CN104968794A - 使用细黄链霉菌菌株生产谷氏菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型的细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株及使用它们来控制植物疾病或害虫的方法。本发明还涉及通过培养产生谷氏菌素(gougerotin)的链霉菌菌株所获得的发酵肉汤，其中该发酵肉汤含有至少约1克/升谷氏菌素。本发明还涉及制造产生谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法，其中该发酵肉汤含有至少约1克/升谷氏菌素，该方法包含在有氧条件下，在含有可消化碳源及可消化氮源的培养基中培养所述链霉菌菌株，其中该培养基含有能有效达成至少1克/升谷氏菌素浓度的氨基酸浓度。本公开内容还涉及从细黄链霉菌进行谷氏菌素生物合成基因簇的分子克隆，及鉴定该基因簇的各基因和由其编码的蛋白质。包含13个开放阅读框(ORFs)的谷氏菌素基因簇定位于细黄链霉菌的基因座内。

Description

使用细黄链霉菌菌株生产谷氏菌素的方法

【技术领域】

本发明关于细菌菌株及它们用于控制植物疾病和害虫的能力的领域。

关于以电子方式提交的序列表

该序列表的正式复本是经由EFS网络以电子方式提交，其是在2013年10月10日以ASCII格式的序列表形式创建，文件名为“250-US_ST25.txt”，档案大小为175KB，且与专利说明书同时提交。包含在此ASCII格式的文档中的序列表为本专利说明书的一部分，其全部内容以引用方式被纳入本文。

【背景技术】

植食性螨类，尤其是蛛螨，为果园、温室及许多蔬菜和水果作物，包括辣椒、西红柿、马铃薯、南瓜、茄子、黄瓜和草莓的主要农业害虫。螨类使用其尖锐的口器损害叶和/或水果表面。除了直接损坏植物部分(称为绘斑(stippling))，螨虫以此为食还造成对植物疾病的易感性增加。

螨虫为蜱螨类(acari)，而非昆虫，一些广谱杀虫剂对螨类也有效。螨虫的特性及可用的杀螨剂的特性为控制螨虫带来挑战。例如，蛛螨(最具经济重要性的螨族之一)一般是生活在植物叶子下方，从而使其难以处理。此外，已知螨类在二至四年内会对目前可用的杀螨剂(其中多种具单一作用模式)发展出抗药性。可用的杀螨剂中对螨卵具有活性的很少，因而必须要重复施用。因此，需要有除了具有良好的击倒活性外还具有透层、杀卵及强大的残留活性的新杀螨剂。

【发明内容】

本发明提供细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株NRRLB-50550或由其衍生的杀植食性(phytophagous-miticidal)螨突变体(菌株)。在一个实施方案中，该杀植食性螨和/或杀真菌突变株为细黄链霉菌菌株M。本发明还提供紫红链霉菌(Streptomyces puniceus)菌株A或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变体(菌株)。

本发明还提供含有细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变体(菌株)的组合物。在一个方面中，该组合物为细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株的发酵产物。本发明还提供含有紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变体(菌株)的组合物。在一个方面中，该组合物为紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株的发酵产物。

本发明还提供藉由培养产谷氏菌素(gougerotin)的链霉菌菌株取得的发酵产物，其中该发酵产物含有至少约1克/升谷氏菌素。

本发明还提供含有至少约1克/升谷氏菌素的发酵肉汤。在一个实施方案中，该发酵肉汤未经过任何下游加工。在一个具体实施方案中，该发酵肉汤是来自链霉菌菌株。适合用于本发明的链霉菌菌株的类型详细描述于本文中。

本发明还提供产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵产物，其中该发酵产物包含至少约1克/升谷氏菌素。在一个实施方案中，该发酵产物为发酵肉汤。本发明还提供含有至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升谷氏菌素的发酵肉汤。在一个实施方案中，该发酵肉汤含有浓度为约1克/升至约15克/升的谷氏菌素。在一个实施方案中，该产谷氏菌素的链霉菌菌株为细黄链霉菌、灰色链霉菌(S.griseus)、环圈链霉菌(S.anulatus)、粪生链霉菌(S.fimicarius)、小链霉菌(S.parvus)、淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)、白绿链霉菌(S.alboviridis)、紫红链霉菌或禾粟链霉菌(S.graminearus)。在另一实施方案中，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。在一种情形下，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的所有氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。在另一种情形下，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的所有氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。在另一实施方案中，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的所有氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。在另一实施方案中，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。在一种情形下，该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的所有氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或至少约95％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。在又一个实施方案中，该产谷氏菌素的链霉菌菌株为细黄链霉菌菌株NRRLB-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株。在另一实施方案中，其为紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨突变株。在又一个实施方案中，其为细黄链霉菌菌株M。

本发明还提供制造产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法(其中该发酵肉汤含有至少约0.5克/升谷氏菌素)，该方法包含：在有氧条件下，将链霉菌菌株培养在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中，其中该培养基含有的氨基酸浓度能有效取得浓度为至少0.5克/升谷氏菌素。本发明还提供制造产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法(其中该发酵肉汤含有至少约1克/升谷氏菌素)，该方法包含：在有氧条件下，将链霉菌菌株培养在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中，其中该培养基含有的氨基酸浓度能有效取得浓度为至少1克/升谷氏菌素。本发明还提供处理植物以控制植物疾病或害虫的方法，其中该方法包含将细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株施用在植物、植物的一部分和/或植物的位点。在一个实施方案中，该菌株的发酵产物或由其衍生的突变体的发酵产物被施用在植物和/或植物的位点。

本发明还提供处理植物以控制植物疾病或害虫的方法，其中该方法包含将细黄链霉菌菌株，包括细黄链霉菌菌株NRRL-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株施用在植物、植物的一部分和/或植物的位点。在一个实施方案中，将该菌株的发酵产物或由其衍生的突变体的发酵产物施用在植物和/或植物的位点。

本发明还提供控制植食性蜱螨或昆虫的方法，其包含将细黄链霉菌菌株，包括细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨菌株施用在植物或植物周围的土壤。在一个实施方案中，将该菌株的发酵产物或由其衍生的突变体的发酵产物施用在植物和/或植物的位点。

本发明还提供制造产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法，其中该发酵肉汤含有至少约1克/升谷氏菌素，该方法包含在有氧条件下，将链霉菌菌株培养在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中，其中该培养基含有的氨基酸浓度能有效取得浓度为至少1克/升谷氏菌素。在一个实施方案中，将链霉菌菌株培养在培养基中，直到培养基中含有的谷氏菌素浓度为至少约2克/升谷氏菌素、至少约3克/升谷氏菌素、至少约4克/升谷氏菌素、至少约5克/升谷氏菌素、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升谷氏菌素。在另一实施方案中，将链霉菌菌株培养在培养基中，直到培养基中含有的谷氏菌素浓度为约1克/升至约15克/升谷氏菌素。

在该制造发酵肉汤的方法的一种实施方案中，该氨基酸是选自下列组：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸及它们的混合物。在一种情况中，该培养基中所含有的氨基酸的初始浓度为至少约2克/升。在一个特定的情况中，该培养基中所含有的甘氨酸的初始浓度和/或谷氨酸的初始浓度为至少约5克/升至约15克/升。

在一个实施方案中，如上述的培养基中含有葡萄糖和寡糖的混合物作为碳源。在一种情况中，该寡糖为麦芽糖糊精或糊精。在一个特殊情况中，该培养基中的初始麦芽糖糊精的浓度为约50克/升至约100克/升。在另一种情况中，该初始麦芽糖糊精浓度为约60克/升至约80克/升。

在一个实施方案中，该培养基中的初始葡萄糖的浓度为约20克/升至60克/升或约30克/升至约50克/升。

在一个实施方案中，该培养基中所含有的碳酸钙的初始浓度为约1克/升至3克/升。

在一个实施方案中，该氮源是至少部分选自下列群组：大豆蛋白胨、大豆酸水解产物、大豆粉水解产物、酪蛋白水解产物、酵母提取物，及它们的混合物。

上述的任何产谷氏菌素的链霉菌菌株均可用于实行此方法。

本发明还提供增强产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤中的谷氏菌素水平的方法，其包含在有氧条件下，将链霉菌菌株培养在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中，其中该培养基含有的氨基酸浓度能有效取得浓度至少两倍高于在含有少于约1克/升、约2克/升、约3克/升、约4克/升、约5克/升、约6克/升、约7克/升、约8克/升、约9克/升、或约10克/升的一或多种氨基酸的培养基中所取得的谷氏菌素浓度。在一个实施方案中，用于培养基中的氨基酸为谷氨酸、丝氨酸和/或甘氨酸。在一个实施方案中，用于取得增进水平的培养基中(即，增强的培养基)的谷氏菌素的氨基酸浓度为约2克/升至约15克/升，且所取得的谷氏菌素浓度为在起始培养基中所取得浓度的至少两倍，其中，在一个实施方案中，该起始培养基含有不超过该增强的培养基中所含有浓度的约1/2氨基酸浓度。

上述的任何产谷氏菌素的链霉菌菌株可用于实行本方法。

本发明还提供来自细黄链霉菌菌株(具体而言，来自细黄链霉菌菌株NRRL B-50550)的谷氏菌素生物合成基因簇、在该基因簇中的个别基因的表征及由其编码的蛋白质。来自细黄链霉菌菌株的谷氏菌素基因簇被公开，该基因簇包含14个开放阅读框(ORFs)，分别称为ORFs4251至4253、4255至4259、4261至4265，和4271(分别为SEQ ID NO：1、3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29和41)，且在此分别称为GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM及GouN。该对应的蛋白质分别提供在SEQ ID NO：2、4、6、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30和42中。包含该来自细黄链霉菌菌株的谷氏菌素生物合成基因簇及一些侧翼区的基因组DNA序列提供于SEQ ID NO：43，其描述基因GouA至GouN的位置。

本发明还提供来自紫红链霉菌(具体地说，来自紫红链霉菌菌株A)的部分谷氏菌素生物合成基因簇、该基因簇中的个别基因的表征及由其编码的蛋白质。一种来自紫红链霉菌的部分谷氏菌素基因簇被公开，该基因簇包含12个开放阅读框(ORFs)(分别为SEQ ID NO：89-100)，且在此分别称为GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM。它们是分别提供于SEQID NO：3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27及29中的基因的直系同源物，且在此分别称为GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL及GouM。对应的蛋白质分别提供在SEQ ID NO：77-88中。包含该来自紫红链霉菌菌株的谷氏菌素生物合成基因簇的基因组DNA序列提供于SEQ ID NO：76中。

本发明还提供与SEQ ID NO：43的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列，其是可操作地连接至少一种用于指导该序列表达的外源性和/或异源性调控元件。该核酸序列可进一步包含SEQ IDNO：43的位置10820至位置12013的核苷酸序列，和/或可进一步包含SEQ ID NO：43的位置13219至位置14334的核苷酸序列。该核酸序列可从细黄链霉菌、灰色链霉菌、环圈链霉菌、粪生链霉菌、小链霉菌、淡紫灰链霉菌、白绿链霉菌、紫红链霉菌或禾粟链霉菌分离出。

本发明还提供包含本文所描述的任一核酸序列(包括在该紧接在前的段落中所描述者)的宿主细胞。本发明还提供包含任一所述核酸序列的表达载体，以及包含该载体的宿主细胞。

本发明提供用于生产谷氏菌素或谷氏菌素类似物的方法，其包含：在培养基中培养谷氏菌素或产谷氏菌素的链霉菌属细菌以制造并将该谷氏菌素或谷氏菌素类似物分泌入培养基中，并从培养基中收集该谷氏菌素或谷氏菌素类似物，其中该细菌已经过修饰以增加与SEQ IDNO：43的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的表达。该细菌可能选自下列组：细黄链霉菌、灰色链霉菌、环圈链霉菌、粪生链霉菌、小链霉菌、淡紫灰链霉菌、白绿链霉菌、紫红链霉菌及禾粟链霉菌。

本发明提供用于制备谷氏菌素或谷氏菌素类似物的方法，其包含以下步骤：a)构建含有SEQ ID NO：43的核酸序列，进一步含有SEQID NO：43的位置10820至位置12013的核苷酸序列，和/或进一步含有SEQ ID NO：43的位置13219至位置14334的核苷酸序列的重组表达载体；b)以含有步骤a)的核酸序列的表达载体将宿主细胞转化以制造转化体；c)培养该步骤b)的转化体；及d)从步骤c)的转化体的培养产物中分离出并纯化该谷氏菌素或谷氏菌素类似物。

本发明提供一种转基因原核细胞，其包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。在另一实施方案中，提供一种转基因原核细胞，其包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、或至少99％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

本发明还提供一种转基因原核细胞，其包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88。在另一实施方案中，提供一种转基因原核细胞，其包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、或至少99％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88。

本发明还提供与选自下组的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41，其中还包含含有外源性限制性内切酶裂解位点的核酸序列。

【附图简述】

图1显示当将稀释后的菌株发酵产物喷洒在被二斑蛛螨(twospotted spider mites)侵染的利马豆植物叶子上时，以细菌候选菌株进行的UV稳定性试验结果。浅灰色的柱条(各菌株的较低柱条)代表无UV光照射时的抗杀螨活性，深灰色的柱条(每一菌株的较高柱条)代表以UV光照射24小时后的抗杀螨活性。第五天，按1至4的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。

图2显示当将稀释后的菌株发酵产物喷洒在被二斑蛛螨侵染的利马豆植物叶子上时，以测试的细菌候选菌株进行的透层活性(translaminar activity)试验的结果。浅灰色的柱条(各菌株的较低柱条)代表透层(抗杀螨)活性，深灰色的柱条(各菌株的较高柱条)代表总体抗杀螨活性。第六天，按1至4的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。

图3显示相对于亲代菌株，生长在1升摇瓶中的细黄链霉菌菌株NRRL B-50550突变体中增加的谷氏菌素产量。

图4显示相对于亲代菌株，生长在5升生物反应器中的细黄链霉菌菌株NRRL B-50550突变体中增加的谷氏菌素产量。

图5显示谷氏菌素的化学结构，及其中丝氨酸、糖、胞嘧啶和肌氨酸亚结构域。

图6显示谷氏菌素的可能的生物合成途径。

图7显示谷氏菌素的化学结构，标注出可能涉及和/或负责谷氏菌素的特殊亚结构域结构的开放阅读框(ORF)编号。

图8显示谷氏菌素生物合成基因簇的组织。

图9显示经由琼脂糖凝胶电泳解析的所命名的引物对的PCR产物(有关引物对名称请见序列表)。MW＝1kDa分子量梯度。C＝16S阳性对照组。gouC1是来自SEQ ID NO：44和45的引物。gouC2是来自SEQ ID NO：46和47的引物。gouD是来自SEQ ID NO：48和49的引物。gouGl是来自SEQ ID NO：50和51的引物。gouG2是来自SEQID NO：52和53的引物。gouIl是来自54和55的引物。gouF2是来自SEQ ID NO：56和57的引物。

图10显示pUC118载体的示意图。

图11显示pKC1139穿梭载体(shuttle vector)的示意图。

图12显示来自使用不同引物对的PCR的PCR产物，经由琼脂糖凝胶电泳解析的结果。I＝gouI引物；G＝gouG引物；Ia＝具有安普霉素(Apramycin)抗性的单次交换；IKI(具GouIup及gouldown)，CKW(具gouCup及gouwholeclusterdown)，及CKI(具gouCup及gouIdown)均为卡那霉素抗性双重交换。

表1

SEQ ID NO:	描述
		1	ORF 4251(GouA)；SEQ ID NO:43的核苷酸4455至4880的反向互补物
2	ORF 4251的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
		3	ORF 4252(GouB)；SEQ ID NO:43的核苷酸6340至6801
4	ORF 4252的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
		5	ORF 4253(GouC)；SEQ ID NO:43的核苷酸7197至7712
6	ORF 4253的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
		7	ORF 4254；SEQ ID NO:43的核苷酸8130至8486的反向互补物
8	ORF 4254的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
		9	ORF 4255(GouD)；SEQ ID NO:43的核苷酸8589至8729
10	ORF 4255的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
		11	ORF 4256(GouE)；SEQ ID NO:43的核苷酸8912至9826
12	ORF 4256的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
		13	ORF 4257(GouF)；SEQ ID NO:43的核苷酸9827至10823
14	ORF 4257的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
		15	ORF 4258(GouG)；SEQ ID NO:43的核苷酸10820至12013
16	ORF 4258的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
		17	ORF 4259(GouH)；SEQ ID NO:43的核苷酸12020至13145
18	ORF 4259的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
		19	ORF 4260；SEQ ID NO:43的核苷酸13146至13265的反向互补物
20	ORF 4260的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
		21	ORF 4261(GouI)；SEQ ID NO:43的核苷酸13219至14334
22	ORF 4261的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
		23	ORF 4262(GouJ)；SEQ ID NO:43的核苷酸14350至15063
24	ORF 4262的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
		25	ORF 4263(GouK)；SEQ ID NO:43的核苷酸15411至16046
26	ORF 4263的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
		27	ORF 4264(GouL)；SEQ ID NO:43的核苷酸16142至17482
28	ORF 4264的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
		29	ORF 4265(GouM)；SEQ ID NO:43的核苷酸17549至19312
30	ORF 4265的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)

