CN104962514B - 人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞 - Google Patents

人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞。所述褐色脂肪细胞由褐色脂肪组织(BAT)祖细胞分化。所述BAT祖细胞以及已分化的褐色脂肪细胞可用于治疗患者的代谢疾病或病症(如肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病、代谢综合征等)，或用于制造治疗上述疾病的药物。

Description

人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞
本申请是申请号为200980129427.9的中国专利申请的分案申请，原申请是2009年05月27日提交的PCT国际申请PCT/US2009/003217于2011年1月26日进入中国国家阶段的申请。
本申请要求美国临时专利申请60/071,916的优先权，所述申请的内容通过引用全文并入本文。
技术领域
本公开内容涉及褐色脂肪组织、祖细胞、细胞分化和褐色脂肪组织解偶联蛋白1。本公开内容还涉及代谢疾病，如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性和异常脂肪血症(dyslipidemia)。
背景技术
肥胖症的流行与糖尿病、高血压、冠心病、癌症和其它疾病的流行紧密相关。白色脂肪组织的作用是储存脂质，而且其与肥胖症相关。褐色脂肪组织(“brown adiposetissue，BAT”)的作用实际上相反。其专门氧化脂质并以热量消耗能量。事实上，褐色脂肪细胞含有很多线粒体(其中进行细胞氧化)并独有地表达BAT解偶联蛋白1(“uncouplingprotein-1，UCP1”)。UCP1作为氧化磷酸化的解偶联剂起作用，导致能量以热量损耗。交感神经***刺激线粒体发生以及UCP1的表达和活性。在啮齿动物中，BAT相关的热产生在暴露在低温时提高(例如，防止体温过低)，或为由于过度进食而提高，燃烧过量摄取的脂肪并防止体重增加。通过调节对体重增加的敏感性和消耗大量葡萄糖，BAT也提高胰岛素敏感性。因此其在保持体温、能量平衡和葡萄糖代谢中有重要作用。
转基因动物的实验证实了BAT潜在的抗肥胖症特性。例如，已报导BAT的遗传删除可导致肥胖症，而据报道BAT量和/或功能(和/或UCP1表达)的遗传提高可导致瘦且健康的表型。尤其地，与对照小鼠相比，BAT量更高的小鼠增加的体重更少而且对胰岛素更敏感。最近，在小鼠肌肉中证实了BAT的异位贮存，认为其为防止体重增加和代谢综合征提供了遗传机制。
尽管已报道UCP1在啮齿动物中有控制能量平衡的作用，并且表达UCP1的BAT在人新生儿中存在，但在长久以来都认为在成人中没有生 理相关的UCP1表达。事实上，人们认为表达BAT的UCP1在生命早期消失，并认为成人中没有BAT。
发明内容
本申请人在多种组织中鉴定出了可分化为褐色脂肪细胞之细胞的存在。在一个方面中，申请人在骨骼肌中鉴定了这种细胞群，申请人称其为BAT祖细胞。本公开内容提供了从多种组织中分选细胞以鉴定和分离BAT祖细胞的方法。在一些实施方案中，从人骨骼肌中分离BAT祖细胞。本公开内容提供了在体外和体内将BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的方法。在一些实施方案中，可在人受试者体内使BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的BAT祖细胞可在培养物中扩增。在另一个实施方案中，可通过药剂提高已分化BAT祖细胞中UCP1mRNA的表达，所述药剂如细胞通透性cAMP衍生物、过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome-proliferator-acticated receptor，PPARγ)激动剂等。在一些实施方案中，已分化为褐色脂肪细胞的BAT祖细胞可包含大量的线粒体转录因子A(mtTFA)和PPARγ共激活子-1α(PGC-1α)，这两者都参与对线粒体发生以及线粒体标志物细胞色素氧化酶IV(COX IV)的控制。分化的BAT祖细胞可显示一个或多个以下特征：高水平的UCP1表达、高水平的解偶联呼吸作用、高代谢率。申请人提供了可通过使氧化磷酸化解偶联而代谢葡萄糖、氧化脂肪酸以及作为热量消耗能量的已分化细胞。
本公开内容提供了在成人骨骼肌中检测UCP1mRNA的方法，以及在体内提高其表达的方法。关于成人UCP1表达的现有研究集中在白色脂肪组织中，但申请人公开了在人骨骼肌中褐色脂肪祖细胞的存在及其分离，该细胞有表达UCP1的极大潜能。在一些实施方案中，这种BAT祖细胞库可用于调节能量消耗和用于治疗肥胖症、糖尿病和代谢疾病。
在一些方面中，本公开内容提供了在人骨骼肌中鉴定BAT祖细胞的方法，以及从人骨骼肌样品中分离这些细胞的方法。还提供了在体外、体内或两者皆有的情况下促进这些祖细胞分化为褐色脂肪细胞的条件和药剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)。提供了使用这些条件和药剂治疗代谢疾病(如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等)的 方法。
本公开内容提供了允许鉴定药剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)的测定方法，所述药剂诱导UCP1基因表达、促使BAT祖细胞在体外分化为褐色脂肪细胞、促使BAT祖细胞在体内分化为褐色脂肪细胞，或以上活性的组合。根据一些实施方案，用该方式鉴定的药剂可用于治疗代谢疾病，例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等。
本文给出了本公开内容的这些特征和其它特征。
附图说明
图1A显示了人胎儿肌肉中血管细胞的免疫组织化学描述。图1B显示了人胎儿肌肉中血管细胞的FACS分析和分选。图1C显示了CD34+/CD146-/CD45-/CD56-(CD34)、CD34-/CD146+/CD45-/CD56-(CD146)以及未分选的总细胞的RT-PCR分析。图1A的比例尺为50μM。
图2A显示了原代培养物(PC)的CD34+细胞。图2B和图2C显示了原代培养物(PC)的CD146+细胞。图2D显示了扩增多至3代(P3)的CD34+细胞。图2E显示了原代培养或扩增3代(P3)的CD34+细胞中UCP1(空心柱)和瘦素(灰色柱)mRNA表达的定量RT-PCR测定。图2F显示了组织或全细胞提取物中UCP1和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的代表性蛋白印迹分析。图2A、B、C：相差图；比例尺：50μM。
图3A显示了分离的胎儿肌肉CD34+细胞以及原代培养且刚进行胰酶消化的成人白色脂肪细胞中的解偶联呼吸作用。图3B显示了cAMP衍生物在原代培养(PC)和扩增多至3代的(P3)的CD34+细胞中对UCP1 mRNA表达的作用。图3C显示了1μM罗格列酮(Rosi)对CD34+PC或P3细胞中UCP1表达的作用。
图4A显示了成人肌肉细胞在脂肪形成培养条件下的表征。图4B显示了UCP1(空心柱)和瘦素(灰色柱)mRNA表达的定量PCR测定。图4C显示了成人WAT细胞在脂肪形成培养条件下的表征。图4A、C：相差图；比例尺：50μM。
图5显示了罗格列酮对人骨骼肌中UCP1 mRNA表达的作用。
具体实施方式
本公开内容提供了用于在多种组织中鉴定和分离BAT祖细胞的方法，在一些实施方案中，其包括鉴定人骨骼肌中的普通褐色脂肪细胞祖细胞，并从人骨骼肌样品中分离该细胞。在一些实施方案中，可通过对细胞表面标记的免疫组织化学分析来对细胞进行分选，如分化/命名抗原簇(“CD”)分子CD34、CD45、CD56和CD 146。造血细胞和成肌祖细胞(myogenic progenitor)可分别基于其细胞表面的CD45和CD56的鉴定来分选。CD34和CD146可分别用于鉴定内皮细胞和周细胞。在一个方面中，CD34的表达标志着细胞是褐色脂肪细胞的祖细胞。
流式细胞术、荧光激活细胞分选(“FACS”)和其它本领域已知的细 胞分选技术可用于分选从多种组织中获得的细胞，并用于将BAT细胞与其它细胞分开。包括其它本领域已知的技术，多色FACS可用于鉴定CD34+内皮细胞和CD146+周细胞，并将它们彼此分开，并与CD45+造血祖细胞和CD56+的成肌祖细胞分开。逆转录酶聚合酶链式反应(“RT-PCR”)分析可用于证实在CD34+和CD146+细胞类群中无造血祖细胞和成肌祖细胞。
申请人发现在骨骼肌中存在祖细胞类群，并且在一些实施方案中，该类群可见于骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织中，并且在一些实施方案中，其只可见于骨骼肌中(即不可见于其它组织中)。骨骼肌可为人或任何动物的骨骼肌，并且祖细胞类群可散布在骨骼肌中或集中在离散的区域中。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于肌纤维之间。骨骼肌BAT祖细胞可为固定不动的类群，或可在骨骼肌或其它组织中以及不同组织之间移动。此外，BAT祖细胞可见于胎儿、幼龄和成体骨骼肌中。
本教导内容提供了分离自多种组织的BAT祖细胞。例如，提供了分离自人骨骼肌的BAT祖细胞。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织中，和/或仅可见于骨骼肌中。一些BAT祖细胞可表达UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)和/或PPARγ共激活子1α(PGC-1α)，以及一种或多种相应的mRNA。本公开内容提供了在成人骨骼肌中检测BAT祖细胞和/或UCP1mRNA的方法。关于成人UCP1表达的现有研究着眼于白色脂肪组织，而申请人公开了褐色脂肪祖细胞在人骨骼肌中的存在和分离，其有表达UCP1的高潜能。在一些实施方案中，BAT祖细胞在骨骼肌中的贮存可提供调节能量消耗以用于治疗代谢性疾病(如肥胖症、糖尿病等)的机制。
