CN104971084A - 一种绞股蓝皂苷纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品加工技术领域,提供一种绞股蓝皂苷纯化方法,特别涉及歙县绞股蓝皂苷的纯化方法。该纯化方法包括如下步骤:(1)湿法装柱(2)提取液进柱(3)静置吸附2h-2.5h(4)水洗杂质(5)乙醇解吸。本发明通过大量创造性劳动,发现以型号HP-20、AB-8大孔树脂进行吸附洗脱,比吸附率都超过4.5mg/g,同时比解吸量均为4.0mg/g以上,解吸附量达到90%以上;乙醇梯度洗脱时,70%乙醇皂苷解吸率为43.3%,纯度由原先提取液的32.6%提高到78.4%。本发明通过合理优化洗脱使用材料、洗脱方法获得了绞股蓝皂苷纯化方法简单高效,为进一步纯化研究绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷提供了参考。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域,涉及一种绞股蓝皂苷纯化方法,特别涉及歙县绞股蓝皂苷的纯化方法。
背景技术
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是多年生的绞股蓝属草本植物,又名“五叶参”“甘茶蔓”等,其最早在我国明清医书中就有对其药用价值的相关记载[1]。其中,绞股蓝皂苷是绞股蓝有效成分之一,其酸水解产物与人参皂苷的水解产物有同物异名性。因此,人参皂苷的检测分析方法可作为绞股蓝皂苷定量的参考。
首次发现绞股蓝含有人参皂苷类似成分是在1976年。至今,国内外通过检测确定绞股蓝皂苷至少有84种,其中绝大部分绞股蓝皂苷与人参皂苷有类似的结构与理化性质。由于绞股蓝皂苷具有降血脂、血糖、保护神经***、抗肿瘤、抗衰老、抗动脉硬化、保护血管等多种功能,目前投入了大量资金对其药用价值的研究。
由于绞股蓝皂苷具大的经济和药用价值,因此,高纯的的绞股蓝皂苷是绞股蓝皂苷品质的重要保障。现有技术一般以相似相溶原理提取皂苷类物质,并进行适当破壁以提高提纯效果。但经过粗提取后,还含有大量的杂质,严重影响绞股蓝产品的品质和后期理化参数的检测等深入研究。因此,分离提纯步骤对粗提取物的纯化来说是非常必要的。
发明内容
本发明目的是提供一种绞股蓝皂苷纯化方法,尤其针对安徽特有的歙县绞股蓝品种优化纯化步骤,为日后大规模生产和利用提供了理论依据和技术指导。
本发明目的通过以下方案实现
1、本发明提供一种绞股蓝皂苷纯化方法,该纯化方法包括如下步骤:
(1)湿法装柱:运用湿法装柱,将大孔树脂填充到柱体;
(2)提取液进柱:采用蠕动泵以1-1.5BV的流速将提取液匀速吸入柱中;
(3)静置吸附2h-2.5h;
(4)水洗杂质:将已被吸附完全的绞股蓝提取液用二倍柱的蒸馏水以1-1.5BV的流速冲洗柱体,使绞股蓝残液完全排出;
(5)乙醇解吸:用二倍体积的一定浓度的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱,将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷洗脱下来;
其中,乙醇溶液浓度为体积分数50-70%,洗脱时间为3-3.5h。
2.上述1提供的纯化方法,其中,步骤(5)乙醇进行解吸附步骤为:先用3-3.5BV蒸馏水洗脱,然后以5-5.5BV体积分数为25-30%的乙醇溶液洗脱,再用5-5.5BV体积分数为65-70%乙醇溶液洗脱。
3.上述1提供的纯化方法,其中,步骤(1)的大孔树脂在填充前先进行预处理,其方法为:用无水乙醇溶胀24h后,再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味。
4.上述1提供的纯化方法,其中,步骤(1)所用大孔树脂为型号HP-20、D101、AB-8的大孔树脂。
5.上述1提供的纯化方法,其中,步骤(1)所用大孔树脂为型号AB-8的大孔树脂。
6.上述1提供的纯化方法,其中,步骤(5)所用乙醇溶液浓度为体积分数70%。