SEQ ID NO:	描述
		31	ORF 4266；SEQ ID NO:43的核苷酸19461至19574
32	ORF 4266的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
		33	ORF 4267；SEQ ID NO:43的核苷酸20147至20551
34	ORF 4267的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
		35	ORF 4268
36	ORF 4268的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
		37	ORF 4269
38	ORF 4269的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
		39	ORF 4270
40	ORF 4270的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)
		41	ORF 4271
42	ORF 4271的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
		43	包含谷氏菌素基因簇(来自细黄链霉菌)的基因座的核酸序列
44	引物1F
		45	引物1R
46	引物2F
		47	引物2R
48	引物3F
		49	引物3R
50	引物4F
		51	引物4R
52	引物5F
		53	引物5R
54	引物6F
		55	引物6R
56	引物7F
		57	引物7R
58	Kan-F引物
		59	Kan-R引物
60	gouL-1-F(-2056)引物
		61	gouL-1-R(-880)引物

SEQ ID NO:	描述
		62	gouL-2-F(+522)引物
63	gouL-2-R(+2364)引物
		64	gouH-1-F(-1827):引物
65	gouH-1-R(-845):引物
		66	gouH-2-F(+1184):引物
67	gouH-2-R(+2985):引物
		68	gouF-1-F(-1831):引物
69	gouF-1-R(-41):引物
		70	gouF-2-F(+1126):引物
71	gouF-2-R(+2919):引物
		72	gouWcluster-F(+4)引物
73	gouWcluster-R(+1897)引物
		74	gouWcluster-F(-1373end)引物
75	gouWcluster-R(-92end)引物
		76	包含谷氏菌素基因簇(来自紫红链霉菌)的基因座的核酸序列
77	ORF 4075的氨基酸序列(GouB)
		78	ORF 4076的氨基酸序列(GouC)
79	ORF 4077的氨基酸序列(GouD)
		80	ORF 4078的氨基酸序列(GouE)
81	ORF4079的氨基酸序列(GouF)
		82	ORF 4080的氨基酸序列(GouG)
83	ORF 4081的氨基酸序列(GouH)
		84	ORF 4082的氨基酸序列(GouI)
85	ORF4083的氨基酸序列(GouJ)
		86	ORF4084的氨基酸序列(GouK)
87	ORF 4085的氨基酸序列(GouL)
		88	ORF4086的氨基酸序列(GouM)
89	ORF 4075(GouB)
		90	ORF4076(GouC)
91	ORF4077(GouD)
		92	ORF 4078(GouE)

SEQ ID NO:	描述
		93	ORF 4079(GouF)
94	ORF 4080(GouG)
		95	ORF 4081(GouH)
96	ORF 4082(GouI)
		97	ORF 4083(GouJ)
98	ORF 4084(GouK)
		99	ORF4085(GouL)
100	ORF 4086(GouM)

发明详述

本文中的所有出版物、专利及专利申请，包括任何附图及附录在此以引用方式被纳入本文中，其程度如同各个别出版物、或专利申请被具体且个别被指定以引用方式被纳入本文中一样。

下列描述包括可用来理解本发明的信息。其并非承认本文中所提供的任何信息为现有技术或与目前请求保护的发明相关、或任何具体指明或隐含引用的出版物为现有技术。

本发明提供细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株。现已发现，菌株NRRL B-50550具有多种有利性能。菌株NRRL B-50550(或其发酵产物)不仅具有这类杀螨活性，还显示出例如高紫外线稳定性、良好的透层活性、良好的杀卵活性、长残留活性、浸液活性以及对抗范围广泛的螨虫的活性(见实施例部分)，因此，符合有效杀螨剂的要求。此外，菌株NRRL B-50550(或其发酵产物)具有杀昆虫活性及对抗各种真菌性植物病原体(诸如叶锈病和霜霉病)的活性。此种独特的活性组合使菌株NRRL B-50550为高度通用的候选菌株，并使该菌株适合被广泛用于处理植物以控制植物疾病和/或植物害虫的方法中。已知的链霉菌菌株未曾被报导过具有这类广范围活性及在农业中的可能应用。关于可能的农业用途，链霉菌菌株曾被大幅描述于1960年代末及1970年代初的出版物。参见，例如英国专利号GB1507193中，其描述产生抗微生物化合物B-98891的龟裂链霉菌(Streptomyces rimofaciens)菌株B-98891号(保藏编号为ATCC 31120)。根据1975年3月提交的GB 1507193，抗微生物化合物B-98891为提供龟裂链霉菌菌株B-98891抗真菌活性对抗白粉病的活性成分。1972年8月2日提交的美国专利第3,849,398号描述菌株丰加链霉菌无刺霉素变种(Streptomyces toyocaensis var.aspiculamyceticus)产生抗微生物化合物无刺霉素(aspiculamycin)，还称为谷氏菌素(参见，Toru Ikeuchiet al.,25J.Antibiotics 548(1972年9月))。根据美国专利第3,849,398号，谷氏菌素具有对抗动物身上的寄生虫(诸如蛲虫，等)的杀寄生虫作用，虽然谷氏菌素被认为显示出弱的对抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及结核杆菌的抗菌活性。类似地，1978年出版的日本专利申请案第JP 53109998(A)号报告菌株丰加链霉菌(LA-681)及其产谷氏菌素作为杀螨剂的能力。然而，需注意的是，目前并无以这类链霉菌菌株为基础的杀螨发酵产物的市售商品。因此，细黄链霉菌菌株NRRLB-50550凭借其广泛的对抗螨(基于谷氏菌素产生)、真菌和昆虫的效力，及其在作用模式方面的有利性质(如透层活性及残留活性)而成为在生物和有利性质方面的重要且出人意料的进步代表，已知的链霉菌菌株仍未曾有这类生物和有利性质的报导。申请者已解决了制造含有高浓度谷氏菌素的发酵肉汤的问题，而使该发酵肉汤成为商业杀虫剂或作为用于商业杀虫剂的谷氏菌素来源的终极用途可行。因此，本发明包含含有浓度为至少约0.5克/升谷氏菌素的发酵肉汤。此外，本发明包含含有浓度为至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升、或至少约1mg/g、至少约2mg/g、至少约3mg/g、至少约4mg/g、至少约5mg/g、至少约6mg/g、至少约7mg/g、或至少约8mg/g谷氏菌素的发酵肉汤。于其它实施方案中，该发酵肉汤含有浓度在约2克/升至约15克/升范围内的谷氏菌素，包括约3克/升、约4克/升、约5克/升、约6克/升、约7克/升、约8克/升、约9克/升、约10克/升、约11克/升、约12克/升、约13克/升，及约14克/升的浓度，或范围在约2mg/g至约15mg/g的浓度。在一些实施方案中，该发酵肉汤是来自链霉菌种。在特定的实施方案中，该发酵肉汤是来自细黄链霉菌。在其他特定的实施方案中，该发酵肉汤是来自细黄链霉菌NRRL-50550或由其衍生的杀植食性螨突变体。此外，本申请者鉴定和操作了负责产谷氏菌素的细黄链霉菌基因簇。参见下图及第5图中的谷氏菌素的结构。

除非另外具体注明，本文所描述的微生物和具体菌株均从自然界中分离出(即，分离的)且生长在人工条件下，诸如在摇瓶培养中或透过规模扩增的制造过程，诸如在生物反应器中(诸如本文所描述者)。在一个实施方案中，提供了细黄链霉菌NRRL B-50550的杀植食性螨突变株。细黄链霉菌为属于链霉菌属的嗜温、腐生细菌，常在土壤和腐烂的植物中找到。NRRL B-50550为从美国大陆的土壤中分离出的细黄链霉菌菌株。细黄链霉菌为好氧的革兰氏阳性丝状菌，其产生发育良好的丝状营养菌丝(～1.0微米宽及10-100微米长)，且能产生分生孢子(conidia)-无性孢子。菌丝是由长的直丝所组成，其以多多少少有点规律的间隔，以旋涡状的排列(环生体)方式携带米色、光滑的孢子。每个菌丝轮的分支在其顶点产生带有二至数个孢子链的孢子伞(umbel)。

术语“突变体”是指从细黄链霉菌菌株NRRL B-50550衍生的遗传变异体。在一个实施方案中，该突变体具有细黄链霉菌菌株NRRLB-50550的一或多种或全部的识别(功能性)特性。在一个特殊的情况中，该突变体或其发酵产物至少如亲代细黄链霉菌菌株NRRLB-50550般良好地控制(为一种识别的功能特性)螨虫。此外，该突变体或其发酵产物可能具有一、二、三、四或全部五种以下特点：与杀螨活性相关的透层活性、与杀螨活性相关的残留活性、杀卵活性、杀虫(尤其是对抗叶甲)活性、或是对抗真菌植物病原体的活性(尤其是对抗霜霉病及锈病)。这类突变体可能为其基因组序列与细黄链霉菌菌株NRRL B-50550具有超过约85％、超过约90％、超过约95％、超过约98％、或超过约99％序列同一性的遗传变体。突变体可经由以下方式取得：以化学物质或辐射处理细黄链霉菌菌株NRRL B-50550细胞或从NRRL B-50550细胞的群体选择自发性突变体(诸如具噬菌体抗性或抗生素抗性的突变体)，或藉由本领域技术人士所熟知的其他方式取得。

用于使细黄链霉菌产生诱变的合适化学品包括(仅举几个例子)：盐酸羟胺、甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、4-硝基喹啉1-氧化物(NQO)、丝裂霉素C或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)(参照，例如Stonesifer&Baltz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82册，1180-1183页，1985年2月)。使用相应链霉菌菌株的孢子溶液，藉由例如NTG来引起链霉菌菌株诱变已为本领域技术人员众所周知。见，例如Delic et al,Mutation Research/Fundamental and MolecularMechanisms of Mutagenesis,Volume 9,Issue 2,1970年2月，167-182页，或Chen et al.,J Antibiot(Tokyo)，2001年11月；54(11)，967-972页)。更详细地说，可使用Kieser,T.,et al.,2000,supra.PracticalStreptomyces Genetics,Ch.5John Innes Centre,Norwich ResearchPark,England(2000),99-107页中描述的方案，藉由NTG使细黄链霉菌发生突变。藉由紫外线(UV)使细黄链霉菌孢子发生诱变可使用标准方案来进行。例如，可将链霉菌菌株的孢子悬浮液(新鲜配制的或冷冻在20％甘油中的)悬浮在不吸收波长254nm的UV光的培养基中(例如水或20％甘油是合适的)。然后，将孢子悬浮液置于玻璃培养皿中，以低压汞蒸汽灯照射(该低压汞蒸汽灯在254nm发射出其大部分能量)，并在30℃下持续搅拌一段合适的时间(最合适的照射时间可经由先绘制剂量存活曲线来测定)。然后，例如可在非选择性培养基斜面或平板上接种密集的经照射的孢子悬浮液，由此取得的突变株可依下文中的解释评估其性质。见Kieser,T.，等人，2000，同上文。

该突变株可为任何具有细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的一或多种或全部鉴定特征的突变株，尤其是相当于或优于细黄链霉菌NRRLB-50550的杀螨活性。该杀螨活性可例如依实施例2中的说明针对二斑蛛螨(“TSSM”)测定，意指可将细黄链霉菌NRRL B-50550的突变株的培养贮存液生长在20-30℃，1升摇瓶内的实施例2培养基1或培养基2中3-5天，然后可将稀释的发酵产物施用在两株植物的利马豆叶的顶部和底部，经过此处理后，可在同一天以50-100TSSM侵染植物并将植物留在温室中五天。

实施例16提供用于产生细黄链霉菌NRRL B-50550的突变株的方法的具体实施例。藉由此方法产生的一种突变株为细黄链霉菌菌株M(其将更充分地描述于实施例中)。该细黄链霉菌M的谷氏菌素生物合成基因簇与细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的谷氏菌素生物合成基因簇(即，SEQ ID NO：43)具有约99％序列同一性。

在本发明的一个方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨的突变株具有透层活性。本文所使用的术语“透层活性”为其在本领域中的常规含义，因此，“透层活性”意指化合物或组合物(此处为组合物，诸如含有细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其突变株的发酵产物)移动通过欲处理的植物的叶组织的能力。透层化合物/组合物渗透叶组织并在叶内形成活性成分的贮库。因此，此透层活性还提供对抗进食叶子的昆虫和螨虫的残留活性。由于该组合物(或其一或多种活性成分)可以移动通过叶片，彻底的喷洒覆盖对控制蜱螨，诸如螨(其通常在叶子下方进食)较不重要。单独的突变株透层活性或与细黄链霉菌NRRL B-50550的比较可例如依本文中实施例6的说明对二斑蛛螨(“TSSM”)进行测定。在实施例6的条件下数天(例如约5天)后仍然可以观察到透层活性。在本发明的一个方面，可在处理后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天观察到(存在)透层活性。

在本发明的另一方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株具有残留活性。本文所使用的术语“残留活性”为其在本领域中的常规含义，因此，“残留活性”意指化合物或组合物(此处为组合物，诸如含有细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其突变株的发酵产物)在施用后的一段延长的时间内保持有效(即，对比于未施用该化合物或组合物的条件，造成较高的螨虫死亡率或导致螨虫的总数减少)的能力。时间的长度可能取决于该配方(粉尘、液体，等)、植物的类型或施用含有细黄链霉菌NRRL B-50550或其突变株的组合物的位置及该植物表面或土壤表面的条件(湿、干，等)。单独突变株的残留活性或与细黄链霉菌NRRL B-50550的比较可例如依本文实施例2或7中的说明，对二斑蛛螨(“TSSM”)进行测定，在杀螨作用方面意指在实施例5的条件下数天(例如约12天)后仍然可以观察到抗螨效果。在本发明的一个方面，可在处理后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40天后观察到(存在)残留活性。

在本发明的另一方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株具有杀卵活性。本文所使用的术语“杀卵活性”为其在本领域中的常规含义，意指“造成卵子破坏或死亡的能力”，在本文中是针对螨蜱(诸如螨)的卵使用。单独细黄链霉菌NRRL B-50550突变株的杀卵活性或与细黄链霉菌NRRL B-50550的比较可使用如实施例7中所描述的方法测定。在实施例7的条件下数天(例如约5天)后仍然可以观察到杀卵活性。在本发明的一个方面，在处理后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天仍能观察到(存在)杀卵活性。

在本发明的另一方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株可能具有浸液活性(drench activity)。本文所使用的术语“浸液活性”为其在本领域中的常规含义，意指从土壤或其它生长培养基经由木质部向上通过植物的杀虫活性。该单独的细黄链霉菌NRRL B-50550突变株的“浸液活性”或与细黄链霉菌NRRL B-5055的比较可使用如实施例8中所描述的方法测定。在本发明的一个方面，在实施例8的条件下数天(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11天)后仍然可以观察到(存在)浸液活性。

在本发明的另一方面，细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株具有对抗多种螨种的杀螨活性，包括如实施例中所说明(但不限于)的对抗二斑蛛螨的活性、对抗柑桔锈螨(柑橘锈瘿螨(Phyllocoptruta oleivora))、瘿螨(枯叶色)和广明螨的活性。

因此，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株可能具有对抗选自下列组的螨的活性：三叶螨(clover mite)、棕色螨(brown mite)、榛子蛛螨(hazelnut spider mite)、芦笋蛛螨(asparagusspider mite)、棕色小麦螨(brown wheat mite)、豆螨(legume mite)、酢浆草螨(oxalis mite)、黄杨木螨(boxwood mite)、德州柑橘螨(Texascitrus mite)、东方红螨(Oriental red mite)、柑桔红螨(citrus red mite)、欧洲红螨(European red mite)、黄蛛螨(yellow spider mite)、无花果蛛螨(fig spider mite)、刘易斯蛛螨(Lewis spider mite)、六斑蛛螨(six-spotted spider mite)、乌伊拉米特螨(Willamette mite)、尤马蛛螨(Yuma spider mite)、纺网络螨(web-spinning mite)、菠萝螨(pineapplemite)、柑橘绿螨(citrus green mite)、美洲皂荚蛛螨(honey-locust spidermite)、茶红蛛螨(tea red spider mite)、南方红螨(southern red mite)、鳄梨棕螨(avocado brown mite)、云杉蛛螨(spruce spider mite)、鳄梨红螨(avocado red mite)、草地小爪螨(Banks grass mite)、朱砂蛛螨(carmine spider mite)、沙漠蛛螨(desert spider mite)、蔬菜蜘螨(vegetable spider mite)、隆突蛛螨(tumid spider mite)、草莓蛛螨(strawberry spider mite)、二斑蛛螨(two-spotted spider mite)、丹尼尔螨(McDaniel mite)、太平洋蛛螨(Pacific spider mite)、山楂蛛螨(hawthorn spider mite)、四斑蛛螨(four-spotted spider mite)、肖氏蛛螨(Schoenei spider mite)、智利假蛛螨(Chilean false spider mite)、柑橘平螨(citrus flat mite)、女贞螨(privet mite)、平猩红螨(flat scarletmite)、白尾螨(white-tailed mite)、菠萝跗线螨(pineapple tarsonemidmite)、西印度甘蔗螨(West Indian sugar cane mite)、鳞茎鳞螨(bulbscale mite)、仙客来螨(cyclamen mite)、广明螨(broad mite)、麦圆叶爪螨(winter grain mite)、红足泥螨(red-legged earth mite)、榛小植刺瘿螨(filbert big-bud mite)、葡萄瘿螨(grape erineum mite)、梨肿叶螨(pear blister leaf mite)、苹果卷叶缘螨(apple leaf edgeroller mite)、桃植羽瘿螨(peach mosaic vector mite)、赤杨珠瘿螨(alder bead gallmite)、佩里安核桃叶瘿螨(Perian walnut leaf gall mite)、胡桃叶卷缘螨(pecan leaf edgeroll mite)、无花果瘿螨(fig bud mite)、橄榄油瘿螨(olive bud mite)、柑橘瘿螨(citrus bud mite)、荔枝瘿螨(litchi erineummite)、小麦曲螨(wheat curl mite)、椰子花核瘿螨(coconut flower andnut mite)、甘蔗肿瘿螨(sugar cane blister mite)、野牛草瘿螨(buffalograss mite)、百慕达草瘿螨(bermuda grass mite)、胡萝卜瘿螨(carrotbud mite)、红薯叶瘿螨(sweet potato leaf gall mite)、石榴叶曲螨(pomegranate leaf curl mite)、ash sprangle瘿螨(ash sprangle gallmite)、槭斜背瘤瘿螨(maple bladder gall mite)、alder erineum螨(aldererineum mite)、红莓螨(redberry mite)、棉花肿螨(cotton blister mite)、蓝莓瘿螨(blueberry bud mite)、粉红茶锈螨(pink tea rust mite)、茶紫瘿螨(ribbed tea mite)、灰色柑橘螨(grey citrus mite)、红薯锈螨(sweetpotato rust mite)、七叶树锈螨(horse chestnut rust mite)、柑桔锈螨(citrus rust mite)、苹果锈螨(apple rust mite)、葡萄锈螨(grape rustmite)、梨锈螨(pear rust mite)、扁针鞘松螨(flat needle sheath pinemite)、野玫瑰芽果螨(wild rose bud and fruit mite)、干莓瘿螨(dryberry mite)、芒果锈螨(mango rust mite)、杜鹃锈螨(azalea rustmite)、梅锈螨(plum rust mite)、桃银色刺瘿螨(peach silver mite)、苹果锈螨(apple rust mite)、西红柿叶赤皮瘿螨(tomato russet mite)、粉红柑桔锈螨(pink citrus rust mite)、谷物锈螨(cereal rust mite)、水稻锈螨(rice rust mite)及它们的组合。此外，该细黄链霉菌菌株NRRLB-50550或其杀植食性螨突变株具有对抗那些对其他螨控制剂具抗性的螨虫的活性。在一个实施方案中，该菌株对阿维菌素(abamectin)抗性螨虫具有活性。