至少，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够分化为真正的褐色脂肪细胞，并且在一些实施方案中，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够在体外分化为真正的褐色脂肪细胞。本公开内容提供了扩增BAT祖细胞培养物的方法，以及将BAT祖细胞分化为真正的BAT细胞的方法，其包括在脂肪形成培养基中分化之前分选之细胞的方法。在一些实施方案中，可通过使用维持白色脂肪细胞分化的条件或者通过使用已确定可促进祖细胞分化为褐色脂肪细胞的药剂，而将分选的祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
一些实施方案利用了UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)，和/或PPARγ共激活子-1α(PGC-1α)及一种或多种相应的mRNA，来鉴定已 开始至少部分分化的BAT祖细胞。可使用以下来鉴定已开始至少部分分化的BAT祖细胞：高代谢率或高水平的解偶联呼吸作用、葡萄糖利用、脂肪酸氧化或上述特征彼此的组合或与其他特征的组合。就本公开内容而言，已开始至少部分分化成褐色脂肪细胞的BAT祖细胞被称为“已分化褐色脂肪细胞”。
作为一个实例，已确定为表达CD34标记的细胞(即CD34+细胞)可在通过在以下培养基中培养而分化为褐色脂肪细胞，所述培养基为含0.86μM胰岛素、10μg/ml转铁蛋白、0.2nM三碘甲腺原氨酸、1μM罗格列酮、100μM 3-异丁基-l-甲基黄嘌呤、1μM***和1％青霉素-链霉素的DMEM-Ham′s F-12培养基。还可用其它药剂促进祖细胞分化为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，可使用根据本公开内容的教导而鉴定的药剂促进祖细胞分化为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，已分化褐色脂肪细胞表现出高水平的UCP1表达、高水平的解偶联呼吸作用和/或高代谢率。
本公开内容提供了在BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或这两者中提高UCP1mRNA表达的方法。例如，诸如细胞透过性cAMP衍生物和过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)激动剂的药剂可用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中UCP1mRNA表达。UCP1表达的提高可通过本领域已知的方法确定，包括通过定量RT-PCR测定UCP1mRNA。用于UCP1mRNA的RT-PCR分析的示例性引物在SEQ ID NOS：1-4和11-12中提供。
与不接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞相比，接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞可含有更高水平的UCP1mRNA。亲环素的mRNA水平可作为评价细胞中UCP1mRNA丰度的归一化数值(反映细胞数或RNA总量)。在一些实施方案中，不接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞中的UCP1mRNA水平无法用RT-PCR检测到，而已分化褐色脂肪细胞中的UCP1mRNA水平则可以检测到，并可根据亲环素mRNA的水平进行归一化。作为UCP1表达的比较测量，已分化褐色脂肪细胞中的UCP1mRNA水平可与培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCP1mRNA水平相当。本公开内容提供的已分化褐色脂肪细胞中的UCP1mRNA水平约为培养的小鼠褐色脂肪细胞中UCP1mRNA水平的25％。而在另一些实施方案中，UCP1mRNA水平约为培养的小鼠褐色脂肪细胞中UCP1mRNA水平的25±10％，或约15％至约30％。本公开内容所涉及的已分化褐色脂肪细胞中 的UCP1mRNA水平为培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCP1mRNA水平的约5％至约100％。在一些实施方案中，UCP1mRNA水平可超过培养的小鼠褐色脂肪细胞中UCP1mRNA水平的100％。
与同一物种或同一成体个体的骨骼肌活检中的细胞相比，已分化褐色脂肪细胞可含显著更高水平的UCP1mRNA。此外，已分化褐色脂肪组织中UCP1蛋白的量可与同一物种或同一胎儿个体的BAT中UCP1蛋白的量大致相同。本公开内容所涉及的人已分化褐色脂肪细胞的UCP1mRNA水平与人体内褐色脂肪细胞的UCP1mRNA水平大致相同。在一些实施方案中，人已分化褐色脂肪细胞的UCP1mRNA水平可为人体内褐色脂肪细胞的UCP1mRNA水平的约1％到高于后者很多倍。
本公开内容提供了用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中的UCP1mRNA的方法。在一些实施方案中，提供了用于选择性提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中的UCP1mRNA的方法。PPARγ激动剂可在骨骼肌和已分化褐色脂肪细胞中刺激UCP1mRNA的生成。例如，在一些实施方案中，PPARγ激动剂罗格列酮在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中刺激UCP1mRNA的生成。细胞透过性cAMP衍生物可在骨骼肌和已分化褐色脂肪细胞中刺激UCP1mRNA的生成。例如，在一些实施方案中，细胞透过性cAMP衍生物8-溴代-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中选择性刺激UCP1mRNA的生成，而在另一些实施方案中，cAMP衍生物(4-氯代苯基硫)-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中选择性刺激UCP1mRNA的生成。
线粒体转录因子A(mtTFA)和过氧化物酶体增殖剂激活受体γ共激活剂1α(“PGC-1α”)参与了线粒体发生的控制。已分化褐色脂肪细胞与未分化的BAT祖细胞相比，可含有大量的mtTFA、PGC-1α或上述两者。本公开内容提供了与未分化的BAT祖细胞相比，含更高水平的mtTFA mRNA、PGC-1αmRNA或上述两者的已分化褐色脂肪细胞。线粒体标志物细胞色素氧化酶IV(COX IV)参与了线粒体的呼吸链。本公开内容提供了与未分化的BAT祖细胞相比，含显著提高水平的COX IV mRNA的已分化褐色脂肪细胞。
根据一些实施方案，已分化褐色脂肪细胞有高水平的解偶联呼吸作用和/或高代谢率。当质子通过线粒体内膜泄露，而不是通过三磷酸腺苷合酶(“ATP合酶”)驱动三磷酸腺苷(“ATP”)的合成时，发生解偶联呼吸作用。质子在电化学质子梯度下的跨膜运动所释放的能量作为热量消耗， 而不是消耗在生成ATP的过程中。解偶联呼吸作用可作为不依赖于ATP形成(通过ATP合酶)而发生的细胞呼吸作用(例如，氧消耗)的比例的函数来衡量。例如，在寡霉素(阻断ATP合酶的功能)存在下氧化磷酸化电子转移链中的氧消耗为解偶联呼吸作用提供了一种度量。
本公开内容提供了与未分化的BAT祖细胞相比，解偶联呼吸作用水平显著升高的已分化褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了解偶联呼吸作用水平为总呼吸作用的约50％的未分化褐色细胞。一些实施方案显示的解偶联呼吸作用水平为总呼吸作用的约20％至约50％。以成体白色脂肪细胞中解偶联呼吸作用的水平作为比较标准，一些实施方案显示的解偶联呼吸作用为成体白色脂肪细胞的约1.5至约3.5倍。在一些实施方案中，解偶联呼吸作用水平为成体白色脂肪细胞的约2.5倍。本公开内容还提供了可通过氧化磷酸化的解偶联进行葡萄糖代谢、脂肪酸氧化并以热量消耗能量的已分化褐色脂肪细胞。
本公开内容提供了在体外和体内可促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的条件和药剂(例如，化合物、蛋白质、生物制品等)。在一些实施方案中，分化促进剂为：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂(例如罗格列酮)，PPARα激活剂或调节剂(例如，GW9578)，PPARδ激活剂或调节剂(例如GW501516或GW0742)，PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂，泛PPAR(α、δ、γ)激活剂或调节剂(例如，GW4148)，PDE4抑制剂(例如咯利普兰或IBMX)，PDE7抑制剂(如BMS586353或BRL 50481或IBMX)，NRIP1(RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂(例如双过氧化钾(双吡啶)氧钒酸盐(potassium bisperoxo(bipyridine)oxovanadate)或双过氧化二钾(5-羟基吡啶-2-羧基)氧钒酸盐(dipotassium bisperoxo(5-hydroxypyridine-2-carboxyl)oxovanadate))，α1-肾上腺素能完全或部分激动剂(如苯福林或西拉唑啉)，RXRα激活剂或调节剂(例如LGD 1069(塔革雷汀(Targretin))或9-顺式视黄酸)，PGC-1α激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂，脂联素或脂联素受体AdipoR1和/或AdipoR2激活剂，NOS抑制剂或激活剂(如2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)或腺苷)，Rho激酶-ROCK抑制剂(例如，法舒地尔)，BDNF，单胺氧化酶(MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂(例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司来吉兰)，SRC激活剂，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼(erlotinib)或ZD1839-吉非替尼(gefinitib)或Argos蛋白)，FAAH抑制剂(如，URB597)，MAPK 1(如，PD98059)或2(如PD98059)或4或5或7或8(如，PD98059)的抑制剂，CDK9抑制剂(如，1，5，6，7- 四氢-2-(4-吡啶基)-4H-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮盐酸盐)，TGR5激动剂(如，齐墩果酸)，AMPK激活剂(如，AICAR)，BMP-7，mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)，腺苷酸环化酶激活剂(例如，毛喉素)，或上述任何药剂的组合。
