CN104957038B

CN104957038B - 草莓种质离体保存的方法

Info

Publication number: CN104957038B
Application number: CN201510398994.1A
Authority: CN
Inventors: 张国芳; 沈岚; 毛碧增; 黄坚; 王芳; 朱宏芬; 刘健; 严成其
Original assignee: Ningbo Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Ningbo Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN104957038A

Abstract

本发明公开了一种草莓种质的离体保存法，依次包括以下步骤：1)、取无病斑、无虫瘿的健康草莓匍匐茎自来水冲洗；2)、剥取草莓匍匐茎的茎尖分生组织0.4～0.6mm，将其接种至MS培养基上进行培养；3)、待茎尖分生组织长成至0.5cm小苗时，将其转接至增殖培养基上进行培养；4)、待步骤3)所得的不定芽生长到1.5cm时，将其接种于生根保存培养基上进行生根培养；5)、将步骤4)所得的草莓组培小苗连同生根保存培养基一起于冷藏箱0～4℃保存，弱光培养，光照强度5～10μmol m^‑2.s^‑1。采用本发明的方法能解决常规种子圃保存中遇到的受病虫害影响，品种退化等一系列问题。

Description

草莓种质离体保存的方法

技术领域

本发明涉及一种草莓种质离体保存的方法。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa Duch.)属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生常绿草本植物，是世界上广泛栽培的重要经济作物。但国内草莓主栽品种单一，目前品种退化现象严重，因此需要选育优良品种，而解决好草莓优良品种选育的第一步工作，就在于建立草莓种质资源库，经济有效地保存种质资源，为草莓的育种工作奠定基础。草莓一般靠匍匐茎进行营养繁殖，传统的种质圃保存方法需要常年种植以及管理草莓植株，在保存过程中不仅容易受病虫害、水肥等各种因素的影响，而且长期保存可能会使原有品种的优良性状退化，因此利用生物技术找到合适的种质保存技术是当务之急。

通过草莓茎尖分生组织获得优质草莓组培苗，利用抑制试管苗生长及低温保存方法长期保存草莓种质资源。

据文献查阅，目前草莓种质的离体保存方法一般为选择抑制生长型培养基，即在培养基中添加多效唑、甘露醇、脱落酸等抑制剂，常温保存；在培养基中添加这些抑制剂在种质恢复生长之后可能会有一定的不良影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用组培脱毒技术离体经济有效地保存草莓种质资源的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种草莓离体保存方法，包括以下步骤：

1)、取无病斑、无虫瘿的健康草莓匍匐茎自来水冲洗(例如放入烧杯中进行水洗，冲洗时间为1小时左右)；

2)、步骤1)所得的草莓匍匐茎经消毒(为常规消毒，即体积浓度75％酒精消毒30秒，质量浓度0.1％升汞溶液消毒10min)后，剥取草莓匍匐茎的茎尖分生组织0.4～0.6mm(例如为0.5mm)，将其接种至MS培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1(较佳为15～25μmol m^-2.s^-1)，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

3)、待茎尖分生组织长成至0.5cm小苗时，将其转接至增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol m^-2.s^-1(较佳为15～25μmol m^-2.s^-1)，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

4)、待步骤3)所得的不定芽生长到1.5cm时，将其接种于生根保存培养基上进行生根培养，培养时间为6～8天(即一周左右)；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmolm^-2.s^-1(较佳为15～25μmol m^-2.s^-1)，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

5)、将步骤4)所得的草莓组培小苗连同生根保存培养基一起(即，整瓶)于冷藏箱0～4℃保存，弱光培养，光照强度5～10μmol m^-2.s^-1。

备注说明：保存6个月左右，苗的长势、长度、根数及根长基本无变化(即，保存起始日、保存终止日上述内容基本是一致的)。

作为本发明的草莓种质的离体保存法的改进：保存1年后更换生根保存培养基继续0～4℃保存，弱光培养，光照强度5～10μmol m^-2.s^-1。

作为本发明的草莓种质的离体保存法的进一步改进：所述步骤2)中的MS培养基为MS基本培养基+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0。

该MS培养基的制备方法为：以MS基本培养基为基础，每1L的MS基本培养基中加入30g糖、8g琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0。

作为本发明的草莓种质的离体保存法的进一步改进：所述步骤3)中的增殖培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.3～0.5mg/l+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0。

该增殖培养基的制备方法为：以MS基本培养基为基础，每1L的MS基本培养基中加入0.3～0.5mg 6-苄氨基嘌呤、30g糖、8g琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0。

作为本发明的草莓种质的离体保存法的进一步改进：其特征是步骤4)中的生根保存培养基为：不含有机成份的1/2MS基本培养基(改良的1/2MS基本培养基)+糖15g/l+琼脂10g/l，pH为5.5～6.0。

该生根保存培养基的制备方法为：以不含有机成份的1/2MS基本培养基为基础，每1L的不含有机成份的1/2MS基本培养基中加入15g糖、10g琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0。

不含有机成份的1/2MS基本培养基，即溶液中大量元素、微量元素、铁盐的含量均为MS基本培养基的一半，不含任何含量的有机成分。

备注说明：MS基本培养基由大量元素、微量元素、铁盐、有机成份组成，此为常规技术(即，成分、含量均属于共知技术)。

本发明的发明点主要为：设置了合适的生根保存培养基的配方，且设置了合适的保存光照强度和保存温度。从而实现了草莓种质的长期离体保存，即，延长了保存时间。

本发明的草莓种质离体保存法，属于种质异地保存方法中的离体保存方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，然后抑制试管苗生长(生根保存培养基抑制草莓苗生长)，同时利用草莓休眠温度，通过低温保存，培养基抑制生长，即采用复合抑制生长措施，获得一套完整的草莓种质离体保存技术。采用本发明的方法，可以使草莓各个种质资源(即，各个不同的草莓品种)接种于抑制生长的合适培养基(生根保存培养基)中保存于实验室冷藏箱中1年以上，通过更换培养基可保存数年，因此这种生物技术保种不仅经济、方便，还能解决常规种子圃保存中遇到的受病虫害影响，品种退化等一系列问题。