在本发明的另一方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株可能还具有杀虫活性。该靶昆虫可能为叶甲(diabrotica)。该叶甲可能为带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle)(食蚜蝇叶甲(Diabrotica balteata))、西斑黄瓜甲虫(Western spottedcucumber beetle)(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctataundecimpunctata))、或玉米根虫，诸如北方玉米根虫(Northern cornrootworm)(巴氏根叶甲(Diabrotica barberi))、南方玉米根虫(Southerncorn rootworm)(黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctata howardi))、西黄瓜甲虫(Western cucumber beetle)(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata tenella))、西玉米根虫(Western corn rootworm)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgiferavirgifera))、墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm)(墨西哥玉米根叶甲(Diabrotica virgifera zeae))及这类叶甲的组合。单独细黄链霉菌NRRL B-50550的突变株的杀虫活性或与细黄链霉菌NRRL B-50550的比较可使用实施例10中所描述的方法对玉米根虫测定。

在本发明的另一方面，该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株具有杀真菌剂活性，意指对抗由真菌引起的植物疾病的活性。该植物疾病可为霜霉病(mildew)或锈病。可以细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株处理的霜霉病的实施例包括，但不限于白粉病，诸如由黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)引起的黄瓜白粉病，或霜霉病，诸如由寄生霜霉菌(Peronosporaparasitica)引起的甘蓝型油菜霜霉病。可以细黄链霉菌菌株NRRLB-50550或其杀植食性螨突变株处理的锈病的实施例包括，但不限于由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)(还称为P.recondita)引起的小麦叶锈病、由麦秆锈菌(Puccinia grammis)引起的麦秆锈病、由条锈病菌(Puccinia striiformis)引起的小麦条锈病、由大麦柄锈菌(Pucciniahordei)引起的大麦叶锈病、由隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)引起的裸麦叶锈病、棕叶锈病、冠锈病及秆锈病。单独的细黄链霉菌NRRLB-50550突变株的杀真菌活性或与细黄链霉菌NRRL B-50550的比较可使用如实施例9中所描述的方法对黄瓜白粉病进行测定。在实施例9的条件下数天(例如约7天)后仍然可观察到杀真菌活性。在本发明的一个方面，可在处理后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和/或15天观察到(存在)杀真菌活性。

本发明还提供紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌的突变株。紫红链霉菌为链霉菌属细菌的灰色链霉菌(S.griseus)分化枝的成员。紫红链霉菌为需氧革兰氏阳性丝状菌。其产生每链具有10至多于50个孢子的中等长度的成熟孢子链。当生长在以燕麦为底质的琼脂上时，该孢子质地光滑且菌落的颜色为淡黄色至淡红色。紫红链霉菌菌株A是自美国大陆采集的土壤样本中分离出的。如实施例18中的描述，菌株A的发酵产物具有杀螨性能。在一个实施方案中，提供紫红链霉菌菌株A的杀植食性螨和/或杀真菌突变株。术语“突变体”是指衍生自紫红链霉菌菌株A的遗传变体。在一个实施方案中，该突变体具有紫红链霉菌菌株A的一或多种或全部的识别(功能性)特性。在一个特殊的情况中，该突变体或其发酵产物至少如亲代紫红链霉菌菌株A般良好地控制(作为一种识别性的功能特性)螨。这类突变体可能为其基因组序列与紫红链霉菌菌株A具有超过约85％、超过约90％、超过约95％、超过约98％、或超过约99％序列同一性的遗传变体。突变体可经由以下方式获得：以化学物质或辐射处理紫红链霉菌菌株A细胞或从A细胞的群体选择自发性突变体(诸如具噬菌体抗性或抗生素抗性的突变体)，或藉由本领域技术人员所熟知的其他方式选择，包括上文及实施例16中关于细黄链霉菌NRRLB-50550所描述的方式。紫红链霉菌菌株A含有编码蛋白质GouB-GouM的谷氏菌素基因簇，且被预期含有GouA。紫红链霉菌菌株A的蛋白质GouB-GouM与来自细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的直系同源蛋白质具有至少90％序列同一性。

本发明还包含处理植物以控制植物害虫和疾病的方法，其是经由将一或多种含有谷氏菌素的链霉菌、细黄链霉菌菌株NRRL B-50550、或由其衍生的杀植食性螨或杀真菌突变株的发酵肉汤、或其无细胞制剂、或其代谢物、或紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨突变株、或其无细胞制剂、或其代谢物投予植物或植物部分(诸如叶、茎、花、果实、根、或种子)，或施用在植物或植物部分生长的位点，诸如土壤。适合用于本发明的方法和发酵产物的其他产谷氏菌素的菌株描述于本文中。

本文所使用的术语“植物”是指属于植物界的任何生物体(即，植物界中的任何属/种)。这包括熟悉的生物体，诸如，但不限于树木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨类植物、苔藓及绿藻。此术语指单子叶植物(monocotyledonous plants，还称为monocots)和双子叶植物(dicotyledonous plants，还称为dicots)两者。在一些实施方案中，植物具经济重要性。在一些实施方案中，该植物为人工种植的植物，例如栽培的植物，其可能为农业、造林或园艺用植物。举些例子，特殊植物的实施例包括，但不限于玉米、马铃薯、玫瑰、苹果树、向日葵、小麦、水稻、香蕉、西红柿、opo、南瓜、西葫芦、豆类(例如，利马豆)、生菜、圆白菜、橡树、擎天菠萝(guzmania)、天竺葵、扶桑、威灵仙(clematis)、一品红(poinsettias)、甘蔗、芋头、鸭杂草、松树、肯塔基蓝草、结缕草、椰子树、芸苔属叶菜类蔬菜(例如西兰花、球花甘蓝、布鲁塞尔豆芽、白菜、中国白菜(Bok Choy和Napa)、菜花、cavalo、芥兰菜、羽衣甘蓝、大头菜、芥菜、油菜及其他芸苔属叶菜类蔬菜作物)、鳞茎类蔬菜(例如大蒜、韭菜、洋葱(洋葱干鳞茎、大葱、长葱)、葱及其他鳞茎蔬菜作物)、柑橘类果实(例如葡萄柚、柠檬、莱姆、柳橙、桔子、柑桔杂交种、柚子及其他柑橘类果实作物)、瓜类蔬菜(例如小黄瓜、枸橼西瓜、食用葫芦、西印度黄瓜、甜瓜(包括黄瓜瓜类的杂交种和/或栽培变种)、西瓜、哈密瓜及其他瓜类蔬菜作物)、果类蔬菜(包括茄子、鹅莓、人参果、辣椒、西红柿、树蕃茄及果类蔬菜作物)、葡萄、叶菜类蔬菜(例如莴苣)、根/块茎和球茎蔬菜(例如马铃薯)、扁豆、苜蓿芽、三叶草及树坚果(杏仁、胡桃、开心果及核桃)、浆果(例如西红柿、伏牛花、葡萄干、接骨木果、醋栗、金银花、鬼臼根、荚迷、奥勒冈葡萄、沙棘、朴树果、熊果、越橘、草莓、海葡萄、黑莓、黄梅、杨莓、覆盆子、美莓、糙莓及酒莓)、禾谷类作物(例如玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、非洲小米(fonio)及藜麦)、梨果类果实(例如苹果、梨)、核果(例如咖啡、枣、芒果、橄榄、椰子、油棕、开心果、杏仁、杏、樱桃、西洋李子、油桃、桃子及李子)、藤(例如食用葡萄、酿酒葡萄)、麻类作物(例如麻、棉)、观赏植物。在一些实施方案中，该植物可能为住宅/家内植物、温室植物、农业植物或园艺植物。如上文所指出者，在一些实施方案中，该植物可能为硬木，诸如合欢、桉树、角树、榉木、红木、胡桃木、橡木、梣树、柳、胡桃木、桦木、板栗、杨树、桤木、枫树、梧桐、银杏、棕榈树和枫香。在一些实施方案中，该植物可能为针叶树，诸如柏树、道格拉斯冷杉、枞、红杉、铁杉、雪松、刺柏、落叶松、松树、红木、云杉及红豆杉。在一些实施方案中，该植物可能为产果实的木本植物，诸如苹果、李子、梨、香蕉、橙、奇异果、柠檬、樱桃、葡萄、木瓜、花生及无花果。在一些实施方案中，该植物可能为木本植物，诸如棉、竹及橡胶植物。在一些实施方案中，该植物可能为农业、造林和/或观赏用植物，即，常用于园艺(例如在公园、花园和阳台)的植物。在大量的观赏植物间可举出的一些例子有草皮、天竺葵(geranium)、天竺葵(pelargonia)、矮牵牛、秋海棠及灯笼海棠。术语“植物”还意欲包括任何植物繁殖体。

术语“植物”一般包括已藉由一或多次育种、诱变和基因工程修饰的植物。基因工程是指使用重组DNA技术。重组DNA技术令那些无法轻易地经由在自然环境下交叉育种、突变或自然重组取得的修饰成为可行。在一些实施方案中，藉由基因工程取得的植物可能为转基因植物。

如本文所使用的术语“植物部分”是指植物的任何部分，包括，但不限于幼芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞、枝条、叶柄、节间、树皮、木材、块茎、软毛、分蘗、根茎、藻体、叶片、花粉、雄蕊、孢子、果实和种子。生长在本领域所使用的典型肉汤(诸如土壤)中的两种植物主要部分通常被称为“地上”部分(还常被称为“枝”)及“地下”部分(还常被称为“根”)。

在根据本发明的一种方法中，可将含有细黄链霉菌NRRLB-50550或其杀植食性螨突变株的组合物施用于生长在长成植物所使用的任何类型的肉汤(例如土壤、蛭石、碎纸板及水)中的任何植物或任何植物的任何部分，或施用于架空种植的植物或植物部分，诸如兰花或鹿角蕨上。该组合物可，例如藉由喷洒、喷雾、蒸发、撒、喷粉、浇水、喷、洒、浇注、或熏蒸施用。如上文已经指出，施用程序可在所欲植物放置的任何需要的地点进行，诸如农业、园艺、森林、农园、果园、苗圃、有机种植的作物、草皮及城市环境。

本发明的组合物可经由使用传统的大规模微生物发酵过程培养细黄链霉菌NRRL B-50550或由其衍生的突变体取得，该发酵过程为，诸如深层发酵、固态发酵或液体表面培养，包括，例如美国专利第3,849,398号；英国专利GB 1 507 193号；Toshiko Kanzaki，等人，Journal of Antibiotics,Ser.A,Vol.15,No.2,1961年6月，93至97页；或Toru Ikeuchi，等人，Journal of Antibiotics(1972年9月)，548至550页中所描述的方法。设置发酵以在发酵容器中取得高水平的活生物量(包括孢子)及理想的次级代谢产物。适合用于本发明的菌株以取得高水平的孢子形成、cfu(菌落形成单位)及次级代谢产物的特定发酵方法描述于实施例部分中。

从发酵产生的培养肉汤(“全肉汤”或“发酵肉汤”)中的细菌细胞、孢子和代谢产物可直接使用或藉由常规工业方法，诸如离心、过滤及蒸发浓缩，或藉由例如喷雾干燥、滚筒干燥及冷冻干燥加工成干燥粉末和颗粒。

如本文所使用的术语“全肉汤”和“发酵肉汤”是指在任何下游处理之前从发酵(包括制造含有浓度为至少约1克/升谷氏菌素的培养肉汤)产生的培养肉汤。该全肉汤包含所述微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)及其组成部分、未使用的原料基质及在发酵过程中由该微生物产生的代谢产物。如本文所使用的术语“肉汤浓缩物”是指已藉由如上述的常规工业方法浓缩，但仍为液体形式的全肉汤(发酵肉汤)。如本文所使用的术语“发酵固体”是指干燥的发酵肉汤。如本文所使用的术语“发酵产物”是指全肉汤、肉汤浓缩物、和/或发酵固体。本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，浓缩的发酵肉汤是例如经由渗滤过程洗涤，以除去残留的发酵肉汤和代谢产物。

在一个实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10⁵个菌落形成单位(CFU)的所述微生物(例如，细黄链霉菌NRRLB-50550或其杀植食性螨突变株)。在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10⁶个菌落形成单位(CFU)的所述微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。再在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10⁷个菌落形成单位(CFU)的所述微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10⁸个菌落形成单位(CFU)的所述微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10⁹个菌落形成单位(CFU)的所述微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10¹⁰个菌落形成单位(CFU)的该微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。在另一实施方案中，该发酵肉汤在每毫升肉汤中含有至少约1×10¹¹个菌落形成单位(CFU)的该微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)。本领域技术人员将理解上述浓度与发酵完成后不久所测量的CFU有关，但该CFU水平将根据储存条件而随着时间降低。当将产物保持在冷藏(例如，约4℃)下，本文所描述的微生物的未经配制的发酵产物的CFU水平是稳定的，但在室温下会下降。

在一个实施方案中，该发酵肉汤或肉汤浓缩物可在添加稳定剂、防腐剂、佐剂、和/或着色剂下配制成液态悬浮液、液态浓缩物、乳剂浓缩物、或可湿性粉末。

在另一实施方案中，该发酵肉汤或肉汤浓缩物可在添加或不添加载体、惰性剂、或添加剂下使用常规干燥过程或方法(诸如喷雾干燥、冷冻干燥、托盘干燥、流化床干燥、滚筒干燥或蒸发)进行干燥。

在一些实施方案中，该发酵肉汤、肉汤浓缩物或发酵固体经处理以杀死所述微生物，产生由被杀死的微生物、其代谢产物和残留的发酵培养基所组成的发酵产物。完成此目的的合适的处理方法为本领域技术人员所已知，包括热处理。

在其中该发酵肉汤或肉汤浓缩物被冷冻干燥的实施方案中，一加仑的发酵肉汤产生约0.2磅至约1磅的冻干粉末。在特定的情况中，一加仑的发酵肉汤产生约0.4磅至约0.6磅的冻干粉末。在另一情况中，一加仑的发酵肉汤产生约0.5磅的冻干粉末。

在进一步的实施方案中，可在添加或不添加惰性剂或添加剂的情况下将所得的干燥产物进一步加工，诸如藉由研磨或粒化，以取得用于农业施用所需的特定颗粒尺寸、或物理形式、或物理性质。

除了使用全肉汤或浓缩肉汤外，可藉由本领域中已知的任何方式(诸如提取、离心和/或过滤发酵肉汤)取得本发明的链霉菌的新颖变体和菌株的发酵肉汤的无细胞制剂。本领域技术人员将会理解所谓的无细胞制剂可能不会完全丧失细胞，但大体上为无细胞或基本上无细胞，这取决于用来除去细胞所使用的技术(例如，离心速度)。所得到的无细胞制剂可与协助其施用的组分一起干燥和/或配制。上文中所描述的用于发酵肉汤的浓缩方法和干燥技术还适用于无细胞制剂。