7.上述1提供的纯化方法,其中,所述绞股蓝皂苷为歙县绞股蓝皂苷。
有益效果:
1.本发明通过大量创造性劳动,发现以型号HP-20、AB-8大孔树脂进行吸附洗脱,比吸附率都超过4.5mg/g,同时比解吸量均为4.0mg/g以上,解吸附量达到90%以上;采用湿法装柱可以使树脂之间堆叠紧密、堆层水平、柱效率高。总之,以此中大孔树脂进行吸附纯化,可以达到纯化速度高,效果良好,大大提高绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷的纯化效率。
2.本发明在使用型号为AB-8大孔树脂的前提下,经过大量创造性试验,在洗脱乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%条件下进行梯度洗脱,发现在50-70%条件下洗脱效果较佳,尤其是乙醇梯度洗脱时,70%乙醇皂苷解吸率为43.3%,纯度由原先提取液的32.6%提高到78.4%。同时,优化了在乙醇浓度为50-70%条件下进行乙醇洗脱的步骤,保证使洗脱液中皂苷纯度提高,极大地减少更深入纯化的费用,避免了洗脱直接由高浓度乙醇开始,造成大孔吸附树脂中产生难以去除的气泡,严重影响柱效率等问题。
综上所述,本发明通过合理优化洗脱使用材料、洗脱方法获得了绞股蓝皂苷纯化方法简单高效,为进一步纯化研究绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷提供了参考。
附图说明
图1人参皂苷Rb1的标准曲线
图2五种大孔树脂静态等温吸附曲线
图3大孔树脂静态解吸曲线
图4不同浓度的乙醇溶液对绞股蓝皂苷的洗脱曲线
图5高效液相绞股蓝皂苷分离色谱图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照本领域的公知手段,或按照制造厂商的建议条件。
实验材料及试剂
绞股蓝:购自安徽易元堂中药饮片科技有限公司;大孔吸附树脂DM130、AB-8、D101及人参皂苷Rb1标准品:购自网络。
香草醛、冰醋酸、乙醇、高氯酸等试剂均为分析纯,甲酸、乙腈为液相级。
实验仪器设备
HPLC:Agilent 1100;722G可见分光光度计:上海仪电分析仪器有限公司;旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;电热恒温水浴锅:北京科伟永兴仪器有限公司。
实施例1
树脂选择
1.1皂苷含量的测定
标准曲线的制备:准确称取20mg人参皂苷Rb1标准品,纯甲醇定容于100mL容量瓶中,混合均匀,待用。精密吸取皂苷标准液200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL于10mL试管中,在70℃水浴挥干甲醇后,各加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL,并混合均匀。再置于60℃恒温水浴锅中加热显色15min,后冰水冷却并各加5mL冰醋酸,相应试剂作空白,在550nm测吸光值。
以吸光度(x)对人参皂苷Rb1含量(y)做回归处理,得标准曲线:y=0.3439x+0.0034(R2=0.9998)。由图1可见,标准曲线在该范围线性良好,可以作为定量的基准。
皂苷含量的测定:取适量提取样品上清液,按上述方法进行显色并测吸光度,带入标准曲线方程得皂苷得率:
其中:η为皂苷得率,%;C为皂苷含量,mg/mL;V为提取液总体积,mL;m为绞股蓝干粉质量,g。
1.2绞股蓝提取液的制备
将干燥的绞股蓝用万能粉碎机粉碎并过200目筛,然后精确称取50g绞股蓝粉于1000mL烧杯中,加8倍体积的70%乙醇,超声提取30min,连续提取3次,抽滤、减压回收至无醇味,将浓缩物加蒸馏水溶解、抽滤、定容,此时绞股蓝提取液中的皂苷的含量为0.9~1.0mg/mL。
1.3大孔吸附树脂的确定
1.3.1树脂预处理
各取DM130、D101、AB-8、HP-20、HDP-100型号大孔树脂40g,用无水乙醇溶胀24h后,再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味,待用。