在一些实施方案中，用罗格列酮治疗受试者(包括人受试者)导致该受试者骨骼肌中UCP1mRNA生成提高。在一些实施方案中，用罗格列酮治疗个体可在骨骼肌中诱导褐色脂肪细胞的出现或分化，提高UCP1基因在骨骼肌中已有褐色脂肪细胞中的表达，或上述两者。例如，在一些实施方案中，可在患代谢疾病的受试者中诱导骨骼肌中褐色脂肪细胞的出现或分化。褐色脂肪细胞可提供葡萄糖消耗器，其具有高的线粒体和细胞呼吸作用以及脂肪酸氧化速率，并以热能消耗能量(解偶联氧化磷酸化)。受试者的代谢速率可被提高，并且可诱导体重减轻。诱导褐色脂肪细胞的出现或分化还可改善胰岛素敏感性、血糖的内稳态以及心血管疾病风险因素。
本公开内容还提供了可鉴定药剂(例如，化合物、蛋白质、生物制品等)的测定法，所述药剂可在体外、体内或这两种情况下促使BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1基因的表达。该药剂可通过筛选化合物、蛋白质、生物制品等来鉴定。例如，在一些实施方案中，分离的CD34+细胞可用于根据诱导UCP1基因表达和/或使CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞的能力来筛选药剂。以这种方式鉴定的药剂可用于多种研究、诊断和治疗目的，例如包括治疗代谢疾病，如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等。在一些实施方案中，可优化通过本公开内容的测定法鉴定的药剂以提高其物理化学和/或药代动力学特性。
可按照在本公开内容中提供的方法在体外和体内增强BAT祖细胞中UCP1、mtTFA、PGC-1α和/或COX IV的表达。在一些实施方案中，可通过接触脂肪形成培养基来刺激BAT祖细胞中UCP1、mtTFA、PGC-1α和/或COX IV的表达增加。可用如以下的药剂刺激BAT祖细胞中UCP1、mtTFA、PGC-1α和/或COX IV的表达的增加：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂(例如罗格列酮)，PPARα激活剂或调节剂(例如，GW9578)，PPARδ激活剂或调节剂(例如GW501516或GW0742)，PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂，泛PPAR(α、δ、γ)激活剂或调节剂(例如，GW4148)，PDE4抑制剂(例如咯利普兰或IBMX)，PDE7抑制剂(如BMS 586353或BRL 50481或IBMX)，NRIP1(RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂(例 如双过氧化钾(双吡啶)氧钒酸盐或双过氧化二钾(5-羟基吡啶-2-羧基)氧钒酸盐)，α1-肾上腺素能完全或部分激动剂(如苯福林或西拉唑啉)，RXRα激活剂或调节剂(例如LGD 1069(塔革雷汀)或9-顺式视黄酸)，PGC-1α激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂，脂联素或脂联素受体AdipoR1和/或AdipoR2激活剂，NOS抑制剂或激活剂(如2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)或腺苷)，Rho激酶-ROCK抑制剂(例如，法舒地尔)，BDNF，单胺氧化酶(MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂(例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司来吉兰)，SRC激活剂，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白)，FAAH抑制剂(如，URB597)，MAPK 1(如，PD98059)或2(如PD98059)或4或5或7或8(如，PD98059)抑制剂，CDK9抑制剂(如，1，5，6，7-四氢-2-(4-吡啶基)-4H-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮盐酸盐)，TGR5激动剂(如，齐墩果酸)，AMPK激活剂(如，AICAR)，BMP-7，mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)，腺苷酸环化酶激活剂(例如，毛喉素)，或上述任何药剂的组合。
实施例
本教导内容的方面可在以下实施例的帮助下得到更好的理解，不应将所述实施例看作在任何形式上对本教导内容范围的限制。
实施例1：分选和分化肌肉血管细胞
通过免疫组织化学，发现在胎儿骨骼肌中CD34和CD146分别在内皮细胞和周细胞表面表达，但CD34也在分散在肌原纤维间的细胞中表达。图1(A)显示了小血管的纵切面，其中CD146+周细胞(绿色)环绕着CD34+内皮细胞(红色)。在成体骨骼肌中也观察到类似的CD34+和CD146+细胞的分布。
用多色荧光激活细胞分选(FACS)对来自7份独立的胎儿肌肉(怀孕16-24周)的血管细胞进行了分选。首先对造血(CD45+)细胞设置门控，还有成肌祖细胞(CD56+)。而后分选出内皮细胞(CD34+/CD146-)和周细胞(CD34-/CD146+)。此后将CD34+/CD146-/CD45-/CD56-指定为CD34+细胞，将CD34-/CD146+/CD45-/CD56-指定为CD146+细胞。图1(B)显示了CD34+/CD146-和CD34-/CD146+细胞的纯化。将分离的细胞用PE-抗CD34、FITC-抗CD146、PE-Cy7-抗CD56和APC-Cy7-抗CD45抗体 染色，并在FACS Aria细胞分选仪上运行。在排除CD45+和CD56+细胞(左图)后，分离在CD34+或CD146+门控之内的细胞。CD34+细胞占初始胎儿肌细胞群的8±1％。
图1(C)显示了CD34+/CD146-/CD45-/CD56-(CD34)、CD34-/CD146+/CD45-/CD56-(CD146)以及未分选的总细胞的RT-PCR分析。测量了肌动蛋白的mRNA作为对照。结果显示CD34+细胞未被可检测到的CD45+造血细胞或CD56+肌原细胞污染。
将分选的细胞在EGM2培养基中培养4-6天，并在材料与方法部分表述的脂肪生成培养基中培养8-12天。这些条件在WAT原代培养中维持了白色脂肪细胞的分化。图2显示了原代培养物(PC)的CD34+(图2(A))和CD146+(图2(B)，图2(C))细胞，以及扩增多至3代(P3)的CD34+(图2(D))细胞。基本上所有分选的胎儿肌肉CD34+细胞都分化为脂肪细胞样的多室(multilocular)细胞(图2(A)、2(D))。值得注意的是，在细胞培养物中，多室结构是白色和褐色脂肪细胞共有的。与之相反，胎儿肌肉CD146+细胞在上述条件下生长非常缓慢。它们未达到细胞汇合并且表现出周细胞样外观，其特征为尺寸大，形状伸展并且边界不规则(图2(B)和(C))。可偶尔检测到多室细胞(图2(C))。在上述条件下在培养物中扩增3代(4周)的CD34+细胞的形态与在原代培养物中观察到的类似，尽管成熟脂肪细胞更小(图2(D))。
实施例2：培养的CD34+细胞中UCP1的表达
胎儿肌肉CD34+细胞的显著脂肪细胞样分化促使我们对其进行进一步表征。惊人的是，定量RT-PCR显示在这些细胞中有高水平的UCP1mRNA。图2(E)显示了原代培养或扩增3代(P3)的CD34+细胞中UCP1(空心柱)和瘦素(灰色柱)mRNA表达的定量RT-PCR测定。用亲环素A归一化的平均UCP1mRNA水平为1797±510主观单位(即用对应的亲环素A的值标准化的的主观值±标准误；n＝4-7)，在此测定中对应于25ng cDNA的循环阈值(Ct)为22。
相比之下，在培养物中分化的小鼠褐色脂肪细胞的平均UCP1mRNA水平(用亲环素A归一化化)为7715±2649(n＝10)主观单位。因此，人CD34+细胞中的UCP1mRNA水平达到了培养的小鼠褐色脂肪细胞的近四分之一。由于妊娠终止后经过的时间造成RNA降解的风险很高，所以未以人胎儿BAT作为定量RT-PCR分析的阳性对照。克隆扩增子并测序，发现其与人UCP1100％相同。在培养多至3代的胎儿肌肉CD34+细 胞中，仍观察到了高的UCP1mRNA表达，为原代培养细胞中检测到的43％。在未分化的胎儿肌肉CD34+细胞或原代培养的CD146+细胞中未检测到UCP1mRNA的表达。在原代培养和扩增的细胞中瘦素mRNA的水平分别为9.9±5.5和71±52主观单位(图2E)。
实施例3：CD34+的其他表型
为了更好地表征在培养物中扩增的胎儿肌肉CD34+细胞的基因表达模式，进行了基因芯片分析。在表1中显示了有显著检测P值(p＜0.01)的若干代表性基因的mRNA表达水平，并与人肌肉活检中的进行比较。选择了以下蛋白的mRNA：UCP1作为参考基因，参与热产生和线粒体发生的控制的线粒体转录因子A(mtTFA)以及过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARγ)和PPARγ共激活子1α(PGC-1α)，线粒体呼吸链的酶琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶IV(COXIV)，脂肪酸降解途径的酶，肉碱棕榈酰转移酶1B(CPT1B)，长链(ACAD)和C-4至C-12直链(ACADM)的酰基辅酶A脱氢酶，以及骨骼肌标志物成肌素(myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌分化因子1(MyoD1)。将在BAT中高表达并可能为UCP1活性抑制剂的Cidea[16]作为BAT标志物。这些基因的Genbank登记号在补充数据中显示。
表1
mRNA 登记号 CD34+细胞 人肌肉活检
UCP1 NM_021833 94 n.s.
