。
在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的存在和/或高水平指示与侵袭性癌症相关的癌细胞标志物的存在。在这些实施方案中,患者遭受侵袭性癌症并且采用了侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗,诸如辅助和新辅助疗法。或者,这些情形可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
相反,在一些实施方案中,通过FACT测量评价肿瘤并且FACT的缺乏和/或低水平指示与侵袭性癌症相关的癌细胞标志物的缺乏。在这些实施方案中,患者遭受较低侵袭性癌症并且采用了较低侵袭性治疗方案,包括本文所述的治疗。在这些实施方案中,辅助和新辅助疗法可被缩短或完全避免。
在一些实施方案中,低风险分类指示新辅助和/或辅助疗法的停止。在一些实施方案中,低风险分类的患者不接受指示新辅助和/或辅助疗法。
在一些实施方案中,高风险分类指示新辅助和/或辅助疗法的提供。在一些实施方案中,高风险分类的患者接受指示新辅助和/或辅助疗法。
本发明还提供可根据癌症的类型和时期而不同的优点。在一些实施方案中,肿瘤尚未侵入深部组织,并且所述评价可用于促使治疗方案防止恶性肿瘤的进展和防止进一步侵入。在这些实施方案中,治疗方案任选地具有比侵袭性癌症中经历的侵袭性低的侵袭性。在其它实施方案中,癌症已侵入深入组织,但没有局部***受累或转移并且所述评价可用于促使治疗方案防止恶性肿瘤的进展和防止进一步侵入。在这些实施方案中,肿瘤方案任选地具有比肿瘤尚未侵入深部组织时经历的侵袭性高的侵袭性。在其它实施方案中,存在局部***受累,但未转移到远离的部位,并且所述评价可用于促使治疗方案防止恶性肿瘤的进展和防止进一步侵入。在此类实施方案中,治疗方案任选地是非常侵袭性的。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。在其它实施方案中,癌症具有多个转移病灶,并且所述评价可用于促使治疗方案防止恶性肿瘤的进展和防止进一步侵入。在此类实施方案中,治疗方案任选地是非常侵袭性的。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指示癌症的时期。作为非限制性实例,使用总体时期分组,I期癌症定位于身体的一个部位;II期癌症是局部晚期的,III期癌症也是局部晚期的。癌症被指定为II期还是III期可取决于癌症的特定类型。在一个非限制性实例霍奇金病中,II期指示仅在隔膜的一侧上受影响的***,而III期指示在隔膜上方和下方受影响的***。因此II期和III期的具体标准根据诊断而不同。IV时期癌症往往是已经转移的,或扩散到其它组织或全身。
因此,在一些实施方案中,癌症是I期且不是局部晚期的。根据这些实施方案,本文所述的肿瘤评价可指导较低侵袭性的治疗。在一些实施方案中,癌症是II或III期,也就是说,癌症可能是局部晚期的。根据这些实施方案,本文所述的肿瘤评价可指导较高侵袭性的治疗。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。在其它实施方案中,癌症是IV时期或是转移的。根据这些实施方案,本文所述的肿瘤评价可指导较高侵袭性的治疗。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
在一些实施方案中,癌症是不可切除的。不可切除的癌症是由于转移病灶的数目或由于处于手术危险区中而无法通过手术去除的恶性肿瘤。在一些实施方案中,所述评价指导在化疗和/或放射治疗之前准备患者和/或减小肿瘤体积的治疗,并且可减少所需的化疗或放射的剂量。
在一些实施方案中,癌症为多重耐药的。例如,患者可能已经受一轮或多轮化学疗法,而没有基本应答。可选地或者另外,肿瘤具有多重耐药的一种或多种标志物。此类标志物可包括化学应答测定或分子测定。因此,术语多重耐药意思是癌症表现出对至少一轮组合化学疗法不应答或者可选地已评定(诊断上)为对以下至少两种(包括可与以下可比的药剂)抵抗:多西他赛、紫杉醇、阿霉素、表柔比星、卡铂、顺铂、长春花碱、长春新碱、奥沙利铂、卡莫司汀、氟尿嘧啶、吉西他滨、环磷酰胺、异环磷酰胺、拓扑替康、埃罗替尼、依托泊苷以及丝裂霉素。在此类实施方案中,基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的肿瘤评价可指导侵袭性治疗。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
在一些实施方案中,患者处于缓解中。对于达到缓解的患者,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导较低侵袭性的治疗(例如避免或延迟再发的治疗)或适用于维持缓解的治疗或无治疗。
在其它实施方案中,癌症是在初始癌症的常规化疗后的再发。往往再发癌症已经发展出药物抗性并且因此特别难以治疗且通常在存活期方面具有不良预后。在此类实施方案中,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
在其它实施方案中,人样品中的FACT测量指示利用常规疗法时在存活期方面具有不良预后的患者。例如,预后可以是小于约五年、小于约三年、小于约两年或小于约一年的预期(例如,大于约50%或约60%或约70%或约80%或约90%几率)存活期。预后可以基于癌症类型,包括癌症类型对放疗和/或化疗的总应答率,并且/或者可以基于肿瘤细胞的分子表征,包括不仅FACT、而且例如VEGF、PDGFRβ、CD31、HER2、PTEN、ERCC1、BRCA1、TOPO2α、Ki-67、P53、TS、ER、PR的表达水平或EGFR、ALK、KRAS、BRAF和PI3K中的一者或多者中的突变体。在一些实施方案中,FACT和/或SSRP1和/或SPT16的存在或高水平指示不良预后。在这些实施方案中,FACT和/或SSRP1和/或SPT16的存在或高水平可指示侵袭性治疗。在这些实施方案中,FACT和/或SSRP1和/或SPT16的存在或高水平可引起患者接受侵袭性治疗。
或者,除了FACT之外,预后可以基于指示化疗抗性、癌症再发可能性或关于存活期的高风险组的癌症的基因表达签名。对于预测肿瘤对疗法的应答和/或关于预后的其它肿瘤分类,基因表达签名正变得日益可用。示例性基因表达签名描述于PCT/US2012/022594(结肠癌)、美国专利号8,211,643(NSCLC)、美国专利公开号2010-0331210(乳腺癌)、美国专利号7,056,674、美国专利号7,081,340、美国专利号7,569,345和美国专利号7,526,387,所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
在包含FACT测量的肿瘤评价指示不良预后的实施例中,这可指导非常侵袭性的治疗方案。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可实际上指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
在一些实施方案中,肿瘤评价替代体能状况。体能状况可使用本领域中已知的用于评定患者体能状况的任何***和方法进行定量。所述量度往往用于确定患者是否能够接受化疗、进行剂量调整和确定姑息性护理的强度。存在各种评定方法,包括Karnofsky评分和Zubrod评分。平行评定***包括功能总体评定(GAF)评分,这已被结合为精神病学诊断与统计手册(DSM)的第五轴。使用体能状况的一个主要限制是存在主观性并且因此本发明在一些实施方案中解决了这个问题。
较高体能状况(例如使用Karnofsky评定***时至少80%或至少70%)可指示治疗防止疾病状态的进展并增强患者接受化疗/或放射治疗的能力。例如,在这些实施方案中,患者不卧床并能够自我护理。在其它实施方案中,所述评价指示具有低体能状况的患者(例如使用Karnofsky评定***时小于50%、小于30%或小于20%),从而允许忍受常规放疗和/或化疗。在这些实施方案中,患者主要被限制到床上或椅子上且甚至不能够自我护理。
在一个实施方案中,人肿瘤标本(包括例如活检组织)或由其培养的细胞中检测到FACT和/或其高水平指示低体能状况。在此类实施方案中,本文所述的FACT测定指导非常侵袭性治疗的使用。或者,在这些情况下,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导侵袭性治疗的停止和姑息性护理的使用,以便为了更好的生活质量而避免来自无效化疗的不必要毒性。
在一个实施方案中,人肿瘤标本(包括例如活检组织)或由其培养的细胞中FACT的缺乏和/或低水平指示高体能状况。在此类实施方案中,本文所述的FACT测定指导较低侵袭性治疗的使用从而省去不合需要的毒性。
Karnofsky评分从100至0,其中100为“完美”健康而“0”为死亡。评分可采用为以10的间隔,其中:100%是正常的,没有抱怨,没有疾病的征兆;90%为能够正常活动,几乎没有疾病的症状或征兆,80%为正常活动有一些困难,一些症状或征兆;70%为护理自身,不能够正常活动或工作;60%为需要一些帮助,可以处理大部分的个人需求;50%为需要经常帮助,需要频繁的医疗;40%为丧失能力的,需要特殊护理和帮助;30%为严重丧失能力的,指示入院,但没有死亡危险;20%为病情严重的,迫切需要入院,需要支持性措施或治疗;以及10%为垂死的、快速进行性致命疾病过程。
用于体能状况的Zubrod评分***包括:0,完全活动的,能够无限制地继续所有疾病前的性能;1、身体剧烈活动受限制、但不卧床且能够执行轻的或久坐性质的工作,如轻的室内工作、办公室工作;2、不卧床且能够自我护理,但不能进行任何工作活动高达且约超过50%的清醒时间;3、只能有限的自我护理,超过50%的清醒时间被限制床上或椅子上;4、完全丧失能力,不能进行任何自我护理,完全被限制床上或椅子上;5、死亡。