1.3.2静态吸附
用DM130、D101、AB-8、HP-20、HDP-100五种树脂对安徽歙县的绞股蓝总皂苷的静态吸附特性进行比较。每种树脂各精密称取3g已经预处理的大孔吸附树脂放入装有25mL绞股蓝提取液的烧杯中,提取液过量,在25℃恒温水浴中反应,每隔半小时从上清液取样一次,共取六次,达到平衡后,再将时间延长24h,,以5%香草醛-冰醋酸显色法对样品中绞股蓝的皂苷含量进行检测,所有样品均重复三次平行。测算平衡吸附量和平衡解吸量。五种大孔树脂的静态等温吸附率结果如图2所示,从图中可以看到,当时间延长时,树脂对绞股蓝皂苷溶液吸附都在逐渐增加,D101树脂刚开始的1h吸附比较强烈,但1.5h之后,逐渐被AB-8与DM130树脂吸附超越,这说明D101树脂吸附速度虽较快,但吸附率不如AB-8及DM130树脂。3h时,五种树脂吸附都基本趋于稳定,型号AB-8大孔吸附树脂吸附率最大。
1.3.3静态解吸附
将各烧杯已反应完全的树脂在小于0.06MPa抽滤后,再加入25mL60-80%乙醇在同样水浴温度环境下释放皂苷,每隔半小时取样一次,共取六次,达到平衡后,再将时间延长24h,,以5%香草醛-冰醋酸显色法对样品中绞股蓝的皂苷含量进行检测,所有样品均重复三次平行。
可参考如下公式计算绞股蓝皂苷:
S0=(C0-Cr)×V/m;
Sp=Cc×V/m;
Ds=(C0-Cr)/C0×100%;
Du=Cc/(C0-Cr)×100%.
其中,S0为比吸附量;C0为吸附前提取液浓度;Cr为吸附后提取液浓度;Sp为比解吸量;Cc为洗脱液定容后浓度;V为溶液体积;m为大孔吸附树脂质量;Ds为吸附率;Du为解析率。最终的结果如图3所示,随着时间的增加,五种树脂都在逐步释放吸附的皂苷,解吸附率也就逐渐上升;1h之前,五种树脂解吸附差别不太明显;1h之后,AB-8与HP-20一直保持在较高解吸水平,最后是D101树脂;在3h之后吸光度都逐渐趋于平稳。
表1.不同大孔吸附树脂饱和吸附及平衡解吸附性能比较
综合考虑之前的静态等温吸附、饱和吸附、静态解吸及平衡解吸附四个实验结果,可见AB-8树脂吸附速率、解吸速度均较大,饱和吸附量和平衡解吸附率同样出色,适于歙县绞股蓝皂苷的分离纯化。
实施例2
树脂动态吸附解吸
2.1按照如下步骤进行股蓝皂苷的分离纯化
湿法装柱→提取液进柱→静置吸附→水洗杂质→乙醇解吸→树脂再生
其中,湿法装柱:运用湿法装柱,将已预处理的大孔树脂填充到柱体(65cm×2cm)。
提取液进柱:采用蠕动泵以1-1.5BV的流速将250mL提取液匀速吸入柱中;
静置吸附:刚刚进入的绞股蓝提取液并不能立刻被树脂完全吸附,需要静置一段时间,从而使大孔吸附树脂充分吸附绞股蓝皂苷,本发明经过试验确定时间2h-2.5h为宜;
水洗杂质:将已被吸收完全的绞股蓝提取液用二倍柱体积的蒸馏水,再以1-1.5BV流速冲洗柱体,使基本无绞股蓝皂苷的绞股蓝残液完全排出;
乙醇解吸:用二倍柱体积的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱,将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷进行梯度洗脱;其中,设定乙醇溶液的浓度25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%。
具体解吸过程如下:3BV去离子水,用于洗去无法吸附的杂质;5BV浓度30%乙醇,去除易溶于低浓度乙醇的杂质,例如黄酮。同时也可以很好地平衡柱子,防止填料周围因乙醇浓度大幅提高而产生气泡,影响柱效;设定不同浓度的乙醇,50%、60%、70%、80%、90%、100%,使用量均为5BV。
树脂再生:由于树脂已被使用过,难免会吸附的杂质没有随乙醇溶液去除,而且为了提高大孔吸附树脂的利用次数,树脂再生必不可少。4%HCl冲洗(2BV)→蒸馏水冲洗至中性→4%NaOH冲洗(2BV)→蒸馏水冲洗至中性。
