JP2021516552A - 高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート - Google Patents

Abstract

本発明は、高速ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に適用される分析プレートの構造に関し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムネスティッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応後にラテラルフロー混成化反応分析を具現するのに使用されるＰＣＲ分析プレートに関する。正圧（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で溶液を押込んで弾性フィルムが凸状の形態に伸びて正圧が維持され得るように、逆止弁が具備されており、ＰＣＲ反応後に後続的なＰＣＲ反応やラテラルフロー分析のためのラテラルフロー分析モジュールを具備しており、各反応が終わった後、溶液の移動を調節できる仕切弁を具備している。温度が調節されるヒーティングブロックにより溶液により凸状になったＰＣＲ反応部の弾性フィルムを押圧して熱抵抗を最小で迅速にＰＣＲ反応溶液を温度循環させることができ、また、ＰＣＲ反応乾燥物と核酸溶液が均質化して混合することができる高速ＰＣＲ反応分析プレートを提供することができる。

Description

本発明は、高速で温度循環ＰＣＲ反応を行うことができるように、プラスチック基板上にＰＣＲ反応部、流路、弁および側面フロー分析部を具備し、弾性フィルムを融着して形成させて弾性フィルムを通じてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液に熱を高速で伝達するＰＣＲ分析プレートに関する。本発明のプレートを用いてリアルタイムＰＣＲ反応、ネスティッドリアルタイムＰＣＲ反応、ＰＣＲ反応に引き続いて核酸プローブが固定されたペーパーを用いたラテラルフロー分析等を行って、ターゲットの増幅結果を迅速に確認するのに使用できる高速ＰＣＲ分析プレートに関する。

患者を迅速に診断するＰＯＣ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）ＰＣＲ診断技術は、証拠基盤精密医学の非常に重要な技術として注目されており、多様な核酸マーカーの開発と核酸マーカーの迅速検出技術の開発に伴って大きく発展を遂げている。

分子診断の多くの核酸マーカー検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、‘ＰＣＲ’という。）を利用している。ＰＣＲは、１９８５年にＫａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓにより発明されて以来、特定ＤＮＡを迅速かつ容易に増幅することができるので、生体試料内に極微量存在する特定ＤＮＡ／ＲＮＡが存在するか否かを確認することができて、ウイルスなど病原性微生物の感染を診断するのに多く利用されている。それだけでなく、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）等の方法で病原体の核酸の数を正確に定量分析することができるので、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶウイルス等の血中ウイルス濃度を正確に測定するこができて、治療効果をモニタリングする定量的な分子診断等に広範囲に使用されている。

このようなＰＣＲを行うためには、生体試料から生体試料のＰＣＲ反応を阻害する物質を除去し、純粋な核酸を抽出する核酸抽出過程を経た後、抽出された核酸とｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｏｂｅを含むＰＣＲ反応溶液を製造して反応容器に入れ、この反応容器を温度循環過程を通じてターゲット核酸を増幅する過程を経なければならない。また、ＰＣＲ反応産物を定量的に測定するためには、増幅されるＰＣＲ産物に比例して発生する蛍光をリアルタイムで測定するための蛍光量測定装置が具備されていなければならない。

分子診断において臨床症状に関連した多くの病原体があるので、患者の感染病原体を迅速に把握するために、多数のターゲットを同時に検査できる多重検査法が必要である。多数のターゲットを定性的に検出するためには、多重ＰＣＲ反応に引き続いてネスティッドリアルタイムＰＣＲ反応や多様なプローブが固定化されたペーパーを用いたラテラルフロー分析が必要である。

最近、研究開発を通じて核酸の抽出、ＰＣＲ反応および反応産物検出の全過程を自動化して高度の専門的知識がなくても容易にＰＣＲを利用できる多様な自動化システムおよびこれを利用する装置が開発されたことがある。しかしながら、従来の装置は、複雑で価格が高価であり、処理時間が依然として長くかかるので、迅速にかつ経済的にＰＣＲ反応を行い、全自動で多数のターゲットを定量または定性分析できる技術が要求されている。より具体的に、ＰＣＲ温度循環時間を画期的に減らし、多数のターゲットを定量、定性分析できる経済的な新しい方式のＰＣＲ反応容器が必要である。