在一些实施方案中,根据Elston和Ellis,Histopathology,1991,19:403-10对肿瘤的组织样品进行评级,所述文献特此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中,FACT为癌干细胞的代用标志物,其可代替针对此类细胞的已知标志物来使用。在一些实施方案中,FACT为癌干细胞的标志物,其可与已知标志物组合使用来提高对患者是否具有此类细胞的准确预测的可能性。
癌干细胞具有自我更新和多能性的能力。癌干细胞假说陈述,虽然癌干细胞代表肿瘤内稀有的细胞群体,但它们的高致瘤能力驱动肿瘤发生。癌干细胞具有广泛的增殖能力;能够不对称细胞***而产生一种或多种具有降低的增殖或发育潜能的分化子代;并且能够为了自我更新或自我维持进行对称细胞***。由于癌干细胞的固有干细胞样特性,癌症干细胞增殖产生更多的癌干细胞,和构成肿瘤本体的所有分化细胞类型。肿瘤中的非癌干细胞已经显示出增殖速度大于癌干细胞,但少有肿瘤起始潜能。因为癌干细胞表现出提高的毒性和化学侵害抵抗力,所以这种特定的细胞亚群被认为构成化疗抗性和疾病复发的基础。事实上,癌干细胞模型假定所有癌干细胞必须根除以消除肿瘤和防止其再发。
在一些实施方案中,通过FACT检测将肿瘤细胞类型分类为包括癌干细胞指示了对常规疗法显示抗性的癌症类型。在一些实施方案中,向具有通过FACT检测被分类为包括癌干细胞的肿瘤的患者提供化疗,所述化疗是针对癌干细胞和/或已知有效抵抗癌干细胞。在一些实施方案中,针对癌干细胞和/或已知能有效抵抗癌干细胞的此类化疗选自BBI608、BBI50、以高亲和力和特异性结合端粒酶催化位点的药剂(例如imetelstat(GRN163L))、GRNOPC1、糖酵解抑制剂3-溴-2-氧代丙酸酯-1-丙酯(3-BrOP)(包括例如在低氧条件下)、卡氮芥、甲福明、硫利达嗪、粘着斑激酶(FAK)抑制剂(例如defactinib(VS-6063))、VS-4718、VS-5584、sabutoclax、靶向Delta样配体4(DLL4)的抗体(包括例如demcizumab)、针对白细胞介素-3受体(IL-3R)的药剂(包括例如SL-401)及其组合。相反,FACT的缺乏可指示患者没有癌干细胞并且可担保使用不需要针对癌干细胞和/或已知能有效抵抗癌干细胞的常规化疗。
在一些实施方案中,通过FACT检测将肿瘤细胞类型分类为包括癌干细胞指示了可能复发的癌症类型。在一些实施方案中,已针对肿瘤进行治疗的患者中检测到FACT可指导治疗后的进一步监测。例如,常规治疗后监测通常是缓解后前面1-2年内不超过每3-4个月一次和随后数年内每6个月一次。在一些实施方案中,检测到FACT可指导增加的监测,例如使用检测再发癌症的常规测定,每周一次、两周一次、每月一次、两月一次等。监测的次数在缓解后前面1-2年内可仍然是高的,例如使用检测再发癌症的常规测定,每周一次、两周一次、每月一次、两月一次等。在一些实施方案中,检测到FACT可指导使用检测再发癌症的常规测定,例如每年1至10次或每两年至少一次的监测。相反,FACT的缺乏可指示患者没有癌干细胞且可担保常规的治疗后监测。
在一些实施方案中,已针对肿瘤进行治疗的患者中检测到FACT可指导因为复发可能性而进行的辅助或新辅助疗法。在一些实施方案中,检测到FACT指示存在癌干细胞和高复发可能性并且因此所述患者可接受如本文所述的辅助或新辅助疗法。相反,FACT的缺乏可指示不存在癌干细胞且蛋白停止辅助或新辅助疗法。
在一些实施方案中,FACT用于预测癌干细胞的存在的使用与用于本文所述的肿瘤评价的其它FACT使用(例如作为肿瘤侵袭性的指示)结合使用。例如,FACT+患者可基于其肿瘤为侵袭性的可能性而接受侵袭性治疗,但这种治疗可选择为有效抵抗癌干细胞的化疗。此外,FACT+可不仅接受侵袭性治疗,而且监测频率可高于成功治疗后的通常监测频率。
本文所述的方法可适用于各种癌症,包括实体肿瘤和白血病。在各种实施方案中,癌症是软组织肉瘤、鳞状细胞癌、纤维肉瘤、肌肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤或上皮癌。在一些实施方案中,肿瘤组织学是浆液性腺癌、内膜型腺癌、粘液性腺癌、未分化腺癌、移行细胞腺癌、或腺癌。示例性癌症包括肺癌,包括SCLC和NSCLC,间皮瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、食道癌、乳腺癌、淋巴瘤、***癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、结肠癌或结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、睾丸癌和黑素瘤。在其它实施方案中,癌症是白血病,如慢性髓细胞性白血病(CML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
在各种实施方案中,癌症为实体肿瘤。在一些实施方案中,肿瘤为原发或再发肿瘤或转移病灶中的一种或多种。
在一些实施方案中,肿瘤为乳腺、***、胰腺、肺、肝、肾、膀胱、结肠直肠、卵巢、宫颈、头颈、皮肤、中枢和外周神经***肿瘤中的任一种。
在各种实施方案中,基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的肿瘤评价指导患者治疗。被评定为FACT+的患者可接受以下中的一种或多种作为主要的、辅助的或新辅助的方案:化疗方案(包括例如单一疗法和联合疗法)。所述化疗可以是,例如但不限于,紫杉醇、多柔比星、普卡霉素、多西他赛、基于铂的化疗剂(包括但不限于顺铂和卡铂)、丝裂霉素、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春瑞滨、托泊替康、伊立替康、博来霉素、博来霉素羟基脲、丝裂霉素、放线菌素、拓扑异构酶I和II抑制剂、蒽环类、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星、依托泊苷、替尼泊苷、卢比替康及其衍生物。化疗科包括紫杉烷和/或抗代谢物和/或其衍生物。
此外或作为替代,患者可接受选自蒽环类、紫杉醇或紫杉烷类、长春花属生物碱、烷基化剂、嵌入剂、激酶抑制剂或氮芥的化疗。非限制性的示例性药剂包括拓扑异构酶抑制剂(I或II)、调亡诱导剂、蛋白酶抑制剂、微管抑制剂、有丝***抑制剂、抗代谢药、信号转导抑制剂、***受体抑制剂、EGFR抑制剂、Her2抑制剂或芳香酶抑制剂中的一种或多种。
此外或作为替代,患者可接受包括以下中的一种或多种的化疗剂:柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、阿霉素、长春新碱、卡莫司汀、顺铂、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、甲羟孕酮、善得定(sandostatine)、丝裂霉素C、膦甲酸、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、氟达拉滨、卡铂、甲酰四氢叶酸、他莫昔芬、戈舍瑞林、酮康唑、亮丙瑞林氟他胺、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、盐酸伊立替康、依托泊苷、米托蒽醌、替尼泊苷、安吖啶、美巴龙、盐酸吡罗蒽醌、氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(Ara-C)、三甲曲沙、阿西维辛、阿拉诺新、吡唑呋喃菌素、喷司他丁、5-氮杂胞苷、5-氮杂胞苷、5-氮杂-5-氮杂-2′-脱氧胞苷、腺苷***糖苷(Ara-A)、克拉屈滨、替加氟、UFT(尿嘧啶和替加氟的组合)、5-氟-2′-脱氧尿苷、5-氟尿苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、羟基脲、dihydrolenchiorambucil、噻唑呋林、奥沙利铂、美法仑、塞替派、白消安、苯丁酸氮芥、普卡霉素、达卡巴嗪、磷酸异环磷酰胺、环磷酰胺、哌泊溴烷、4-薯醇、二氢仑哌隆(dihydrolenperone)、螺莫司汀、格尔德霉素、细胞松弛素、缩酚肽、4'-氰基-3-(4-(例如ZOLADEX)和4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-3-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺。
在一些实施方案中,患者可接受以下中的一种或多种:抗-Her2/neu抗体诸如HERCEPTIN、抗-EGFR抗体诸如ERBITUX、生长因子受体抗体诸如AVASTIN、小分子抑制剂诸如TARCEVA、IRESSA或舒尼替尼)、或抗-CD20抗体诸如RITUXAN。在其它实施方案中,患者接受埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗或伊马替尼。
在一些实施方案中,本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评价可指导用咔唑化合物进行的患者治疗,例如像国际专利公开号WO2010/042445中描述的那些咔唑化合物,所述专利特此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中,咔唑化合物为curaxin,例如像CBLC000、CBLC100和CBLC137(参见例如Gasparian等Sci.Trans.Med.3:95ra74(2011),所述参考的内容特此以引用的方式整体并入)。
本文所述的基于FACT和/或SSRP1和/或SPT16的肿瘤评价可指导患者治疗,包括放射疗法。放射疗法可例如为外部射束疗法(EBT)或强度调控放射疗法(IMRT)。EBT向肿瘤的位置递送高能X射线射束。射束产生于患者外部(通常由直线加速器产生)且靶向于肿瘤位点。这些X射线会破坏癌细胞并且谨慎的治疗计划能使周围正常组织不受伤害。患者身体内部不安排放射源。IMRT是高精度放疗的高级模式,其利用计算机控制的X射线加速器向恶性肿瘤或肿瘤内的特定区域递送精确放射剂量。放射剂量被设计为通过调控或控制放射射束的强度来贴合肿瘤的三维(3-D)形状,以便将更高放射剂量集中到肿瘤上而同时最小化健康细胞的放射暴露。也可采用近距放射疗法,其使用植入到治疗区域中的密封放射源,这些密封放射源可以是暂时的或永久的。
