CN111574606A - 小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用。TaCOK是如下任一蛋白：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。本发明所提供的TaCOK及其编码基因可用于提高植物抗病性和通过调控春化基因和春化相关基因的表达作用，进而调控植物抽穗，对于培育抗病且具有广泛适应性的植物新品种具有重要意义。

Description

小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用。

背景技术

小麦是世界及我国人民的重要主粮作物之一。全球40％以上人口以小麦作为主粮作物，因此小麦对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。随着种植密度增加、肥水条件和耕作制度的改变，小麦纹枯病已发展成我国小麦生产的主要病害，成为我国小麦高产稳产的重要限制因素。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，我国小麦纹枯病主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005-2018年我国小麦纹枯病每年发生面积约1.0-1.3亿亩，经济损失达数十亿元以上，已成为我国小麦主产区第一大土传病害。因此，选育和推广抗纹枯病小麦新品种是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保障我国小麦稳产、高产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的抗纹枯病的小麦种质资源，常规育种方法在抗纹枯病的小麦品种育种方面进展缓慢。分子生物学和基因工程，特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的长足进展，为高效培育抗纹枯病小麦奠定了基础。

抽穗期对于小麦来说异常重要，对生育周期与产量相关性状影响很大。抽穗很大程度上受植株春化反应和光周期反应的控制。春化相关基因是一类影响小麦抽穗的重要基因，它与环境温度共同调控小麦抽穗。适宜的抽穗期是保证作物高产稳产的重要前提，挖掘与春化和抽穗期相关基因可以为培育具有适应不同生态环境的小麦新品种提供候选基因，对于培育具有广泛适应性的小麦新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用。

第一方面，本发明要求保护一种能蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质，名称为TaCOK，来源于抗纹枯病的小麦品系CI12633，可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质中，SEQ ID No.2由632个氨基酸残基组成。

为了使蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对氨基酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，所述TaCOK可来源于小麦。

第二方面，本发明要求保护与TaCOK相关的生物材料。

本发明所要求保护的与TaCOK相关的生物材料，可为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码TaCOK的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)：

1)编码链的编码序列(ORF)是序列表中SEQ ID No.1的第53-1951位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的cDNA分子或DNA分子杂交且编码TaCOK的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的cDNA分子或DNA分子具有90％以上的同一性且编码TaCOK的DNA分子。

上述核酸分子中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与SEQ ID No.1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与SEQ ID No.1的第1897-2148位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由2181个核苷酸组成，其ORF序列是SEQ ID No.1的第53-1951位，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶启动子("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1启动子(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pWMB123、pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子可为Ubiquitin启动子。具体地，所述重组载体为将SEQ ID No.1的第53-1951位所示DNA片段***到pWMB123载体的Ubiquitin启动子下游(如BamH I和SpeⅠ之间)后得到的重组质粒。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

第三方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品具有如下a1)和/或a2)所示功能的产品，含有前文所述蛋白质(TaCOK)或/和前文所述的生物材料。

a1)增强植物抗病性；

a2)通过促进春化基因和/或春化相关基因表达来调控植物在春化作用下提前抽穗。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或所述生物材料的下述P1-P9中的任一种应用：

P1、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在调控植物春化中的应用

P6、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在调控植物春化基因和/或春化相关基因表达中的应用；

P7、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在通过调控春化基因和/或春化相关基因表达调控植物抽穗期中的应用；

P8、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在通过促进春化基因和/或春化相关基因表达来调控植物在春化作用下提前抽穗中的应用；

P9、前文所述蛋白质(TaCOK)或所述生物材料在植物育种中的应用。

第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种培育抗病植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中前文所述蛋白质(TaCOK)或其编码基因的表达量或/和活性，得到目的植物；所述目的植物的抗病性高于所述受体植物的抗病性。

上述方法中，所述提高受体植物中所述蛋白质(TaCOK)或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质(TaCOK)的编码基因导入所述受体植物实现。

上述方法中，其中所述蛋白质(TaCOK)的编码基因可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

所述蛋白质(TaCOK)的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述目的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

方法B：一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：降低受体植物中前文所述蛋白质(TaCOK)的编码基因的表达量或/和活性，得到抗病性低于所述受体植物的转基因植物。

上述方法中，降低所述受体植物中前文所述蛋白质(TaCOK)的编码基因的表达量可通过将与SEQ ID No.1的第1897-2148位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子导入所述受体植物实现。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

方法C：一种培育具有可控抽穗期的植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量或/和活性，得到目的植物；如果将所述目的植物按照所述受体植物的栽培生长规律进行播种(自然春化)，则与所述受体植物同步进入抽穗期；如果将所述目的植物播种前进行人为春化处理，则所述目的植物在不符合所述受体植物的栽培生长规律时播种，能够比同条件下的所述受体植物提早抽穗。