ＰＣＲ技術の初期には、０．５ｍｌの反応容器が使用されたが、現在一般的に多く使用されるＰＣＲ装備は、温度循環時間を減らすために０．２ｍｌのＰＣＲ反応容器を使用している。しかしながら、このような装備を使用した場合に、ＰＣＲ反応のために温度を循環させるのに約１〜２時間の時間がかかるので、現場診断のために、より迅速にかつ正確にＰＣＲを行うことができる方法が持続的に開発されてきた（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１６，１６，３８６６−３８８４）。

ＰＣＲの原理をみると、ＤＮＡ二重らせんを９５度以上で加熱して二重らせんを１本鎖に分離させた後、ＰＣＲ反応溶液をアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度に冷却させてＰＣＲ反応溶液に入っている増幅しようとする部位の両末端に相補的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）が選択的に混成化されるようにすると、ＤＮＡポリメラーゼがそれぞれの１本鎖に相補的なＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種のｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを順次に連結して二重らせんを作る反応を繰り返し行うものである。実験的にＰＣＲ反応溶液を加温、冷却することを繰り返し３０〜４５サイクル（ｎ）を行って、特定ＤＮＡ二重らせんを２^ｎ個だけ幾何級数的に増幅させる反応である。ＲＮＡを検出するためのＰＣＲ反応は、逆転写酵素でまずｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲを通じて増幅し、定量分析することができる。

ＰＣＲ反応後に増幅されたターゲット核酸を分析するために、様々な方法が開発された。最初に開発された方法は、遺伝子実験室で頻繁に使用される電気泳動法で反応産物をＤＮＡサイズ別に分離した後、増幅されたターゲットＤＮＡが適合したサイズのＤＮＡであるか否かを確認する方法である。この方法は、ＰＣＲ反応後、追加的な複雑な電気泳動過程が必要なので、分析時間が長くかかり、また、診断検査のように繰り返されるＰＣＲ実験は、電気泳動過程でターゲットＤＮＡが漏れ出て実験室を汚染させて後続のＰＣＲ実験で偽陽性を発生させる問題があった。また、３０サイクル以上を進行してから最終反応産物を分析するので、ターゲットが少ない場合は、ＰＣＲサイクルが終るまで持続的に増幅されるが、ターゲットＤＮＡが多く存在する場合、ｄＮＴＰが消耗して増幅反応があらかじめ終結されるので、ＰＣＲサイクルが完了した後、分析したとき、初期のターゲットの濃度を定量できない問題があった。

このような定量問題とＰＣＲ反応産物による汚染問題を一緒に解決できる方法としてリアルタイム定量ＰＣＲ法が開発された。ターゲット核酸を定量分析できるリアルタイム定量ＰＣＲ過程は、増幅されるターゲットＤＮＡ断片に比例して蛍光が発生する物質をＰＣＲ反応液に添加した後、各サイクルごとにリアルタイムで蛍光を測定して臨界蛍光値が検出されるサイクルを把握する方式である。このような方式で反応容器に入れたターゲット核酸の初期濃度を定量的に測定することができる。リアルタイム定量ＰＣＲ法は、増幅されるＤＮＡ二重らせんに結合して蛍光を出す蛍光染料を利用する方法と、さらに正確な方法で増幅された塩基配列に特異的に混成化されて蛍光を出す蛍光プローブ法が開発された。このような塩基配列特異蛍光プローブ法を使用すると、５〜６個の互いに異なるターゲットを１つの反応液で全部定量分析できる強力な技術に発展してきた。

分子診断は、臨床症状を基盤として病気を起こすすべての病原体を一度に検査して正確な発病原因を一度に検査できる方向に発展している。リアルタイム定量ＰＣＲで５個のターゲットを同時に検出することができるが、呼吸器や性感染症のように類似した症状を起こす病原体の種類が多くて、１０個、２０個以上の多数のターゲットを同時に多重検出できる技術に対する需要が継続して増加している。より多数のターゲットを分析する方法として多重ＰＣＲ方法が開発された。多数のターゲットＤＮＡを増幅できるプライマーペアを反応溶液に入れて増幅を行う方式である。しかしながら、このような方式は、プライマーの相互作用等により非特異的増幅を誘発し得るので、追加的な検証過程を経て分析を行う方法が開発された。