mTFA NM_003201.1 413 205
PPARγ NM_138712.2 3326 84
PGC-1α NM_013261.2 137 619
COX IV NM_001861.2 13′082 13′407
SDH NM_003000.1 2390 5187
CPT1B NM_004377.2 99 639
ACAD NM_032169.3 1032 141
ACADM NM_000016.2 599 1640
成肌素 NM_002479.3 n.s. 267
Myf5 NM_05593 n.s. 21
MyoD1 NM_002478 n.s. 12
Cidea NM_198289.1 337 n.s.
表1中的数据表示为平均发光信号。检测P值＜0.01。使用了以下缩略词：n.s.，不显著；mtTFA，线粒体转录因子A；PPARγ，过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ；PGC-1α，PPARγ共激活子1α；COX IV，细胞色素过氧化物酶IV；SDH，琥珀酸脱氢酶；CPT1B，肉碱棕榈酰转移酶1B；ACAD，长链酰基辅酶A脱氢酶；ACADM，C-4至C-12直链；Myf5，生肌因子5；MyoD1，生肌分化因子1。
UCP1在胎儿肌肉扩增的CD34+细胞中有显著表达，但在成体肌肉活检样品中则没有(p＝0.12)。除PGC-1α和CPT1B mRNA(在细胞中的表达低5倍)，以及PPARγ和ACAD mRNA(其在肌肉活检样品中的表达分别低40倍和7倍)外，在胎儿肌肉中扩增的CD34+细胞中所选基因的mRNA表达水平均与成体肌肉活检样品中的相当。肌肉标志物成肌素、Myf5和MyoD1mRNA在肌肉中有显著的表达但在细胞中没有，而BAT标志物Cidea mRNA在细胞中表达但在肌肉中没有。在基因芯片分析中没有检测到β3-肾上腺素受体mRNA的表达。然而，值得注意的是，在原代培养的胎儿肌肉CD34+细胞中，定量RT-PCR可检测到β3-肾上腺素受体mRNA(以亲环素A作为参考的主观单位为0.084±0.044，n＝4)。为了 用不同的技术证实基因芯片的数据，还用定量RT-PCR检测了mtTFA、PGC-1α和COX IV。结果得到了证实，显示原代培养的胎儿肌肉CD34+细胞以亲环素A作为参考有高水平的mtTFA、PGC-1α和COX IV mRNA表达[分别达到306±117、385±294和23,400±10,300主观单位(n＝3-4)]。
通过用与人UCP1(80％同一性)反应的抗小鼠抗体进行的蛋白印迹，检测到UCP1蛋白在原代培养的胎儿肌肉CD34+细胞中的丰度与在胎儿BAT中相同。图2(F)显示了组织或全细胞提取物中UCP1和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的代表性蛋白印迹分析。显示了19周胎儿肩胛间BAT(第1道)、原代培养的CD34+细胞(第2道)以及成人骨骼肌(第3道)。在每道中加入了25μg蛋白。
实施例4：氧化磷酸化的解偶联
为了研究UCP1在肌肉来源之细胞中的可能功能，比较了分离的人胎儿肌肉CD34+培养细胞和成人白色脂肪细胞中的线粒体呼吸作用。将基本呼吸作用定义为抗霉素A敏感性氧消耗。将解偶联呼吸作用(质子泄漏)定义为对ATP合酶阻断剂寡霉素不敏感的基本呼吸作用的百分比。
图3(A)显示了分离的胎儿肌肉CD34+细胞以及原代培养且刚进行胰酶消化的成人白色脂肪细胞中的解偶联呼吸作用。结果形式为平均值±标准误；＊p＜0.05。n＝3。在人胎儿肌肉CD34+细胞和成体白色脂肪细胞中的解偶联呼吸作用与总呼吸作用的比值分别为47±12％和19±2％。实施例5：在培养的CD34+细胞中调节UCP1的表达
可通过药物处理来调节胎儿肌肉CD34+细胞中的UCP1mRNA表达。细胞透过性cAMP衍生物在原代培养和扩增的细胞中都强烈刺激(7-8倍)UCP1mRNA表达。在图3(B)中显示了cAMP衍生物(8-溴代-cAMP，0.25mM或(4-氯代苯基硫)-cAMP，0.25mM(cAMP))在原代培养(PC)和扩增多至3代的(P3)的CD34+细胞中对UCP1mRNA表达的作用。所有细胞在EGM2培养基中培养6天，而后在材料和方法部分所述的脂肪生长培养基中培养8-12天。结果表示为用相应的亲环素A值归一化的主观值的平均值±标准误。它们表示为它们相未处理(对照)值(认为是100％)的百分数(＊p＜0.05，n＝3-6)。
PPARγ激动剂罗格列酮对原代培养细胞无作用，但可强烈刺激(8倍)扩增细胞中mRNA的表达。在图3(c)中显示了1μM罗格列酮(Rosi) 对CD34+PC或P3细胞中UCP1表达的作用。结果按照图3(B)中的形式表示(＊＊p＜0.01，n＝4-7)。
实施例6：人褐色脂肪细胞祖细胞的肌肉特异性和终生持续性
表达UCP1的细胞来自于人胎儿肌肉组织，这提出了以下问题：即褐色脂肪细胞祖细胞局限在该组织和胎儿阶段。为了解决该问题，将通过FACS从人胎儿胰腺、肺和肝纯化的CD34+细胞在与胎儿肌肉CD34+细胞相同的脂肪生成条件下培养。分选出的细胞生长缓慢，并且只有其中的一小部分成为多室细胞。胰腺或肺细胞中不表达UCP1mRNA，然而，在肝细胞中检测到少量表达，为胎儿肌肉CD34+细胞中检测到的2％(结果未显示)。
从4个成人(50-78岁)骨骼肌样品中分选并在脂肪生成条件下原代(PC)培养的CD34+细胞也分化为多室细胞。在这些细胞中散布有其它类型的细胞，其中一些含有小脂滴(图4(A))。UCP1mRNA的水平(370±132主观单位)为在原代培养的胎儿肌肉CD34+细胞的21％。与之相反，瘦素表达(75±69主观单位)为胎儿细胞中的7.6倍。图4(B)显示了UCP1(空心柱)和瘦素(灰色柱)mRNA表达的定量PCR测定。所有细胞在EGM2培养基中培养4-6天，而后置于材料和方法部分所述的脂肪生长培养基中培养8-12天。结果表示为用对应的亲环素A值(n＝4-5)归一化的主观值的平均值±标准误。从4个成人(45-55岁)WAT样品中分选的CD34+细胞也在脂肪生成条件下进行原代(PC)培养。它们部分地成为多室细胞(图4(C))，但是不表达UCP1mRNA。
实施例7：检测人肌肉中UCP1mRNA的表达和罗格列酮的体内作用
成人骨骼肌的褐色脂肪细胞祖细胞可在体内分化并产生表达UCP1的细胞。使用高灵敏度RT-PCR技术检测到成人骨骼肌中UCP1mRNA的存在，事实上，在10名清瘦个体的腹直肌中检测到了低水平的UCP1mRNA(UCP1/亲环素A比例：24±9)。对PCR扩增的片段进行测序，发现与人UCP1有100％的同一性。成人肌肉中UCP1mRNA水平比培养的胎儿肌肉CD34+细胞中的低75倍。
因为在培养的肌肉CD34+细胞中PPARγ激动剂罗格列酮为UCP1mRNA的强诱导物，因此对该化合物在体内对人的作用进行了研究。使用7位患2型糖尿病的肥胖症患者的股外肌活检样品，所述患者用罗格列酮治疗他们的代谢综合征。在治疗前和用罗格列酮治疗8周(每天2×4mg) 后取得活检样品。罗格列酮的治疗使患者的胰岛素抗性和糖尿病显著改善。在该研究中，罗格列酮在提高胰岛素敏感性的同时，将UCP1的表达水平提高为约1.6倍。图5显示了UCP1mRNA表达的定量RT-PCR测定。结果为用对应的亲环素A值归一化的主观值的平均值±标准误(n＝7，与对照比＊p＜0.05)。因为所用的RT-PCR条件不同，所以该图中的主观值不能与图2-4中的直接比较。
在图5中显示了患者组(n＝7)中骨骼肌活检样品的UCP1mRNA水平，“对照”指治疗前的水平，“Rosi”指用罗格列酮治疗(8周)后的水平。作为纵向研究，测定了每个个体中罗格列酮对UCP1水平的作用(比较“对照”前和“Rosi”后状态的个体值的比较)。用(通过RNA的逆转录产生的)25ng cDNA起始反应，实时PCR中的检测阈值(Ct)UCP1为22，亲环素为18。罗格列酮的作用(治疗结束时的UCP1水平与治疗前对比)如下：
患者1：提高50％(至150％，对照＝437，Rosi＝652主观单位)
患者2：无变化(至100％，对照＝444，Rosi＝453主观单位)
患者3：提高80％(至180％，对照＝378，Rosi＝677主观单位)
患者4：提高180％(至280％，对照＝260，Rosi＝730主观单位)
患者5：提高8％(至108％，对照＝553，Rosi＝600主观单位)
患者6：提高310％(至410％，对照＝135，Rosi＝556主观单位)
患者7：提高10％(至110％，对照＝128，Rosi＝142主观单位)
在7名患者中的4名中观察到了罗格列酮的强作用，为1.5-4.1倍不等。该结果提示，罗格列酮在患者骨骼肌中诱导褐色脂肪细胞的出现和/或增强已有褐色脂肪细胞中UCP1基因的表达。PPARγ激动剂的这种作用可在以该药剂为胰岛素增敏剂的治疗作用中发挥重要作用。
实施例8：筛选人UCP1启动子/增强子区的潜在调节剂
经鉴定和分离的CD34+细胞可作为工具用于鉴定诱导这些细胞分化为褐色脂肪细胞或调节UCP1表达的药剂(化合物、蛋白、生物制品等)。
为了达到该目的，将人UCP1基因转录起始位点DNA上游(5’端)的大区域(6kb)(含有启动子/增强子区)克隆到报告子/MAR GFP(绿色荧光蛋白)或萤光素酶中。用该构建体转染CD34+细胞，将细胞培养在多孔板中，并筛选可增强细胞荧光(GFP)或发光(萤光素酶)(这可 反映出基因的表达(并因此反映提高UCP1的表达)的药剂。这可使得能够鉴定出增强CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞和/或通过以下方式增强UCP1表达的药剂，所述方式包括：增强UCP1基因的转录和/或增强UCP1转录本的翻译，和/或稳定UCP1转录本或蛋白。