2.2不同浓度乙醇溶液对皂苷洗脱效果比较
分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱滤液,以HPLC-ELSD检测测定洗脱液中皂苷,结果如图4所示。
由图中可以看出,使用纯水冲洗树脂几乎对绞股蓝皂苷没有洗脱作用。从乙醇浓度为30%开始,均有一定量的绞股蓝皂苷被逐步洗脱下来。其中洗脱能力较强的乙醇范围为50%~70%,在这一范围内绝大部分绞股蓝皂苷均被洗脱。尤其是70%乙醇,1BV的洗脱液即可将31.8%的皂苷洗脱下来,随后几个BV的洗脱液则逐步降低。5BV的洗脱液的总洗脱率达到43.3%。70%乙醇洗脱液真空干燥后,用香草醛冰醋酸法多次检测70%洗脱液中绞股蓝皂苷纯度由原先的32.6%提高到78.4%。
在试验中我们发现如果洗脱直接由高浓度乙醇开始,会造成大孔吸附树脂中产生难以去除的气泡,严重影响柱效率。因此,可选择在蒸馏水洗去部分水溶性非皂苷物后,先用少量20%乙醇溶液在去除一定量的杂质,同时也改变原本柱中的纯蒸馏水环境,再用70%乙醇溶液洗脱,会使洗脱液中皂苷纯度提高,极大地减少更深入纯化的费用。
2.3 HPLC-ELSD检测
使用C18反相色谱柱,梯度洗脱时间40min,流动相0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱条件:起始比例72%A与28%B,10min内变为30%B,12min变为34%B,保持2min后,到23min变为35%B,30min变为42%B,35min变为75%B,40min变为80%。41min变为起始比例。柱温30℃,流速1.0mL/min,ELSD检测器气体压力2.5bar,漂移管温度70℃,对绞股蓝皂苷样品液进行分析。
如图5所示,针对绞股蓝中含有的几个常见皂苷单体,发现保留时间22min的为Rb3,保留时间25min的为Rd,保留时间31min的为Rf,与未经树脂纯化的相比纯度提高。
可以知道,上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式,然而本发明不仅限于此,本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下,可以做出各种改进和变更,这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种绞股蓝皂苷纯化方法,其特征在于,该纯化方法包括如下步骤:
(1)湿法装柱:运用湿法装柱,将大孔树脂填充到柱体;
(2)提取液进柱:采用蠕动泵以1-1.5BV的流速将提取液匀速吸入柱中;
(3)静置吸附2h-2.5h;
(4)水洗杂质:将已被吸附完全的绞股蓝提取液用二倍柱体积的蒸馏水以1-1.5BV的流速冲洗柱体,使绞股蓝残液完全排出;
(5)乙醇解吸:用二倍柱体积的乙醇溶液以1-1.5BV速度过柱,将大孔吸附树脂上的绞股蓝皂苷洗脱下来;
其中,乙醇溶液浓度为体积分数50-70%,洗脱时间为3-3.5h。
2.权利要求1所述的纯化方法,其特征在于:步骤(5)乙醇进行解吸附步骤为:先用3-3.5BV蒸馏水洗脱,然后以5-5.5BV体积分数为25-30%的乙醇溶液洗脱,再用5-5.5BV体积分数为65-70%乙醇溶液洗脱。
3.权利要求1所述的纯化方法,其特征在于:步骤(1)的大孔树脂在填充前先进行预处理,其方法为:用无水乙醇溶胀24h后,再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味。
4.权利要求1所述的纯化方法,其中,步骤(1)所用大孔树脂为型号HP-20、D101、AB-8的大孔树脂。
5.权利要求1所述的纯化方法,其中,步骤(1)所用大孔树脂为型号AB-8的大孔树脂。
6.权利要求1所述的纯化方法,其中,步骤(5)所用乙醇溶液浓度为体积分数70%。
7.权利要求1所述的纯化方法,其中,所述绞股蓝皂苷为歙县绞股蓝皂苷。
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