このような多重検査の正確性を高め、簡便に一度に行うための方法として、多数のターゲットを対象として多重ＰＣＲを行い、二次的にネスティッド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを蛍光染料を用いてリアルタイムＰＣＲで行う方式がＢｉｏｆｉｒｅ社（ＦｉｌｍＡｒｒａｙ）で開発された。この方法は、数十余個以上のターゲットを同時に検出する簡便な方法であるが、１時間程度時間がかかり、試薬を水に溶かす前処理過程が必要であり、また、装備の価格と検査キットの価格が高価であるという限界点を有している。

他の方式として、多重ＰＣＲ反応を行った後、多様なターゲットが固定化されている配列に混成化反応を行って蛍光を検出する方法であって、ＰＣＲ後、ＤＮＡマイクロアレイを用いて特定位置に付いているプローブに混成化された増幅されたターゲットＤＮＡを確認する方法が多く開発された。９６ウェル底面にプローブが固定された９６ウェルプレートを利用する方法も開発された。他の方法として、特定ＤＮＡプローブが付いている蛍光バーコードビーズに混成化させて分析する方法がＬｕｍｉｎｅｘ社により開発されたが、相対的に分析時間が長くかかり、操作が複雑であるという問題点がある。

さらに低価であり、容易に使用できる多重ターゲット検出方法として、ＰＣＲを行った後、ラテラルフローストリップ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｓｔｒｉｐ）を用いて混成化した後、洗浄過程等を１０分程度に一度に行うことができ、経済的なターゲット核酸検出方法が開発された（ｍａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｆｅｂ １５；８１（４）：１６６０−８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ８０２４６５３．）。このような原理で多数のターゲットを検査できる商用化した方法としては、ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ ＨＰＶ遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）３２種を検査できるキット等が開発されている。しかしながら、このような製品は、一般的なＰＣＲ反応チューブを用いて１時間〜２時間反応させ、これをさらに検査するので、操作が煩雑であり、時間が長くかかる問題点とＰＣＲ反応産物の汚染による偽陽性が問題になり得る。

現場ですぐに診断できる現場型（Ｐｏｉｎｔ−Ｏｆ−Ｃａｒｅ、以下、ＰＯＣという）ＰＣＲのためには、何よりも高速でＰＣＲ反応溶液の温度を変化させなければならない。また、正確なＰＣＲ反応で所望のターゲットのみを選択的に増幅するためには、プライマーが所望のターゲットに特異的に混成化されるように設計されなければならず、ＰＣＲ温度循環反応でアニーリング温度を正確に調節しなければならない。

このようにＰＣＲ反応溶液をより迅速に熱循環させるための多くの技術が開発された。開発された方式は、大きく、ＰＣＲ反応溶液の空間移動方式と時間温度変換方式とに分けられる。空間移動方式は、反応容器や反応液を一定温度が維持されている熱伝達体に移動、接触させて迅速に加熱／冷却させる方式である。まず、反応容器を移動させる方式として、ＰＣＲ反応容器を高温水槽と低温水槽に一定時間ずつ繰り返し浸漬されるように反応容器ラックを移す方式が初期のＰＣＲ反応装置として開発された（Ｔｕｒｂｏ Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ．Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｄａｅｊｅｏｎ）。このように温度が異なる区域に反応器を循環させるＰＣＲ装備は、空間移動方式であって、あらかじめ正確に温度が維持されている特定温度の液体がＰＣＲ反応容器に接触して迅速にかつ正確に熱伝達を行ってＰＣＲ反応を行うことができるという長所がある。しかしながら、複数個の恒温水槽が必要で、装備が大きく、維持管理に手間がかかる問題点がある。したがって、このような液体水槽の代わりに、アルミニウム恒温ブロックを移す方式が開発された（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ^ＴＭ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。しかしながら、この方式は、固体と固体との接触で熱を伝達させるので、微細な粉塵により熱抵抗が変わる問題点があるので、高速で運営するには難しい点がある。