本发明的组合物可包括添加在包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中的配制成分，以提高效力、稳定性和物理性能、可用性和/或便于加工、包装和最终施用。这类配制成分可包括载体、惰性剂、稳定剂、防腐剂、营养素或物理性能改质剂，其可以单独添加或组合加入。在一些实施方案中，该载体可包括液态物质，诸如水、油和其他有机或无机溶剂，以及固态物质，诸如矿物质、聚合物或生物学地衍生或藉由化学合成衍生的聚合物复合物。在一些实施方案中，该成分为促进该组合物黏附至植物部分(诸如叶、种子或根)的结合剂、佐剂，或黏合剂。见，例如Taylor,A.G.,et al.,"Concepts andTechnologies of Selected Seed Treatments"Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339(1990)。该稳定剂可包括防结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。该营养素可包括碳、氮及磷源，诸如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。该物理性能改质剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、pH改质剂、流变改质剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、抗冻剂或着色剂。在一些实施方案中，该藉由发酵产生的包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物可在无任何其他配制剂、有或无作为稀释剂的水的存在下直接使用。在一个特定的实施方案中，在发酵固体(诸如冷冻干燥或喷雾干燥粉末)中添加润湿剂。当将润湿剂施用至活性成分的表面时，其可增加该活性成分的扩散和渗透性能(一旦稀释时)。示例性的润湿剂为本领域技术人员所已知，包括磺基琥珀酸酯和衍生物，诸如MONAWET MO-70(Croda公司，纽泽西州Edison)；trsiloxanes，诸如BREAKTHRU(德国Evonik)；非离子性化合物，诸如ALTOX 4894(Croda公司，纽泽西州Edison)；烷基多糖苷，诸如TERWET 3001(Huntsman国际有限责任公司，德州，The Woodlands)；C12-C14仲醇乙氧基化物，诸如TERGITOL 15-s-15(道氏化学公司，密执安州Midland)；磷酸酯，诸如RHODAFAC BG-510(Rhodia公司)；和烷基醚羧酸酯，诸如EMULSOGEN-LS(Clariant公司，北卡罗莱纳州)。

在一些实施方案中，该配制惰性剂是在浓缩发酵肉汤后，及干燥期间和/或干燥后加入。

本发明包含含有浓度为至少约1克/升谷氏菌素的发酵肉汤。在一些实施方案中，这类全肉汤培养来自产谷氏菌素的链霉菌菌株。在一个特殊的实施方案中，这类产谷氏菌素的菌株为细黄链霉菌、紫红链霉菌、或禾粟链霉菌。在另一实施方案中，该产谷氏菌素的菌株为灰色链霉菌、环圈链霉菌、粪生链霉菌、小链霉菌、淡紫灰链霉菌、白绿链霉菌、或紫红链霉菌。再在另一特殊实施方案中，这类产谷氏菌素的菌株为禾粟链霉菌CGMCC 4.506，其存放于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC。

本发明还提供来自细黄链霉菌的谷氏菌素生物合成基因簇、该基因簇中的个别基因的表征及由其编码的蛋白质。谷氏菌素基因簇被公开，该基因簇包含14个开放阅读框(ORFs)，分别称为ORFs4251至4253、4255至4259、4261至4265，和4271(分别为SEQ ID NO：1、3、5、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29和41)，且在此分别称为GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM及GouN。对应的蛋白质分别提供在SEQ ID NO：2、4、6、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30和42中。包含该谷氏菌素生物合成基因簇及一些侧翼区的基因组DNA序列提供于SEQ ID NO：43中，且描述基因GouA至GouN的位置。本公开内容提供位于遗传位点内的谷氏菌素基因簇的核酸序列、其中所含的ORFs及由其编码的蛋白质。此信息使得能够例如分离编码谷氏菌素基因簇及对应的ORFs的同源物的相关核酸分子(诸如在其他链霉菌属中)。

从细黄链霉菌菌株鉴定的包含在SEQ ID NO：43(核苷酸残基1-21933)内的谷氏菌素基因簇包括24个ORFs，称为ORFs 4248至4271。ORFs 4251、4252、4253、4255、4256、4257、4258、4259、4261、4262、4263、4264、4265和4271分别为13个基因gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM及gouN。需注意的是SEQ ID NO：89-100(从紫红链霉菌菌株鉴定出)分别提供直系同源基因gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM。这些基因的潜在功能及其在谷氏菌素合成反应中可能的作用提供于表2中。

表2:谷氏菌素生物合成基因的可能作用

因此，在又一个实施方案中，本发明的发酵产物(包括具有至少约0.5克/升谷氏菌素或至少约1克/升谷氏菌素的发酵肉汤)是来自产谷氏菌素的链霉菌菌株，该链霉菌菌株具有编码与选自下组的至少一个氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。再在另一实施方案中，该发酵产物(包括具有至少约0.5克/升谷氏菌素或至少约1克/升谷氏菌素的发酵肉汤)是来自产谷氏菌素的链霉菌菌株，该链霉菌菌株具有与SEQ ID NO：43的核苷酸序列或与SEQ ID NO：43所示核苷酸序列中编码蛋白质GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL和/或GouM的区域具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。

在一个具体的实施方案中，具有上述核酸序列的这类产谷氏菌素的菌株为细黄链霉菌或紫红链霉菌。一个具体的实例为细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变体。在一种情况中，这类杀植食性螨突变体为细黄链霉菌菌株M。在另一实例中，这类产谷氏菌素的菌株为紫红链霉菌菌株A或其杀植食性螨突变体。

含有至少约1克/升谷氏菌素的发酵肉汤可以数种方式取得，诸如发酵优化和/或使产谷氏菌素的亲代菌株发生突变以取得比亲代菌株产生更高水平的谷氏菌素的突变株。

因此，本发明还包含制造产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法，其中该发酵肉汤含有至少约0.5克/升谷氏菌素。该方法包含将链霉菌菌株在有氧条件下，在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中培养，其中该培养基中含有谷氏菌素的前体，诸如胞嘧啶；核碱基；和/或其浓度可有效取得至少0.5克/升谷氏菌素浓度的氨基酸。

在一些实施方案中，将该链霉菌菌株培养在培养基中，直到该培养基中含有的谷氏菌素的浓度为至少约0.5克/升、至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升。

在其它实施方案中，将该链霉菌菌株培养在培养基中，直到该培养基中含有的谷氏菌素的浓度为约0.5克/升至约25克/升谷氏菌素，意味着在发酵完成后，该发酵肉汤中所含有的谷氏菌素的浓度通常是在约0.5克/升至约15克/升谷氏菌素的范围内。

在此背景下，应注意的是该氨基酸(其添加浓度为可有效取得至少约0.5克/升或至少约1克/升谷氏菌素浓度)是以限定的浓度，以分开的个别组分形式提供，而非组合物的一部分，诸如酵母提取物或蛋白质水解产物(例如，仅举几例，酪蛋白水解产物、大豆粉水解产物，大豆蛋白胨，大豆酸水解产物)，其中氨基酸可存在于与其它化合物(诸如寡肽和经部分水解的蛋白质)的混合物中。因此，发酵肉汤中“有效取得至少1克/升谷氏菌素浓度的浓度”是指经特别选择以在培养基中提供这类谷氏菌素浓度的氨基酸浓度。在一些实施方案中，取得所需的谷氏菌素浓度的有效浓度为培养基中氨基酸浓度至少约1克/升。因此，此“有效浓度”可为高于2克/升，且可能在例如约2克/升至约15克/升的范围内。该浓度可为约3克/升、约4克/升、约5克/升、约6克/升、约7克/升、约8克/升、约9克/升、约10克/升、约11克/升、约12克/升、约13克/升、或约14克/升。

该氨基酸可为任何能提供至少约0.5克/升或更高的谷氏菌素浓度(诸如至少为约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升)的氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸为甘氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，L-天冬氨酸、L-丝氨酸，或它们的混合物。在一些实施方案中，该培养基含有浓度为约5克/升至约15克/升的甘氨酸，而在其它实施方案中，该培养基含有初始浓度为约5克/升至约15克/升的谷氨酸。还可能该培养基同时含有浓度为约5克/升至约15克/升的甘氨酸和L-谷氨酸(或L-谷氨酰胺)。

对链霉菌菌株而言为可消化(从而可利用)的任何碳源均可用于制造如本文所描述的发酵肉汤的方法(或发酵法)中。合适的碳源的实例(仅举几例)包括葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、淀粉(为多糖的一个实例)、糊精、麦芽糊精(为寡糖的一个实例)或甘油。该碳源的总初始浓度可为能提供合适的链霉菌生长并产生所需浓度的谷氏菌素的任何浓度，且可藉由实验测定(测定发酵肉汤中的谷氏菌素的最终浓度，取决于所用的碳源的浓度)。总初始碳源浓度可为，例如在约10克/升至约150克/升的范围内，例如约10克/升、约20克/升、约30克/升、约40克/升、约50克/升、约60克/升、约70克/升、约80克/升、约90克/升、100克/升、约110克/升或约120克/升。在一些实施方案中，该碳源可为二或多种碳源的混合物，例如葡萄糖与多糖(诸如淀粉)的混合物、葡萄糖和寡糖(诸如糊精或麦芽糖糊精)的混合物，或葡萄糖、淀粉和糊精的混合物。在一些实施方案中，该培养基含有葡萄糖和寡糖的混合物作为碳源。该寡糖可为麦芽糊精或糊精。在这类实施方案中，培养基中的初始麦芽糊精浓度可为约50克/升至约100克/升，或约60克/升至约80克/升。培养基中的初始葡萄糖浓度可为约20克/升至约80克/升，例如约30克/升、约40克/升、约50克/升、约60克/升或约70克/升。在其中使用葡萄糖与麦芽糖糊精或糊精作为碳源的其它实施方案中，该葡萄糖浓度可为约20克/升至60克/升、或约30克/升至约50克/升。

任何可消化氮源均可用于本文所描述的发酵过程中。该氮源可为单独的来源或来源的混合物。在一些说明性实施方案中，该氮源(至少部分地)是选自下列组：大豆蛋白胨、大豆酸水解产物、大豆粉水解产物、酪蛋白水解产物、酵母提取物、及它们的混合物。该氮源的总初始浓度可为能提供合适的链霉菌生长并产生所需浓度的谷氏菌素的任何浓度，且可藉由实验测定。例如，培养基中的合适的总浓度可在约10克/升至约60克/升的范围内，例如约20克/升、约30克/升、约40克/升、约50克/升。在一些说明性实施方案中，该氮源可能为酪蛋白水解产物与大豆粉水合物的混合物、或酵母提取物与大豆酸水解产物的混合物，其中，例如培养基中所使用的酵母提取物的浓度(或量)为10克/升，且所使用的大豆酸水解产物的浓度/量为20克/升。

该培养基可进一步含有钙源，诸如氯化钙或碳酸钙。若存在时，该培养基中可含有钙源，诸如初始浓度为约1克/升至3克/升的碳酸钙。

需注意的是，在此背景下，除非另有说明，所给予的该培养基中的所有成分的浓度为发酵开始时的浓度(初始浓度)。该浓度是依据用于发酵的接种后体积。此处所给予的初始浓度可经由在发酵过程中连续补入营养素来保持，或者，仅在发酵开始时添加成分(碳源、氮源、氨基酸)。然而，该培养基/发酵肉汤的pH值通常是经由添加合适的酸(诸如硫酸或柠檬酸)和/或合适的碱(诸如氢氧化钠或氨溶液或氢氧化钾)来连续监测和控制。适当的pH值可以根据经验来确定。在典型的实施方案中，该培养基/发酵肉汤的pH值是在6.5至7.5的范围内，例如6.8至7.0。处理参数，诸如温度及通气速率通常在发酵过程的整个过程中均受到控制。由于链霉菌菌株的培养是在有氧条件下进行，该发酵肉汤通常是以空气、富含氧的空气，或者，若需要时，纯氧通气。所选择的温度通常是在20℃至30℃的范围内，然而，此处还考虑更高的温度。还可持续添加标准的发酵试剂，诸如消泡剂。发酵肉汤可使用常规的大规模微生物发酵过程制造，诸如深层发酵、固态发酵或液体表面培养，包括，例如美国专利第3,849,398号；英国专利第GB 1507193号；Toshiko Kanzaki et al.,Journal of Antibiotics,Ser.A,Vol.15,No.2,1961年6月，93至97页；或Toru Ikeuchi et al.,Journal of Antibiotics,(1972年9月)，548至550页中所描述的方法。

任何产谷氏菌素的链霉菌菌株均可用于制造本文所公开的含有谷氏菌素的发酵肉汤。在说明性实施方案中，该链霉菌菌株为细黄链霉菌菌株、紫红链霉菌菌株、或禾粟链霉菌菌株。该细黄链霉菌菌株可为例如细黄链霉菌菌株NRRL B-50550，或由其衍生的杀植食性螨突变株。此外，能够产谷氏菌素(即使以低水平)的亲代菌株，诸如各种链霉菌(包括，但不限于细黄链霉菌、紫红链霉菌及禾粟链霉菌)和芽孢杆菌可经过诱变以增强谷氏菌素的产生。实施例14中描述了一种用来制造这类突变体并产生含有至少1克/升谷氏菌素的发酵肉汤的方法。

选择发酵期间特定的碳源和氮源及其他营养素可用来优化谷氏菌素的产生。用于增进谷氏菌素的产生的合适碳源为淀粉、麦芽糖糊精、糊精、糖和葡萄糖。在一个特定的实施方案中，使用葡萄糖与寡糖的组合物作为碳源和/或前体。用于增进谷氏菌素的产生的合适氮源为大豆蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、大豆蛋白胨、酵母提取物，及其他营养素较不丰富的氮源。其它合适的氮源包括氨基酸和/或谷氏菌素前体，诸如甘氨酸、谷氨酸(包括L-谷氨酸)、天冬氨酸(包括L-天冬氨酸)、丝氨酸(包括L-丝氨酸)及胞嘧啶。胞嘧啶可以具有高浓度的胞嘧啶的培养基组分(诸如具有高核碱基含量的酵母提取物)的一部分的形式添加。能够制造具有提高的谷氏菌素水平的发酵肉汤的发酵培养基实例提供于实施例11、12和13中。

在另一实施方案中，本发明的发酵产物(例如发酵肉汤或发酵固体)具有至少40％、至少50％、或至少60％的效力，其中该效力是依下述方法测定的。将发酵产物在水表面活性剂溶液中稀释(使用表面活性剂产品标签上建议的表面活性剂的量)以取得5％的全肉汤(或者，若处理衍生自全肉汤的发酵固体时，则为如下述的全肉汤同等物)。将该稀释的溶液施用在叶子(诸如利马豆的叶子)顶部和底部表面直到两个表面均湿润，但不要施用至流掉。让植物干燥，然后以10-20只二斑蛛螨(Tetranychus urticae Koch)侵染。处理后四天，检查处理过的叶子并计算叶子上的存活及死亡的成年雌蹒和二期若虫。使用Sun-Shepard公式计算效力(即，经校正的死亡率)。校正％＝100(经处理的小块地区中％降低±未经处理的群体中的变化％)/(100±未经处理的群体中的变化％)。在此施用中，藉由上述方法计算的效力将称为“蛛螨效力”。

在一些实施方案中，使用本发明的组合物处理各种各样的农业和/或园艺作物，包括那些长成以供结籽、生产、园林绿化者，以及那些长成以供生产种子者。可使用本发明的组合物处理的代表性植物，包括，但不限于下列：芸苔属蔬菜、鳞茎类蔬菜、谷物、柑橘、棉花、葫芦科植物、果菜类、叶菜类、豆类、油籽作物、花生、梨果、根类蔬菜、块茎类蔬菜、球茎类蔬菜、核果、烟草、草莓和其他浆果，及各种观赏植物。

本发明的组合物可以叶面喷雾、土壤处理剂、和/或种子处理剂/敷料的形式施予。在一个实施方案中，当作为叶面处理剂时，每英亩施用约1/16至约5加仑的全肉汤。在一个实施方案中，当作为土壤处理剂时，每英亩施用约1至约15加仑，或约1至约5加仑的全肉汤，或根据欲处理的种子大小和该发酵产物(诸如冻干产物)中的菌落形成单位的浓度，为约0.1毫克至约14毫克、或约0.2毫克至约10毫克、或约0.2毫克至约8毫克发酵产物。当作为种子剂时，每英亩施用约1/32至约1/4加仑的全肉汤。为了处理种子，该最终配方每克含有至少1×10⁸个菌落形成单位。

在一些实施方案中，将本发明的组合物施用在植物、植物部分或植物位点之前先鉴定需要处理的位点。

将微生物(例如细黄链霉菌NRRL B-50550或其杀植食性螨突变株)的发酵产物，诸如全肉汤培养或发酵固体(包括冻干粉末)/毫升稀释并施用于植物叶面。施用率是以每英亩的加仑数或磅数来提供，且可按比例调整为较小量的施用(诸如实施例中所描述的微小区试验)。如实施例中所描述的，在较大量的施用方面，该发酵产物是在施用前在100加仑的水中先稀释。在一个实施方案中，将每英亩约0.5加仑至约15加仑、约1加仑至约12加仑、或约1.25加仑至约10加仑的全肉汤培养物(在水中稀释及，可选择地，表面活性剂)施用在植物叶面。在另一实施方案中，将冻干粉末(在水中稀释及，可选择地，表面活性剂)以每英亩约0.2磅至约8磅、约0.4磅至约7磅、或约0.4磅至约6磅的比率施用于植物叶面。在一个特定的情况中，该发酵产物具有至少约40％、至少约50％、或至少约60％的“蛛螨效价”。在另一情况中，该发酵产物为具有约0.5％至约15％的谷氏菌素、约1％至约12％的谷氏菌素、或约2％至约10％的谷氏菌素的发酵粉末(包括喷雾干燥或冷冻干燥的粉末)，其中所有百分比为重量比。在另一情况中，该发酵产物为具有约0.01％至约0.5％(重量/重量)的谷氏菌素的发酵肉汤。

