CN104971084A

CN104971084A - 一种绞股蓝皂苷纯化方法

Info

Publication number: CN104971084A
Application number: CN201510433837.XA
Authority: CN
Inventors: 程轶群; 许飞跃
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明属于食品加工技术领域，提供一种绞股蓝皂苷纯化方法，特别涉及歙县绞股蓝皂苷的纯化方法。该纯化方法包括如下步骤：(1)湿法装柱(2)提取液进柱(3)静置吸附2h-2.5h(4)水洗杂质(5)乙醇解吸。本发明通过大量创造性劳动，发现以型号HP-20、AB-8大孔树脂进行吸附洗脱，比吸附率都超过4.5mg/g，同时比解吸量均为4.0mg/g以上，解吸附量达到90％以上；乙醇梯度洗脱时，70％乙醇皂苷解吸率为43.3％，纯度由原先提取液的32.6％提高到78.4％。本发明通过合理优化洗脱使用材料、洗脱方法获得了绞股蓝皂苷纯化方法简单高效，为进一步纯化研究绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷提供了参考。

Description

一种绞股蓝皂苷纯化方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种绞股蓝皂苷纯化方法，特别涉及歙县绞股蓝皂苷的纯化方法。

背景技术

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是多年生的绞股蓝属草本植物，又名“五叶参”“甘茶蔓”等，其最早在我国明清医书中就有对其药用价值的相关记载[1]。其中，绞股蓝皂苷是绞股蓝有效成分之一，其酸水解产物与人参皂苷的水解产物有同物异名性。因此，人参皂苷的检测分析方法可作为绞股蓝皂苷定量的参考。

首次发现绞股蓝含有人参皂苷类似成分是在1976年。至今，国内外通过检测确定绞股蓝皂苷至少有84种，其中绝大部分绞股蓝皂苷与人参皂苷有类似的结构与理化性质。由于绞股蓝皂苷具有降血脂、血糖、保护神经***、抗肿瘤、抗衰老、抗动脉硬化、保护血管等多种功能，目前投入了大量资金对其药用价值的研究。

由于绞股蓝皂苷具大的经济和药用价值，因此，高纯的的绞股蓝皂苷是绞股蓝皂苷品质的重要保障。现有技术一般以相似相溶原理提取皂苷类物质，并进行适当破壁以提高提纯效果。但经过粗提取后，还含有大量的杂质，严重影响绞股蓝产品的品质和后期理化参数的检测等深入研究。因此，分离提纯步骤对粗提取物的纯化来说是非常必要的。

发明内容

本发明目的是提供一种绞股蓝皂苷纯化方法，尤其针对安徽特有的歙县绞股蓝品种优化纯化步骤，为日后大规模生产和利用提供了理论依据和技术指导。

本发明目的通过以下方案实现

1、本发明提供一种绞股蓝皂苷纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：

(1)湿法装柱：运用湿法装柱，将大孔树脂填充到柱体；

(2)提取液进柱：采用蠕动泵以1-1.5BV的流速将提取液匀速吸入柱中；

(3)静置吸附2h-2.5h；

(4)水洗杂质：将已被吸附完全的绞股蓝提取液用二倍柱的蒸馏水以1-1.5BV的流速冲洗柱体，使绞股蓝残液完全排出；

(5)乙醇解吸：用二倍体积的一定浓度的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱，将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷洗脱下来；

其中，乙醇溶液浓度为体积分数50-70％，洗脱时间为3-3.5h。

2.上述1提供的纯化方法，其中，步骤(5)乙醇进行解吸附步骤为：先用3-3.5BV蒸馏水洗脱，然后以5-5.5BV体积分数为25-30％的乙醇溶液洗脱，再用5-5.5BV体积分数为65-70％乙醇溶液洗脱。

3.上述1提供的纯化方法，其中，步骤(1)的大孔树脂在填充前先进行预处理，其方法为：用无水乙醇溶胀24h后，再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味。