在一些实施方案中,高风险患者接受化疗和放射疗法。
可源于本发明的肿瘤评价的治疗的剂量是本领域中已知的,例如参考Physicians’Desk Reference,第66版,PDR Network;2012版(2011年12月27日),所述参考的内容以引用的方式整体并入。可采用体外或体内测定以帮助确定最佳剂量范围。剂量可取决于若干因素,包括癌症严重程度、受试者的年龄、体重和健康状况以及药物基因组学参数。
施用方法包括但不限于:口服、皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、***内、经皮、直肠、通过吸入、或局部,特别是施用到耳、鼻、眼或皮肤。施用方式可由从业人员判断。治疗组合物可任选地包含合适量的药学上可接受的赋形剂以便提供适用于向受试者施用的形式。
在各种实施方案中,本发明包括测量FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平。例如,在一些实施方案中,本发明包括测量SSRP1和/或SPT16。
在一些实施方案中,SSRP1和/或SPT16的测量包括使用特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂。例如,这种药剂可为抗体。
在一些实施方案中,SSRP1和/或SPT16的测量包括使用特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白核酸之一的药剂。在一些实施方案中,药剂可为DNA或RNA。在一些实施方案中,药剂可为引物或探针。
在一些实施方案中,测量包括评价蛋白质的存在、缺乏或水平。在一些实施方案中,测量包括对特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂的使用并且所述药剂例如可以为抗体。在各种实施方案中,SSRP1和SPT16蛋白水平中的一种或多种的测量为免疫组织化学染色、蛋白印迹、细胞内蛋白印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)中的任一种。
本发明的方法可涉及使抗体(例如,针对FACT和/或SSRP1和/或SPT16)与肿瘤标本(例如,活检组织或组织或体液)接触以便鉴定对组织或体液特异的且为癌症状态的指示(例如,针对FACT和/或SSRP1和/或SPT16)的表位。
通常使用两种策略来检测体液或组织的抗原上的表位,这两种策略为直接方法和间接方法。直接方法包括一步染色法并且可涉及与体液或组织样品中的抗原直接反应的标记抗体(例如,FITC缀合的抗血清)。间接方法包括与体液或组织抗原反应的未标记的一抗以及与一抗反应的经标记的二抗。标记可包括放射性标记、荧光标记、半抗原标记(如生物素)或酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。进行这些测定的方法是本领域中已知的。参见例如Harlow等(Antibodies,Cold SpringHarbor Laboratory,NY,1988)、Harlow等(Using Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1999)、Virella(MedicalImmunology,第6版,Informa HealthCare,New York,2007)和Diamandis等(Immunoassays,Academic Press,Inc.,New York,1996)。用于进行这些测定试剂盒可从例如Clontech Laboratories,LLC.(Mountain View,CA)商购。
在各种实施方案中,抗体包括全抗体和/或任何抗原结合片段(例如,抗原结合部分)和/或这些的单链(例如,包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的抗体、Fab片段、由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段;F(ab)2片段、包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;由VH和CH1结构域组成的Fd片段;由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;等)。在各种实施方案中,多克隆抗体和单克隆抗体为有用的,如为分离的人或人源化抗体或其功能片段。
评价抗体对不同种类的靶标的结合能力的标准测定为本领域已知的,包括例如ELISA、蛋白印迹法和RIA。也可通过本领域已知的标准测定、例如通过Biacore分析来评估抗体的结合动力学(例如,结合亲和力)。
在另一个实施方案中,测量包括评价核酸的存在、缺乏或水平。
本领域技术人员将理解许多方法可用于检测或定量FACT和/或SSRP1和/或SPT16的DNA/RNA水平。
可使用例如低度至中度重叠(low-to-mid-plex)技术测量基因表达,所述技术包括但不限于报道基因测定、RNA印迹法、荧光原位杂交法(FISH)以及逆转录PCR(RT-PCR)。还可使用例如较高重叠技术测量基因表达,所述技术包括但不限于基因表达的连续分析(SAGE)、DNA微阵列。瓦片阵列、RNA-Seq/完整转录物组短枪测序(WTSS)、高通量测序、多重PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、通过连接的DNA测序以及Luminex/XMAP。
本领域技术人员将了解,可使用多种方法检测或定量样品内的生物标记的RNA产物的水平,所述方法包括阵列(如微阵列)、RT-PCR(包括定量PCR)、核酸酶保护测定以及RNA印迹分析。
在各种实施方案中,本发明提供FACT和/或SSRP1和/或SPT16的测量以提供关于存在或缺乏的信息,并且此信息指导患者治疗。
在其它实施方案中,本发明提供FACT和/或SSRP1和/或SPT16的测量以确定FACT和/或SSRP1和/或SPT16的定量的量。在一些实施方案中,本发明提供定量恶性/肿瘤细胞的数目并确定表达FACT和/或SSRP1和/或SPT16的那些细胞的百分比。在一些实施方案中,高水平的FACT和/或SSRP1和/或SPT16指示侵袭性癌症,而低水平的FACT和/或SSRP1和/或SPT16指示较低侵袭性癌症。
在一些实施方案中,使用了反映染色强度和阳性肿瘤细胞比例的FACT评定***。可使用任何合适的评定***,包括阈值和连续评定***。例如,所述评定***可使用0到至少4的标度。在一些实施方案中,不同的FACT分数截止点为:(i)高FACT和/或SSRP1和/或SPT16SSRP1水平样品(例如指标>4)对低和阴性样品(例如指标≤4);(ii)阳性FACT和/或SSRP1和/或SPT16(例如指标>1)和弱的/阴性的(例如指数≤1);和(iii)完全阴性样品(例如指标=0,没有可检测到的FACT和/或SSRP1和/或SPT16阳性细胞)对所有阳性样品(例如指标>0,FACT和/或SSRP1和/或SPT16阳性细胞的任何比例,包括非常弱或小于例如10%)。
在一些实施方案中,获得了存活期与FACT和/或SSRP1和/或SPT16水平的关系并且比较了阳性和阴性FACT和/或SSRP1和/或SPT16样品。
如本文所用的FACT阳性是指FACT或其亚基(例如SSRP1和/或SPT16)的阳性检测。在一些实施方案中,FACT阳性样品包括恶性细胞数目为至少约5%或至少约10%的那些样品。在各种实施方案中,FACT阳性样品包括包含大于约10%、或约20%、或约30%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约80%、或约90%、或约100%的表达FACT和/或SSRP1和/或SPT16的恶性细胞的那些样品。例如,用于区别高风险或低风险组的FACT阈值是在约5%至约50%、诸如约10%至30%内。
在各种实施方案中,本发明提供待从患者肿瘤取得的活检组织,和任选地例如通过对恶性细胞的百分比计数而进行的活检组织中恶性细胞的鉴定和/或测量,和任选地对表达FACT和/或SSRP1和/或SPT16的恶性细胞的鉴定和/或测量。在一些实施方案中,本发明提供对表达FACT和/或SSRP1和/或SPT16的恶性细胞的百分比的定量,这允许确定本文所述的FACT评分(并因此在一些实施方案中引导治疗)。在一些实施方案中,FACT和/或SSRP1和/或SPT16的评定建立本文所述的阈值以便确定例如疾病特性(例如肿瘤侵袭性)。在一些实施方案中,恶性细胞的测量可采用本文所述的各种生物标志物。在一些实施方案中,恶性细胞的测量可采用本文所述的各种实验技术。
在各种实施方案中,本发明提供从患者肿瘤取得活检组织并鉴定恶性细胞。可使用合适的染剂(例如使用DAPI染色)来鉴定个体细胞。可由受过训练的病理学家和/或使用肿瘤/恶性肿瘤标志物来鉴定恶性细胞。样品的恶性部分用于评价FACT状况。
在一些实施方案中,还可以确定FACT和/或SSRP1和/SPT16染色的接近度。
在各种实施方案中,还测试了对照标志物。
在各种实施方案中,采用了同时或顺序的测量。
在各种实施方案中,测量可以采用自动化或计算机执行的技术,所述技术对染色肿瘤样品成像,并且量化所使用的不同标志物,包括量化表达多个标志物的细胞。在一些实施例中,病理学家可以实施本文所述的测量。
在各种实施方案中,自动化或计算机执行的技术和/或病理学家可以确定FACT和/或SSRP1和/或SPT16阳性细胞的数量或百分比相对肿瘤/恶性细胞的数量或百分比,并且计算如本文所述的阈值量或评分。
在各种实施方案中,评分***与本文所述的检测测定耦合。例如,在一个实施方案中,由原发性肿瘤活检组织和(当可用时)匹配正常或转移性病病灶的样品组成的组织微阵列(TMA)的IHC染色,用于评价人肿瘤样品中FACT和/或SSRP1和/或SPT16的蛋白水平。