例如，可用PPARγ调节剂或激活剂(如罗格列酮)来促进CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞(图3(C)和5)。另一个例子是使用cAMP衍生物，如8-溴代-cAMP和/或(4-氯代苯基硫)-cAMP)(图3(B))，或使用蛋白激酶A(PKA)激活剂或磷酸二酯酶抑制剂。另一个例子是使用三碘甲腺原氨酸(T3)、其它甲状腺激素、甲状腺激素受体TRα和/或TRβ拮抗剂或调节剂。另一个例子为采用β肾上腺素能激动剂如异丙基肾上腺素(泛激动剂)或特异性β1-、β2-、β3-激动剂或调节剂。另一个例子为使用候选受体的调节剂或这些受体下游信号途径中目标基因的调节剂，所述候选受体通过基因芯片研究得出。
实施例9：基因芯片研究
进行了基因芯片研究以鉴定在CD34+祖细胞分化为褐色脂肪细胞中起作用和/或诱导UCP1表达的分子途径。从人骨骼肌活检样品中分离CD34+细胞，并将它们用于以下两项研究中：(1)cAMP研究：按照在材料中描述的(对照)或再加入载体(对照1样品)或cAMP(cAMP样品)来分化CD34+细胞；以及(2)罗格列酮研究：将CD34+细胞按照在材料中表述的方法进行分化，只是在脂肪生成培养基中不加入罗格列酮(对照2样品)。在本研究中，罗格列酮只添加到第二个样品(罗格列酮样品)中。
我们发现，这些化合物促使CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞并促进UCP1的表达(见图3(B)、(C))。
从这些细胞中纯化总RNA，并用Illumina人WG-6BeadChip(Expression Analysis，Inc.，Durham，NC)评估转录谱。用Ingenuity Pathway Analysis 7.0(试用版本)分析结果。用这些结果来确定参与CD34+细胞分化为褐色脂肪细胞的分子途径，并且更重要的是，确定哪些分子靶标可用于开发促进褐色脂肪细胞出现和UCP1表达的药剂。
该工作显示，以下作用/药剂可促进褐色脂肪细胞的发育：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂(例如罗格列酮)，PPARα激活剂或调节剂(例如，GW9578)，PPARδ激活剂或调节剂(例如GW501516或GW0742)，PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂，泛PPAR(α、δ、γ)激活剂或调节剂(例 如，GW4148)，PDE4抑制剂(例如咯利普兰或IBMX)，PDE7抑制剂(如BMS 586353或BRL 50481或IBMX)，NRIP1(RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂(例如双过氧化钾(双吡啶)氧钒酸盐或双过氧化二钾(5-羟基吡啶-2-羧基)氧钒酸盐)，α1-肾上腺素能完全或部分激动剂(如苯福林或西拉唑啉)，RXRα激活剂或调节剂(例如LGD 1069(塔革雷汀)或9-顺式视黄酸)，PGC-1α激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂，脂联素或者脂联素受体AdipoR1和/或AdipoR2激活剂，NOS抑制剂或激活剂(如2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)或腺苷)，Rho激酶-ROCK抑制剂(例如，法舒地尔)，BDNF，单胺氧化酶(MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂(例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司来吉兰)，SRC激活剂，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白)，FAAH抑制剂(如，URB597)，MAPK 1(如，PD98059)或2(如PD98059)或4或5或7或8(如，PD98059)的抑制剂，CDK9抑制剂(如，1，5，6，7-四氢-2-(4-吡啶基)-4H-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮盐酸盐)，TGR5激动剂(如，齐墩果酸)，AMPK激活剂(如，AICAR)，BMP-7，mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)，腺苷酸环化酶激活剂(例如，毛喉素)，或上述任何药剂的组合。
材料和方法
从Sigma Chemical Co.(St Louis，MI)和Gibco BRL(New York，NY)购得所有有机和无机的分析级或分子生物学级化学品。
人组织
遵循机构审查委员会方案，从Pittsburgh大学Magee女子医院获得了(在自发、自愿和治疗性妊娠终止后)的匿名人胎儿组织。通过测量足长度来估计发育阶段(怀孕16至24周)。对所有情况均获得了患者对使用胎儿组织的知情同意。废弃的成人腹部皮下WAT(其来自在胃旁路手术一年后进行整形手术的45-55岁患者)由Peter Rubin医生(Division ofPlastic Surgery，Pittsburgh大学整形外科部)惠赠。从死亡后的50-78岁捐献者中获得了用于细胞分选的成人骨骼肌组织。用于第一组RT-PCR研究的成人骨骼肌在手术中(束胃带手术、***手术或子宫切除术)从10个清瘦的男性和女性个体的腹直肌获得。所有受试者均同意在其手 术中捐献肌肉样品，而且实验方案已经Deakin大学的医学伦理审查委员会批准。平均年龄为45±3岁，平均体重指数为22.2±0.8。用于第二组RT-PCR实验的成人骨骼肌获取自在治疗前和用罗格列酮治疗8周(每天2×4mg)后，7位患2型糖尿病的男性和女性肥胖症患者的股外肌。平均年龄为63±4岁，并且平均身体质量指数为29.9±3.8。在之前所发表文章中表述了患者的完整临床特点[18]。所有个体均同意捐献肌肉样品，而且实验方案已经Maastricht大学的医学伦理审查委员会批准。
小鼠
将动物按照Centre Médical Universitaire(Genève)机构准则进行处理。将它们在12小时光周期的房间中单独饲养，温度控制为24℃。允许它们随意食用水和标准实验室饲料。切下4至6周龄雄性129Sv/ev小鼠的肩胛间BAT，分离其前体细胞并按照之前所述进行培养[19]。
免疫组织化学
通过浸入用液氮冷却的异戊烷而逐步冰冻新鲜的胎儿和成体组织。在低温恒温器(Microm HM 505E)上切成5至7μm的切片，用50％丙酮和50％甲醇固定，在室温(RT)下干燥5分钟，然后在磷酸盐缓冲液中清洗3次，每次5分钟。用5％山羊血清在RT下封闭非特异结合位点1小时。将切片在4℃下用CD34小鼠抗人抗体(Serotech，1∶50)孵育过夜，然后，在润洗后，用山羊抗小鼠生物素化二抗(DAKO，1∶1000)在RT孵育1小时，用链霉亲合素-Cy3(Sigma，1∶1000)在RT下孵育30分钟，或用缀合的CD 146-Alexa 488小鼠抗人抗体(Chemicon，1∶200)在室温下孵育2小时。在RT下用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(MolecularProbes，1∶2000)对核染色5分钟。每步免疫染色都使用同种型匹配的阴性对照。
流式细胞术
用流式细胞术分析胎儿骨骼肌、胰腺、肺和肝及成体肌肉和WAT中的血管细胞。在含有20％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(PS)和胶原酶IA-S、II-S和IV-S(1mg/mL)的高糖Dulbecco优化的Eagle培养基(DMEM)中，将新鲜的胎儿或成人肌肉以及胎儿胰腺、肺和肝组织 用手术刀切碎，而后在持续搅拌下在37℃下孵育75分钟(胎儿组织)或90分钟(成体组织)。在毛玻璃片之间实现最终的细胞分离。将细胞用磷酸盐缓冲液清洗并在350g下离心5分钟。将它们重悬在含20％FBS的DMEM中，100μm过滤，用台盼蓝染色，并在除去死细胞后计数。按照Champigny等的表述[20]通过胶原酶消化制备WAT血管基质级分。在1ml含有20％FBS、1％青霉素-链霉素的DMEM中，在4℃下将细胞(分析使用105个，分选使用约30.106个)用以下直接偶联的小鼠抗人抗体之一孵育15分钟：CD45-APC Cy7(Santa CruzBiotechnologies，1∶200)，CD56-PE Cy7(BD Pharmigen 1∶100)，CD34-PE(DAKO，1∶100)和CD146-FITC(Serotec，1∶100)。在清洗和离心后，将细胞与7-氨基-放线菌素D(7-AAD，BDPharmigen，1∶100)孵育30分钟以去除死细胞，70□m过滤，并在FACS Aria流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行分析。作为阴性对照，将细胞的等分试样与缀合有APC Cy7(BDPharmigen，1∶100)、PE Cy7(BD Pharmigen，1∶100)，PE(Chemicon，1∶100)和FITC(USBiological，1∶100)的同种型匹配的小鼠IgG在相同条件下孵育。
细胞培养