在一个特殊的实施方案中，将每英亩1.25磅的发酵产物，诸如冻干粉末或喷雾干燥粉末(在水中稀释及，可选择地，表面活性剂)施用在植物叶面。在这些实施方案中，该最终用途的配方是基于每毫升含有至少约1×10⁶个菌落形成单位、每毫升含有至少约1×10⁷个菌落形成单位、每毫升含有至少约1×10⁸个菌落形成单位、每毫升含有至少约1×10⁹个菌落形成单位、或每毫升含有至少约1×10¹⁰个菌落形成单位的起始发酵肉汤。在另一实施例中，该发酵产物含有至少约1重量％的谷氏菌素、至少约2重量％的谷氏菌素、至少约3重量％的谷氏菌素、至少约4重量％的谷氏菌素、至少约5重量％的谷氏菌素、至少约6重量％的谷氏菌素、至少约7重量％的谷氏菌素、或至少约8重量％的谷氏菌素。

谷氏菌素基因簇、ORFs及由此编码的蛋白质

本公开内容提供位于基因座内的谷氏菌素基因簇的核酸序列、其中所含的ORFs及由其编码的蛋白质。此信息使能例如能够分离出诸如在其他链霉菌属中的编码谷氏菌素基因簇的同系物的相关核酸分子及对应的ORFs。本公开内容进一步使得能够制造由谷氏菌素基因簇或其部分编码的蛋白质(包括，但不限于GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM和/或GouN)的变体，及编码这些变体的核酸分子。

包含在从细黄链霉菌菌株鉴定出的SEQ ID NO：43内的谷氏菌素基因簇(核苷酸残基1-21933)包括24个ORFs，称为ORFs 4248至4271。ORFs 4251、4252、4253、4255、4256、4257、4258、4259、4261、4262、4263、4264、4265和4271分别为13个基因gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM及gouN。需注意的是SEQ ID NOs：89-100(从紫红链霉菌菌株鉴定的)分别提供直系同源基因gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM。这些基因的潜在功能及其在谷氏菌素合成反应中可能的作用提供于表2中。

藉由本文所提供的所公开的基因座的序列(SEQ ID NO：43)及其中所含的ORF，可采用体外核酸扩增(包括，但不限于PCR)作为用于制造编码一或多种上述表1中所列的谷氏菌素生物合成蛋白质的核酸序列的简单方法。下文中提供用于以此方式制备编码蛋白质的核酸分子的代表性技术。

藉由本领域技术人员所熟知的各种方法中的任一着从细胞中提取RNA或DNA。Sambrook，等人(在Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989中)及Ausubel，等人(在Current Protocols in Molecular Biology,GreenePubl.Assoc.and Wiley-Intersciences,1992中)提供用于分离RNA或DNA的方法的代表性描述。谷氏菌素生物合成酶至少在细黄链霉菌中表达。因此，在一些实例中，可从细黄链霉菌细胞提取RNA或DNA。提取出的RNA可用于，例如作为用于进行逆转录(RT)-PCR扩增的模板以制造cDNA。用于RT-PCR的代表性方法和条件描述于Kawasaki，等人(在PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Inniset al.(eds.)21-27Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1990中)。

扩增引物可根据欲扩增的DNA部分选择。在一个实施方案中，引物可经过选择以扩增DNA片段(例如特定ORF或一组相邻的ORFs)，或者，在另一实施方案中，整个DNA分子。为了适应具不同长度和组成的引物和扩增子，可能需要改变扩增条件。这类考虑为本领域所熟知且讨论于，例如在Innis，等人(PCR Protocols,A Guide toMethods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1990))中。举例而言，编码选择的谷氏菌素生物合成蛋白质的核酸分子(诸如gouA至gouN中任一个，或其组合)可使用针对原型细黄链霉菌gouA、gouB、gouC、gouD、gouE、gouF、gouG、gouH、gouI、gouJ、gouK、gouL、gouM和/或gouN序列的5’-及3’-端的引物扩增。可理解的是，从所提供的核酸序列可衍生出许多不同的引物。建议将藉由任何扩增程序获得的扩增产物重新测序，以便于确认该经扩增的序列，并提供谷氏菌素与经扩增的序列之间的自然变异的信息。从任一谷氏菌素序列衍生的寡核苷酸可用于对例如该对应的谷氏菌素(或谷氏菌素相关的)扩增子测序。

此外，可采用常规杂交和PCR扩增程序二者来克隆编码该谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORFs(例如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27，29、31、33、35、37、39及41中一或多种)的直系同源物。此两种技术的共通点为衍生自具有或不具有上游和下游侧翼区的谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORF核酸序列的探针或引物的杂交。此外，杂交可以是Northern印迹、Western印迹或PCR。

直接PCR扩增可在从所讨论的细菌菌种制备的DNA文库上进行，或者可采用标准方法，使用从细菌细胞提取的RNA进行RT-PCR。PCR引物将包含谷氏菌素基因簇(带有或不带有上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF核酸序列的至少10个连续核苷酸。本领域技术人员将会理解，介于谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORF核酸序列与欲扩增的靶核酸序列之间的序列差异可能会导致扩增效率较低。为了弥补此点，可在扩增循环期间使用较长的PCR引物或较低的退火温度。每当使用较低的退火温度时，使用巢式引物对的扩增顺序循环对增进扩增特异性可能有用。

所公开的谷氏菌素生物合成蛋白质的直系同源物可能存在在一些其他链霉菌属的成员中、细黄链霉菌种的其他菌株中，及其他产谷氏菌素的生物体中。藉由提供该公开的谷氏菌素基因簇和其ORFs4251-4253、4255-4259、4261-4265和4271，以及邻接和***的ORFs4248-4250和4266-4270的核酸序列，能够藉由标准方法克隆这些其它生物体中的编码蛋白质的DNA(诸如ORFs)和编码谷氏菌素生物合成酶直系同源物的基因簇。该公开的谷氏菌素生物合成酶和蛋白质的直系同源物具有如本文所公开的生物活性或功能，包括，例如胞嘧啶合成酶(ORF 4258；gouG；SEQ ID NO：15和16)或CGA合成酶(ORF4261；gouI；SEQ ID NO：21和22)。

直系同源物通常与编码所公开的谷氏菌素生物合成蛋白质的核酸序列(例如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41中一或多种)共享至少65％序列同一性。在特定的实施方案中，当适用时，直系同源的谷氏菌素基因簇或谷氏菌素ORFs可能与该公开的细黄链霉菌或紫红链霉菌核苷酸或氨基酸序列共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％，至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。

在常规的杂交技术方面，较佳地，将杂交探针与可检测的标记(诸如放射性标记)缀合，且该探针的长度较佳为至少10个核苷酸。如本领域中众所周知的，增加杂交探针的长度倾向增进特异性。使用本领域中已知的方法可将自谷氏菌素基因簇或自谷氏菌素ORF核酸序列衍生的经标记的探针与细菌DNA文库杂交，并检测杂交信号。该杂交的集落或噬斑(取决于所使用的文库的类型)可经过纯化，并分离和鉴定包含在该菌落或噬斑中的克隆的序列。

在特定的实例中，可使用各种市售(例如Stratagene、Epicentre)的柯斯质粒(cosmid)或福斯质粒(fosmid)***迅速地构建基因组文库。有利的是，这些***将该经克隆的DNA的不稳定性降至最低。在这类实例中，筛选基因组文库后，再接着分离柯斯质粒或福斯质粒，将其分组成重迭克隆的族群，并分析以建立群簇身份。柯斯质粒末端定序可用于依据从天然产物结构及其经推测的生物合成来源预测的预期通路特征取得关于特定克隆的相关性的初步信息。

或者，可藉由免疫筛选表达文库来取得谷氏菌素基因簇(+/-上游或下游侧翼区)或谷氏菌素ORF核酸序列的直系同源物。藉由本文中提供的公开的基因座(SEQ ID NO：43)，可在异源表达***(例如大肠杆菌)中表达并纯化对应的蛋白质，并使用其产生特异于谷氏菌素生物合成酶或蛋白质(诸如GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL、GouM和/或GouN)的抗体(单克隆或多克隆抗体)。还可能产生针对从本文呈现的谷氏菌素氨基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、和42、和/或SEQ ID NO：77-88)所衍生的合成肽的抗体。产生抗体的方法为本领域所周知，且大致描述于Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor,1988中。这类抗体可用于筛选从细菌制造的表达文库。例如，此筛选将可鉴定谷氏菌素直系同源物。所选定的DNA可藉由测序和酶活性分析确认。

衍生自谷氏菌素基因簇(SEQ ID NO：43)或编码该基因簇的ORFs的核酸序列(SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、和41)、或这些核酸序列的片段的寡核苷酸包含在本公开内容的范围内。这类寡核苷酸可作为例如探针或引物使用。在一个实施方案中，寡核苷酸可包含具有谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF核酸序列的至少10个连续核苷酸的序列。若将这些寡核苷酸与体外扩增程序(诸如PCR)一起使用，延长寡核苷酸可增进扩增特异性。因此，在其他实施方案中，可使用包含这些序列中至少15、20、25、30、35、40、45、50、或更多个连续寡核苷酸的寡核苷酸引物。在另一个实例中，包含编码谷氏菌素生物合成酶的核酸分子(诸如，例如SEQ ID NO：15或21)的30个连续核苷酸的引物将以比仅具有15个核苷酸的对应引物更高的特异性退火至靶序列，诸如谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或存在于来自另一链霉菌种(或其他产谷氏菌素的物种)的DNA文库中的谷氏菌素同系物。为了取得更高的特异性，可选择包含谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF核苷酸序列中至少17、20、23、25、30、35、40、45、50或更多个的探针和引物。在特殊的实例中，探针或引物可具有所公开的谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF序列的至少100、250、500、600或1000个连续核苷酸。

寡核苷酸(诸如引物或探针)可从所公开的谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF核酸序列的任何区域获得。举例而言，谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)或谷氏菌素ORF序列可根据序列长度被分成约二分、三分、或四分，且该分离的核酸分子(例如寡核苷酸)可衍生自该分子的一半或另一半、该三个三分之一中的任一者、或该四个四分之一中的任一者。感兴趣的核酸序列还可被分到为具类似效果的较小区域，例如约八分、十六分、二十分、五十分，等。或者，其可被分成编码保守结构域的数个区域。

藉由本文提供的谷氏菌素生物合成蛋白质及对应的核酸序列，能够创建这些序列的变体。变异型谷氏菌素生物合成酶包括其氨基酸序列与所公开的原型酶不同、但仍然保留如表1中所列的原型蛋白的生物活性/功能的蛋白质。变异型酶还可能不具有其制造谷氏菌素的生物合成前体或新颖类似物的活性/功能。

在一个实施方案中，变异型谷氏菌素生物合成蛋白质包括其氨基酸序列与所公开的谷氏菌素生物合成蛋白质序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及42、和/或SEQ ID NO：77-88)不同，但与这类酶序列共享至少65％氨基酸序列同一性的蛋白质。在其它实施方案中，其他变异体将共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。可使用标准程序(例如定点诱变或PCR)操纵所公开的谷氏菌素基因簇(+/-上游和下游侧翼区)及谷氏菌素ORF核苷酸序列，以制造这类变体。最简单的修饰涉及以一或多个氨基酸取代具有类似的生化性质的氨基酸。这些所谓的保守取代对所产生的蛋白质的活性可能具有最小的影响。

谷氏菌素的生物合成制造方法

用于创建谷氏菌素的生物合成方法由于能有效制造谷氏菌素且可同样用于制造谷氏菌素及其类似物因而很有用。因此，在异源宿主，诸如大肠杆菌或其它链霉菌属物种中克隆和表达谷氏菌素生物合成基因簇或由此而来的ORF可用来增加谷氏菌素、谷氏菌素前体、谷氏菌素中间体、或包含在该基因簇中的酶或蛋白质的产生。此外，基因重组和结构域交换构建体可允许创建使用常规合成方法将很难制造的谷氏菌素结构。

在一个实施方案中，重组表达***选自原核宿主。细菌细胞可从许多来源取得，包括本领域技术人员已知的公共来源，诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC；维吉尼亚州Manassas)。用于重组蛋白表达的细胞的商业来源还提供这类细胞用法的说明。

一种用于表达谷氏菌素基因簇的代表性异源宿主***是链霉菌属。在特定的实例中，链霉菌属已被用作人工宿主来表达非常大尺寸的天然产物生物合成基因簇(见，例如Stutzman-Engwall andHutchinson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3135-3139,1989；Motamedi and Hutchinson Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4445-4449,1987；Grim et al.Gene 151:1-101994；Kao et al.Science 265:509-512,1994:及Hopwood et al.Meth.Enzymol.153:116-166,1987)。链霉菌属为有用的异源宿主***，因为其容易生长，用于表达和/或整合生物合成基因簇的质粒和柯斯质粒己被完善表征且其具有产生功能性途径所需的修饰酶和辅助酶中的许多种(Donadio et al.J.Biotechnol.99:187-198,2002)。具有分段菌丝体的宿主细胞可能表达出保持低黏度的优点；宿主细胞的其他有利特点(除了表达大量谷氏菌素的能力外)包括快速生长及在简单底物上生长。

另一用于表达谷氏菌素基因簇(或一或多个其ORFs)的代表性异源宿主***为大肠杆菌。大肠杆菌为具有吸引力的人工表达***，因为其生长快速且易于以遗传工程方式操作。以大肠杆菌为基础的表达***的最新进展大大促进了在单一宿主生物体中同时表达多个基因。来自复杂的生物合成***的多个ORFs现在可以同时在大肠杆菌中表达。

然而，表达***的选择将取决于表达的多肽所需的特性。任何可转导的克隆载体均可用作目前公开的核酸构建体的克隆载体。若欲表达大的基因簇，较佳地，使用噬菌粒、柯斯质粒、福斯质粒、P1s、YACs、BACs、PACs、HACs、或类似的克隆载体来将核苷酸序列克隆入宿主细胞中。分别与M13噬菌体及λ噬菌体比较，这些载体的好处是能够***较大的DNA片段并稳定地增殖。

在一个实施方案中，可使用本领域技术人员已知的方法将一或多种公开的ORFs和/或其变体***一或多个表达载体中。使用载体将谷氏菌素生物合成基因或谷氏菌素基因簇引入宿主细胞中。原核宿主细胞或其它具有坚固细胞壁的宿主细胞可使用本领域中已知的任何方法转化，包括，例如磷酸钙沉淀法或电穿孔。代表性原核转化技术描述于，例如Dower(Genetic Engineering,Principles and Methods12:275-296,Plenum Publishing Corp.,1990)及Hanahan，等人(Meth.Enzymol.204:63,1991)中。载体包括一或多个可操作地连接至所需的ORF的控制序列。然而，表达盒的选择可能取决于所选择的宿主***及表达多肽或天然产物所需的特性。通常，该表达盒包括在选定的宿主***中具有功能的启动子且可为组成型的或可诱导的。在一个实施方案中，除了所需的DNA分子和终止密码子外，该表达盒包括启动子、核糖体结合位点、起始密码子(若需要时)，及任选地编码前导肽的区域。另外，3’末端区(翻译和/或转录终止子)可被包含在该表达盒内。构造在DNA分子中的ORF可能仅受启动子控制，从而使转录和翻译发生在宿主细胞中。启动子编码区是本领域技术人员众所周知并且可获得的。启动子的实施例可包括细菌启动子(诸如那些衍生自糖代谢酶者，诸如半乳糖、乳糖、麦芽糖)、衍生自生物合成酶的启动子序列，诸如色氨酸、β-内酰胺酶启动子***、噬菌体λPL，及TF和病毒启动子。

表达盒内存在额外的调控序列可能有利于调控一或多个ORFs相对于宿主细胞生长的表达。这些调控序列为本领域所熟知。调控序列的实例包括响应化学或物理刺激，以及增强子序列而开启或关闭基因表达的序列。除了调控序列外，可包含可选择标记以协助选择转化细胞。例如，赋予质粒抗生素抗性或敏感性的基因可用来作为可选择标记。

可设想的是，可将谷氏菌素基因簇或一或多个感兴趣的谷氏菌素ORF以个别盒的形式，藉由不同的控制组件，或受单一控制组件(例如启动子)的控制而克隆入一或多个重组载体中。在一个实施方案中，该ORFs包括二或多个限制性酶切位点以允许容易地缺失和***其他开放阅读框，从而可产生杂合合成途径。这类限制性酶切位点的设计和用途为本领域技术人员所熟知，且可经由使用上述技术，诸如PCR或定点诱变进行。由转化细胞表达的蛋白质可根据本领域技术人员所熟知的标准方法回收。例如，可加上常规的标签来表达蛋白质以促进分离。此外，可使用结合多肽的配体，藉由亲和层析法来纯化所产生的多肽。

进一步考虑藉由前面针对产谷氏菌素所述的发酵条件来制造各种谷氏菌素ORFs、基因簇、或感兴趣的谷氏菌素蛋白质。制造后，可藉由本领域技术人员所熟知的方法(例如高压液相色谱法(HPLC))纯化和/或分析该化合物。