上述方法中，所述提高受体植物中所述蛋白质(TaCOK)或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质(TaCOK)的编码基因导入所述受体植物实现。

上述方法中，其中所述蛋白质(TaCOK)的编码基因可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

所述蛋白质(TaCOK)的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述目的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为小麦。

在上述各方面中，所述抗病可为抗纹枯病。

进一步地，所述纹枯病的致病菌可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，具体可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207或R0301。

在上述各方面中，所述春化处理的温度可为4℃，所述春化处理的时间可为30天。

在本发明的具体实施方式中，所述春化基因具体为TaVRN1基因和/或TaVRN3基因；所述春化相关基因具体为TaVRT2基因。

实验证明：一方面，向周麦18中导入TaCOK基因，发现TaCOK过表达可以显著提高转基因小麦植株对纹枯病抗性。采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaCOK基因，结果显示TaCOK基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力。上述结果说明TaCOK是小麦抗纹枯病反应所必需的基因。另一方面，向周麦18中导入TaCOK基因，发现与非转基因对照相比，TaCOK过表达能够促进春化基因和/或春化相关基因的表达，使转基因小麦在不适合温度等条件下也能通过春化，进行抽穗，增加了小麦推广种植的适用地区，即广适应性。这样基因类型的小麦，不仅具有广泛的适应性，而且可以到云南/海南繁殖、加代，能缩短育种年限(2-3年)，有利于小麦育种事业的发展。总之，本发明对于培育抗病且具有广泛适应性的植物新品种具有重要意义。

附图说明

图1为TaCOK基因表达量分析。Wen6表示温麦6号。

图2为4株T₀代转pWMB123-TaCOK周麦18阳性植株的PCR检测结果。P代表pWMB123-TaCOK重组表达载体质粒DNA，Z18代表周麦18，COK1、COK2、COK3和COK4分别代表4个转基因小麦株系。箭头所示为目的条带。

图3为72株T₁代转pWMB123-TaCOK周麦18单株的PCR检测结果。COK1、COK2、COK3和COK4分别代表4个转基因小麦株系。箭头所示为目的条带。

图4为4个转基因小麦株系T1代植株中TaCOK基因的相对表达量。

图5为收获期小麦对纹枯病表型的照片以及相应病级。

图6为BSMV:TaCOK沉默植株中TaCOK表达量。

图7为定量PCR检测BSMV感染小麦中禾谷丝核菌相对生物量。

图8为BSMV:TaCOK接种纹枯病菌后病情统计结果。A为表型；B为统计结果。

图9为野生型小麦周麦18和转TaCOK基因周麦18抽穗期差异表现。

图10为转TaCOK基因周麦18的春化基因及春化相关基因表达量。

各图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中小麦CI12633为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质，小麦CI12633表现为抗纹枯病。温麦6号为来自国家植物种质资源共享平台(中国农业科学院种质资源库)的种质，温麦6号高感纹枯病。小麦品种周麦18购自周口地区农业科学研究院，周麦18感纹枯病(https://baike.***.com/item/％E5％91％A8％E9％BA％A618/4103514？fr＝aladdin)。

小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)北方强致病菌株WK207为山东农业大学植保学院于金凤教授馈赠(参考文献：Ji,L.,Liu,C.,Zhang,L.,Liu,A.,and Yu,J.(2017).Variation of rDNA internal transcribed spacer sequences inRhizoctonia cerealis.Curr.Microbiol.74,877-884.doi:10.1007/s00284-017-1258-2)。禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301来自江苏省农业科学院(参考文献：冷苏凤,张爱香,李伟,陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报,2010，26(6)：1176-1180)。上述生物材料公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

单子叶植物表达载体pWMB123：由中国农业科学院作物科学研究所王珂等构建(参考文献：Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat viaanAgrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheatvarieties,Ke Wang,Huiyun Liu,Lipu Du and Xingguo Ye,Plant BiotechnologyJournal(2016),pp.1–10doi:10.1111/pbi.12660)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒及BSMV-γ：GFP质粒从美国引入(Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripemosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327。Burch-Smith T M,Anderson J C,Martin G B,Dinesh-Kumar S P.Applicationsand advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies inplants.The Plant Journal，2004,39:734-746.赵丹，赵继荣，黄茜，李宁，刘艳，黄占景，张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报ACTAAGRONOMICA SINICA 2011,37(11):2106-2110)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。

小麦纹枯病病级标准(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表2。

表2小麦纹枯病病级标准

其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。

长满禾谷丝核菌的牙签的制备方法：将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌的菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