在一些实施方案中,在计算机上执行FACT和/或SSRP1和/或SPT16的测量。因此,在一些实施方案中,本发明提供用于实施本文所述的方法的计算机程序和计算机执行的产品。在一个实施方案中,本申请提供一种用于与具有处理器和连接至所述处理器的存储器的计算机结合使用的计算机程序产品,所述计算机程序产品包括具有在其上编码的计算机机构的计算机可读存储介质,所述计算机程序机构可以加载到计算机的存储器中并且可以使计算机实施本文所述的方法。在另一个实施方案中,本申请提供一种用于通过分析FACT和/或SSRP1和/或SPT16数据来预测预后或分类对象的计算机执行的产品。这样一种计算机执行的产品可以包括用于接收对应于受试者样品(例如,FACT和/或SSRP1和/或SPT16的)中受试者表达谱的值的装置和包含预后相关参考数据的数据库,其中计算机执行的产品选择与受试者FACT和/或SSRP1和/或SPT16谱最类似的参考数据,从而预测预后或分类受试者。
在一些实施方案中,本发明包括成像仪以实现对提供测量的信号的检测。
在各种实施方案中,自动化装置和/或计算机可以用于执行本文所述的方法,包括例如成像、测量和/或量化步骤。在一些实施方案中,这种自动化装置和/或计算机可以实现本文所述测量的自动化。
例如,在一个实施方案中,本发明允许使用红外荧光成像***(例如,光动力学眼,日本Hamamatsu Photonics,如在例如Kitai,T.等,BreastCancer.2005;12(3):211–215中所述,其内容特此以引用的方式整体并入)。此类红外荧光成像***可以包括作为光源的(例如)760nm的发光二极管,以及作为检测器的(例如)820nm以下的电荷耦合装置照相机截止滤波器。
在另一个实施方案中,本发明涉及使用激光辅助成像装置(例如,SPY机器,Novadaq公司,Bonita Springs,Fl,如在例如Jain,V.等,International Journal of Surgical Oncology Volume 2013(2013),文章编号904214)中所述,其内容特此以引用的方式整体并入)。这种激光辅助成像装置可允许实时检测荧光染料。
在另一个实施方案中,本发明涉及使用用于荧光检测的手持式视野装置(作为非限制性例子,如在例如Poh,C.F.等,Clin Cancer Res2006;12(22)2006中所述,其内容特此以引用的方式整体并入)。荧光视野装置可包括台式光源,所述光源耦合至手持式单元以用于直接荧光可视化。组织荧光的照片可使用来自所述视野装置以及具有长通滤波器(例如Schott GG475-3,Howard Glass,Worcester,MA)的数字单镜头反光照相机(例如Fuji FinePix S2 Pro,Fujifilm,Odawara,Japan)的照明来获取。单镜头反光照相机可装备有105mm f/2.8微距镜头(例如,Nikkor-Micro,Nikon,Tokyo,Japan)和环形闪光灯(例如,Nikon MacroSpeedlight SB-29s,Tokyo,Japan)用于获得白光图像。
在另一个实施方案中,本发明包括使用荧光显微镜(例如,OlympusMicroscope,Olympus America,Center Valley,PA),如在例如Marcus,A.等,Am J Clin Pathol 2012;138(4)590-3.中所述,其内容特此以引用的方式整体并入。
在另一个实施方案中,本发明可采用MDS***(Applied Imaging公司,Santa Clara,CA),如在例如Borgen,E.等,Cytometry(Communications in Clinical Cytometry)46:215–221(2001)中所述,其内容特此以引用的方式整体并入。MDSTM***包括具有计算机控制平台移动的落射荧光显微镜、自动聚焦机构,用于检测多/色原/荧色物的两个滤光轮、黑白CCD照相机、计算机、监测器以及专有扫描和分析软件。
在另一个实施方案中,本发明涉及使用便携式γ-照相机(例如,Sentinella,S102;Oncovision),如在例如Kitai,T.等,Open SurgicalOncology Journal,2010,2,78-82和Vermeeren,L.等,J of NuclearMedicine 2010;51(5)700-703中所述,其内容特此以引用的方式整体并入)。γ-照相机***包括利用SymbiaT混合照相机(Siemens)进行术前成像以得到SPECT/CT图像,以及使用手持式γ-探针(Neoprobe;Johnson&Johnson Medical)与γ-照相机以得到更高的灵敏度。
在一些实施方案中,本发明包括测量肿瘤标本,包括活检组织或手术标本样品。在一些实施方案中,所述活检组织为人的活检组织。在各种实施方案中,活检组织为以下任一种:冷冻肿瘤组织标本、培养的细胞、循环肿瘤细胞、以及***固定石蜡包埋的肿瘤组织标本。
在一些实施方案中,肿瘤标本可为活检组织样品,如冷冻肿瘤组织(冷冻切片)标本。如本领域已知的,冷冻切片可采用低温恒温器,所述低温恒温器在冷冻箱内包括切片机。将手术标本置于金属组织盘内,然后将所述盘固定在卡盘上并迅速冷冻至约-20℃至约-30℃。将标本包埋在由例如聚乙二醇和聚乙烯醇组成的凝胶样介质中。用低温恒温器的切片机部分冷冻切割冷冻组织并且任选在载玻片上收集切片并染色。
在一些实施方案中,肿瘤标本可为活检组织样品,如培养的细胞。可使用本领域已知的常用细胞培养技术来处理这些细胞。这些细胞可为循环肿瘤细胞。
在一些实施方案中,肿瘤标本可为活检组织样品,如***固定的石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织标本。如本领域已知的,可将活检组织标本置于具有***(水与甲醛的混合物)或一些其它液体的容器中以保存它。可将组织样品置于具有热石蜡的模子中。使石蜡冷却以形成保护所述组织的固体块。将具有包埋组织的此石蜡块置于切片机上,所述切片机切割非常薄的组织切片。
在某些实施方案中,肿瘤标本包含少于100mg的组织,或者在某些实施方案中,包含约50mg的组织或更少。肿瘤标本(或活检组织)可包含约20mg至约50mg的组织,如约35mg的组织。
所述组织可例如作为一个或多个(例如,1、2、3、4或5)针活检组织(例如,使用14号针或其它适合尺寸)来获得。在一些实施方案中,活检组织为细针抽吸活检,其中将长的细针***到可疑区域内并且使用注射器抽出液体和细胞用于分析。在一些实施方案中,活检组织为芯针活检,其中在芯针活检期间使用具有刀片的大针以将一列组织抽出可疑区域。在一些实施方案中,活检组织真空辅助活检,其中吸引装置增加通过针提取的液体和细胞的量。在一些实施方案中,活检组织为图像引导的活检,其中针活检与成像程序组合,所述成像程序例如像X射线、计算机化断层显象(CT)、磁共振成象(MRI)或者超声波。在其它实施方案中,可经由例如活检***的装置来获得样品,所述活检***为激光制导的用于乳腺活检的真空辅助活检***。
在一些实施方案中,使用机械碎裂从患者的组织样品(例如,活检组织样品或手术标本)制备内聚性多细胞微粒(外植体)。可在基本不含能够消化所述外植体的酶的介质中进行所述外植体的这种机械碎裂。一些酶消化可在某些实施方案中发生。通常,可使用两个无菌解剖刀以剪式运动,或使用机械上等同的手动或自动相对门齿刀片***地切碎组织样品。此横切运动在所得组织多细胞微粒上产生光滑的切割边缘。测得肿瘤微粒各自为约0.25至约1.5mm3,例如约1mm3。切碎后,可将颗粒铺在培养烧瓶中。每个烧瓶中铺的外植体数可以例如在约一与约25之间变化,如每个烧瓶约5至约20个外植体。出于说明目的,可将外植体均匀分布在烧瓶底表面上,随后初始倒置约10至约15分钟。随后可将烧瓶以非倒置位置置于37℃CO2孵育箱中,保持约5至约10分钟。定期检查烧瓶生长和污染。在几周的时间后,细胞单层将形成。另外,相信(无意受所述理论束缚)肿瘤细胞先于基质细胞从多细胞外植体中生长出来。因此,通过初始维持组织细胞在外植体中并且在预定时间(例如,在约10%至约50%汇合时,或在约15%至约25%汇合时)移除外植体,促进肿瘤细胞(与基质细胞相比)生长到单层中。在某些实施方案中,可扰动肿瘤外植体以从肿瘤外植体大量释放肿瘤细胞,并且培养所释放的细胞以产生细胞培养物单层。使用此程序来形成细胞培养物单层有助于最大化代表性肿瘤细胞从组织样品的生长。
在一些实施方案中,本发明涉及鉴定样品中的单个细胞,和/或确定样品中的正常和/或恶性细胞,和/或确定恶性细胞中FACT和/或其亚基的存在、缺乏和/或量和/或接近度。在一些实施方案中,这种鉴定是同时的或顺序的。在一些实施方案中,这种鉴定包括控制测量如本文所述的一个或多个肿瘤/恶性肿瘤标志物。
在一个实施方案中,本发明涉及同时检测样品中的单个细胞,以及检测一个或多个肿瘤/恶性肿瘤标志物,以及检测FACT和/或其亚基的存在、缺乏和/或量和/或接近度以测定FACT和/或其亚基表达和/或活性的百分比。在一些实施方案中,表达FACT和/或其亚基的恶性细胞的百分比指导如本文所述的治疗或停止治疗。在各种实施方案中,本发明包括量化表达FACT和/或其一个亚基的肿瘤/恶性细胞的数目的步骤。
通常,可通过各种细胞遗传学、核酸、蛋白或免疫化学分析检测单个细胞的位置。各种细胞的存在或缺乏可通过使样品与能够与标志物特异性结合或相互作用的配体接触来检测,所述标志物的存在或缺乏或其存在水平的增加或减少与肿瘤和/或恶性肿瘤特定相关。
在一个实施方案中,单个细胞的存在或缺乏可使用抗体(作为非限制性例子,MSN-1抗体、OXA抗体、OXB抗体、PTEN抗体、抗-LeY抗体、抗-CAGE抗体、抗-UPAR抗体、抗-Hepcidin抗体以及抗-KLK4抗体)来测量。在另一个实施方案中,各种细胞的存在或缺乏可使用核酸探针来测量,所述核酸探针能够特异性杂交与某些细胞特定相关的核酸序列,例如,与某些细胞特定相关的基因的SNP、突变、内含子-外显子剪接排列、转录物,与某些细胞特定相关的遗传序列或基因等。术语“核酸序列”、“核酸”或“核酸探针”可指包括例如约5个核苷酸至约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多个核苷酸的任何核酸。所述术语包括:单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