4.上述1提供的纯化方法，其中，步骤(1)所用大孔树脂为型号HP-20、D101、AB-8的大孔树脂。

5.上述1提供的纯化方法，其中，步骤(1)所用大孔树脂为型号AB-8的大孔树脂。

6.上述1提供的纯化方法，其中，步骤(5)所用乙醇溶液浓度为体积分数70％。

7.上述1提供的纯化方法，其中，所述绞股蓝皂苷为歙县绞股蓝皂苷。

有益效果：

1.本发明通过大量创造性劳动，发现以型号HP-20、AB-8大孔树脂进行吸附洗脱，比吸附率都超过4.5mg/g，同时比解吸量均为4.0mg/g以上，解吸附量达到90％以上；采用湿法装柱可以使树脂之间堆叠紧密、堆层水平、柱效率高。总之，以此中大孔树脂进行吸附纯化，可以达到纯化速度高，效果良好，大大提高绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷的纯化效率。

2.本发明在使用型号为AB-8大孔树脂的前提下，经过大量创造性试验，在洗脱乙醇浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％条件下进行梯度洗脱，发现在50-70％条件下洗脱效果较佳，尤其是乙醇梯度洗脱时，70％乙醇皂苷解吸率为43.3％，纯度由原先提取液的32.6％提高到78.4％。同时，优化了在乙醇浓度为50-70％条件下进行乙醇洗脱的步骤，保证使洗脱液中皂苷纯度提高，极大地减少更深入纯化的费用，避免了洗脱直接由高浓度乙醇开始，造成大孔吸附树脂中产生难以去除的气泡，严重影响柱效率等问题。

综上所述，本发明通过合理优化洗脱使用材料、洗脱方法获得了绞股蓝皂苷纯化方法简单高效，为进一步纯化研究绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷提供了参考。

附图说明

图1人参皂苷Rb1的标准曲线

图2五种大孔树脂静态等温吸附曲线

图3大孔树脂静态解吸曲线

图4不同浓度的乙醇溶液对绞股蓝皂苷的洗脱曲线

图5高效液相绞股蓝皂苷分离色谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

实验材料及试剂

绞股蓝：购自安徽易元堂中药饮片科技有限公司；大孔吸附树脂DM130、AB-8、D101及人参皂苷Rb₁标准品：购自网络。

香草醛、冰醋酸、乙醇、高氯酸等试剂均为分析纯，甲酸、乙腈为液相级。

实验仪器设备

HPLC：Agilent 1100；722G可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司。

实施例1

树脂选择

1.1皂苷含量的测定

标准曲线的制备：准确称取20mg人参皂苷Rb₁标准品，纯甲醇定容于100mL容量瓶中，混合均匀，待用。精密吸取皂苷标准液200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL于10mL试管中，在70℃水浴挥干甲醇后，各加新配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，并混合均匀。再置于60℃恒温水浴锅中加热显色15min，后冰水冷却并各加5mL冰醋酸，相应试剂作空白，在550nm测吸光值。

以吸光度(x)对人参皂苷Rb₁含量(y)做回归处理，得标准曲线：y＝0.3439x+0.0034(R2＝0.9998)。由图1可见，标准曲线在该范围线性良好，可以作为定量的基准。

皂苷含量的测定：取适量提取样品上清液，按上述方法进行显色并测吸光度，带入标准曲线方程得皂苷得率：

其中：η为皂苷得率，％；C为皂苷含量，mg/mL；V为提取液总体积，mL；m为绞股蓝干粉质量，g。

1.2绞股蓝提取液的制备

将干燥的绞股蓝用万能粉碎机粉碎并过200目筛，然后精确称取50g绞股蓝粉于1000mL烧杯中，加8倍体积的70％乙醇，超声提取30min，连续提取3次，抽滤、减压回收至无醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解、抽滤、定容，此时绞股蓝提取液中的皂苷的含量为0.9～1.0mg/mL。

1.3大孔吸附树脂的确定

1.3.1树脂预处理

各取DM130、D101、AB-8、HP-20、HDP-100型号大孔树脂40g，用无水乙醇溶胀24h后，再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味，待用。