迅速なＰＣＲ反応のための空間移動方式でＰＣＲ反応容器の代わりにＰＣＲ反応液のみが微細流路を通じて温度が異なる区間を迅速に移動することによって、反応容器が有している熱容量なしに迅速にＰＣＲ反応溶液の温度を循環させることができる空間移動ＰＣＲ温度循環方式が開発された。この方式は、ＦＩＦＯ（Ｆｉｒｓｔ−Ｉｎ−Ｆｉｒｓｔ−Ｏｕｔ）方式で連続的に流れて行く開放された反応器方式と、異なる温度区間を繰り返し移動する閉鎖型方式とに分けられる。開放型方式としては、１９９４年にＮａｋａｎｏ等が温度が異なる区画を有する円筒形ブロックに毛細管を巻いてこれに連続的にＰＣＲ溶液を流す方式で開発された（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（２），３４９−３５２，１９９４）。これを微細流路の形態で１９９８年に高温と低温区間を繰り返して流れて通過する微細流路方式のＰＣＲ装備がＫｏｐｐ等により１０ｕｌの溶液を４．５秒のサイクルで２０サイクル通過させてＰＣＲが進行されることを確認した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０ １０４６−１０４８，１９９８）。

時間差温度循環方式を用いたＰＣＲ方式は、現在一般的に実験室で最も広く使用されるＰＣＲ装備が採択している方式であって、固定されたブロックでＰｅｌｔｉｅｒ素子等を用いて時間によって温度を変える時間差温度循環方式を採択したＰＣＲ装備が主流をなしている。このように固定された反応容器内で行う時間差温度循環方式を迅速に具現するために、実験室で一般的に使用されている０．２ｍｌの反応器より反応液の熱容量対比で熱源との接触面積が大きくなければならず、また、熱源とＰＣＲ反応液まで伝達される過程の熱抵抗が少なくて迅速に熱伝達されなければならない。このような目的で毛細管型ＰＣＲ反応器（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０，Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）と薄板型ＰＣＲ反応器（ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ，Ｃｅｐｈｅｉｄ）等熱交換面積が広い多様なＰＣＲ反応容器が開発された。しかしながら、このような反応器は広い表面積にもかかわらず、比熱が少ない空気で加熱冷却するので、時間が長くかかって３５サイクルを３０分で終了することができ、温度を正確に調節することが相対的に困難なことがある。高速で熱循環を行うことができるＰＣＲ反応器は、一般的に反応溶液を少なく使用するが、ＰＣＲ反応溶液が少ないほど、入るターゲット核酸の数が少なくて、微量の病原菌を検出することができないこととなって、検出限度（ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬＯＤ）が高まる問題点がある。したがって、分子診断で通常的に使用される１０〜５０ｕｌのＰＣＲ反応溶液を使用するには、相対的に広い表面積を有している場合のみに、迅速に熱伝達が行われ得る。このような事例として、シリコンウェハーに１７Ｘ１５ｍｍのサイズで４０〜８０ｕｍの薄い反応溝にＰＣＲ溶液１０ｕｌを入れ、ガラス板で覆って、体積対比で熱交換面積を高くした（＞１００ｍｍ２／１０ｕｌ）報告がある。しかしながら、ここでは、従来のＰｅｌｔｉｅｒ素子とアルミニウムブロックを用いてシリコンウェハーの反応液まで熱抵抗が大きくて、反応液の温度を上げたり下げたりするのに多くの時間が必要となり、１つのサイクルを約３分に短縮させる程度しか示していない（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０／９，１８１５−１８１８（１９９４））。

このような問題点を解決するために、迅速にＰＣＲ溶液が空間移動をする方式で開発されたものが、フィルムチューブを通じて２つの恒温ブロックの間を移動するＬｉａｔ （Ｌａｂ−ｉｎ−ａ−ｔｕｂｅ）である。この方式を用いて１５分程度の短時間に核酸抽出とリアルタイム定量ＰＣＲ結果を得ることができる。しかしながら、この方式は、１つのビニルチューブで反応が起こるので、多重ターゲットを検査するにあたって限界を有しており、チューブに試薬を入れなければならないので、大量生産するのに効率性が落ちる短所がある。

現場型分子診断検査のためにＰＯＣ ＰＣＲ反応を行うことができる様々な構造が持続的に発明されているが、多数のターゲットを迅速に全自動で検査できる経済的な多重ＰＯＣ ＰＣＲ反応器はまだ開発されていない。