本发明还包含经由以下步骤用于鉴定和/或制造杀螨和/或杀真菌的细菌产物的方法：(i)筛选链霉菌物种的菌株，(ii)选择具有与SEQ IDNO：43或者SEQ ID NO：43的核苷酸序列中编码蛋白质GouA、GouB、GouC、GouD、GouE、GouF、GouG、GouH、GouI、GouJ、GouK、GouL和/或GouM的区域具有至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、或至少约99％序列同一性的核苷酸序列的菌株，及(iii)从所选择的菌株制造杀螨发酵产物。在一些其它实施方案中，该选择步骤涉及选择那些具有编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的菌株：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。在一些实施方案中，筛选下列链霉菌物种的菌株：细黄链霉菌、灰色链霉菌、环圈链霉菌、粪生链霉菌、小链霉菌、淡紫灰链霉菌、白绿链霉菌、紫红链霉菌或禾粟链霉菌。在一些实施方案中，筛选的链霉菌种为亲代链霉菌菌株的突变体。在一个方面，这类突变体是以本申请案中描述的方式，或藉由本领域中已知的其它方法，包括实施例16中所描述的方法产生。在一些实施方案中，筛选步骤前先进行产生亲代链霉菌菌株的突变体的步骤。本文中描述了用于产生突变体的方法。在一些实施方案中，该筛选步骤还涉及制备菌株的发酵肉汤及选择还具有至少约60％的蛛螨效力的菌株。依据序列同一性的百分比，这类选择步骤可在选择步骤之前或之后发生。本文中列举了用于制造发酵产物及用于测试杀螨活性的方法。在一个实施方案中，该制造步骤(步骤(iii))的发酵产物具有浓度为至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、至少约8克/升、至少约9克/升、或至少约10克/升谷氏菌素。用于测量谷氏菌素浓度的方法为本领域技术人员所已知。

保藏信息

本发明的细黄链霉菌菌株样本已根据布达佩斯条约的规定在2011年8月19日保藏在位于61604美国伊利诺伊州皮奥里亚市北大学街1815号，美国农业部农业研究服务，全国农业利用研究中心的农业研究服务培养物保藏中心，且已指派以下保藏编号：NRRLB-50550。

细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的突变体(本文命名为细黄链霉菌菌株M，还称为AQ6121.002)的样本已根据布达佩斯条约的规定在2013年9月27日保藏在位于61604美国伊利诺伊州皮奥里亚市北大学街1815号，美国农业部农业研究服务，全国农业利用研究中心的农业研究服务培养物保藏中心。此菌株还根据布达佩斯条约的规定在2013年10月8日保藏在位于20110美国维吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，美国典型培养物保藏中心。此菌株还在2013年10月9日保藏在位于R3E 3R2加拿大曼尼托巴省温尼伯阿灵顿街1015号的加拿大国际保藏管理局且已被指派编号091013-02。

本文中称为紫红链霉菌菌株A(还称为AQ7439)的紫红链霉菌菌株样本已根据布达佩斯条约的规定在2013年10月8日保藏在位于20110美国维吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，美国典型培养物保藏中心。此菌株还在2013年10月9日保藏在位于R3E 3R2加拿大曼尼托巴省温尼伯阿灵顿街1015号的加拿大国际保藏管理局且已被指派编号091013-01。

下列实施例仅用于举例说明，而非用于限制本发明。

实施例1-选择细黄链霉菌NRRL B-50550

菌株是取自内部菌株收集处，并进行初步筛选试验以测定潜在候选菌株对抗二斑蛛螨(“TSSM”)(此为常用来筛选一般杀螨活性的典型生物体)的效力。先选择具有有利于实验室或人工培养的性质的微生物，诸如在琼脂盘上生长迅速的变体。将选定的菌株的培养贮存物生长在适合各菌株的培养基中，诸如实施例2中描述的培养基1和培养基2。使用水和0.03％的表面活性剂BREAK-THRU FIRST聚醚-聚甲基硅氧烷共聚物将由此产生的发酵产物(全肉汤)稀释成25％溶液。然后，将8毫升稀释后的发酵产物施用于两株植物的利马豆叶(该利马豆植物为1至1.5周龄)的顶部和底部直至滴落。经过这类处理后，在同一天，以50-100只TSSM侵染植物并留置在温室中五天。在第五天以1至4的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。使用杀螨剂(阿维菌素，Syngenta)作为阳性对照组。在螨和卵方面，1表示100％死亡率，1.5表示90％至95％死亡率，2.0代表75％至90％死亡率；2.5代表40％至55％死亡率；3.0代表20％至35％死亡率，且4.0代表0％至10％死亡率。除了NRRL B-50550外，其他链霉菌菌株及一些芽孢杆菌株也被发现具有对抗螨类的活性。

为了进一步选择，除其他活性外，检查筛选出的菌株的UV稳定性和透层活性，因为杀蹒剂应该对UV光稳定且拥有透层活性以有效施用于田野。

为了评估UV稳定性，将上述的发酵产物的25％稀释液喷洒在利马豆植物的上表面上。经过这类处理后，在同一天，以50-100只TSSM侵染植物并暴露在紫外线下24小时，再留置在温室中五天。藉由施放在叶片并作为不让螨逾越的界限的凡士林环将螨虫限制在叶子的近轴(上方)表面。依上述，在第五天以1至4的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。使用杀螨剂(阿维菌素，Syngenta)及(螺甲螨酯(spiromesifen)，Bayer CropScience AG)作为对照组。结果显示于图1中。菌株NRRL B-50550的发酵产物在所有测试菌株中显示出最佳的紫外线稳定性。

为了评估透层活性，依上述培养菌株，并使用水和0.35％表面活性剂将所得的全肉汤稀释且施用于两株植物的利马豆叶的下表面直至滴落。处理后一天，将50-100只TSSM放置在叶子的上表面上并依上述使用凡士林环/物理屏障将其包含在内，以侵染处理过的叶子的上表面。在第六天，依上述的1至4的级别评估植物上存在的螨虫和卵。使用杀螨剂(阿维菌素，Syngenta)及(螺甲螨酯，Bayer CropScience AG)作为对照组。结果显示于图2中。菌株NRRLB-50550的发酵产物显示出所有测试菌株中最佳的透层活性。

实施例2-抗蛛螨活性

进行进一步测试以更严密地测定细黄链霉菌菌株NRRL B-50550对抗二斑蛛螨(“TSSM”)的效力。将细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的培养贮存液生长在28℃，1升摇瓶中的培养基1或培养基2中5天。培养基1是由2.0％淀粉、1.0％右旋糖、0.5％酵母提取物、0.5％酪蛋白水解产物及0.1％碳酸钙所组成。培养基2是由2％ProFlo棉籽粉、2％麦芽提取物、0.6％磷酸二氢钾及0.48％磷酸氢二钾所组成。使用水和0.03％表面活性剂BREAK-THRU FIRST(聚醚-聚甲基硅氧烷共聚物)将由此产生的发酵产物稀释成25％溶液，取6毫升施用于两株植物的利马豆叶的顶部和底部直至滴落。经过这类处理后，在同一天，以50-100只TSSM侵染植物并留置在温室中五天。在第六天，以1至4的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。使用杀螨剂(阿维菌素，Syngenta)作为阳性对照组。在螨虫和卵方面，1表示100％死亡率，1.5表示90％至95％死亡率，2.0代表75％至90％死亡率；2.5代表40％至55％死亡率；3.0代表20％至35％死亡率且4.0代表0％至10％死亡率。结果显示于下列表3中。细黄链霉菌NRRLB-50550的两种发酵产物造成螨虫90％或更高的死亡率。

表3

针对杏仁中的太平洋蛛螨、葡萄中的太平洋蛛螨及草莓中的二斑蛛螨进行的田野试验确认了上述的温室结果。针对杏仁中的太平洋蛛螨的田野试验结果报告于下列表4-6中。使用杀螨剂(阿维菌素，Syngenta)作为阳性对照组。在含有培养基1的摇瓶中接种NRRL B-50550的冷冻培养物并在28-30℃下生长1-2天。使用所产生的发酵产物接种含有以下培养基的20升生物反应器：6.0％淀粉、3.0％右旋糖、1.5％酵母提取物和1.5％酪蛋白水解产物，及0.3％碳酸钙。将此培养基在28℃之间发酵7天。将所产生的全肉汤制成冻干粉(“FDP”)与佐剂，0.03％的BREAK-THRU FIRST(聚醚-聚甲基硅氧烷共聚物)混合后用于试验中。

表4:抗成年螨的活性

表5:抗幼螨的活性

表6:抗螨卵的活性

实施例3-对抗柑橘螨虫的田野活性

进行田野试验以测定NRRL B-50550对抗巴伦西亚橙上的柑桔锈螨(柑橘锈瘿螨(Phyllocoptruta oleivora))的效力。在含有培养基1(见实施例2)的摇瓶中接种NRRL B-50550的冷冻培养物并在20-30℃下生长1-2天。重复此过程。使用所产生的发酵产物接种含有以下培养基的20升生物反应器：6.0％淀粉、3.0％右旋糖、1.5％酵母提取物、2.0％大豆水解产物、0.6％甘氨酸，及0.2％碳酸钙。将此培养基在28℃之间发酵8天。使用所产生的全肉汤创建冻干粉末(“FDP”)，用于下列试验中。将冻干粉末在水中稀释，并依下表7中所显示的比率，以100加仑/英亩施用。使用杀螨剂(螺甲螨酯，BayerCropScience，德国)作为阳性对照。在处理1-3中，以0.66％体积/体积的比率添加BREAK-THRU FIRST佐剂(聚醚-聚甲基硅氧烷共聚物，见上文)。以0.625磅/英亩的比率施用的发酵产物显示出较以16液盎司/英亩的比率施用的螺甲螨酯更佳的杀螨活性。

表7

实施例4-对抗其他螨虫的活性

研究显示出NRRL B-50550具有对抗各种其他螨虫，包括瘿螨(eriophyid)(赤褐色)及广明螨的活性。依实施例2中所描述的用于田野试验的方法制备发酵肉汤。使用水和0.35％表面活性剂将所产生的发酵肉汤稀释成各种浓度，再将10毫升的稀释肉汤施用于两株植物的利马豆叶的顶部和底部直至滴落。在处理的同一天以赤褐色螨侵染植物，并在处理后六天依上述的级别评估赤褐色螨的存在情形。评分为4表示没有控制且在评估时存在至少100只赤褐色螨。使用杀螨剂(阿维菌素)作为阳性对照组。

表8

实施例5-残留活性

其他研究揭示NRRL B-50550具有残留活性。在含有实施例2的培养基1的摇瓶中接种基于Luria肉汤的NRRL B-50550培养物(其已接种NRRL B-50550的冷冻培养物)并在28℃下生长1-2天。使用所产生的发酵产物接种含有以下培养基的20升生物反应器：8.0％右旋糖、1.5％酵母提取物、1.5％酪蛋白水解产物及0.1％碳酸钙。将培养基在28℃之间发酵7-8天。使用水和0.35％表面活性剂将所产生的发酵产物稀释成3.13％溶液，再将8毫升稀释后的肉汤施用于两株植物的利马豆叶的顶部和底部直至滴落。在这类处理后六天，以50-100只TSSM侵染植物，并在处理后12天依上述的级别评估存在的螨虫和卵。使用杀螨剂(阿维菌素)作为阳性对照组。结果显示于下表9中。

表9

除了对初次接触经过处理的植物的螨虫的作用外，还评估对那些可能在稍后的时间点迁移至处理过的叶子上的螨虫的效果。在第0天，以依类似于实施例13中描述的方式制造的6.25％或1.56％全肉汤处理全部植物。然后，在处理后以一周的时间间隔将螨虫加入植物群体中。此处理组包括用于比较的其他杀螨剂。处理后，每周添加一次螨虫，共5周。活性在该5周的期间内持续维持着且活性降低的速率类似(螺甲螨酯)产品，并略快于产品。此研究还显示出，当处理利马豆植物的初生叶时，稍后冒出的叶子不受保护。

实施例6-透层活性

进行研究以测定NRRL B-50550是否具有透层活性。依实施例5中的描述制备全肉汤。使用水和0.35％表面活性剂将所得的全肉汤稀释，将10毫升的稀释肉汤施用于两株植物的利马豆叶的下表面直至滴落。处理后一天，将50-100只TSSM放置在叶子的上表面上并使用放置在该叶片的上表面上的凡士林环/物理屏障将其包含在内以侵染该经过处理的叶子的上表面。处理后五天依上述的级别评估存在于植物上的螨虫和卵。结果显示于下列表10中。

表10

实施例7-杀卵活性

依下述测试NRRL B-50550的杀卵活性。依实施例5中的描述制备全肉汤。在处理前48小时，允许成年雌螨在叶片表面上产卵，以TSSM卵预侵染两株利马豆植物。然后，以8毫升全肉汤的各种稀释液处理植物。处理后5天评估植物。存在于各处理组和对照组中的存活和死亡的卵的数目显示于下列表11中。

表11

实施例8-浸液活性

使用生长在泥沙中的利马豆研究NRRL B-50550的浸液活性。依实施例3中的描述制备全肉汤。将每次10毫升的12.5％全肉汤稀释液施用在泥沙二次。小心为植物浇水，以防止全肉汤从盆底滤出。全肉汤是在种植后四天和种植后五天施用。在第2次处理后三天以能动的TSSM侵染较下方的叶片。下方的叶片被侵染后9天，侵染上方的叶片。在侵染后4、5、8及11天评估下方的叶片。在侵染后2天评估上方的叶片。依据实施例2中描述的评分***的结果显示于下列表12中。

表12

实施例9-对抗真菌性植物病原体的活性

测试NRRL B-50550对抗各种植物真菌性病原体的活性。其被发现对小麦叶锈病和黄瓜白粉病均具有活性。在含有培养基1的摇瓶中接种NRRL B-50550的冷冻培养物并在20-30℃下生长1-2天。将所得的发酵产物接种在含有类似培养基的20升生物反应器中，并在28℃下生长1-2天。接着，使用所得的发酵产物接种含有以下培养基的200升发酵器：7.0％淀粉、3.0％右旋糖、1.5％酵母提取物、2.0％大豆酸水解产物、0.8％甘氨酸及0.2％碳酸钙。将此培养基在26℃之间发酵8天。以显示于下列表13中的在具有0.03％佐剂(BREAK-THRUFIRST聚醚-聚甲基硅氧烷共聚物)的蒸馏水中制备的各种NRRL-50550全肉汤稀释液处理六天大的小麦苗，其中以全肉汤覆盖叶子的上、下两表面并使其干燥。在这类处理后一天将小麦叶锈病的悬浮液接种在幼苗上。处理后约一周，使用0-100％控制的下列级别将植物分级，其中0％为无控制，而100％为完全控制。

表13

处理	比率	对照
			NRRL B-50550WB	20％	98.7
NRRL B-50550WB	5％	95.0
			NRRL B-50550WB	1.25％	50.0
NRRL B-50550WB	0.3125％	0.0
			NRRL B-50550上清液	20％	95.0
NRRL B-50550上清液	5％	66.7

NRRL B-50550上清液	1.25％	0.0
			NRRL B-50550上清液	0.3125％	0.0
NRRL B-50550细胞提取物	20％	50.0
			NRRL B-50550细胞提取物	5％	50.0
NRRL B-50550细胞提取物	1.25％	0.0
			NRRL B-50550细胞提取物	0.3125％	0.0
未经处理的检查		0.0
			佐剂检查		0.0

另外，当将全肉汤施用在下叶片表面上，而病原体施放在上叶片表面时，NRRL B-50550显示出对抗黄瓜白粉病的活性。

在治病试验中NRRL B-50550还显示出对抗黄瓜白粉病的活性。当植物已在微小区上形成茂密的树冠，而自然白粉病才刚刚在相邻的地基开始发展的时点，在黄瓜微小区上接种黄瓜白粉病。感染后六天，没有来自接种的疾病的可见迹象。从依类似于实施例13中所描述的方式制备的发酵肉汤取得NRRL B-50550的冻干粉末。然后，将冻干粉末与惰性成分(润湿剂、稳定剂、载体、助流剂和分散剂)一起配制，以制造可湿性粉末。该配制的产品包含75重量％的冻干粉末。将可湿性粉末在水中稀释，并以下列表14中所示的比率，以100加仑/英亩的比率施用。(注意，每英亩100加仑换算为每一微小区为200毫升的喷雾量)。依据上述的相同级别分级。

表14

实施例10-玉米根虫活性

进行测试，以测定NRRL B-50550对抗玉米根虫的效力。依实施例2中的描述在培养基1或培养基2中制备NRRL B-50550全肉汤。将NRRL B-50550全肉汤稀释并喂予西斑黄瓜甲虫(黄瓜十一星叶甲)，以在微量滴定盘中进行以饮食为基础的分析。依实施例2中的描述评估活性并在1至4的级别上评定等级。使用杀白蚁剂/杀虫剂SC(5-氨基-1-(2,6-二氯-4(三氟甲基)苯基)-4-((1,R,S)-(三氟甲基)亚磺酰基)-1-H-吡唑-3-甲腈，俗称氟虫腈(fipronil)BASF)作为阳性对照组。结果显示于表15中。NRRL B-50550显示出与杀虫剂SC(其包含活性成分氟虫腈)相同的杀虫活性。

表15

实施例11-剂量/反应实验室分析

进行研究以测定TSSM对不同剂量的NRRL B-50550的反应。依实施例5中的描述制备全肉汤。使用水和0.35％表面活性剂将所产生的全肉汤稀释成如下表13中所示的百分比。使用水和0.35％表面活性剂作为对照处理组。在两个分开的试验中，将全肉汤溶液和对照处理组施用于利马豆叶的下表面直至滴落，每一剂量重复四次。经过这类处理后，以50-100只TSSM侵染植物，并在处理后五天以上述的级别评估螨虫和卵的存在情形。结果显示于下列表16中。

表16

％全肉汤	螨分级	死亡率
			0.20	3.55	15％
0.39	3.17	25％
			0.78	2.11	70％
1.57	1.52	90％
			3.13	1.22	95％

依据处理的误差线，与对照处理组相比较时，在测试的最低浓度(0.20％全肉汤)下可观察到明显的死亡率。据观察，与施用NRRLB-50550相关的部分效果为其造成螨虫离开植物。因此，即使在亚致死剂量下，NRRL B-50550可能减少植物上的螨虫群体。