1.3.2静态吸附

用DM130、D101、AB-8、HP-20、HDP-100五种树脂对安徽歙县的绞股蓝总皂苷的静态吸附特性进行比较。每种树脂各精密称取3g已经预处理的大孔吸附树脂放入装有25mL绞股蓝提取液的烧杯中,提取液过量，在25℃恒温水浴中反应，每隔半小时从上清液取样一次，共取六次，达到平衡后，再将时间延长24h，，以5％香草醛-冰醋酸显色法对样品中绞股蓝的皂苷含量进行检测，所有样品均重复三次平行。测算平衡吸附量和平衡解吸量。五种大孔树脂的静态等温吸附率结果如图2所示，从图中可以看到，当时间延长时，树脂对绞股蓝皂苷溶液吸附都在逐渐增加，D101树脂刚开始的1h吸附比较强烈，但1.5h之后，逐渐被AB-8与DM130树脂吸附超越，这说明D101树脂吸附速度虽较快，但吸附率不如AB-8及DM130树脂。3h时，五种树脂吸附都基本趋于稳定，型号AB-8大孔吸附树脂吸附率最大。

1.3.3静态解吸附

将各烧杯已反应完全的树脂在小于0.06MPa抽滤后，再加入25mL60-80％乙醇在同样水浴温度环境下释放皂苷，每隔半小时取样一次，共取六次，达到平衡后，再将时间延长24h，，以5％香草醛-冰醋酸显色法对样品中绞股蓝的皂苷含量进行检测，所有样品均重复三次平行。

可参考如下公式计算绞股蓝皂苷：

S₀＝(C₀-C_r)×V/m；

S_p＝C_c×V/m；

D_s＝(C₀-C_r)/C₀×100％；

D_u＝C_c/(C₀-C_r)×100％.

其中，S₀为比吸附量；C₀为吸附前提取液浓度；C_r为吸附后提取液浓度；S_p为比解吸量；C_c为洗脱液定容后浓度；V为溶液体积；m为大孔吸附树脂质量；D_s为吸附率；D_u为解析率。最终的结果如图3所示，随着时间的增加，五种树脂都在逐步释放吸附的皂苷，解吸附率也就逐渐上升；1h之前，五种树脂解吸附差别不太明显；1h之后，AB-8与HP-20一直保持在较高解吸水平，最后是D101树脂；在3h之后吸光度都逐渐趋于平稳。

表1.不同大孔吸附树脂饱和吸附及平衡解吸附性能比较

综合考虑之前的静态等温吸附、饱和吸附、静态解吸及平衡解吸附四个实验结果，可见AB-8树脂吸附速率、解吸速度均较大，饱和吸附量和平衡解吸附率同样出色，适于歙县绞股蓝皂苷的分离纯化。

实施例2

树脂动态吸附解吸

2.1按照如下步骤进行股蓝皂苷的分离纯化

湿法装柱→提取液进柱→静置吸附→水洗杂质→乙醇解吸→树脂再生

其中，湿法装柱：运用湿法装柱，将已预处理的大孔树脂填充到柱体(65cm×2cm)。

提取液进柱：采用蠕动泵以1-1.5BV的流速将250mL提取液匀速吸入柱中；

静置吸附：刚刚进入的绞股蓝提取液并不能立刻被树脂完全吸附，需要静置一段时间，从而使大孔吸附树脂充分吸附绞股蓝皂苷，本发明经过试验确定时间2h-2.5h为宜；

水洗杂质：将已被吸收完全的绞股蓝提取液用二倍柱体积的蒸馏水，再以1-1.5BV流速冲洗柱体，使基本无绞股蓝皂苷的绞股蓝残液完全排出；

乙醇解吸：用二倍柱体积的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱，将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷进行梯度洗脱；其中，设定乙醇溶液的浓度25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％。