在各种实施方案中,本文所述的细胞检测可采用适于检测目的的任何试剂。这种标记试剂可包括但不限于各种酶、辅基、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记以及放射性标记。合适的酶的非限制性实例包括:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、α-磷酸甘油、天冬酰胺酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶以及乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括:链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性实例包括:伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、邻苯二醛、藻蓝蛋白以及藻红蛋白。化学发光材料的实例包括:吖啶翁盐、咪唑、草酸酯、热吖啶翁酯(theromaticacridinuumester)、鲁米诺以及异鲁米诺。生物发光材料的非限制性实例包括:萤光素酶、萤光素以及水母蛋白。合适的放射性材料的非限制性实例包括:125I、131I、35S、32P和3H。
在一些实施方案中,用于本发明的肿瘤/恶性肿瘤标志物包括但不限于以下中的一种或多种:MYBL2、MKI67、MAD2L1、AURKA、BCL2、BUBl、BIRC5、ESRl、CENPN、CCNBl、ERBB2、MLFlIP、NUDTl、PLKl、RNASE4、GGH、RRM2、CKS2、MCM4、CDKN3、Cl6orf61、DLG7、H2AFZ、PFKP、KPNA2、GATA3、CENPF、KRT18、KRT5、CCNE2、MELK、CX3CR1、TRIP13、MCM6、CCNDl、PDIA4、CENPA、UBE2S、NCFl、CDC25B、PGR、TGFB3、PSMD2、HMMR、XBPl、TROAP、KNTC2、PRAME、BTG2、KRT8、FOXMl、KYNU、NMEl、MCM3、NUSAPl、PCTKl、IGFBP5、CDC2、ERBB3、CSElL、PTTGl、PRCl、BRRNl、UBE2C、MUCl、KIF23、CDK2、PPP2R5C、RARRES3、PIR、CCT4、KIF14、SLPI、TOP2A、BBC3、RHOC、EZH2、HMGB3、GMPS、YIFlA、NP、DKFZp762E1312、MET、FABP5、DCK、CTSC、CCNB2、FLJ21062、VEGF、IL32、CDC20、TACC2、IGFBP2、IFI30、ID3、GPSM2、TIMP2、CCNEl、EIF4A1、RFC4、CST3、CCNA2、CENPE、SLC25A5、GSTM3、SLC7A5、LETMDl、RPS4X、TFF3、ATAD2、ACADSB、KRT17、YWHAZ、PSMB7、CNKSRl、EXTl、SMC4、MCM2、GATM、DDOST、PEX12、YYl、TFDPl、LMNB2、HPN、POLQ、PCNA、GTSEl、MAPREl、PLAUR、PTDSSl、LRRC17、FENl、NDP、ABCD3、SCUBE2、TP53、AURKB、KIFCl、COL3A1、NPYlR、PTPLB、SFRSlO、SDCl、CDCβ、CD24、TCEALlClorfl98、FAM64A、CDCA3、MSN、MYOlO、KIF2C、ASPM、TUBAl、VIL2、CYBRDl、CTSL、SFRS7、SESNl、LRP8、CP、KIT、CNAPl、TFRC、PL0D2、CKSlB、DUSP4、NDRGl、SLC35A1、CIS、CCT5、IFITMl、ITPR3、SAT、FABP7、OMD、ADAMTSl、PPP1R12A、PRLR、FKBPlA、SNRPAl、CCNC、SCAPl、SPRR2C、FADS2、CTSL2、TLE3、PDAPl、IER2、ESPLl、CDHl、UBR2、RAB6A、CD44、FBXO5、F3、PTPRT、RACGAPl、CCT7、SLC25A1、C4orfl8、TXNRDl、SLC3A2、Clβorf35、INSR、S0D2、GABBRl、SNRPB、EIF2C2、IDIl、CEP55、RLNl、PTMA、KIFIl、SHMT2、FAM89B、TPX2、CFB、EXOl、EIF4EBP1、DHFR、HIPK2、SYNCRIP、BRCAl、ZNF43、LMNBl、PBXIPl、FlO、FCGRT、FUT8、RAD21、FRY、LDHA、VASHl、GRB7、ZMYM4、ACTB、CCL18、MTDH、MS4A7、C17orf27、LOC286052、TACC3、MTlX、TKl、CDH3、CDC42BPA、FUT3、GNAZ、YBXl、GPR126、ARPC4、AP2B1、COL6Al、CXCL9、C14orf45、DIAPH3、DNAJC12、LAPTM4B、TUBA3、DTL、ALDH4A1、0RC6L、ABLIMl、SHCBPl、FGFRl、ER-RFIl、CIRBP、C20orf4β、SLC16A1、SPARC、CYP2J2、AP2A2、SLC39A6、F2、SCD、ECT2、QSCN6L1、H3F3B、COL2A1、TBX19、EDNl、OXCTl、RP13-297E16.1、PALM2-AKAP2、HRB、TUBB、CTPS、CAD、CHI3L1、GREMl、ENOl、PLODl、SORBSl、TSPANl、STMNl、HIFlA、MMP7、STK3、G0LPH2、MT2A、FOXCl、SRM、C0L1A2、GEMIN4、MAPRE2,PGK1、TIMPl、ZBTB4、CRABPl、MAP3K8、TGFBl、ClOorfllβ、C14orfl32、TP53INP1、BLM、CD-C25A、MSX2、MMP23B、ADM、CTSF、SFRP4、HMGAl、MRPS6、AP-BA2BP、STRA13、CDCA8、SQLE、ACSS2、FBPl、PSMA7、HTATIP2、PSMD14、HSPB2、APP、TAS2R5、NFIB、TNFAIP2、NATl、SC4M0L、HNRPAB、TUBGl、PAXIPl、SEC14L1、SATBl、CELSR2、RNASEH2A、TMEM45A、CDKNlA、PTG-S2、ARFl、HDAC2、BCL6、CKAP4、JUNB、NOLA2、APOD、MMPl、EGFR、CCT6A、HDGFRP3、CES2、SMS、DEPDClB、TSPAN4、BDH2、EEF1A2、S100A8、WISPl、PGAMl、DYNLTl和/或ADCY3。
在一些实施方案中,用于本发明的肿瘤/恶性肿瘤标志物包括但不限于以下中的一种或多种:ALK基因重排、α-甲胎蛋白(AFP)、β-2-微球蛋白(B2M)、β-人绒毛膜***(β-hCG)、BCR-ABL融合基因、BRAF突变V600E、CA15-3/CA27.29、CA19-9、CA-125、降钙素、癌胚抗原(CEA)、CD20、嗜铬粒蛋白A(CgA)、染色体3、7、17和9p21、细胞角蛋白片段21-1、EGFR突变分析、***受体(ER)/孕酮受体(PR)、纤维蛋白/纤维蛋白原、HE4、HER2/neu、免疫球蛋白、KIT、KRAS突变分析、乳酸脱氢酶、核基质蛋白22、***特异性抗原(PSA)、甲状腺球蛋白、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、5-蛋白签名(Ova1)、21-基因签名(Oncotype DX)、70-基因签名(Mammaprint)。
在一些实施方案中,用于本发明的肿瘤/恶性肿瘤标志物包括但不限于以下中的一种或多种:SSX蛋白家族成员,例如SSX1、SSX4、SSX5或其片段,MSN-1、OXA、OXB、PTEN、LeY、CAGE、UPAR、Hepcidin以及KLK4。在一些实施方案中,用于本发明的肿瘤/恶性肿瘤标志物包括但不限于以下中的一种或多种:***特异性抗原(PSA)、***特异性膜抗原(PMSA)、***分泌性蛋白(PSP)、***酸性磷酸酶(PAP)、人腺体激肽释放酶2(HK-2)、***干细胞抗原(PSCA)和PTI-1。在一些实施方案中,用于本发明的肿瘤/恶性肿瘤标志物包括但不限于以下中的一种或多种:β-肌动蛋白、γ-肌动蛋白、α-微管蛋白、细胞角蛋白、细胞角蛋白8(CK 8)、细胞骨架原肌球蛋白、F-肌动蛋白加帽蛋白、hsp 27、hsp 60、hsp 70、hsp 90、grp 78(BIP)、gp 96、谷光甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巯基酯酶、磷酸丙糖异构酶、醛糖还原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇酶、膜联蛋白II、IV和V、驿蛋白、烟酰胺-N-甲基转移酶、B23/核仁磷酸蛋白以及波形蛋白。
在一些实施方案中,在评定FACT水平之前,可监测细胞的生长,并且可使用周期性计数得到的数据来确定生长速率,所述生长速率可以或可以不被视为与患者中体内相同细胞的生长速率平行。
如本文所用,除非另外定义,否则术语受试者是哺乳动物,例如人类。还包括实验性动物,如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、或非人类灵长类动物,如猴子、黑猩猩或狒狒。在一个实施方案中,受试者是兽患者,包括本文所述的动物。在一个实施方案中,受试者是人类。在一些实施方案中,人类是儿童。在其它实施方案中,受试者是成年人,包括例如老年人。
本发明提供可简化肿瘤样品评价的试剂盒。本发明的典型试剂盒包括各种试剂,包括例如用以检测FACT和/或SSRP1和/或SPT16的药剂。试剂盒还可包括用于检测的一种或多种试剂,包括在各种检测方法(例如像ELISA)中有用的那些试剂。所述试剂盒还可包括评价所必需的材料,包括多孔板、注射器等。所述试剂盒还可包括指导使用所述试剂的标签或印刷说明书。
本发明进一步通过以下非限制实施例进行说明。
实施例
此外本文所采用的方法是本领域已知的。这些方法中的一些的细节在以下提供。