长满禾谷丝核菌的菌麦粒的制备方法：配制MS液体培养基，灭菌后，将新培养的禾谷丝核菌的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集；再将浸泡5-6小时麦粒煮沸20分钟，塞满250-500毫升三角瓶，接入上面密集菌丝液，摇匀，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

实施例1、抗纹枯病的小麦蛋白TaCOK及其编码基因的克隆及其受纹枯病菌诱导的表达分析

1、抗纹枯病的小麦蛋白TaCOK及其编码基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦种质CI12633中分离克隆出一个抗病相关的小麦蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其命名为TaCOK蛋白。将编码TaCOK蛋白的基因命名为TaCOK基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体克隆方法如下：

提取接种小麦纹枯菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207菌丝的小麦CI12633茎部总RNA，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaCOK-FL-U1：5'-GCAGTCGCACCATCCAC-3'和TaCOK-FL-R1：5'-CTGAGTTGTAGAGGCAGATA-3'为引物，进行第一轮PCR扩增，扩增程序为：先96℃预变性2分钟；然后94℃45秒，54℃35秒，72℃2.5分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；以稀释50倍的第一轮PCR扩增产物作为模板，利用TaCOK-FLU2：5'-GCCGACACCACTTAGGAT-3'和TaCOK-FLR2：5'-TACACCCAACATTGCTTTT-3'为引物，进行第二轮PCR扩增，扩增程序为：先95℃预变性2分钟；然后94℃45秒，54℃35秒，72℃2分钟，5个循环；94℃45秒，52℃45秒，72℃2分钟，5个循环；最后72℃延伸10分钟；第二轮PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-1976核苷酸所示。SEQ ID No.1的编码序列(ORF)是其第53-1951位核苷酸；编码SEQ ID No.2所示的蛋白质TaCOK。

为了获得TaCOK基因全长的cDNA序列，设计3′-RACE引物(TaCOK-3RA-F1：5′-TGTGAGGCTGAGAACCAA-3′和TaCOK-3RA-F2：5′-CATTGGGCGGTAAGACCTCTGTTCATC-3′)，通过2轮PCR扩增，从抗病小麦CI12633 cDNA中扩增到3′序列，即SEQ ID No.1所示的自5′末端第1712-2181核苷酸。

2、TaCOK基因受纹枯病菌诱导的表达分析

为了研究TaCOK基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用RT-qPCR分析在禾谷丝核菌WK207接种不同天数的抗纹枯病和感纹枯病小麦中TaCOK基因的表达情况。

用禾谷丝核菌WK207菌丝牙签接种于抗病小麦CI12633及感纹枯病小麦温麦6号分蘖期幼苗的叶鞘与茎间；于未接种(0)和接种2、4、7、10、14、21天，分别取各个小麦材料接种叶鞘/茎部组织，液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱备用。

分别提取各小麦材料茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaCOK基因的特异引物进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-ΔΔCT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method.Methods.25:402-408)分析TaCOK基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′；

TaActin-R：5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′。

TaCOK基因的特异引物对：

TaCOK-Q-F：5′-TTTGGGATTCCATCCTTGCTG-3′；

TaCOK-Q-R：5′-ATGTTTGGTTGCCATTGCTCT-3′。

结果如图1所示。对TaCOK基因表达量分析结果表明，接种禾谷丝核菌(纹枯病菌)前后的CI12633中的TaCOK基因表达量始终高于在温麦6号中的表达量；而且TaCOK基因在抗纹枯病小麦CI12633中显著受禾谷丝核菌诱导表达，在接种禾谷丝核菌10天时，TaCOK基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量最高，而在感纹枯病小麦温麦6号中，TaCOK的表达量只在禾谷丝核菌接种10天时显著提高。暗示TaCOK基因参与了小麦对纹枯病的抗性反应。

实施例2、抗纹枯病的转TaCOK基因小麦的获得、分子和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

将TaCOK基因完整的ORF序列构建到pWMB123，具体操作如下：

1、采用TaCOK-TV-F和TaCOK-TV-R组成的引物对。

TaCOK-TV-F：5′-TTCTGCAGGTCGACTCTAGAATGGAGAAGACGACAGGGAT-3′(下划线指示的序列为载体同源序列)；

TaCOK-TV-R：

(下划线指示的序列为载体同源序列，方框指示的序列为6×His标签编码序列)。

2、以SEQ ID No.1所示DNA片段为模板，以TaCOK-TV-F和TaCOK-TV-R组成的引物对，在高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收

PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃10s、56℃15s、72℃2min，34个循环；72℃10min。

3、回收并纯化步骤2得到的PCR扩增产物。

4、用限制性内切酶BamH I和SpeⅠ酶切单子叶植物表达载体pWMB123，回收载体骨架。

5、将步骤3回收的酶切产物和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到重组表达载体pWMB123-TaCOK。