本発明は、現場で迅速にリアルタイム定量ＰＣＲを通じて多数のターゲットを定量、定性分析できるＰＣＲ分析プレート提供するものである。本発明は、同じ原理で現場で迅速に極微量のターゲットを検出できるリアルタイムネスティッドＰＣＲに必要なプレートを提供するものである。また、多重ターゲットを検出するために多重ＰＣＲを行い、プライマー延長連鎖反応を行い、ラテラルフロー分析を通じて多くの種類の極微量のターゲットを検出できるＰＣＲ分析プレートに関するものである。このようなＰＣＲ分析プレートは、本発明は、上述した問題を解決するために案出されたものであって、反応溶液を短時間内に温度循環を正確に行うことができ、自動化生産が容易な経済的なＰＣＲプレートを提供しようとする。

また、ＰＣＲ反応容器内に乾燥されているＰＣＲ用乾燥物が注入される核酸溶液と均一に混ざって再現性に優れたＰＣＲ分析プレートを提供しようとする。前記のＰＣＲ反応容器内に乾燥されている乾燥物は、ｐｒｉｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ、核酸ポリメラーゼの２つのうちに１つ以上を含んでいるものであって、試料から抽出された核酸溶液で短時間に乾燥物を均質に溶かしてＰＣＲ反応が均一に良好に行われ得るようにするＰＣＲ反応分析プレートを提供しようとする。

また、本発明は、偽陽性の原因となるＰＣＲ反応物が外部に流出されずに、閉鎖された空間に留まる形態の構造として偽陽性を最小化できるＰＣＲ用反応プレートを提供するものである。

本発明の実施例では、ＰＣＲ反応溶液を高速で温度循環を正確に行うことができると共に、大量生産が容易であり、かつ、ＰＣＲ反応容器内に乾燥されている乾燥物が注入される核酸溶液と均一に混ざることができる経済的なＰＣＲプレートを提供するために、弾性熱伝導フィルムが融着された板状のＰＣＲ用反応器を考案した。

プレートの上部面に注入通路と連結されている注入口を含むように閉鎖線形態で高分子フィルムを融着して、ＰＣＲ反応物が薄くて広い面に密封される構造を形成した。注入口に核酸溶液を注入すると、溶液が流路の空気を押し出すことによって空気とともに注入されて、弾性フィルムが伸びて凸状になり、プレートの内部にＰＣＲ反応物が配置される。具体的に、核酸溶液の注入によってプライマーまたはプライマー／プローブまたはプライマー、プローブが含まれたＰＣＲ混合物乾燥物が溶解してＰＣＲのための反応物が配置される。この際、注入流路上に配置された仕切弁または逆流防止の逆止弁により正圧がかかった状態で凸状に反応容器が維持され得る。仕切弁は、溶液の注入時に開弁し、注入後に閉弁して、ＰＣＲ反応部が正圧を維持できるように具備されなければならず、好ましくは、反応が終わった後にもＰＣＲ反応液が逆流して抜け出して汚染させることを防止することができるように逆止弁を具備して逆流を防止できた方が良い。このように溶液が凸状になった弾性フィルムに高温と低温の熱板を交互に密着してＰＣＲ反応を行うことができる。

また、ベース基板と弾性フィルムをシーリングヒーターで容易に融着するために、プレートの融着される閉鎖線をプレートの上部面から１ｍｍ〜２ｍｍ以下の均一な高さで突出部を形成させ、これに弾性を有する高分子フィルムを融着してプレートに１ｍｍ以下の薄くて広い面の溝が形成されるようにＰＣＲ反応部構造を形成するようにすることもできる。

本発明の実施例では、前記プレートでリアルタイム定量ＰＣＲを行うためには、プレートを透明な材質で製作して、プレート面で励起光を照射し、蛍光を検出してリアルタイム定量ＰＣＲを行うことができる。

本発明の実施例では、同じ原理で現場で迅速に極微量のターゲットを検出できるリアルタイムネスティッド定量ＰＣＲに必要なプレートを提供するために、前記プレートに追加的に同じ形態の第２のＰＣＲ反応部を具備するように、１つのプレートに１つの弾性フィルムでＰＣＲ反応部が形成されるように融着し、それぞれのＰＣＲ反応部を連結する流路を形成し、流路の中間に仕切弁を設置することによって、一次にＰＣＲ反応を行い、２次にネスティッドリアルタイムＰＣＲを行うことができる。