试剂:CBLC137由Cleveland BioLabs公司(Buffalo,NY)提供。
细胞:HT1080、WI-38、MCF7和MCF10A细胞获自ATCC。将HT1080、WI-38、MCF7维持在增补有10%热灭活(HI)FBS和抗生素的DMEM中。将MCF10A细胞维持在增补有5%马血清、20ng/mL EGF、500ng/mL氢化可的松)、.01mg/mL胰岛素、100ng/mL霍乱毒素和抗生素的1:1DMEM/F12中。RCC45和NKE-hTERT细胞已得到描述(Gurova等(2004).Cancer Res 64,1951-1958)。自***复位成形术获得人乳腺上皮细胞,并且如本领域已知的进行改良和维持。自怀孕13.5天的C57/B6野生型或p53-/-小鼠获得野生型和p53敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)并且将它们维持在具有10%FBS和抗生素的DMEM中。
质粒、转染和慢病毒转导:pLV-H-RasV12-Bleo或pLV-Bleo慢病毒载体由Andrei Gudkov博士(Roswell Park Cancer Institute,Buffalo,NY)友好提供。将人SSRP1cDNA克隆到pLV新慢病毒载体中并且通过测序来验证。SUPT16cDNA使用已由DAPCEL公司(Cleveland,OH)遵循DAPCEL公司专有同义密码子优化策略为增强同源和异源宿主中蛋白表达而优化的序列来合成(Invitrogen,GeneArt AG)。将cDNA克隆到pMLV HygroR慢病毒载体中作为XbaI-BamHI片段。shRNA至SSRP1、Spt16或GFP获自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。
siRNA至SSRP1(On-Target plus SMART pool,目录号L-011783-00)SPT16(On-Target plus SMART pool,目录号L-009517-00)以及siCONTROL非靶向siRNA(目录号D-001210-01)购自Thermo ScientificDharmacon。根据制造商方案使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)执行转染。如本领域已知的执行慢病毒包装和转染。
蛋白印迹法、荧光激活细胞细胞计量术以及免疫荧光方案是本领域已知的。
根据制造商方案使用EDU和EU试剂盒(Invitrogen)测量细胞中的复制和转录速率。
定量RT-PCR:根据制造商方案通过TRIzol试剂(Ambion)分离总RNA。根据制造商方案使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)由2μg总RNA合成第一链cDNA。利用购自Applied Biosystems的引物执行定量实时PCR:使用7900HT序列检测***(ABI PRISM;AppliedBiosystems)的缺省参数,利用TagMan基因表达主液混合物(AppliedBiosystems)执行SSRP1–Hs00172629_m1、SUPT16H–Hs00200446_m1和18S–Hs99999901_s1.qPCR。为了比较样品之间的基因表达,使用参考基因18S核糖体RNA(rRNA)的平均CT标准化阈循环(CT)值。将标准化mRNA水平定义为ΔCT=CT(测试基因)-CT(参考基因的平均值)。最终数据表示为测标本品与对照样品之间的倍数差异,其被定义为2(ΔCT测试-ΔCT对照)。所有反应以一式三份执行,并且实验至少重复两次。结果表示为至少两次实验的平均值。
TMA和患者群体:使用TMA上的16个癌症组评定癌症患者中的SSRP1蛋白表达。所述TMA含有一个组织核心,所述核心得自在Roswell Park Cancer Institute.Buffalo,NY于1994和2002之间诊断的非选择的***固定的且石蜡包埋的标本。患者年龄范围为25至82岁,中值年龄为56岁。有经验的外壳病理学家(C.M.)在构造TMA之前评价所有标本的H&E-染色的载玻片以便鉴定代表性肿瘤区域。在组织学上,根据Elston和Ellis,Histopathology,1991,19:403-10对所有肿瘤评级,所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。由PathologyResource Network或RPCI提供的临床随访数据在数月的中值随访期(0-148个月不等)可供用于所有癌症患者。此研究中所包括的所有患者均给出关于出于研究目的进一步分析他们的病情并公布数据的知情同意书。RPCI的教学审查委员会批准该方案。
表1A.用于此研究中使用的TMA的患者组的描述
如本领域所知的进行免疫组织化学染色。
计算机模拟在线转录组学—整合基因表达参考数据库是这样的数据库软件:它含有各种健康和病理人组织的统一mRNA表达数据,具有多个用于分析和可视化所述数据的工具。当可用时手动注释的临床变量也被包括在内,并且所述组织已被***地分类为特定开发的癌症和解剖组。所述数据库目前含有来自251个不同研究的20,064个样品,其中15,392个是癌症样品,包括1,227个癌细胞系样品。已从公共可获得的表达数据库收集数据,所述数据库的在Affymetrix阵列上测得的表达数据已包括在内。来自Affymetrix微阵列代的不同类型的CEL文件的数据已经在特定开发的三步过程中一起标准化,以便产生跨越不同研究和阵列代的大的整合数据收集。这允许将不同来源的样品直接与彼此进行比较,并且在荟萃分析中一起利用它们,从而提供在单独数据集中难以实现的新的发现可能性。
利用嵌入容易使用的图形用户界面的R统计编程语言(RDevelopment Core Team)执行分析和可视化工具。在此研究中,使用用于遍及人转录组的整体数据可视化的点形图和框形图工具。通过针对组织定义绘制标准化SSRP1或SPT16表达值作为不同数据点来描绘点形图,其中基于组织类型点被分成五个区段:健康组织、恶性组织、其它疾病、来自健康组织的细胞系和癌细胞系;在这些区段内,应用样品解剖类别。还计算描述性统计以区分在其代表性区段内不同于其它样品的那些样品,以使得组织类型被挑出并且在点上上色,条件是其表达水平一标准偏差高于相同区段中所有组织的平均表达,或者组织中的第90百分位表达等于或高于相同区段的四分位距加上第75百分位的2倍。描绘每个基因的框形图作为标准框-须线图,其可视化健康和癌症组织中的基因表达,其中组织分类显示在X轴上。包括具有至少五个样品的所有组织。框底部是数据的第25百分位,框顶部是第75百分位,并且水平线是中值。须线延伸至距框边缘四分位距的1.5倍,并且在此范围之外的任何数据点都被视为超偏值。
为了分析临床病理学变量与基因表达之间的关联,使用IST Online的Phenoplot工具绘制所选择的体内癌症样品针对临床属性的表达值。Phenoplot利用来自不同癌症类型的癌症样品的预定义子集,其中已经基于代表性癌症类型中的相关临床变量的有效性选择样品。Phenoplot是框形图和点形图的组合,所以点指示单个样品并且框-须线可视化指示更高水平的数据值分布。具有特定临床协变量值的每个样品组示出为Phenoplot的X轴上的单独区段。如果任何两个框的凹口不竖直重叠,则这指示两个样品组的中值在所讨论的基因表达方面彼此显著不同(p值<0.05)。
TMA分析:对分SSRP1数据。执行Fisher精确检验以测试所述对分的SSRP1表达指数与其它对分的类别变量之间的关联,所述类别变量如年龄(≥60,<60)、或肿瘤等级(高,低)、时期(早期晚期)和疾病特异性标志物的表达(当可用时)。执行卡方检验以测试与多于两种水平的类别变量的关联。采用利用时序检验的Kaplan-Meier存活分析来评定患者存活期与SSRP1表达指数之间的相关性。具有p值<0.05的任何检验被认为是显著的。使用R统计编程语言执行所有统计分析。
实施例1:在体外转化时FACT表达升高
确定在体外以及不同类型的人肿瘤组织中转化不同正常细胞期间的FACT亚基的表达模式。
通过比较不同体外转化时期的原型正常细胞之间的SSRP1和SPT16水平,研究体外转化过程期间的FACT诱导。确切地,研究有限寿命的细胞、永生的细胞和转化的细胞。
在正常人成纤维细胞或以人端粒酶永生化的成纤维细胞,或来自p53野生型或敲除动物的小鼠原发性成纤维细胞之间几乎未观察到FACT水平变化(图1A)。然而,当用激活H-RAS V12癌基因转化永生化成纤维细胞时,在人和小鼠细胞中都观察到FACT水平明显增加(图1B和图1C)。所有这些成纤维细胞(早期传代菌株、永生化的或恶性转化的)在增殖速率方面未显著不同,并且因此FACT水平的增加并不反映加速的细胞增殖。
许多人肿瘤是上皮来源的。因此还进行体外上皮细胞转化。利用如本领域已知的乳腺上皮细胞转化的同基因模型。分析来自两个***复位成形术标本的有限寿命菌株(184和240L)、以及在正常细胞暴露于化学致癌原苯并(a)芘后获得的永生化系(184B5、184AA3)或暴露于一组已知可克服肿瘤抑制屏障的基因构建体(shRNA至CDKN2A(p16)和/或原癌基因c-Myc)后获得的永生化系(184p16sMY、184FMY2、240Lp16sMY)。表征永生化系锚定非依赖生长(AIG)和在免疫妥协的小鼠中体内形成肿瘤的能力。184B5、184p16sMY和240Lp16sMY未显示AIG。184FMY2和184AA3均表现出AIG,但仅184AA3是致瘤的。正常HMEC几乎未显示核SSRP1相关染色,而在拥有AIG、184AA3和184FMY2的系中见到最高水平的SSRP1相关免疫荧光(图2A、2B和2C)。缺乏AIG的永生化系具有不同密度的弱免疫荧光染色(图2A),但通过蛋白印迹法相比正常细胞显示出显著增加的SPT16和SSRP1水平(图2B)。在转化的HMEC细胞中仅SSRP1mRNA升高,在某种程度上与其蛋白水平成比例,相比SPT16蛋白SPT16mRNA几乎未改变(图2C)。不希望受理论束缚,这可能是由于SPT16蛋白水平对SSRP1的依赖性。基于PCNA染色,在这些培养物之间增殖并不显著不同(图2B)。