根据测序结果，对重组表达载体pWMB123-TaCOK进行结构描述如下：在单子叶植物表达载体pWMB123的BamHⅠ和SpeⅠ酶切位点之间***了“SEQ ID No.1的第53-1948位+CATCATCATCATCATCACTAA”的DNA分子(编码融合有6×His标签的TaCOK蛋白)。重组表达载体pWMB123-TaCOK中，TaCOK基因受Ubiquitin启动子控制。重组表达载体pWMB123-TaCOK中还具有1个受35S启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将重组表达载体pWMB123-TaCOK导入农杆菌C58C1的感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化周麦18的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。

3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。

5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。

获得了16株再生小麦植株。

6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。

移栽3周以后，有14株小麦植株(T0代)成活。

7、转基因小麦的分子鉴定

在4叶期，每株成活的再生小麦植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaCOK基因特异的一段序列作为上游引物(TaCOK-F：5′-TTTGGGATTCCATCCTTGCTG-3′)和载体Tnos序列特异的一段序列作为下游引物(tNOS-R：5′-AAAACCCATCTCATAAATAACG-3′)进行PCR扩增，以重组表达质粒pWMB123-TaKOC1为阳性对照，周麦18的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段约为1500bp。PCR程序：94℃预变性3min；94℃30s、58℃30s、72℃1min30s，34个循环；72℃10min

PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

PCR检测结果表明，在14株转pWMB123-TaCOK周麦18植株(T₀代)中，PCR阳性植株(即为转基因植株)4株(图2)。

收获的4株转基因小麦种子被种植，得到T₁代单株。将T₁代单株进行PCR鉴定，方法同以上步骤。

在72株T₁代单株中，阳性植株58株(图3)，分属4个株系，阳性率80.6％。

利用TaCOK基因特异的定量引物(TaCOK-QF：5′-TTTGGGATTCCATCCTTGCTG-3′；TaCOK-QR：5′-ATGTTTGGTTGCCATTGCTCT-3′)和RT-qPCR技术分析4个转基因株系T₁代植株中TaCOK基因的相对表达量。利用小麦内源actin基因作为内参。具体参见实施例1步骤2。结果见图4。图中，Z18代表周麦18，COK1、COK2、COK3和COK4分别代表4个转基因小麦株系。转基因植株中TaCOK基因的相对表达量明显高于周麦18。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaCOK，其它同步骤二，得到转空载体周麦18植株，作为转基因植株的对照。

四、转基因植物纹枯病抗性鉴定及TaCOK基因的转录水平

1、小麦纹枯病菌丝培养

将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

制备麦粒蛭石培养基(熟麦粒：砂＝1：1体积比，加适量水，混匀)，灭菌后，接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

2、纹枯病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为步骤二的58株T₁代阳性转基因植株、步骤三的10株转空载体周麦18植株和20株野生型周麦18。

在小麦拔节期，将两根布满小麦禾谷丝核菌WK207的牙签嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态，接种后喷水保湿5-7天；于小麦蜡熟期、收获时调查纹枯病病情。

纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法(表2)进行(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33).

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

收获期小麦对纹枯病表型的照片以及相应病级见图5和表3。

58株转TaCOK周麦18植株的纹枯病平均病级为1.77，病情指数为35.45，而野生型周麦18植株的纹枯病平均病级分别为2.61，病情指数分别为52.35，说明转TaCOK基因可增强植株对纹枯病抗性。株系编号COK1-COK4为转TaCOK周麦18植株；株系编号Z18为野生型周麦18(受体植株)；株系编号EV为转空载体植株。

结果表明，TaCOK过表达显著提高转基因小麦植株对纹枯病抗性。

表3转基因小麦植株与对照的纹枯病病情的调查结果

株系	病级	病情指数
			COK1	1.93<sup>*</sup>	38.52<sup>**</sup>
COK2	1.90<sup>*</sup>	38.00<sup>**</sup>
			COK3	1.73<sup>*</sup>	34.60<sup>**</sup>
COK4	1.53<sup>**</sup>	30.60<sup>**</sup>
			Z18	2.61	52.35
EV	2.66	53.33

注：*表示在P<0.05水平上各转基因株系病级/病情指数与周麦18病级/病情指数有显著差异；**表示在P<0.01水平上各转基因株系病级/病情指数与周麦18的有显著差异。

实施例3、培育纹枯病性降低的小麦进行TaCOK功能反向分析

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaCOK基因

1、将SEQ ID No.1的第1897-2148位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将SEQ ID No.1的第1897-2148位核苷酸所示的DNA片段(252bp)以反向***法***到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)上，使与SEQ ID No.1的第1897-2148位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子(antiTaCOK)被γ载体的T7启动子驱动，得到重组载体BSMV-γ：antiTaCOK。