ひいては、本発明の実施例では、多数のターゲットを検出するためには、２次ＰＣＲ反応部を複数個設置し、これに１次ＰＣＲ反応部と多数の２次ＰＣＲ反応部を並列で連結する流路と仕切弁を具備して、１次ＰＣＲ反応部で多重ＰＣＲを行い、２次に複数個のネスティッドリアルタイムＰＣＲを行うことができる分析プレートも発明した。

また、同じ構造の反応器を用いて多数のターゲットを定性的に検出するために、ＰＣＲ分析プレートとして、１次ＰＣＲ反応部と２次反応部、そしてプローブが固定化されたペーパーが保持されているラテラルフロー分析部を形成し、それぞれを連結する流路と仕切弁を同一プレートと同一弾性フィルムで融着して形成させて製作することができる。このプレートで一次に多重ＰＣＲを行い、仕切弁を開弁して第２反応器で２次にラベリングされたプライマーでプライマー延長反応を１０回以上繰り返し行い、第２仕切弁を開弁してラテラルフロー分析（ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ａｓｓａｙ、以下、ＬＦＡという）用ペーパーでラベリングされた単一らせんＤＮＡ溶液を通過して多数の増幅されたターゲットを同時に定性的に分析できるＰＣＲプレートを発明した。この際、ラベルは、金ナノ粒子を使用したり蛍光物質を使用することができる。

本発明の実施例によれば、本発明のＰＣＲ反応分析プレートは、ヒーティングブロックで押圧すると、正圧が維持された空気が収縮して圧力が追加で増加して、反応溶液と接触している弾性フィルムが均一な圧力でヒーティングブロックに密着して、最小限の熱抵抗で再現性があるようにＰＣＲ反応溶液に熱を伝達することができる長所がある。したがって、プレートの反応部にＰＣＲ反応溶液が注入されて凸状の弾性フィルムに高温と低温熱ブロックを順次に密着させて迅速にＰＣＲ熱循環反応を行うことができる長所がある。前記熱ブロックは、ＰＣＲ反応溶液よりも格別に大きい熱容量を有するブロックであって、一定の温度を維持していて、迅速に弾性フィルムを通じて広い面積に熱を伝達してＰＣＲ反応液の温度を変えることができる。熱ブロックが一定の温度を維持しており、熱ブロック自体の温度を熱循環（加熱や冷却）しなくてもよいので、電気消耗が小さく、安定した温度サイクルの調節が可能である。

また、反応容器内部の溶液は、弾性を有する空気層があるので、ＰＣＲ反応溶液が凸状になった部分を押圧すると、溶液がＰＣＲ反応容器の内部に移動することができるので、溶液の移動により乾燥されたプライマー／プローブを十分に溶解させることができて、均一なＰＣＲ反応を行うことができる長所がある。

また、ＰＣＲ増幅物である反応物がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を具現するプレートの反応空間内で正圧が維持されるように仕切弁を具備することができ、好ましくは、反応が終わった後にも、ＰＣＲ反応液が逆流して抜け出して汚染させることを防止することができるように、逆止弁構造物を具備する逆流防止機能を有していて、ＰＣＲ増幅産物の汚染による偽陽性を排除することができて、信頼性を有する反応プレートを提供することができる。

本発明のＰＣＲ反応分析プレートを透明プラスチック材質で製作して底面を通じて励起光を照射し、ＰＣＲ反応が進行されるにしたがって増加する蛍光を検出してリアルタイム定量ＰＣＲ反応を行うことができる。

本発明は、前記のプレートに追加的に同じ形態の第２のＰＣＲ反応部を具備するように、１つのプレートに１つの弾性フィルムでＰＣＲ反応部が形成されるように融着し、それぞれのＰＣＲ反応部を連結する流路を形成し、流路の中間に仕切弁を設置することによって、一次にＰＣＲ反応を行い、２次にネスティッドリアルタイムＰＣＲを行うことができて、極微量のターゲットを現場で迅速に検出できるリアルタイムネスティッド定量ＰＣＲを行うことができる。

また、本発明の実施例では、２次ＰＣＲ反応部を複数個設置し、これに１次ＰＣＲ反応部と多数の２次ＰＣＲ反応部を並列で連結する流路と仕切弁を具備して、１次ＰＣＲ反応部で多重ＰＣＲを行い、２次に複数個のネスティッドリアルタイムＰＣＲを行って、多数のターゲットを高感度で検出することができる。