具体实施方式

实施例1：一种草莓种质离体保存的方法，依次进行以下步骤：

1)、取无病斑、无虫瘿健康“红颊”草莓匍匐茎，放入烧杯中，自来水冲洗1小时；

2)、步骤1)所得的匍匐茎经常规消毒，即75％(体积％)酒精消毒30秒，0.1％(质量％)升汞消毒10min，剥取草莓茎尖分生组织0.5mm左右，将其接种至MS培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度15～25μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

MS培养基为：MS基本培养基+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0。

3)、待上述茎尖分生组织长成至0.5cm左右小苗时，将其转接于接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度15～25μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

增殖培养基为：MS基本培养基+6-BA0.5mg/l+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0。

4)、待不定芽生长到1.5cm左右，接种于生根保存培养基上进行生根培养一周；培养条件为：16小时光照，光照强度15～25μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

生根保存培养基为：不含有机成份的1/2MS基本培养基(改良的1/2MS基本培养基)+糖15g/l+琼脂10g/l，pH为5.5～6.0。

5)、将以上步骤所得的草莓组培小苗整瓶(即，连同生根保存培养基一起)放置于冷藏箱中保存，弱光培养，保存条件为：温度0～4℃，光照强度5～10μmol m^-2.s^-1。

保存180天苗的长势、长度、根数及根长基本无变化。具体如表1所述。三个重复，每重复十棵苗，取平均值。

表1

苗生长情况	原始	保存180天	保存13个月
				长势	良好	良好	良好
长度(cm)	2.33	2.45	2.69
				根数	3.67	3.78	4.01
根长(cm)	1.58	1.61	1.79

6)、保存1年更换生根培养基继续保存，保存、弱光培养的条件同步骤5)。

保存第13个月时，对苗的长势、长度、根数及根长进行检测，所得结果如表1所示。

因此，依照上述方法，可成功保存“红颊”草莓种质资源，比常规种质圃种质保存更方便，更经济。

实施例2：将实施例1中的“红颊”草莓匍匐茎改称“章姬”草莓匍匐茎；其余同实施例1。

所得结果如下表2所示。

表2

苗生长情况	原始	保存180天	保存13个月
				长势	良好	良好	良好
长度(cm)	2.02	2.18	2.34
				根数	3.98	4.11	4.19
根长(cm)	1.42	1.61	1.73

对比例1-1、将实施例1的“生根保存培养基”中的“不含有机成份的1/2MS基本培养基(改良的1/2MS基本培养基)”改成“常规的1/2MS基本培养基”；其余同实施例1。

备注说明：常规的1/2MS基本培养基，即溶液中大量元素、微量元素、铁盐、有机成分的含量均为MS基本培养基的一半(此为公知技术)。

对比例1-2、将实施例1中的生根保存培养基中的“琼脂10g/l”改成“琼脂4g/l”；其余同实施例1。

对比例2-1、将实施例1步骤5)中的光照强度由“光照强度5～10μmol m^-2.s^-1”改成“光照强度20～25μmol m^-2.s^-1”。其余同实施例1。

对比例2-2、将实施例1步骤5)中的光照强度由“光照强度5～10μmol m^-2.s^-1”改成“光照强度1～2μmol m^-2.s^-1”。其余同实施例1。

对比例3-1、将实施例1步骤5)中的温度由“0～4℃”改成“5～8℃。其余同实施例1。

对比例3-2、将实施例1步骤5)中的温度由“0～4℃”改成“-4～-1℃。其余同实施例1。

上述对比例的结果如下表3所示。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.草莓种质的离体保存方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、取无病斑、无虫瘿的健康草莓匍匐茎自来水冲洗；

2)、步骤1)所得的草莓匍匐茎经消毒后，剥取草莓匍匐茎的茎尖分生组织0.4～0.6mm，将其接种至MS培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol·m^-2·s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

MS培养基为MS基本培养基+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0；

3)、待茎尖分生组织长成至0.5cm小苗时，将其转接至增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol·m^-2·s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

增殖培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤0.3～0.5mg/l+糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.5～6.0；

4)、待步骤3)所得的不定芽生长到1.5cm时，将其接种于生根保存培养基上进行生根培养，培养时间为6～8天；培养条件为：16小时光照，光照强度10～30μmol·m^-2·s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

所述生根保存培养基为不含有机成份的1/2MS基本培养基+糖15g/l+琼脂10g/l，pH为5.5～6.0；

不含有机成份的1/2MS基本培养基为：溶液中大量元素、微量元素、铁盐的含量均为MS基本培养基的一半，不含任何含量的有机成分；

5)、将步骤4)所得的草莓组培小苗连同生根保存培养基一起于冷藏箱0～4℃保存，弱光培养，光照强度5～10μmol·m^-2·s^-1。

2.根据权利要求1所述的草莓种质的离体保存方法，其特征是：保存1年后更换生根保存培养基继续0～4℃保存，弱光培养，光照强度5～10μmol·m^-2·s^-1。