2、制备转录反应液

(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：antiTaCOK、BSMV-γ：GFP，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，分别命名为线性化的BSMV-γ：antiTaCOK、线性化的BSMV-γ：GFP。

(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。

线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：GFP。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：antiTaCOK时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：TaCOK。

3、BSMV接种小麦植株

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：TaCOK或转录反应液BSMV-γ：GFP，混匀，然后加入60μl RNase-freeddH₂O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K₂HPO₄、1％Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV:TaCOK病毒混合液或BSMV:GFP病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV:TaCOK病毒混合液或BSMV:GFP病毒混合液，摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后移去保鲜膜，每隔3h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

4、定量RT-PCR检测基因沉默情况

接种第12天取第四片叶片，提取RNA，采用小麦内源TaActin基因作为内参基因，RT-qPCR检测TaCOK基因沉默情况，所用引物：

TaCOK-QF：5′-TTTGGGATTCCATCCTTGCTG-3′；

TaCOK-QR：5′-ATGTTTGGTTGCCATTGCTCT-3′。

具体参见实施例1步骤2。

结果如图6所示：导入BSMV：TaCOK的CI12633植株中TaCOK基因被沉默，得到TaCOK基因沉默的CI12633(命名为BSMV:TaCOKCI12633)；而导入BSMV:GFP的CI12633(命名为BMSV:GFPCI12633，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaCOK基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV至分蘖盛期(约60天)，采用牙签接种法对其接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207，将长满禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207菌丝的牙签嵌入到基部第1-2叶鞘之间，菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿3天。禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207接种15天后，提取发病部位茎秆的RNA，进行定量和半定量RT-PCR分析，检测纹枯菌Actin基因的相对表达量。RT-qPCR所用的引物为：

RcActin-F：5’-gcatccacgagaccacttac-3’；

RcActin-R：5’-gcgtcccgctgctcaagat-3’。

结果显示，BSMV:TaCOK植株中禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207 Actin基因的相对表达量显著高于BSMV:GFP CI12633中的表达量(图7)，即TaCOK基因表达沉默后的BSMV:TaCOKCI12633植株中，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207的积累量显著高于TaCOK基因正常表达的对照(BSMV:GFP CI12633)植株中禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)WK207的积累量。

禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207接种45天后，进行纹枯病的病级鉴定。结果如图8所示，TaCOK基因表达沉默后的BSMV:TaCOK CI12633植株茎部的纹枯病病斑(平均病级3.00)明显大于对照(BSMV:GFPCI12633)植株的病斑(平均病级1.83)，野生型植株的病斑与对照(BSMV:GFP CI12633)植株相比无统计学差异。表明TaCOK基因沉默降低了CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaCOK是CI12633抗纹枯病反应所需的基因，也是小麦抗纹枯病重要基因。

实施例4、转TaCOK基因小麦显著调控春化和光周期基因的表达，进而调控抽穗期

将萌发后的野生型小麦周麦18和转TaCOK基因周麦18(实施例2中的COK2、COK3、COK4)种子，放于4℃冰箱30天，2019年9月30日种植于花盆，每盆8颗发芽幼苗，每个系3-4盆，搬至北京中关村南大街12号的中国农科院作物科学研究所的室外生长。2019年12月1日搬至北京中关村南大街12号的中国农科院作物科学研究所的温室生长，2019年12月28日转TaCOK基因周麦18进入抽穗期，而野生型小麦周麦18于2020年1月8日进入抽穗期，进一步说明TaCOK过表达显著促进了转基因小麦的春化与抽穗。图9是2020年1月3日拍照的野生型小麦周麦18和转TaCOK基因周麦18抽穗期差异表现。

为了探讨其分子机制，本发明利用定量PCR技术，分析了转TaCOK基因周麦18(实施例2中的COK2、COK3、COK4)和野生型小麦周麦18中的春化基因TaVRN1(L.Yan*,A.Loukoianov,G.

M.