また、本発明の１次ＰＣＲ反応部と２次反応部、そしてプローブが固定化されたペーパーが保持されているラテラルフロー分析部を具備するＰＣＲ分析プレートを用いて、一次に多重ＰＣＲを行い、仕切弁を開弁して第２反応器で２次にラベリングされたプライマーでプライマー延長反応を１０回以上繰り返し行い、第２仕切弁を開弁してアンカープローブが固定されているラテラルフロー分析（ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ａｓｓａｙ、以下、ＬＦＡという）ペーパーでラベリングされた単一らせんＤＮＡ溶液を通過させてそれぞれにターゲットが付くＤＮＡそれぞれのプローブが固定されている位置のラベルの存在有無を検出して多数のターゲットを定性的に同時に迅速に検出することができる。

本発明の実施例によれば、生体試料から核酸の抽出、ＰＣＲ反応およびスキャニングを通したリアルタイム反応産物の検出を自動化して行うことができ、一度の作動で様々な検査が可能であり、使用が簡便であり、特に短時間に正確な結果を得ることができるＰＣＲプレートを提供することができる。

本発明の実施例による仕切弁を具備する弾性フィルムが融着されたＰＣＲ分析プレートの作用状態図を示す概念図である。 本発明の実施例による逆止弁を具備する弾性フィルムが融着されたＰＣＲ分析プレートの作用状態図を示す概念図である。 図２の逆止弁と２つのＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートが組み立てられる斜視図であって、融着される弾性フィルム、逆止弁、流路を形成するシーリング剤を示す図である。 図３の上部と下部の平面図であって、融着される弾性フィルム、逆止弁、流路を形成するシーリング剤を示す図である。 図５のＡとＡ’の断面図である。 図３および図４のＰＣＲ反応分析プレートの状態を実際に示している平面写真（ａ）と斜面写真（ｂ）であって、反応液が収容部に注入されて正圧が維持されて弾性フィルムが凸状に形成されていることを示す図である。 逆止弁と８個のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートであって、プレートの平面と下部平面を示しており、ＡとＡ’の断面図を示している図である。 本発明においてネスティッドＰＣＲを行うことができる逆止弁と第１のＰＣＲ反応部と第２のＰＣＲ反応部を具備するネスティッドＰＣＲ反応のためのＰＣＲ分析プレートの作用状態を示す概念図である。 本発明のネスティッドＰＣＲを行うことができるＰＣＲ分析プレートであって、逆止弁と第１のＰＣＲ反応部と第２のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートの平面図である。 図８の逆止弁と第１のＰＣＲ反応部および第２のＰＣＲ反応部、仕切弁と精製部を具備するネスティッドＰＣＲ用ＰＣＲ分析プレートが組み立てられる斜視図であって、融着される弾性フィルム、逆止弁、精製部、仕切弁、流路を形成するシーリングフィルムを示す図である。 図１０の下部組立図である。 本発明によるＰＣＲ分析プレートのさらに他の実施例を示すものである。 本発明のＰＣＲ反応後にラテラルフロー分析を行うことができるＰＣＲ分析プレートの順次的な作用状態を示す概念図である。 図１３によるＰＣＲ分析プレートの平面図である。 本発明のＰＣＲ反応後にネスティッドプライマーを用いた延長反応または非対称ＰＣＲ反応を順次に行い、引き続いてラテラルフロー分析を行うことができるＰＣＲ分析プレートの順次的な作用状態を示す概念図である。 図１５によるＰＣＲ分析プレートの平面図である。 本発明のさらに他の実施例による２個のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートの上部平面（ａ）、下部平面（ｂ）および断面（ｃ）を示す図である。 本発明のさらに他の実施例による８個のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートの上部平面（ａ）、下部平面（ｂ）および断面（ｃ）を示す図である。

本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、添付の図面と共に詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になるだろう。しかしながら、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。かえって、ここで紹介される実施例は、開示された内容が徹底かつ完全になりえるように、そして当業者に本発明の思想が十分に伝達され得るようにするために提供されるものである。

本出願で使用した用語は、単に特定の実施例を説明するために使用されるものであり、本発明を限定しようとする意図ではない。単数の表現は、文脈上明白に異なるように意味しない限り、複数の表現を含む。本出願で、「含む」または「有する」等の用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定しようとするものであって、１つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたもの等の存在または付加可能性をあらかじめ排除しないものと理解されなければならない。