这些实验尤其表明,人上皮细胞的体外转化伴随FACT亚基的蛋白水平升高,并且所述增加可与转化的细胞获得恶性特性同时发生。
实施例2:FACT亚基在多个不同类型的肿瘤样品中在RNA和蛋白水平上过表达
比较正常组织和不同肿瘤中的SSRP1和SPT16的mRNA水平。在这些研究中检查几乎所有肿瘤类型的高含量微阵列数据。使用ICT在线软件(Medisapience,Inc)应用经技术和经研究标准化。
此分析显示,相比健康正常组织或得自其它疾病的组织,在大多数肿瘤类型中总体上SSRP1 mRNA升高(图3A-3B)。然而,存在具有近乎正常水平的SSRP1 mRNA的样品和具有多倍SSRP1增加的样品(图3A)。此分析还包括得自体外细胞系的数据,所述体外细胞系拥有所有类别中最高的SSRP1平均水平(图3A)。不希望受理论束缚,这可表明,例如体外条件促进SSRP1水平急剧升高,或者仅具有升高的SSRP1的细胞可以在体外培养中生长。
相比非肿瘤样品,肿瘤中SPT16mRNA表达的中值水平也升高,但是没有SSRP1显著。SSRP1与SPT16mRNA数据之间的这种差异与在分析一组HMEC细胞时观察到的趋势一致(图2A-2C)。类似于SSRP1,在肿瘤样品中存在具有非常高水平的SPT16mRNA的大量超偏值。
由原发性肿瘤活检组织和(当可用时)匹配正常或转移性病灶的样品组成的组织微阵列(TMA)的IHC染色用于评价人肿瘤样品中FACT的蛋白水平。采用若干由来自乳腺、肺、肾、***和胃肠道的若干器官的约854个单独样品组成的TMA组。各组由不同肿瘤类型表示,所述肿瘤类型与它们在一般美国人口中的发生率成比例。SSRP1的IHC染色用作肿瘤中总FACT水平的指示,因为前者显示出不同组织中SSRP1和SPT16蛋白亚基表达之间的高度相关性。这种相关性可能起源于(不希望受理论束缚)SPT16蛋白水平对SSRP1量的依赖性。
这些细胞的正常细胞,肠隐窝底部的上皮细胞除外,不表达SSRP1蛋白(图3A)。因此,这些器官的肿瘤中的阳性SSRP1染色表明相比正常组织FACT水平升高。
观察大多数肿瘤类型中不同程度的SSRP1过表达(图4A、4B、4C、4D、4E)。非恶性基质细胞对于SSRP1通常是阴性的(图4A-4D)。
考虑到所述分析中不同样品之间SSRP1染色的可变性,使用反映染色强度和阳性肿瘤细胞比例、使用0至3标度的评分***。累积SSRP1指数是分类强度和比例评分的产物。具有>1指数的“阳性SSRP1”样品包括所有阳性样品,其中阳性细胞数小于10%或染色非常弱的那些样品除外(图4D)。具有>4指数的“高SSRP1”是其中大多数肿瘤细胞是高度SSRP1阳性的样品(图4A、图3B、图3D)。在胰腺肿瘤中观察到最高的SSRP1阳性样品发生率(图4C和图4E)。在***患者中存在非常少的阳性SSRP1样品(图4E)。与在体外人肿瘤细胞系上获得的数据相反,但与RNA表达数据一致,在所有肿瘤类型中存在一定比例的不具有SSRP1染色的肿瘤样品(图4E)。
实施例3:FACT亚基水平与肿瘤临床病理特征的相关性
检查FACT亚基表达与不同类型肿瘤的临床病理特征之间的相关性。
比较若干器官(乳腺、肺和肾)中不同组织学类型的癌症之间的SSRP1表达,其中样品由不同亚型表示。
在乳腺癌患者中,相对管腔型癌,基底型癌中SSRP1mRNA的水平更高(图5A)。相对激素受体阳性乳腺癌,在三阴性癌中SSRP1蛋白过表达更加频繁(表1B和图5B)。另外高的SSRP1水平与管腔型乳腺癌的ER阴性和Her2阳性状态相关(表1B和图5B)。
在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中,相对其它类型的肺癌,在未分化大细胞癌中观察到最高水平的SSRP1mRNA(表1B)。对于SSRP1蛋白观察到相同趋势。在肾细胞癌(RCC)患者中,相比其它SSRP1在***状和肉瘤样癌样品中更频繁地过表达(表1B)。
具有更高SSRP1阳性样品发生率的所有亚型,***状RCC除外,相比相应SSRP1阴性亚型具有更差的预后(例如在乳腺癌中,基底型相对管腔型、三阴性相对激素受体阳性、ER阴性相对阳性以及Her2阳性相对阴性)。
因此,SSRP1阳性样品在更具侵袭性的癌症亚型中过表示。
这通过使用TMA染色数据的SSRP1表达和总存活期之间的相关性分析得到确认。比较使用以下不同SSRP1评分截止的数据:(i)高SSRP1水平样品(指数>4)相对低和阴性样品(指数≤4);(ii)阳性SSRP1(指数>1)和弱/阴性(指数≤1);以及(iii)完全阴性样品(指数=0,无任何SSRP1阳性细胞)相对全部阳性样品(指数>0,任何比例的SSRP1阳性细胞,包括非常弱或小于10%)。
对于所有肿瘤类型,如果比较阳性和阴性SSRP1样品获得存活期和SSRP1水平的最佳相关性,如基于比较正常和肿瘤组织中的SSRP1表达所预期的。对于所有854IHC样品,SSRP1阳性与较差总存活期显著相关(图6A)。当单独分析乳腺癌时,情况也是如此(图6D)。
在蛋白质或mRNA水平上分析的任何肿瘤类型中都未发现肿瘤时期与SSRP1表达的相关性,这表明,不希望受理论束缚,FACT亚基的表达不随肿瘤生长或疾病进展而改变(表1B)。然而,在若干癌症类型中,发现肿瘤等级与FACT亚基水平的相关性(表1B)。在乳腺癌、结肠癌和***状肾细胞癌中,在高等级的分化不良的肿瘤中存在显著较高水平的SSRP1mRNA和蛋白质(表1B、图5C、图5D)。在肺癌患者和肺腺癌2期患者中观察到相同趋势,即SSRP1mRNA和蛋白质随肿瘤等级增加(表1B)。
还显示患有乳腺癌和肾细胞癌的患者(其原发性肿瘤是SSRP1阳性的)相比患有SSRP1阴性原发性肿瘤的患者具有更高的转移性疾病发生率(图5D)。在发生肺癌和***癌转移的患者中,相比在未发生转移的患者中,SSRP1mRNA也是更高的。在通过IHC分析的所有癌症中,在原发性病灶与转移性病灶之间存在高SSRP1状态重合(>87%)。因此,患有乳癌、RCC、肺癌或***癌的患者的原发性肿瘤中SSRP1的存在指示转移性疾病。
对临床样品中SSRP1表达的分析表明,SSRP1以更高发生率和水平在低分化(更高等级)和更具侵袭性的肿瘤,如(i)预后不良的实体瘤亚型(乳腺癌和肺癌);(ii)来自总存活期较差的患者的肿瘤;(iii)患有转移性疾病(乳腺癌、肺癌、肾癌和***癌)的患者中表达。
对于SPT16,在不同样品中存在与SSRP1表达的高相关性。不希望受理论束缚,SSRP1和SPT16以一个的蛋白水平依赖于另一个的蛋白水平这样一种方式共同调节。例如,存在SPT16蛋白水平对SSRP1mRNA的强烈依赖。如果肿瘤细胞开始表达更高水平的SSRP1,SPT16水平也升高。
虽然在相同肿瘤(在其中我们基于蛋白印迹和IHC观察到SSRP1升高)中SPT16蛋白水平升高,原则上抗-SPT16抗体比SSRP1质量差得多,因此我们不使用它们用于TMA染色。
实施例4:肿瘤细胞存活和生长依赖于FACT表达
已检查FACT是否是肿瘤细胞所需要的,或者是否其表达是一些其它治疗特异性过程的标志物。之前观察到以shRNA至FACT亚基转导若干肿瘤细胞系导致相比对照shRNA细胞生长减少。在此细胞系清单被扩展并与shRNA至FACT对肿瘤和一些原型“正常”细胞的影响比较。重要的是要知晓后者以便评定靶向FACT值用于癌症治疗。本发明人已显示两种FACT亚基的水平同时得到调节,并且因此使用针对FACT亚基之一的shRNA有效消除两者。使用若干对来自相同组织来源的肿瘤细胞和非转化的原型“正常”细胞,包括肾细胞癌细胞(RCC45)和以人端粒酶的酶亚基永生化的正常肾上皮细胞(NKE);人纤维肉瘤细胞(HT1080)和人二倍体成纤维细胞(Wi38);以及人乳腺癌细胞(MCF7)和永生化乳腺上皮细胞(MCF10A)。相比体内正常细胞,所有使用的转化和非转化细胞体外表达一定水平的两种FACT亚基(比较图4A-4E和图7A-7H)。
使用集落形成测定(对于上皮细胞)评定作为对照的以shRNA至FACT亚基或GFP转导的这些细胞的生长,或评定总细胞数(对于成纤维细胞样细胞,其不形成集落)。抑制两种FACT亚基表达使得所有细胞生长减少,但正常成纤维细胞除外,其生长不受所使用的任何shRNA影响(图7A-7C)。相比其它非转化细胞情况,在肿瘤细胞情况中生长减少或集落形成显著更强(图7A-7C)。对从shRNA转导和嘌呤霉素选择幸存的细胞中FACT亚基水平的分析表明,在三分之二的细胞对(肾细胞和成纤维细胞)中,SSRP1和SPT16KD在肿瘤细胞中非常弱,而在成对非转化细胞中减少非常显著(图7D和7E)。不希望受理论束缚,此数据表明只有具有无效FACT KD的细胞可从肿瘤细胞扩增,而非肿瘤细胞可在抑制FACT时生长。
这通过测量在使用一对具有最大SSRP1和SPT16KD的细胞进行shRNA转导后在肿瘤细胞MCF7/MCF10A中不同时间点处FACT亚基水平和细胞生长来测试。观察到,尽管在嘌呤霉素选择结束时在FACTKD情况下相比对照shGFP细胞存在较少MCF10A和MCF7细胞,在重铺后,抗嘌呤霉素的MCF10A独立于FACT亚基水平生长,而在MCF7情况下,具有降低FACT亚基水平的细胞和对照shGFP细胞生长中的差异持续观察的多达8天。仅具有恢复FACT水平的MCF7细胞开始类似于shGFP细胞生长。此外,虽然MCF10A细胞在观察时间段维持FACT亚基水平中的差异,但在MCF7细胞中此差异随传代减少。因此,这说明具有降低FACT水平的非肿瘤细胞类似于对照细胞生长,但肿瘤细胞不这样。换句话说,此实验说明肿瘤细胞(MCF7)不能在FACT KD时繁殖。这些细胞不生长或者仅其中KD无效的那些细胞开始生长,并且FACT水平快速恢复。相反,非肿瘤细胞(MCF10A)可在减少的FACT水平下繁殖,并且这些细胞可以生长,同时FACT水平仍旧是低的。
不希望受理论束缚,探寻肿瘤细胞为什么受FACT KD影响的潜在解释。在shSSRP1培养物中具有低SSRP1水平的细胞的比例随时间减少(图7G)。在G1中具有低FACT水平的肿瘤细胞具有减少的复制(图7H)和积累(图7G);此外,它们中的一些死亡(图7G和7I)。此数据支持FACT在复制中的作用。然而,缺乏S期阻滞(在细胞缺乏仅在复制期间需要的因子时所预期的)表明,某些信号传导可能在细胞中存在,导致G1生长阻滞,和/或FACT在不同于复制的过程(即,转录)中的功能可能对于肿瘤细胞也是至关重要的。