T.Fahima§,and J.Dubcovsky*，Positionalcloning of the wheat vernalizationgene VRN1，PNAS May 13,2003vol.100no.106263–6268)，TaVRN3(L.Yan,D.Fu,C.Li,A.Blechl,G.Tranquilli,M.Bonafede,A.Sanchez，M.Valarik,S.Yasuda,and J.Dubcovsky，The wheat and barley vernalization geneVRN3 is an orthologue of FT，PNAS December 19,2006vol.103no.51 19581–19586)、春化相关基因TaVRT2(其编码蛋白与TaVRN1互作，Li Xie,Yong Zhang,Ke Wang,Xumei Luo,Dengan Xu,Xiuling Tian,Lingli Li,Xingguo Ye,Xianchun Xia,Wenxue Li,LiulingYan，Shuanghe Cao，TaVrt2,an SVP-like gene,cooperates with TaVrn1to regulatevernalization-induced flowering in wheat，New Phytologist(2019)doi:10.1111/nph.16339)的表达情况。

采用小麦内源TaActin基因作为内参基因，具体参见实施例1步骤2。

用于检测TaVRN1基因的引物序列：

TaVRN1-QF：5’-GTATGAGCGCTATTCTTATG-3’；

TaVRN1-QR：5’-GATTCAAGATCCTCTCCCAT-3’。

用于检测TaVRN3基因的引物序列：

TaVRN3-QF：5’-CAGGCCGGTCGATCTATACTA-3’；

TaVRN3-QR：5’-TCCTGTTCCCGAAGGTCA-3’。

用于检测TaVRT2基因的引物序列：

TaVRT2-QF：5’-CAGAGGAAAATATGCGCTTG-3’；

TaVRT2-QR：5’-CATCATTGTCCTGCGAGCTT-3’。

结果如图10所示，在转TaCOK基因小麦3个株系中，3个春化相关基因(TaVRN1，TaVRN3，TaVRT2)表达量显著高于野生型小麦周麦18中的。

而按照受体周麦18(半冬性小麦)的栽培生长规律，分别在2018年10月10日和2019年10月8日播种于北京中关村南大街中国农科院作物科学研究所试验田，2019年5月2-5日、2020年5月1-3日，野生型小麦周麦18和转TaCOK基因小麦周麦18基本同步进入抽穗期，两者进入抽穗期的日期没有显著差异。

转空载体植株的抽穗表型以及春化相关基因的表达情况与野生型小麦周麦18基本一致，无显著差异。

上述结果说明，TaCOK显著能够调控转基因小麦体内春化相关基因的表达，使转基因小麦在不适合温度等条件下也能通过春化，进行抽穗，增加了小麦推广种植的适用地区，即广适应性。这样基因类型的小麦，不仅具有广泛的适应性，而且可以到云南/海南繁殖、加代，能缩短育种年限(2-3年)，有利于小麦育种事业的发展。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦抗病与抽穗调控基因TaCOK及其相关生物材料与应用