具体解吸过程如下：3BV去离子水，用于洗去无法吸附的杂质；5BV浓度30％乙醇，去除易溶于低浓度乙醇的杂质，例如黄酮。同时也可以很好地平衡柱子，防止填料周围因乙醇浓度大幅提高而产生气泡，影响柱效；设定不同浓度的乙醇，50％、60％、70％、80％、90％、100％，使用量均为5BV。

树脂再生：由于树脂已被使用过，难免会吸附的杂质没有随乙醇溶液去除，而且为了提高大孔吸附树脂的利用次数，树脂再生必不可少。4％HCl冲洗(2BV)→蒸馏水冲洗至中性→4％NaOH冲洗(2BV)→蒸馏水冲洗至中性。

2.2不同浓度乙醇溶液对皂苷洗脱效果比较

分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱滤液，以HPLC-ELSD检测测定洗脱液中皂苷，结果如图4所示。

由图中可以看出，使用纯水冲洗树脂几乎对绞股蓝皂苷没有洗脱作用。从乙醇浓度为30％开始，均有一定量的绞股蓝皂苷被逐步洗脱下来。其中洗脱能力较强的乙醇范围为50％～70％，在这一范围内绝大部分绞股蓝皂苷均被洗脱。尤其是70％乙醇，1BV的洗脱液即可将31.8％的皂苷洗脱下来，随后几个BV的洗脱液则逐步降低。5BV的洗脱液的总洗脱率达到43.3％。70％乙醇洗脱液真空干燥后，用香草醛冰醋酸法多次检测70％洗脱液中绞股蓝皂苷纯度由原先的32.6％提高到78.4％。

在试验中我们发现如果洗脱直接由高浓度乙醇开始，会造成大孔吸附树脂中产生难以去除的气泡，严重影响柱效率。因此，可选择在蒸馏水洗去部分水溶性非皂苷物后，先用少量20％乙醇溶液在去除一定量的杂质，同时也改变原本柱中的纯蒸馏水环境，再用70％乙醇溶液洗脱，会使洗脱液中皂苷纯度提高，极大地减少更深入纯化的费用。

2.3 HPLC-ELSD检测

使用C18反相色谱柱，梯度洗脱时间40min，流动相0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱条件：起始比例72％A与28％B，10min内变为30％B，12min变为34％B，保持2min后，到23min变为35％B，30min变为42％B，35min变为75％B，40min变为80％。41min变为起始比例。柱温30℃，流速1.0mL/min，ELSD检测器气体压力2.5bar，漂移管温度70℃，对绞股蓝皂苷样品液进行分析。

如图5所示，针对绞股蓝中含有的几个常见皂苷单体，发现保留时间22min的为Rb₃，保留时间25min的为Rd，保留时间31min的为Rf，与未经树脂纯化的相比纯度提高。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种绞股蓝皂苷纯化方法，其特征在于，该纯化方法包括如下步骤：

(1)湿法装柱：运用湿法装柱，将大孔树脂填充到柱体；

(3)静置吸附2h-2.5h；

(4)水洗杂质：将已被吸附完全的绞股蓝提取液用二倍柱体积的蒸馏水以1-1.5BV的流速冲洗柱体，使绞股蓝残液完全排出；

(5)乙醇解吸：用二倍柱体积的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱，将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷洗脱下来；

其中，乙醇溶液浓度为体积分数50-70％，洗脱时间为3-3.5h。

2.权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(5)乙醇进行解吸附步骤为：先用3-3.5BV蒸馏水洗脱，然后以5-5.5BV体积分数为25-30％的乙醇溶液洗脱，再用5-5.5BV体积分数为65-70％乙醇溶液洗脱。

3.权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)的大孔树脂在填充前先进行预处理，其方法为：用无水乙醇溶胀24h后，再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味。

4.权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(1)所用大孔树脂为型号HP-20、D101、AB-8的大孔树脂。

5.权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(1)所用大孔树脂为型号AB-8的大孔树脂。

6.权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(5)所用乙醇溶液浓度为体积分数70％。

7.权利要求1所述的纯化方法，其中，所述绞股蓝皂苷为歙县绞股蓝皂苷。