实施例12-对抗具阿维菌素抗性的蛛螨的活性

进行研究以测定与野生型蛛螨(二点叶螨(Tetranychusurticae)RW品种)相比较时，NRRL B-50550对抗具阿维菌素抗性的蛛螨(二点叶螨NL品种)的活性。以依实施例9的最后一段制备的NRRLB-50550发酵产物的可湿性粉末处理法国豆植物，稀释后依下列表17中所示的比率施用。处理前一天，以50-100只品种NL或RW侵染植物，并在处理后7和14天评估螨虫的存在。结果显示出下列表17中。

表17

实施例13-含有提高水平的谷氏菌素的发酵产物-使用甘氨酸

进行发酵以优化谷氏菌素的产生和NRRL B-50550的杀螨活性。在2升摇瓶中，使用由10.0克/升淀粉、15.0克/升葡萄糖、10.0克/升酵母提取物、10.0克/升酪蛋白水解产物(或10.0克/升大豆蛋白胨)和2.0克/升碳酸钙所组成的培养基，在20-30℃下依实施例1中的描述制备初级种子培养物。约1-2天后，当摇瓶中长出大量菌丝后，将内容物转移到400升发酵器中的新鲜培养基(与上述者相同，具0.1％的消泡剂)中并在20-30℃下在生长。约20-30小时后，当摇瓶中长出大量菌丝后，将内容物转移到3000升发酵器中，并在由80.0克/升(8.0％)的麦芽糊精、30.0克/升(3.0％)的葡萄糖、15.0克/升(1.5％)的酵母提取物、20.0克/升(2.0％)的大豆酸水解产物、10.0克/升(1.0％)的甘氨酸和2.0克/升(0.2％)的碳酸钙和2.0毫升/升的消泡剂所组成的培养基中，在20-30℃下生长160-200小时。

表18–产率和标准化的谷氏菌素生产力

使用第一批3000升发酵作为实例，依下述计算发酵器中谷氏菌素的产量。3397公斤×1.7毫克/克发酵肉汤＝5774.90克谷氏菌素＝5.78公斤。在发酵器中的初始重量为3496公斤(3256公斤培养基+240公斤种子)，这造成最终体积多于目标体积3000升。由于目标体积3000升为用于计算生产培养基中的所有成分的量的基础，该标准化的体积生产率为：5774.9克/3000升＝1.9克/升。此谷氏菌素浓度类似于使用如上述的相同培养基，及最后的发酵步骤和含甘氨酸(作为氨基酸)的培养基进行20升发酵时所取得的1.8克/升。

在本申请案的全文中，依下列实施例16和19中的描述使用分析型HPLC层析法检测谷氏菌素水平。

实施例14-含有提高水平的谷氏菌素的发酵产物-使用谷氨酸

进行发酵以优化谷氏菌素的产生和NRRL B-50550的杀螨活性。在1升摇瓶中，使用由10.0克/升淀粉、15.0克/升葡萄糖、10.0克/升酵母提取物、10.0克/升酪蛋白水解产物(或10.0克/升大豆蛋白胨)和2.0克/升碳酸钙所组成的培养基，在20-30℃下依实施例1中的描述制备初级种子培养物。约1-2天后，当摇瓶中长出大量菌丝后，将内容物转移到1升发酵器中的新鲜培养基(与上述者相同，具0.1％的消泡剂)中并在20-30℃下在生长。约20-30小时后，当摇瓶中长出大量菌丝后，将内容物转移到20升发酵器中，在由60.0克/升(8.0％)的淀粉、30.0克/升(3.0％)的右旋糖、15.0克/升(1.5％)的酵母提取物、20.0克/升(2.0％)的大豆酸水解产物、12.0克/升(1.0％)的L-谷氨酸和2.0克/升(0.2％)的碳酸钙，及2.0毫升/升的消泡剂所组成的培养基中，在20-30℃下生长160-200小时。

使用L-谷氨酸作为氨基酸的本发酵中的谷氏菌素浓度为1.1克/升。

实施例15-含有提高水平的谷氏菌素的发酵产物-使用核苷酸

不欲受限于学理，如图6的假设合成途径所示，本申请者假设胞嘧啶的可用性对产谷氏菌素具关键性。因此，藉由在培养基中提供提高的胞嘧啶水平，所得的谷氏菌素的量也应增加。本申请者测试在添加胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶的培养基中由细黄链霉菌B-50550产生的谷氏菌素。具体地说，将细黄链霉菌B-50550在2升摇瓶中，生长在由20.0克/升的麦芽糊精、10.0克/升的葡萄糖、5.0克/升的酵母提取物、6.0克/升大豆酸水解产物、2.0克/升的甘氨酸、1.0克/升的碳酸钙和浓度各为0或0.50克/升的胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶所组成的培养基中，在20-30℃下生长6天。结果显示于下列表19中。

表19

实施例16-过量产生谷氏菌素的突变体

以增加谷氏菌素产量和生物活性为目标，透过抗生素抗性突变体筛选计划(其中产生对个别抗生素(庆大霉素、利福平、链霉素、巴龙霉素或妥布霉素)具抗性的突变体文库)从亲代菌株细黄链霉菌NRRLB-50550创建突变体。见，Okamoto-Hosoya,Y.，等人，The Journal ofAntibiotics 43(12)2000年12月。使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(“NTG”)令亲代菌株发生突变，再选择和筛选所产生的具抗生素抗性的突变体。用来选择供进一步研发的过量产谷氏菌素的菌株的突变体文库的创建和筛选方法详细说明于下。

从含有生长约14天或将形成孢子的B-50550的大豆粉麦芽糖(SFM)琼脂板制备细黄链霉菌B-50550的孢子悬浮液并储存在-80℃，20％甘油中。将溶解在合适缓冲液中的合适量NTG加入孢子悬浮液中，以取得50％杀灭(在37℃下，0.5毫克/毫升，pH为8.5，慢慢地摇动1小时)。然后，将经NTG处理的孢子悬浮液平皿接种在补充以下列浓度的抗生素的GYM(4克/升的葡萄糖、4克/升的酵母提取物、10克/升的麦芽提取物及12克/升的琼脂)上。见，下列表20。

表20

见Kieser,T.,et al.,Practical Streptomyces Genetics，第5章JohnInes Centre Norwich Research Park，英国(2000)，第99-107页。依下述分离、纯化并筛选约350个具抗生素抗性的个别菌落。

将从GYM抗生素板移出的各分离菌落重新平皿接种在SFM琼脂盘上。使用含有具抗生素抗性细菌的琼脂塞接种含有2.5毫升种子培养基的24孔积木。让在这些经接种的积木中的细菌生长3天并使用所产生的培养肉汤接种含有生产培养基的24孔积木。让在生产积木中的细菌在28℃下生长七天。在种子积木中的每个孔中含有胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(每升的DI H₂O：17克Bacto Tryptone(酪蛋白胰酶消化物)、3克Bacto Soytone(豆粕胰酶消化物)、2.5克右旋糖、5克氯化钠、2.5克磷酸氢二钾)，而在生产积木中的每个孔中含有实施例2的培养基2(Proflo 20克/升、麦芽提取物20克/升、KH₂PO₄一碱价6克/升、K₂HPO₄二碱价4.8克/升)。

依下述使用分析性HPLC层析法测试来自生产积木的每个孔的全肉汤的谷氏菌素产量。在生产积木的每个孔中加入2.4毫升水。将积木震荡混合并离心。将0.8毫升上清液转移入每孔含有4毫升水的提取积木中。将3.2毫升水加入生产积木的各孔中的细胞沉淀中，再次将积木震荡混合并离心。然后，将此3.2毫升的洗涤水加入各提取积木的适当的孔中。然后，使用分析性HPLC层析法分析提取积木中的水性提取物的谷氏菌素含量。具体而言，将样本注入安装DiamondHydride保护柱的Cogent Diamond氢化物柱(100A，4微米，150×4.6毫米)上。以30分钟的乙腈/NH₄OAC梯度(见下文)洗脱该柱。流速为1毫升/分钟。在254nm检测谷氏菌素。谷氏菌素洗脱液为单一尖峰，近似保留时间为19分钟。经由重新生长在24孔积木和250毫升培养瓶中来确认谷氏菌素水平，以确认顶尖的过量产制突变体。一旦确认后，将经确认的一些分离株再进行至少一轮以上的诱变和抗生素抗性筛选。使用在前一轮中衍生的分离株尚未对其发展出抗性的剩余抗生素来进行接下去的各轮诱变加抗生素筛选。在单轮筛选后发现谷氏菌素的产量有小量(1.2倍)增加，而随后的几轮导致从相同的原始低水平过生产者产生的分离株所产生的谷氏菌素大为增加。见图3。

令所选出的具有较高谷氏菌素产量及在SFM琼脂盘上形成孢子的能力的突变体生长在1升的带档板的摇瓶中，随后在含有培养剂2的5升Sartorius B-plus生物反应器和/或20升生物反应器中扩大规模。见图4。

选择在图3和图4中被命名为第3轮第4分离株的菌株来根据实施例13中描述的过程扩大规模。此菌株制造含有3.8毫克/克谷氏菌素的发酵肉汤。

实施例17-转换率：全肉汤至冻干粉末

表21显示出依实施例13中的描述制备的数批B-50550全肉汤从全肉汤转换成冻干粉末的转换率。这些计算假设全肉汤完全被转换成冻干粉末且全肉汤的密度为1克/毫升(注意：在任何下游加工前发酵肉汤的密度是大约1g/ml)。“平均％”为从某一批全肉汤取得的冻干粉末的平均重量百分比。

表21

实施例18-其他链霉菌菌株-发酵和用于控制螨的方法

使用类似于实施例13中所描述的那些条件培养数个链霉菌菌株。所有菌株具有编码与细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的GouA-M或GouB-M蛋白质(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：30)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的谷氏菌素生物合成基因簇。菌株的命名和根据实施例13所述方法(但以更小规模)制备的发酵肉汤的谷氏菌素浓度显示于下列表22中。(浓度以g/L表示，假设在任何下游加工前发酵肉汤的密度为约1g/ml)

表22

菌株	谷氏菌素浓度(mg/g)
		细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株B	0.1
紫红链霉菌(Streptomyces puniceus)菌株A	1.0
		紫红链霉菌(Streptomyces puniceus)菌株B	0.3

进行分开的实验，其中上述菌株在有和没有甘氨酸的发酵培养基中分别生长。添加甘氨酸使得紫红链霉菌菌株A的谷氏菌素产量加倍了，但对于细黄链霉菌菌株B或紫红链霉菌菌株B的谷氏菌素产量几乎没有影响。

使用上述实施例2中所述的二斑蛛螨(TSSM)实验室分析，采用上述以水和表面活性剂稀释的全肉汤筛选紫红链霉菌菌株A的发酵肉汤。紫红链霉菌菌株A及细黄链霉菌菌株NRRL B-50550的结果显示于下列表23中。

表23

菌株	全肉汤％	螨分级
			紫红链霉菌菌株A	6.25	1.16
紫红链霉菌菌株A	3.125	1.32
			紫红链霉菌菌株A	1.5625	1.49
NRRL B-50550	2.84	1.12
			NRRL B-50550	1.42	1.42
NRRL B-50550	0.71	1.40
			未经处理的对照		3.65

实施例19-敲除NRRL B-50550中的谷氏菌素基因簇以确认其功能

进行研究以确认该推测的基因簇负责谷氏菌素的表达。从NRRLB-50550基因组DNA产生三个构建体，其含有类似于杀稻瘟菌素的胞啶咛(cytosinine)合成酶的氨基转移酶基因(ORF 4258)、胞嘧啶葡糖醛酸合成酶基因(ORF 4261)及脱氢酶/羟基异丁酸酯(ORF 4253)(其可能涉及UDP-葡糖醛酸产生)加上编码区上游的300个核苷酸。不希望受限于学理，本申请者假设氨基转移酶基因(ORF 4258)及胞嘧啶葡糖醛酸合成酶基因(ORF 4261)在谷氏菌素生物合成途径中的相当早期是必要的。因为ORF 4258和ORF 4261在基因组中靠近彼此，还因为它们位于基因簇的中间，该脱氢酶基因(ORF 4253)可能涉及的产生UDP-葡糖醛酸的产生。本申请者假设在该途径的早期还应需要此酶。

所使用的细菌菌株和载体显示于表24中。含有用于将DNA片段分克隆到质粒载体中的限制性内切酶位点的引物提供于SEQ ID NO：44-75中。

表24:细菌菌株和载体

为了确认该谷氏菌素基因簇序列正确，设计7对用于PCR及序列确认的引物(SEQ ID NO：44-57)。依照Qiagen基因组DNA提取试剂盒方案进行PCR产物的DNA提取。用于基因组DNA和不同引物对的热循环参数为：95℃下15分钟，接着为35个循环的95℃下1分钟、58℃下1分钟及72℃下1分钟，然后为72℃下10分钟，再储存在4℃。藉由在琼脂糖凝胶上电泳来解析PCR产物(见图9)，并将PCR产物送去进行序列确认。PCR产物的大小和序列结果确认该谷氏菌素基因簇序列正确，因此，设计引物以进行敲除实验。

构建用于交换的基因盒

为了敲除特定基因，设计含有特定限制性内切酶位点的上游和下游引物(见SEQ ID NO：60-75)。在基因上游方面，正向引物使用EcoRI位点(GAATTC)，而反向引物使用KpnI位点(GGTACC)。在基因下游方面，正向引物使用XbaI位点(TCTAGA)，而反向引物使用HindIII位点(AAGCTT)位点。将卡那霉素抗性基因加在中间以作为选择标记。将所有构建体克隆入pUC 118载体(图10)。经由测定上游和下游序列来确认含有卡那霉素抗性和敲除基因，上游及下游的基因盒。以HindIII和EcoRI消化基因盒，以卡那霉素作为选择标记，克隆入pKC1139穿梭载体中：pKC1139：：C_upKI_down；pKC1139：C_upKW_down；pKC1139：I_upKI_down，pKC1139W_upKW_down(第11图)。在限制性内切酶分析、PCR和序列验证后，将基因簇电穿孔入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中。经由在安普霉素(apramycin)和卡那霉素的存在下选择来选择转化子并藉由PCR确认选择上游和下游引物。

为了确保基因的破坏，设计实验以执行单次交换同源重组。从基因组DNA扩增约1kb的HindIII/EcoRI片段并***pKC1139的HindIII/EcoRI位点，以产生pKC1139：C、pKC1139：G及pKC1139：I。

接合作用

用于本实验的供体为含有在该pKC1139穿梭载体上的敲除盒的大肠杆菌菌株(ET12567/pUZ8002)。依循用于通过细菌接合转移质粒的修改方案(解释于下文中)，该基因盒被成功地引入NRRL B-50550中。

将含有质粒pUZ8002w/pkc1139：：I_upKI_down的大肠杆菌(菌株ET12567)划线接种在卢里亚(Luria)肉汤(LB)琼脂盘上，并在30℃或37℃下培育过夜以取得单菌落。在至少两根含有10毫升LB(其中辅以25微克/毫升氯霉素Cm、25微克/毫升卡那霉素及100微克/毫升安普霉素)(LB_{Cm25k-Kan25-Aprl00})的50毫升试管中接种单菌落。令菌落在37℃，摇动培育箱中生长过夜(20-24小时)。将过夜培养物在50毫升LB_Apr100中稀释100倍，再在37℃的摇动培育箱中生长至OD₆₀₀为0.4-0.6，通常需要4-5个小时。然后，令细胞在约5000RCF和4℃下沉淀15-20分钟。将所得的上清液倾析并丢弃。将细胞沉淀尽力重新悬浮并以LB洗涤两次，以除去残留的抗生素。在沉淀的大肠杆菌细胞被洗涤时，将足量的甘油贮存孢子准备管解冻以提供细胞用于欲测试的各受体菌株/条件。由于链霉菌孢子很小且非常难以计数，使用视觉上密集的制品。此外，当洗涤细胞时，在层流罩中选择琼脂盘并放置干燥。在每一次接合时，将500微升孢子制品与500微升2×YT肉汤在无菌2.0毫升微量离心管中混合，然后在50℃下进行热休克约20分钟(实验上，热休克时间在10分钟至1小时的范围内生存能力并无可检测到的差异)。YT肉汤为较卢里亚肉汤更丰富的培养基(含有两倍于LB的酵母提取物且较LB多出60％蛋白胨)。然后，将混合物冷却至室温，再将500微升沉淀大肠杆菌细胞加入每个试管中，再充分混合。将细胞在5000RCF和室温下离心5分钟。倾空上清液。将沉淀细胞重新悬浮并平皿接种在琼脂盘上。使用4-10个12毫米的玻璃珠或Lazy L涂布器将细胞涂布开。将琼脂盘在30℃下培育过夜(16-20小时)。对于每块板，在1毫升水中制备5毫克的卡那霉素和0.5毫克的萘啶酸(来自氢氧化钠贮存物)，然后以Lazy L涂布器加至琼脂盘上以将溶液分布均匀，这需要反复涂布几分钟并风干。然后，将琼脂盘进一步培育在30℃下。培育4-6天后，选择白色卡那霉素抗性菌落进行PCR确认和谷氏菌素产量分析。