以2.104个/cm2将细胞接种在0.2％明胶包被的培养板上，37℃下在EGM2培养基(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD)上培养直至汇合(4-6天)，并在Rodriguez等[21]描述的修改的脂肪生成培养基中培养直至分化(再培养8-12天)，所述培养基为含有0.86μM胰岛素、10μg/ml转铁蛋白、0.2nM三碘甲腺原氨酸、1μM罗格列酮(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)、100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM***和1％青霉素-链霉素的DMEM-Ham′s F-12培养基。为进行细胞扩增研究，通过用胰酶-EDTA在37℃下处理3-5分钟而使仅在EGM2培养基中培养的汇合细胞脱壁，而后以1∶3传代，并按照上述培养。按照之前的描述[22]的获得在血氧定量法研究中使用的原代培养人白色脂肪细胞。
RT-PCR
用试剂盒
Figure BDA0000665658730000191
RNAII(Clontech，Palo Alto，CA)或 Extract-all溶液(Eurobio，Courtaboeuf，France)制备细胞总RNA，并用生物光度测定法(生物光度测定仪，Eppendorf)定量。含oligo-dT的cDNA第一链用SuperscriptTM II RNase H逆转录试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)和oligo-dT引物合成，或用High Capacity cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)和随机引物合成。使用ABI快速热循环***和SYBRGreen PCR master mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行定量实时PCR。用亲环素A作为对照，以补偿因逆转录效率而产生的任何变化。上游和下游寡核苷酸引物选自内含子的两侧，以防止污染的基因组DNA发生扩增。
在人细胞和小鼠褐色脂肪细胞中的实时定量PCR中使用的引物如下：
人UCP1
正向引物：5’-CCTCACCGCAGGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO：1)
反向引物：5’-CTAACGACTGGAGGAGTGGCA-3’(SEQ ID NO：2)
扩增子位置：429-504
登记号：NM_021833
小鼠UCP1
正向引物：5′-CGATGTCCATGTACACCAAGGA-3′(SEQ ID NO：3)
反向引物：5′-TTGTGGCTTCTTTTCTGCGA-3′(SEQ ID NO：4)
扩增子位置：996-1063
登记号：NM_009463.2
人瘦素
正向引物：5’-CCAAAACCCTCATCAAGACAATT-3’(SEQ ID NO：5)
反向引物：5’-AAGTCACCGGTTTGGACTTCA-3(SEQ ID NO：6)
扩增子位置：143-238
登记号：BC069323
人亲环素A
正向引物：5’-CATCTGCACTGCCAAGACTGA-3’(SEQ ID NO：7)
反向引物：5’-GCAAAGTGAAAGAAGGCATGAA-3’(SEQ ID NO：8)
扩增子位置：466-537
登记号：NM_203431
小鼠亲环素A
正向引物：5′-CAAATGCTGGACCAAACACAA-3′(SEQ ID NO：9)
反向引物：5′-CCATCCAGCCATTCAGTCTTG-3′(SEQ ID NO：10)
扩增子位置：343-412
登记号：NM_008907
用于人骨骼肌的实时定量PCR的引物如下：
人UCP1
正向引物：5′-TCCGGCTCCAGGTCCAA-3′(SEQ ID NO：11)
反向引物：5′-TGATTGTTCCCAGGACACCTTT-3′(SEQ ID NO：12)
扩增子位置：240-311
登记号：NM_021833
人亲环素A
正向引物：5’-CATCTGCACTGCCAAGACTGA-3’(SEQ ID NO：7)
反向引物：5’-GCAAAGTGAAAGAAGGCATGAA-3’(SEQ ID NO：8)
扩增子位置：466-537
登记号：NM_203431
分析性PCR中所用引物如下：
CD34
正向引物：5′-CATCACTGGCTATTTCCTGATG-3′(SEQ ID NO：13)
反向引物：5′-AGCCGAATGTGTAAAGGACAG-3′(SEQ ID NO：14)
扩增子位置：1172-1591
登记号：M81104
CD56
正向引物：5′-GTATTTGCCTATCCCAGTGCC-3′(SEQ ID NO：15)
反向引物：5′-CATACTTCTTCACCCACTGCTC-3′(SEQ ID NO：16)
扩增子位置：542-873
登记号：BC014205
CD45
正向引物：5′-CATGTACTGCTCCTGATAAGAC-3′(SEQ ID NO：17)
反向引物：5′-GCCTACACTTGACATGCATAC-3′(SEQ ID NO：18)
扩增子位置：940-1579
登记号：Y00638
CD146
正向引物：5′-AAGGCAACCTCAGCCATGTCG-3′(SEQ ID NO：19)
反向引物：5′-CTCGACTCCACAGTCTGGGAC-3′(SEQ ID NO：20)
扩增子位置：168-603
登记号：M28882
β-肌动蛋白
正向引物：5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′(SEQ ID NO：21)
反向引物：5′-GGAATCCTTCTGACCCATGC-3′(SEQ ID NO：22)
扩增子位置：25-229
登记号：NM_001101
通过以亲环素mRNA水平归一化的靶mRNA水平来确定主观单位(基于Ct)，其中为了易于进行参照，先将亲环素的水平除以100,000。例如，靶mRNA与亲环素mRNA比值为0.01797，则表示为1797。
验证人UCP1扩增子
通过TOPO-TA克隆***(Invitrogen，Carlsbad，CA)将扩增的PCR片段克隆入pCR2.1-TOPO载体，使用Qiaprep Spin Miniprep(Qiagen，Hilden，Germany)对颜色选择的集落进行纯化。在ABI 3700自动测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，采用Applied Biosystem Big Dye测序试剂盒，在pCR2.1-TOPO上用M13反向寡核苷酸来测定序列。
Western印迹
在200μlRIPA缓冲液(150mM NaCl，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1∶200蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemical Co，St Louis，MI)和50mM Tris/HCl pH8.0)中，用橡胶刮棒收集培养细胞。将人BAT和骨骼肌细胞在上述RIPA缓冲液中匀浆。按照Lowry技术[23]测定蛋白含量。按照之前表述的方法[24]进行Western印迹。使用B.Cannon博士(Stockholm，Sweden)惠赠的兔抗小鼠UCP1多克隆一抗，以1/500稀释度检测UCP1蛋白。该抗体针对小鼠UCP1的C端十肽，所述十肽与人UCP1有80％的同一性，与UCP2和UCP3分别有0和10％的同一性。用1/5000倍稀释的小鼠抗小鼠GAPDH单克隆一抗(ChemiconInternational，Inc，Temecula，CA)检测磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白。使用了1/5000倍稀释的山羊抗兔或抗小鼠的过氧化物酶标记的二抗(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO或Bio-Rad，Hercules，CA)。使用
Figure BDA0000665658730000232
Plus 2预染标准梯度(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用标准ECL试剂盒通过化学发光来检测蛋白信号，并在Hyperfilm ECL上显影。
高分辨率氧消耗测量
氧消耗使用装备了Peltier恒温器、克拉克型电极和整合的电磁搅拌机的两压射室呼吸计(
Figure BDA0000665658730000231
Oxygraph，Oroboros，Innsbruck，Austria)来测量。测量在2mlDMEM F12、10％新生牛血清中，在37℃且持续搅拌下进行。在这些条件下，血清提供了维持UCP1解偶联活性所需的脂肪酸。在每个氧消耗测量前，用空气平衡室里的培养基30分钟，而后用将刚用胰酶消化的细胞转入呼吸计玻璃室中。在观察到稳态呼吸流量后，用寡霉素(0.25-0.5mg/l)抑制ATP合酶，将细胞用解偶联剂羰基氰-3-氯-苯腙滴定到最佳浓度(1-2μM)。用抗霉素A(1μg/ml)抑制呼吸链。用DataGraph软件(Oroboros software)计算氧消耗。
基因芯片
按照以上的表述制备培养至3代(4周)的胎儿肌肉CD34+细胞和人肌肉活检样品的总RNA。由Expression Analysis，Inc.(Durham，NC)进行质量确认检测、制备cRNA靶标，以及用Illumina Human WG-6 BeadChip进行基因芯片分析。用BeadStudio非参量方法计算检测P值。数据分析