实施例5:FACT作为癌干细胞的标志物
FACT亚基的检测显示在癌干细胞的鉴定中有用。发现两种FACT亚基Spt16和SSRP1均在体外转化的人乳腺上皮细胞(HMEC)中以较高水平表达,所述人乳腺上皮细胞表达表面癌干细胞标志物(CD44高/CD24低)。以指定基因构建体转化的HMEC提取物的蛋白印迹示出于图8A中。使用流式细胞术基于结合表面CD44和CD24的抗体的检测分选转导所有构建体后转化的细胞的变体。在具有最高胰腺癌干细胞表面标志物表达水平的细胞中观察到FACT的SSRP1亚基的最高水平。图8B示出以针对存在于胰腺CSC上的表面标志物(CD44+/CD24+/CD326+)和FACT的SSRP1亚基的抗体共染色的胰腺导管腺癌细胞PANC1和MIA PaCa的流式细胞术分析。
等效方案
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和出版物特此以引用的方式整体并入。
Claims (38)
1.一种用于评价肿瘤的方法,其包括测定人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中表达促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的恶性细胞的相对水平。
2.如权利要求1所述的方法,其还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将所述受试者分类为高风险组或低风险组。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述评价包括诊断、预后以及对治疗的应答中的任一种。
4.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述肿瘤为原发性肿瘤或再发性肿瘤。
5.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中FACT的所述成分包括SSRP1和SPT16中的一种或多种。
6.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述测量包括评价蛋白质的存在、缺乏或水平。
7.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述测量包括使所述肿瘤标本或由其培养的细胞与特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂接触。
8.如权利要求7所述的方法,其中特异性地结合SSRP1或SPT16蛋白的所述药剂是抗体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其中SSRP1和SPT16蛋白水平中的一种或多种的测量包括以下中的一种或多种:免疫组织化学染色、蛋白印迹、细胞内蛋白印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)。
10.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述肿瘤标本为选自以下的活检组织:冷冻肿瘤组织标本、培养的细胞、循环肿瘤细胞、以及***固定石蜡包埋的肿瘤组织标本。
11.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述肿瘤为乳腺、***、胰腺、肺、肝、肾、膀胱、结肠直肠、卵巢、宫颈、头颈、皮肤、中枢和外周神经***肿瘤中的任一种。
12.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述高风险或低风险分类为对新辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对新辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
13.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述高风险或低风险分类为对辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
14.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述高风险分类包括高水平的癌症侵袭性,其中所述侵袭性可通过高肿瘤等级、低的总存活期、高的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的存在中的一种或多种来表征。
15.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述低风险分类包括低水平的癌症侵袭性,其中所述侵袭性可通过低肿瘤等级、高的总存活期、低的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的缺乏和/或减少中的一种或多种来表征。
16.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述低风险分类指示新辅助疗法的停止。
17.如权利要求2-11中任一项所述的方法,其中所述低风险分类指示辅助疗法的停止。
18.一种用于评价肿瘤细胞的方法,其包括测量人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平,以及基于FACT的至少一种成分的存在,将所述肿瘤细胞分类为包含癌干细胞。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述评价包括诊断、预后以及对治疗的应答中的任一种。
20.如权利要求18或19所述的方法,其中将所述肿瘤细胞分类为包含癌干细胞指导增加的监测和辅助或新辅助疗法中的一种或多种。
21.一种用于治疗癌症的方法,其包括向人受试者施用有效量的抗癌剂,其中所述癌症通过人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平来表征。
22.一种用于治疗癌症的方法,其包括:
(a)测量人受试者肿瘤标本或由其培养的细胞中促染色质转录复合物(FACT)的至少一种成分的存在、缺乏或水平;
(b)基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将所述受试者分类为高风险组或低风险组;以及
(c)向人受试者施用有效量的疗法。
23.如权利要求22所述的方法,其还包括以下步骤:基于FACT的至少一种成分的存在、缺乏或水平,将所述受试者分类为高风险组或低风险组。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其中所述评价包括诊断、预后以及对治疗的应答中的任一种。
25.如权利要求21-24中任一项所述的方法,其中所述肿瘤为原发性肿瘤或再发性肿瘤。
26.如权利要求21-25中任一项所述的方法,其中FACT的所述成分包括SSRP1和SPT16中的一种或多种。
27.如权利要求21-26中任一项所述的方法,其中所述测量包括评价蛋白质的存在、缺乏或水平。
28.如权利要求21-27中任一项所述的方法,其中所述测量包括使所述肿瘤标本或由其培养的细胞与特异性地结合SSRP1和SPT16蛋白之一的药剂接触。
29.如权利要求28所述的方法,其中特异性地结合SSRP1或SPT16蛋白的所述药剂是抗体。
30.如权利要求21-29中任一项所述的方法,其中SSRP1和SPT16蛋白水平中的一种或多种的测量包括以下中的一种或多种:免疫组织化学染色、蛋白印迹、细胞内蛋白印迹、免疫荧光染色、ELISA和荧光激活细胞分选(FACS)。
31.如权利要求21至30中任一项所述的方法,其中所述肿瘤标本为选自以下的活检组织:冷冻肿瘤组织标本、培养的细胞、循环肿瘤细胞、以及***固定石蜡包埋的肿瘤组织标本。
32.如权利要求21至30中任一项所述的方法,其中所述肿瘤为乳腺、***、胰腺、肺、肝、肾、膀胱、结肠直肠、卵巢、宫颈、头颈、皮肤、中枢和外周神经***肿瘤中的任一种。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述高风险或低风险分类为对新辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对新辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
34.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述高风险或低风险分类为对辅助化疗具有阳性应答和/或从中受益或者对辅助化疗无应答和/或不从中受益的预示。
35.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述高风险分类包括高水平的癌症侵袭性,其中所述侵袭性可通过高肿瘤等级、低的总存活期、高的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的存在中的一种或多种来表征。
36.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述低风险分类包括低水平的癌症侵袭性,其中所述侵袭性可通过低肿瘤等级、高的总存活期、低的转移可能性和指示侵袭性的肿瘤标志物的缺乏和/或减少中的一种或多种来表征。
37.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述低风险分类指示新辅助疗法的停止。
38.如权利要求23-32中任一项所述的方法,其中所述低风险分类指示辅助疗法的停止。
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