PCR确认

将选出用于进行PCR确认的白色卡那霉素抗性菌落培养在具有卡那霉素抗生素的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中，依照制造商的方案，使用ZYGEM试剂盒(来自ZyGEM股份有限公司(NZ))，使用88微升的培养、10微升的10x绿缓冲剂、1微升的prepGEM及1微升的溶菌酶来提取DNA，在37℃下培育15分钟，75℃下培育15分钟，及95℃下培育5分钟。然后，以合适的引物及下列循环参数来进行PCR：95℃下15分钟，再进行35个循环的95℃下1分钟，58℃下1分钟，及72℃下1分钟，然后在72℃下10分钟，再储存于4℃。经由在1％琼脂糖凝胶上进行电泳来解析PCR产物(图12)。

pKC1139：I为***pKC1139穿梭载体的gouI片段，其再经由单次同源交换被整合入染色体中。此方法产生侧接两个突变型等位基因的整合载体拷贝。PCR结果仍显示出gouI及gouG带(图12)。双重交换的pKC1139：IKI PCR未显示gouI的PCR产物(图12)。而对于pKC1139：CKW，gouG的PCR产物显示出较小的分子量带，这可能是由于该基因的部分缺失。

谷氏菌素产生

使用分析性HPLC层析法测量谷氏菌素产量。简单地说，将试验样品(1.0克)移入离心管中，并以3毫升水提取。藉由震荡混合及超音波处理将组分混合，然后使用离心分离。将上清液倾析到干净的烧瓶中。额外重复此程序一次，将上清液与先前分离的上清液合并。使水性提取液的最终体积成为10毫升，并使用分析型HPLC层析法分析谷氏菌素的含量。

将稀释的样本过滤并使用安装了Diamond氢化物保护柱的Cogent Diamond氢化物柱(100A，4微米，150×4.6毫米)藉由HPLC进行分析。以乙腈/NH₄OAC梯度洗脱该柱30分钟(见下文)。流速为1毫升/分钟。在254nm检测所需的代谢产物。谷氏菌素洗脱液为单一尖峰的形式，其近似保留时间为17-19分钟。野生型NRRL B-50550可制造0.5毫克/克的谷氏菌素，而若gouI基因被去活化，则不产生谷氏菌素(见表25)。单次交换去活化gouI及gouG也显示出不产生谷氏菌素。将整个谷氏菌素基因簇去活化同样导致不产生谷氏菌素。

表25:谷氏菌素产量

除非另有定义，本文中所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然可使用类似或等同于本文所描述的任何方法和材料来实行或测试本发明，本文所描述了较佳的方法和材料。本文所列举的所有出版物、专利及专利出版物的全部内容以引用方式并入本文以用于所有目的。

本文所讨论的出版物仅提供其在本申请案提交日之前的公开内容。本文中的任何信息均不应被解释为承认本发明无权凭借以往的发明而早于这类出版物。

虽然本发明已结合其特定实施方案进行了描述，需理解的是，本发明能够进一步修改，且本申请意在涵盖依循一般而言本发明原则的任何变化、用途或改编，且包括偏离本公开内容，但在本发明所属领域内公知或习惯的做法，且可能适用于前文所载的基本特征及以下所附的权利要求范围。

Claims (80)

1.一种组合物，其包含杀植食性螨和/或杀真菌细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株的生物学纯培养物。

2.权利要求1的组合物，其中该突变株具有透层活性。

3.权利要求1的组合物，其中该突变株具有杀卵活性。

4.权利要求1的组合物，其中该突变株具有残留活性。

5.权利要求1的组合物，其中该突变株具有杀真菌活性。

6.权利要求5的组合物，其中该突变株具有抗霉菌活性。

7.权利要求1的组合物，其中该突变株具有杀虫活性。

8.权利要求7的组合物，其中该突变株具有抗玉米根虫活性。

9.权利要求1的组合物，其包含每毫升培养物至少约1×10⁶CFU的所述菌株。

10.权利要求1的组合物，其进一步包含配方成分。

11.权利要求10的组合物，其中该配方成分为湿润剂。

12.权利要求1的组合物，其具有至少约50％的蛛螨(Spider Mite)效力。

13.权利要求12的组合物，其具有至少约60％的蛛螨效力。

14.一种组合物，其包含杀螨和/或杀真菌细黄链霉菌菌株NRRLB-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株的发酵产物。

15.权利要求14的组合物，其中该发酵产物进一步包含配方成分。

16.权利要求15的组合物，其中该配方成分为润湿剂。

17.权利要求14的组合物，其具有至少约50％的蛛螨效力。

18.一种处理植物以控制植物疾病或害虫的方法，其中该方法包含将细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或突变株施用在植物、植物的一部分和/或植物的所在地上。

19.权利要求18的方法，其中该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨和/或杀真菌突变株是以包含该细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株的组合物施用的。

20.权利要求19的方法，其中该组合物为细黄链霉菌菌株NRRLB-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株的发酵产物。

21.权利要求19的方法，其中该方法包含将该组合物施用在叶面植物部分。

22.权利要求19的方法，其中该欲控制的害虫是选自螨及叶甲(Diabrotica)。

23.权利要求22的方法，其中该螨是选自下组：三叶螨(clovermite)、棕色螨(brown mite)、榛子蛛螨(hazelnut spider mite)、芦笋蛛螨(asparagus spider mite)、棕色小麦螨(brown wheat mite)、豆螨(legume mite)、酢浆草螨(oxalis mite)、黄杨木螨(boxwood mite)、德州柑橘螨(Texas citrus mite)、东方红螨(Oriental red mite)、柑桔红螨(citrus red mite)、欧洲红螨(European red mite)、黄蛛螨(yellow spidermite)、无花果蛛螨(fig spider mite)、刘易斯蛛螨(Lewis spider mite)、六斑蛛螨(six-spotted spider mite)、乌伊拉米特螨(Willamette mite)、尤马蛛螨(Yuma spider mite)、纺网络螨(web-spinning mite)、菠萝螨(pineapple mite)、柑橘绿螨(citrus green mite)、美洲皂荚蛛螨(honey-locust spider mite)、茶红蛛螨(tea red spider mite)、南方红螨(southern red mite)、鳄梨棕螨(avocado brown mite)、云杉蛛螨(sprucespider mite)、鳄梨红螨(avocado red mite)、草地小爪螨(Banks grassmite)、朱砂蛛螨(carmine spider mite)、沙漠蛛螨(desert spider mite)、蔬菜蜘螨(vegetable spider mite)、隆突蛛螨(tumid spider mite)、草莓蛛螨(strawberry spider mite)、二斑蛛螨(two-spotted spider mite)、丹尼尔螨(McDaniel mite)、太平洋蛛螨(Pacific spider mite)、山楂蛛螨(hawthorn spider mite)、四斑蛛螨(four-spotted spider mite)、肖氏蛛螨(Schoenei spider mite)、智利假蛛螨(Chilean false spider mite)、柑橘平螨(citrus flat mite)、女贞螨(privet mite)、平猩红螨(flat scarletmite)、白尾螨(white-tailed mite)、菠萝跗线螨(pineapple tarsonemidmite)、西印度甘蔗螨(West Indian sugar cane mite)、鳞茎鳞螨(bulbscale mite)、仙客来螨(cyclamen mite)、广明螨(broad mite)、麦圆叶爪螨(winter grain mite)、红足泥螨(red-legged earth mite)、榛小植刺瘿螨(filbert big-bud mite)、葡萄瘿螨(grape erineum mite)、梨肿叶螨(pear blister leaf mite)、苹果卷叶缘螨(apple leaf edgeroller mite)、桃植羽瘿螨(peach mosaic vector mite)、赤杨珠瘿螨(alder bead gallmite)、佩里安核桃叶瘿螨(Perian walnut leaf gall mite)、胡桃叶卷缘螨(pecan leaf edgeroll mite)、无花果瘿螨(fig bud mite)、橄榄油瘿螨(olive bud mite)、柑橘瘿螨(citrus bud mite)、荔枝瘿螨(litchi erineummite)、小麦曲螨(wheat curl mite)、椰子花核瘿螨(coconut flower andnut mite)、甘蔗肿瘿螨(sugar cane blister mite)、野牛草瘿螨(buffalograss mite)、百慕达草瘿螨(bermuda grass mite)、胡萝卜瘿螨(carrotbud mite)、红薯叶瘿螨(sweet potato leaf gall mite)、石榴叶曲螨(pomegranate leaf curl mite)、ash sprangle瘿螨(ash sprangle gallmite)、槭斜背瘤瘿螨(maple bladder gall mite)、alder erineum螨(aldererineum mite)、红莓螨(redberry mite)、棉花肿螨(cotton blister mite)、蓝莓瘿螨(blueberry bud mite)、粉红茶锈螨(pink tea rust mite)、茶紫瘿螨(ribbed tea mite)、灰色柑橘螨(grey citrus mite)、红薯锈螨(sweetpotato rust mite)、七叶树锈螨(horse chestnut rust mite)、柑桔锈螨(citrus rust mite)、苹果锈螨(apple rust mite)、葡萄锈螨(grape rustmite)、梨锈螨(pear rust mite)、扁针鞘松螨(flat needle sheath pinemite)、野玫瑰芽果螨(wild rose bud and fruit mite)、干莓瘿螨(dryberry mite)、芒果锈螨(mango rust mite)、杜鹃锈螨(azalea rustmite)、梅锈螨(plum rust mite)、桃银色刺瘿螨(peach silver mite)、苹果锈螨(apple rust mite)、西红柿叶赤皮瘿螨(tomato russet mite)、粉红柑桔锈螨(pink citrus rust mite)、谷物锈螨(cereal rust mite)、水稻锈螨(rice rust mite)及它们的组合。

24.权利要求22的方法，其中该叶甲是选自下组：带状黄瓜甲虫(Banded cucumber beetle)(食蚜蝇叶甲(Diabrotica balteata))、北方玉米根虫(Northern corn rootworm)(巴氏根叶甲(Diabrotica barberi))、南方玉米根虫(Southern corn rootworm)(黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi))、西黄瓜甲虫(Westerncucumber beetle)(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctatatenella))、西斑黄瓜甲虫(Western spotted cucumber beetle)(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata))、西玉米根虫(Western corn rootworm)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgiferavirgifera))、墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm)(墨西哥玉米根叶甲(Diabrotica virgifera zeae))及它们的组合。

25.权利要求20的方法，其中该发酵产物为经冷冻干燥的粉末或经喷雾干燥的粉末，且其中该发酵产物是以约0.625磅/英亩至约5磅/英亩的比率施用。

26.权利要求25的方法，其中该发酵产物包含至少约2重量％的谷氏菌素。

27.权利要求26的方法，其中该发酵产物包含至少约4重量％的谷氏菌素。

28.权利要求23的方法，其中该螨为抗阿维菌素(abamectin)螨。

29.权利要求19的方法，其中该植物疾病是由真菌引起。

30.权利要求29的方法，其中该植物疾病为霉病或锈病。

31.权利要求30的方法，其中该霉病为白粉病或霜霉病。

32.权利要求30的方法，其中该锈病是选自下组：由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈叶锈病、由大麦柄锈菌(Pucciniahordei)引起的大麦叶锈病、由隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)引起的裸麦叶锈病、棕叶锈病、冠锈病及秆锈病。

33.一种产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤，其中该发酵肉汤包含至少约1克/升谷氏菌素。

34.权利要求33的发酵肉汤，其中该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

35.权利要求34的发酵肉汤，其中该产谷氏菌素的链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：42。

36.权利要求33的发酵肉汤，其中该发酵肉汤含有至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升谷氏菌素。

37.权利要求33的发酵肉汤，其中该发酵肉汤含有浓度为约1克/升至约15克/升谷氏菌素。

38.权利要求34的发酵肉汤，其中该链霉菌菌株为细黄链霉菌菌株或紫红链霉菌(Streptomyces puniceus)菌株。

39.权利要求38的发酵肉汤，其中该细黄链霉菌菌株是选自下组：细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株。

40.权利要求39的发酵肉汤，其中该紫红链霉菌菌株是选自下组：紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨突变株。

41.一种制造产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤的方法，其中该发酵肉汤含有至少约1克/升谷氏菌素，该方法包含：在有氧条件下，将链霉菌菌株培养在含有可消化碳源和可消化氮源的培养基中，其中该培养基含有的氨基酸浓度能有效达成浓度为至少1克/升的谷氏菌素。

42.权利要求41的方法，其中将该链霉菌菌株培养在培养基中直到该培养基中含有的谷氏菌素浓度为至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、为至少约5克/升、至少约6克/升、至少约7克/升、或至少约8克/升谷氏菌素。

43.权利要求41的方法，其中将该链霉菌菌株培养在培养基中直到该培养基中含有的谷氏菌素浓度在约1克/升至约15克/升的范围内。

44.权利要求41的方法，其中该氨基酸是选自下组：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸及它们的混合物。

45.权利要求44的方法，其中该培养基含有初始浓度为至少约2克/升的氨基酸。

46.权利要求45的方法，其中该培养基含有初始浓度为约5克/升至约15克/升的甘氨酸。

47.权利要求45的方法，其中该培养基含有初始浓度为约5克/升至约15克/升的谷氨酸。

48.权利要求41的方法，其中该培养基含有葡萄糖和寡糖的混合物作为碳源。

49.权利要求48的方法，其中该寡糖为麦芽糊精或糊精。

50.权利要求49的方法，其中该培养基中的麦芽糊精的初始浓度为约50克/升至约100克/升。

51.权利要求50的方法，其中该培养基中的麦芽糊精的初始浓度为约60克/升至约80克/升。

52.权利要求41的方法，其中该培养基中的葡萄糖的初始浓度为约20克/升至约60克/升。

53.权利要求52的方法，其中该培养基中的葡萄糖的初始浓度为约30克/升至约50克/升。

54.权利要求41的方法，其中该培养基中含有初始浓度为约1克/升至3克/升的碳酸钙。

55.权利要求41的方法，其中该氮源是至少部分选自下组：大豆蛋白胨、大豆酸水解产物、大豆粉水解产物、酪蛋白水解产物、酵母提取物及它们的混合物。

56.权利要求41的方法，其中该链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

57.权利要求41的方法，其中该链霉菌菌株为细黄链霉菌菌株。

58.权利要求56的方法，其中该细黄链霉菌菌株是选自细黄链霉菌菌株NRRL B-50550或由其衍生的杀植食性螨突变株。

59.权利要求56的方法，其中该链霉菌菌株为紫红链霉菌菌株。

60.权利要求59的方法，其中该紫红链霉菌菌株为紫红链霉菌菌株A或由其衍生的杀植食性螨突变株。

61.一种增加产谷氏菌素的链霉菌菌株的发酵肉汤中的谷氏菌素水平的方法，其包含在有氧条件下，在含有可消化碳源及可消化氮源的培养基中培养所述链霉菌菌株，其中该培养基中含有的氨基酸浓度能有效达成比在含有少于约1克/升的一或多种氨基酸的培养基中的谷氏菌素浓度至少高两倍的谷氏菌素浓度。

62.权利要求55的方法，其中该培养基中所含有的氨基酸浓度为约2克/升的一或多种氨基酸。

63.权利要求62的方法，其中该氨基酸是谷氨酸、丝氨酸或甘氨酸。

64.权利要求61的方法，其中该链霉菌菌株包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

65.一种与SEQ ID NO：43的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列，其可操作地连接至少一种用于指导该序列表达的外源性和/或异源性调控元件。

66.权利要求65的核酸序列，其进一步包含SEQ ID NO：43的位置10820至位置12013的核苷酸序列。

67.权利要求65-66中任一项的核酸序列，其进一步包含SEQ IDNO：43的位置13219至位置14334的核苷酸序列。

68.权利要求65-67中任一项的核酸序列，其中该核酸序列是从细黄链霉菌、灰色链霉菌(S.griseus)、环圈链霉菌(S.anulatus)、粪生链霉菌(S.fimicarius)、小链霉菌(S.parvus)、淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)、白绿链霉菌(S.alboviridis)、紫红链霉菌或禾粟链霉菌(S.graminearus)分离出来的。

69.一种宿主细胞，其包含权利要求65-68中任一项的核酸序列。

70.一种用于生产谷氏菌素或谷氏菌素类似物的方法，其包含：在培养基中培养链霉菌家族中产谷氏菌素或谷氏菌素类似物的细菌以制造并将该谷氏菌素或谷氏菌素类似物分泌入培养基中，从培养基中收集该谷氏菌素或谷氏菌素类似物，其中该细菌已经过修饰以增强权利要求65-68中任一项的核酸序列的基因表达。

71.权利要求70的方法，其中该细菌是选自下组：细黄链霉菌、灰色链霉菌、环圈链霉菌、粪生链霉菌、小链霉菌、淡紫灰链霉菌、白绿链霉菌、紫红链霉菌及禾粟链霉菌。

72.权利要求70的方法，其中该细菌为细黄链霉菌。

73.一种表达载体，其包含编码选自权利要求65-68中任一项的核酸序列的多肽亚单位的基因。

74.一种宿主细胞，其包含权利要求73的载体。

75.一种用于制备谷氏菌素或谷氏菌素类似物的方法，其包含以下步骤：

a)构建含有权利要求65-68中任一项的核酸序列的重组表达载体；

b)以步骤a)的含有核酸序列的表达载体将宿主细胞转化以产生转化株；

c)培养该步骤b)的转化株；及

d)从步骤c)的转化株的培养产物中分离并纯化该谷氏菌素或谷氏菌素类似物。

76.一种转基因的原核细胞，其包含编码与选自下组的至少一种氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列：SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：42。

77.一种与SEQ ID NO：13的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列，其可操作地连接至少一种用于指导该序列表达的外源性和/或异源性调控元件。

78.权利要求77的核酸序列，其进一步包含与SEQ ID NO：17的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列。

79.权利要求77或78的核酸序列，其进一步包含与选自下组的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的至少一种核酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41。

80.一种与选自下组的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：41，其进一步包含含有外源性限制性内切酶裂解位点的核酸序列。