数据用平均值±标志物表示。用未配对Student t检验来评估显著性。用配对Student’s t检验确定罗格列酮对人骨骼肌UCP1mRNA水平的作用。显著性设定为p＜0.05。
克隆人UCP1启动子/增强子区：
为了开发我们的筛选策略，按照以下所述进行人UCP1启动子/增强子的亚克隆：
从CHORI(Oakland儿童医院研究所)BAC-PAC资源服务获得含有人UCP1(解偶联蛋白1)启动子/增强子区的人BAC(细菌人工染色体)克隆#RP11-5K16(AC 108019)。所选的启动子/增强子区起始于人UCP1基因(登记号：NM_021833)5’UTR(非翻译区)上游-25位。根据UCP1基因的起始密码子，完整克隆的启动子/增强子序列位于-149位到-6269位之间。
设计引物对扩增以下区域：
i)完整的靶标启动子/增强子区(6120bp，起始于UCP15’UTR上游-25位)，左引物：
5’-TCGTAAGCTTAGAGGCGGCGGCTGCAGACGGAGCGCGGTGTT-3’(SEQ ID NO：23)
右引物：
5’-ACGAAGATCTCATTACCCCAAATAGCATCACA-3’(SEQ ID NO：24)
ii)近端靶标启动子/增强子区(3685bp，起始于UCP15’UTR上游-25位)，左引物：
5’-TCGTAAGCTTAGAGGCGGCGGCTGCAGACGGAGCGCGGTGTT-3’(SEQ ID NO：25)
右引物：
5’-ACGAACCGGTCAGAAGTGGTGAAGCCAGCCTGC-3’(SEQ ID NO：26)
iii)远端目的启动子/增强子区(2435bp，近端目的启动子/增强子区域上游)，
左引物：
5’-TCGTACCGGTACAGGCTCTGGGAAGTAGGAGAAAGT-3’(SEQ ID NO：27)
右引物：
5’-ACGAAGATCTCATTACCCCAAATAGCATCACA-3’(SEQ ID NO：28)
每个引物均含有限制性位点以便于随后克隆入哺乳动物表达载体中(见下文)。
以500ng的BAC#RP11-5K16作为模板，用Takara Ex Taq DNA聚合酶试剂盒(Clontech)在PCR反应中进行启动子/增强子的克隆。PCR程序按照以下设置：起始步骤，92℃2分钟，其后是28个循环：变性92℃-30秒/退火：59℃-40秒/延伸：68℃-5分钟30秒，最后延伸步骤为68℃-8分钟。
随后将完整启动子/增强子、近端或远端启动子/增强子依次亚克隆到含有报告子/MAR元件的载体p1_68_GFP中的BlgII/HindIII位点，替换SV40启动子盒[25]。或者，可用基于萤光素酶的pGL3基本载体(Promega)作为另一个报告子类型，用相同的BglII/HindIII位点进行亚克隆。
人UCP1启动子序列克隆通过生物技术公司Fastens SA，Switzerland用现有技术测序进行确认。人UCP1启动子序列在提供如下(SEQ ID NO.29)：
5’-
CATTACCCCAAATAGCATCACATTCTATCTCTGGATCACCATTTTTACACTTATCTAGAATTTGCCCACCTGTAGTTTCCACTCTTCGGCACTAATTATTTTGCTTAATTGCGTACAGAACAAATCTACCCCGTCCACTGTCTATGCCTTCAAGTATCTGAGAACAGTAATGTCCTGTTCGGTAAGTCATTTTCTCCTTTTCACTCTCTGGTCCTTCCATGGGGCTTCAATCCCCATACACCTCTTTTTTCTAAATTTCATAGGTCAGTTTTCCTGTCTCTTCTACCAGGTTCTACTGAAGATGAAAAAAAGTGCTTTTTTAAACCAAAAGTATTGCAATGTTTATTTTATCTTTGTAAGTTCCTTAGTAATATATACAAATCAAGTAAAAGATATATGTTGCATGTGATATTTTAACTTTTGATATGACTTATTGAAAAAATATATAAGGATACATAGCCATTGTGTGTCTTCAAATCATAGGAAAGTATCATGTCGCGAATGTATTGGGAAGGCAGTTGGGGTATCACGTAGTAGTTGAGAGTTAGGGGGTCAGGCAGATCCTCAGTGTACCATTTACTGGTTCCGTGACCTAGGAGAAGTTATTTAACTTCTCTGAGCCTCTGAGTTTCCTCATCAGTGAAGTGGGAATAACAATAATATATGCCTCCAAAGGCCGCAATGAGGACTAACTGTGTTAAGTT TTGTAAAATGCCTAAAATATTATAGTGTCTGGCACTTGTTCAATGCTATGTATTTGTTAAATACATGACATGAATAAATCTTTCATTGAGTTATGAGGATTAGGTACATCAGGTGCTTAGCATAAAGAGTGATTTATTAATAAGAATAGGCTCATGATGCAGGAATATTCATCACATATGTAAATAATCTGAAGCTCAGAGAAGTTAAGTAATTTGGCCATGCTTACCCAGTCAGTTATTATCTTAGTGAGAATTTGAACATGGGCCTCCTGGTCTCTTAATCACCATGCTATACCACTTATATCAGCATAGAAATGGAATATTTTCTCCTTAACGCAGAGTTTGATAGTCTTTGTCTCTTTGTATTGGGCTGGACTAAGAAAACCCAATCCTGTCCTCTTTCTACTTTTTCTCTGTTCCTAAGAGCACTCCCCTTTCTCTGTTGTATATCAGTTCCTAATGGTAGACACTTGAGCACCACTATTCTGTACAGCTCTCCGACAATCCCACATCTAGATGCCAAGCTGAGGTTGGCATTCTCACTAATTTGCTGTTATAAATATTAAGCTATCATAAGCGTTAGCCTACATATGACTCTTTCATATGTTAGTTAATTATTTTAGGGTAGAAATCCAAAAGTGGAGTTACCAGAAGTGGATATAGACATTCTGGCTGGGTGTGATGGTTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATCACTTGAGGCCAGGAGTTTGAGATCAGCCTGGGCCAACACAGCGAAACCCCATCTCTACTAAAAATTCCAAAACTAGCCAGGCATAGTGGCACATGCCTGTACTCCCAGCTACTTGGGAGGCTAAGACACAAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGGAGGTGGAGGTTGCGGTGAGCTGAGATTGTGCCACCGTACTCCAGCCTGGGTGACACAGCTAGACTCTGTTTCAAAAAAAAAAAGAAAAAGAAAAGAAAAAAATAGACTTTCTCTTGGCTCAGTGTATACTGCCAAATTGTTTTCCAAAAAAATTGTGTCAATGTATAACACCATCACTAATATAGTATTGATATTATGGTTATTACATTTTAAAATTCATAATTTGTAATTATAACATTCATAATTTATTACTATTTATAATATTAATGTAAATGTATATTATATATAAATGTTATAGTAATTATAACTTTGGTAGTGACAAAGTATTAATTTATTAGGTGAAGTATATGCTTTTTTATTAGTGATAATAAATATATCCTCTCTCCCATTATAAAAGTTTGTATTTCTTCTTTTAGAAATTGATTCTTCTGTCATTTGCACATTTATCTGTATAATTATAACAGGGTATTTCCCAGTGGTGGCTAATGAGAGAATTATGGGAAAGTATAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATGATTTTTATTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATGTGTTCTACATTTTCAAAAAGGAAAGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGCTACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGACCTATTCTTTACCTCTCTGCTTCTTCTTTGTGCCAGAAGAGTAGAAATCTGACCCTTTGGGGATACCACCCTCTCCCCTACTGCTCTCTCCAACCTGAGGCAAACTTTCTCCTACTTCCCAGAGCCTGTCAGAAGTGGTGAAGCCAGCCTGCTCCTTGGAATCCAGAACTACTTTCAGAATCTTGAACTTCTGTGACCTCTCAGGGTCCCCTTGTGTGAAGTTTTTGACGTCAGCTTCTCCTGTGACCCTTAGAAGTCACTCTTGTGTCTAGCACATCCCAGGTGCTCAGTCACCATTGAACTACAGTCATACTATCTCCTGGCAAAGGCTCTTAACTGTCCATGTTAGCCTGATATTAATATCCTGGAAGCTTATACTGTCGTTCTTCCTTCCAGGTTTAAATAAGGCAGCCCCTTTATCCTGTCACAGGTCCTCTCTCCCTACCTATCCTTACCTGTTTTGGATAACAACCTTTCTTATTTCTAATAGATTTATTTATTTCTCACATTTCCTTCCCTTAT 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本说明书的分段标题和小标题仅用于组织的目的，而不应认为是以任何方式对所述主题进行限制。进一步讲，尽管本教导内容是与多个实施方案结合进行表述的，但本教导内容并不局限于这些实施方案。相反，本领域技术人员会认识到，本教导内容包括多种变化形式、变更及等同方案。