<130> GNCLN201563

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 1

gccgacacca cttaggattc agattagagg cggggaaaag cggaaaaagc agatggagaa 60

gacgacaggg atggcaggct cccagcccac cgacaccgag tcgttcgagt acatgctgct 120

ggagaaggac cccgaccact accggacggt cttctccggc ccgagccaga taagcccgtg 180

gatcgacccg gcggtgctga atctgaagca ccggatagga agaggcccct tcggggacgt 240

ctggatagcg acgcaccacc agaggacgga agattatgac cggtaccacg aggtcgccgt 300

gaagatgatg cacccggtca gggacgacca gctgcaggtg ttctcggcga ggttcgacga 360

ggtgttcggc aaatgccagg gcctgggcaa tgtctgcttc ctacatggca tctcaacgca 420

gaatgggagg ctttgcatag cgatgaagtt ttatgaagga tccatcgggg acaagatggc 480

tcggcttaaa ggtggaaggc tccctttgtc ggatgtttta agatgtggtg ccgatttggc 540

gcgtggtgtg ctagacctac actccagggg aatatttgtt cttaatctca agccttgcaa 600

ttttctcctt gatgaccatg accatgctgt gctgggggat tttgggattc catccttgct 660

gtttggactt tctctgccaa acccagagct tatccaaaga cttgggactc caaattacat 720

ggccccagag caatggcaac caaacatcag aggtccaatt agttacgaga cagattcatg 780

gggctttgcc tgcagcattc ttgagatgtt cagtggcgtt cagccttggc gtggcaaatc 840

accagatgaa atttatcagt tggttgtcct gaagaaagag aaaccgatat tcccatacaa 900

cttacctgca gaggttgaga atgtcctttc tagctgcttt gagtacgact ttcgggatcg 960

ccccttgatg tcagatatct tgcaagcatt tgaaagtgct aaagatgtgg attatgacaa 1020

caatggctgg gatagttctg aaaacccaag ggcagtagtg ccaagtcaca ctaattggtc 1080

acaccttaag gataagctgc aagttggtga caaggtccgc tcgagaaagg ttaaaaactc 1140

ttgtactcct gaagcaatgg aaattcctga tggaaccata gttggcatgg aggaggatgg 1200

agaacgtgat agctacattc ttgtacgagt ccatggaata catgaccctt tgaaggtcca 1260

ttcctcgaca gtggagaggg tgacctatgg tttcgctgcc ggaggctggg taaggcttag 1320

ggaggaagac aagaagcggt ctcaggtcgg aattcttcat agcattgacc gtaatggcac 1380

cgtgtatgtt ggtttaatag gaatggacac cctctggaag ggggaatatt caggtctgca 1440

aatggccgaa gcctactgtg tgggacaatt tgtgaggctg agaaccaaca cttcaagccc 1500

gcggttcgaa tggcagcgaa agagaggcgg ggtgtttgcc acaggccgta tttcacagat 1560

actctcgaat ggatgccttg ttgtgacctt ctctggcaag ttgagccttg gcgaagtgtg 1620

cagctgcttg gccgaccctt ctgaggtgga ggtggtgagc ttcgacaagt gcgagggggt 1680

tgtgaagaag tatgagcacc tcgaggactt ccattgggcg gtaagacctc tgttcatcgc 1740

cataggtttc tttactgcta tggagctagg tgtgttcgtc gggaagagca tcacaaggcc 1800

aaggagtcga aaggtcgcca gcgtctccga tcagggtgcc gatcctcaga aagttcagca 1860

gcaagaagtg cacaacagtg ccggcacggc atggctccct ccacccgtcg caaacatgct 1920

tttcagggac ggtcctgcgc cttctgggta aaactgcaaa agcaatgttg ggtgtaccct 1980

gaagtatatc tcgatcatgc aacgctttga acaagccgtg ctgtgtatat ttagggctgt 2040

aattttctac cttgccaaaa ccttgtaaat tagtatctgc ctctacaact cagcatgcct 2100

gagctcaact gctctaggat cattcctaga tgtttctaga agcatgcaac tacgggaggt 2160

tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2181

<210> 2

<211> 632

<212> PRT

<213> Triticum aestivum L.

<400> 2

Met Glu Lys Thr Thr Gly Met Ala Gly Ser Gln Pro Thr Asp Thr Glu

1 5 10 15

Ser Phe Glu Tyr Met Leu Leu Glu Lys Asp Pro Asp His Tyr Arg Thr

20 25 30

Val Phe Ser Gly Pro Ser Gln Ile Ser Pro Trp Ile Asp Pro Ala Val

35 40 45

Leu Asn Leu Lys His Arg Ile Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Val Trp

50 55 60

Ile Ala Thr His His Gln Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Tyr His Glu

65 70 75 80

Val Ala Val Lys Met Met His Pro Val Arg Asp Asp Gln Leu Gln Val

85 90 95

Phe Ser Ala Arg Phe Asp Glu Val Phe Gly Lys Cys Gln Gly Leu Gly

100 105 110

Asn Val Cys Phe Leu His Gly Ile Ser Thr Gln Asn Gly Arg Leu Cys

115 120 125

Ile Ala Met Lys Phe Tyr Glu Gly Ser Ile Gly Asp Lys Met Ala Arg

130 135 140

Leu Lys Gly Gly Arg Leu Pro Leu Ser Asp Val Leu Arg Cys Gly Ala

145 150 155 160

Asp Leu Ala Arg Gly Val Leu Asp Leu His Ser Arg Gly Ile Phe Val

165 170 175

Leu Asn Leu Lys Pro Cys Asn Phe Leu Leu Asp Asp His Asp His Ala

180 185 190

Val Leu Gly Asp Phe Gly Ile Pro Ser Leu Leu Phe Gly Leu Ser Leu

195 200 205

Pro Asn Pro Glu Leu Ile Gln Arg Leu Gly Thr Pro Asn Tyr Met Ala

210 215 220

Pro Glu Gln Trp Gln Pro Asn Ile Arg Gly Pro Ile Ser Tyr Glu Thr

225 230 235 240

Asp Ser Trp Gly Phe Ala Cys Ser Ile Leu Glu Met Phe Ser Gly Val

245 250 255

Gln Pro Trp Arg Gly Lys Ser Pro Asp Glu Ile Tyr Gln Leu Val Val

260 265 270

Leu Lys Lys Glu Lys Pro Ile Phe Pro Tyr Asn Leu Pro Ala Glu Val

275 280 285

Glu Asn Val Leu Ser Ser Cys Phe Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Arg Pro