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.一种用于鉴定细胞群体中的BAT祖细胞的方法，其包括：
提供至少两个细胞；
使所述至少两个细胞与抗体接触，其中所述抗体对与内皮细胞相关而不与造血细胞、成肌细胞或周细胞相关的标志物具有特异性，并且
确定与所述抗体结合的细胞；
其中将与该抗体结合的细胞鉴定为BAT祖细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体对CD34具有特异性。
3.权利要求1的方法，其中所述接触步骤还包括，在将所述细胞与对内皮细胞相关标志物具有特异性的抗体接触前：
将所述细胞与抗体接触，所述抗体对与造血细胞、成肌细胞和周细胞中至少之一相关的标志物具有特异性；并且
去除与所述抗体结合的细胞，所述抗体对与造血细胞、成肌细胞和周细胞中至少之一相关的标志物具有特异性。
4.权利要求1的方法，其还包括分离被鉴定为BAT祖细胞的细胞。
5.用于诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的方法，其包括：
提供BAT祖细胞；并且
使所述BAT祖细胞接触分化培养基；
其中所述分化培养基诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
6.权利要求4的方法，其中分化培养基包含以下一种或多种：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂；PPARα激活剂或调节剂；PPARδ激活剂或调节剂；PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂；泛PPAR(α、δ、γ)激活剂或调节剂；PDE4抑制剂；PDE7抑制剂；NRIP1(RIP140)抑制剂；PTEN抑制剂；α1-肾上腺素能完全或部分激动剂；RXRα激活剂或调节剂；PGC-1α激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂；脂联素或者脂联素受体AdipoRl和/或AdipoR2激活剂；NOS抑制剂或激活剂；Rho激酶-ROCK抑制剂；BDNF；单胺氧化酶(MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂；SRC激活剂；EGFR抑制剂；FAAH抑制剂；MAPK 1或2或4或5或7或8的抑制剂；CDK9抑制剂；TGR5激动剂；AMPK激活剂；BMP-7；mTOR抑制剂；腺苷酸环化酶激活剂；或上述的任何组合。
7.权利要求4的方法，其中所述分化培养基包含罗格列酮。
8.用于治疗患者中代谢疾病或病症的方法，其包括在该患者中诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述代谢疾病为以下之一：肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
10.用于鉴定诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞之药剂的方法， 其包括：
提供BAT祖细胞；
使所述BAT祖细胞与药剂接触；
确定所述BAT祖细胞是否显示出分化成褐色脂肪细胞的指标。
11.权利要求10的方法，其中分化的指标为以下一种或多种的提高：UCP1蛋白或mRNA的表达、mtTFA蛋白或mRNA的表达、PGC-1α蛋白或mRNA的表达、解偶联呼吸作用、代谢率、葡萄糖利用速率、脂肪酸氧化速率，以及任何以上的组合。
12.用于鉴定诱导UCP1表达或活性水平之药剂的方法，其包括：
提供BAT祖细胞；
使所述BAT祖细胞与药剂接触；
确定所述BAT祖细胞是否显示出UCP1表达或活性的提高。
13.权利要求12的方法，其中所述UCP1表达或活性的提高是由于以下一种或多种：提高UCP1基因的转录、使UCP1mRNA稳定、提高UCP1mRNA的翻译、使UCP1蛋白稳定、活化UCP1蛋白、降低对UCP1基因表达的抑制、降低对UCP1活性的抑制。
14.用权利要求10的方法或权利要求12的方法鉴定的药剂用于制造治疗患者代谢疾病之药物的用途。
15.权利要求12的方法，其中所述代谢疾病为以下之一：肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
16.用权利要求10的方法或权利要求12的方法鉴定的药剂用于制造预防体温过低之药物的用途。
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Claims (13)

1.一种分离的BAT祖细胞，其中所述分离的BAT祖细胞获自成人骨骼肌，并且对于CD34标志物为阳性、对于CD45标志物为阴性、对于CD56标志物为阴性以及对于CD146标志物为阴性，
其中所述BAT祖细胞通过以下分离：
提供分离自成人骨骼肌的细胞；并且
确定CD45标志物为阴性、CD56标志物为阴性、CD34标志物为阳性且CD146标志物为阴性的细胞；并且
其中将所述CD45标志物为阴性、CD56标志物为阴性、CD34标志物为阳性且CD146标志物为阴性的细胞鉴定为分离自成人骨骼肌的BAT祖细胞。
2.权利要求1所述的分离的BAT祖细胞，当在分化培养基中体外培养时，其能够被诱导分化为褐色脂肪细胞。
3.权利要求2所述的分离的BAT祖细胞，其中所述分化培养基包含以下一种或更多种：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂；PPARα激活剂或调节剂；PPARδ激活剂或调节剂；PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂；泛PPAR α、泛PPAR δ、泛PPAR γ激活剂或调节剂；PDE4抑制剂；PDE7抑制剂；NRIP1（RIP140）抑制剂；PTEN抑制剂；α1-肾上腺素能完全或部分激动剂；RXRα激活剂或调节剂；PGC-1α 激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂；脂联素或者脂联素受体AdipoRl和/或 AdipoR2激活剂；NOS抑制剂或激活剂；Rho激酶-ROCK抑制剂；BDNF；单胺氧化酶A抑制剂和/或单胺氧化酶B抑制剂；SRC激活剂；EGFR抑制剂；FAAH抑制剂；MAPK 1或2或4或5或7或8的抑制剂；CDK9抑制剂；TGR5激动剂；AMPK激活剂；BMP-7；mTOR抑制剂；腺苷酸环化酶激活剂；或上述的任何组合。
4.权利要求2所述的分离的BAT祖细胞，其中所述分化培养基包含罗格列酮。
5.权利要求1所述的分离的BAT祖细胞，其用于治疗患者的代谢疾病或病症。
6.权利要求5所述的分离的BAT祖细胞，其中所述代谢疾病或病症为以下一种或多种：肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
7.诱导褐色脂肪细胞的出现的方法，其包括：
由权利要求1所述的BAT祖细胞体外分化为褐色脂肪细胞，其显示出分化的指标。
8.权利要求7所述的方法，其中所述分化的指标为以下一种或更多种的提高：UCP1蛋白或mRNA的表达、mtTFA蛋白或mRNA的表达、PGC-1α蛋白或mRNA的表达、解偶联呼吸作用、代谢率、葡萄糖利用速率、脂肪酸氧化速率，以及任何以上的组合。
9.权利要求7所述的方法，其中所述BAT祖细胞在分化培养基中体外培养。
10.权利要求9所述的方法，其中所述分化培养基包含以下一种或更多种：PPARγ激活剂、调节剂或抑制剂；PPARα激活剂或调节剂；PPARδ激活剂或调节剂；PPARα和PPARδ双激活剂或调节剂；泛PPARα、泛PPARδ、泛PPARγ激活剂或调节剂；PDE4抑制剂；PDE7抑制剂；NRIP1（RIP140）抑制剂；PTEN抑制剂；α1-肾上腺素能完全或部分激动剂；RXRα激活剂或调节剂；PGC-1α 激活剂；PGC-1β抑制剂或激活剂；脂联素或者脂联素受体AdipoRl和/或 AdipoR2激活剂；NOS抑制剂或激活剂；Rho激酶-ROCK抑制剂；BDNF；单胺氧化酶A抑制剂和/或单胺氧化酶B抑制剂；SRC激活剂；EGFR抑制剂；FAAH抑制剂；MAPK 1或2或4或5或7或8的抑制剂；CDK9抑制剂；TGR5激动剂；AMPK激活剂；BMP-7；mTOR抑制剂；腺苷酸环化酶激活剂；或上述的任何组合。
11.权利要求9所述的方法，其中所述分化培养基包含罗格列酮。
12.权利要求7至11中任一项权利要求所述的方法，其中所获得的褐色脂肪细胞用于治疗患者的代谢疾病或病症。
13.权利要求12所述的方法，其中所述代谢疾病或病症为以下一种或多种：肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
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