290 295 300

Leu Met Ser Asp Ile Leu Gln Ala Phe Glu Ser Ala Lys Asp Val Asp

305 310 315 320

Tyr Asp Asn Asn Gly Trp Asp Ser Ser Glu Asn Pro Arg Ala Val Val

325 330 335

Pro Ser His Thr Asn Trp Ser His Leu Lys Asp Lys Leu Gln Val Gly

340 345 350

Asp Lys Val Arg Ser Arg Lys Val Lys Asn Ser Cys Thr Pro Glu Ala

355 360 365

Met Glu Ile Pro Asp Gly Thr Ile Val Gly Met Glu Glu Asp Gly Glu

370 375 380

Arg Asp Ser Tyr Ile Leu Val Arg Val His Gly Ile His Asp Pro Leu

385 390 395 400

Lys Val His Ser Ser Thr Val Glu Arg Val Thr Tyr Gly Phe Ala Ala

405 410 415

Gly Gly Trp Val Arg Leu Arg Glu Glu Asp Lys Lys Arg Ser Gln Val

420 425 430

Gly Ile Leu His Ser Ile Asp Arg Asn Gly Thr Val Tyr Val Gly Leu

435 440 445

Ile Gly Met Asp Thr Leu Trp Lys Gly Glu Tyr Ser Gly Leu Gln Met

450 455 460

Ala Glu Ala Tyr Cys Val Gly Gln Phe Val Arg Leu Arg Thr Asn Thr

465 470 475 480

Ser Ser Pro Arg Phe Glu Trp Gln Arg Lys Arg Gly Gly Val Phe Ala

485 490 495

Thr Gly Arg Ile Ser Gln Ile Leu Ser Asn Gly Cys Leu Val Val Thr

500 505 510

Phe Ser Gly Lys Leu Ser Leu Gly Glu Val Cys Ser Cys Leu Ala Asp

515 520 525

Pro Ser Glu Val Glu Val Val Ser Phe Asp Lys Cys Glu Gly Val Val

530 535 540

Lys Lys Tyr Glu His Leu Glu Asp Phe His Trp Ala Val Arg Pro Leu

545 550 555 560

Phe Ile Ala Ile Gly Phe Phe Thr Ala Met Glu Leu Gly Val Phe Val

565 570 575

Gly Lys Ser Ile Thr Arg Pro Arg Ser Arg Lys Val Ala Ser Val Ser

580 585 590

Asp Gln Gly Ala Asp Pro Gln Lys Val Gln Gln Gln Glu Val His Asn

595 600 605

Ser Ala Gly Thr Ala Trp Leu Pro Pro Pro Val Ala Asn Met Leu Phe

610 615 620

Arg Asp Gly Pro Ala Pro Ser Gly

625 630

<210> 2

<211> 252

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 2

ccctccaccc gtcgcaaaca tgcttttcag ggacggtcct gcgccttctg ggtaaaactg 60

caaaagcaat gttgggtgta ccctgaagta tatctcgatc atgcaacgct ttgaacaagc 120

cgtgctgtgt atatttaggg ctgtaatttt ctaccttgcc aaaaccttgt aaattagtat 180

ctgcctctac aactcagcat gcctgagctc aactgctcta ggatcattcc tagatgtttc 240

tagaagcatg ca 252

Claims (10)

1.蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)：

1)编码链的编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第53-1951位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的cDNA分子或DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的cDNA分子或DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.具有如下a1)和/或a2)所示功能的产品，含有权利要求1所述蛋白质或/和权利要求2或3中所述的生物材料；

a1)增强植物抗病性；

a2)通过促进春化基因和/或春化相关基因表达来促进植物在春化作用下提前抽穗。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的下述P1-P9中的任一种应用：

P1、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在调控植物春化中的应用

P6、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在调控植物春化基因和/或春化相关基因表达中的应用；

P7、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在通过调控春化基因和/或春化相关基因表达调控植物抽穗期中的应用；

P8、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在通过促进春化基因和/或春化相关基因表达来调控植物在春化作用下提前抽穗中的应用；

P9、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在植物育种中的应用。

6.如下任一方法：

方法A：一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量或/和活性，得到目的植物；所述目的植物的抗病性高于所述受体植物的抗病性；

方法B：一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量或/和活性，得到抗病性低于所述受体植物的转基因植物；

方法C：一种培育具有可控抽穗期的植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量或/和活性，得到目的植物；如果将所述目的植物按照所述受体植物的栽培生长规律进行播种，则与所述受体植物同步进入抽穗期；如果将所述目的植物播种前进行春化处理，则所述目的植物在不符合所述受体植物的栽培生长规律时播种，能够比同条件下的所述受体植物提早抽穗。

7.根据权利要求4所述产品或权利要求5所述应用或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为小麦。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述受体植物实现的。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将与SEQ ID No.1的第53-1951位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述受体植物实现的。

10.根据权利要求4-9中任一所述的产品或应用或方法，其特征在于：所述抗病为抗纹枯病；

进一步地，所述纹枯病的致病菌为禾谷丝核菌；

和/或

所述春化处理的温度为4℃，和/或所述春化处理的时间为30天。

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