図１は、本発明の実施例による高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート（以下、「ＰＣＲプレート」という）の要部を示す概念図である。図２は、図１の仕切弁の代わりに逆止弁が装着された概念図である。図３は、図２の一例として逆止弁と２つのＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートが組み立てられる斜視図であって、融着される弾性フィルム、逆止弁、流路を形成するシーリング剤を示す図である。図４は、図３の平面と下部平面を示す図であり、図５は、図５のＡとＡ’の断面図である。

図１〜図４を参照すると、本発明によるＰＣＲ分析プレートは、ベース基板Ｓと前記ベース基板上に設けられ、核酸溶液を印加されて、プライマーまたはプライマー／プローブまたはプライマープローブが含まれたＰＣＲ混合物の乾燥物が収容された少なくとも１以上の収容領域を具備する反応部Ｗおよび前記反応部Ｗの内部を密閉する弾性フィルムＦを含んで構成される構造を具備することができる。

具体的には、本発明によるＰＣＲプレートは、図３に示された構造のように、一面と該一面に対向する他面とから構成されるプレート型構造物で具現される。

この場合、一面側には、核酸抽出カートリッジや外部注入機構により注入される核酸溶液を注入されてＰＣＲ反応を具現するためのプライマーまたはプライマー／プローブまたはプライマープローブが含まれたＰＣＲ混合物乾燥物が収容された収容領域Ｗ１、Ｗ２を具現する反応部Ｗが設けられる。前記反応部Ｗの場合、ベース基板Ｓの上に弾性フィルムＦを融着する構造で具現することもできるが、本発明の一例では、２ｍｍ〜４ｍｍ以下、好ましくは、２ｍｍ〜３ｍｍ以下、より好ましくは、２ｍｍ以下で突出した隔壁部ＧＡを用いて図４に示されたように隔離された空間で具現することができる。これは、４ｍｍ超過する高さで隔壁部を具現する場合には、後で高温、低温のヒーティングブロックが弾性フィルムに接触する場合に、下部の反応物の精密な温度伝達（熱伝達）が行われない短所が発生する。最も好ましくは、２ｍｍ以下の範囲で隔壁部を具現したり、融着部で具現する場合にも、このような融着部の高さ（厚み）も、このような範囲内で具現することが好ましい。

また、以下、本発明の実施例において「融着」の概念は、ベース基板にフィルム材が浮き上がる部分なしに密着する形態で定義し、超音波や熱、加圧等を通じて行われる融着が一般的であるが、所定の接着物質を利用する変形形態の密着や付着の方式も、本概念に含むものと定義する。

また、前記反応部Ｗを具現する場合、図３では、収容領域Ｗ１、Ｗ２が２つで具現されており、図７では、８個で具現されているが、これは、これに限定されるものではなく、１つまたは２つを超過する構造で具現することも可能であることはもちろんである。

また、本発明のＰＣＲ反応分析プレートの場合、前記反応部Ｗの上部に弾性を有する弾性フィルムＦを閉鎖線形態で融着させて形成され得、収容領域の内部を密閉する構造で具現される。以下、本発明において「閉鎖線形態」の用語は、弾性フィルムの一定外縁をベース基板に融着する場合、融着部が完全にベース基板に融着して融着部位と内側空間が密閉され得る構造で具現される線形融着部を具現する形態の加工構造と定義する。

前記弾性フィルムＦは、前記収容領域Ｗ１、Ｗ２と流路部Ｊ、後述する弁部を全部密閉する構造でベース基板Ｓの上部に配置されるようにする。

前記隔壁部ＧＡは、図３に示されたように、収容領域Ｗ１、Ｗ２を具現し、前記収容領域Ｗ１、Ｗ２と連結される流路部Ｊを具現する。前記流路部Ｊは、ベース基板の他端に具現される注入ホールｈ１を通じて注入される核酸を逆止弁溝Ｋを経由して前記収容領域Ｗ１、Ｗ２に誘導することができるようにする。

このようになると、前記収容領域Ｗ１、Ｗ２の内部に収容されているＰＣＲ反応を具現するためのプライマーまたはプライマー／プローブまたはプライマープローブが含まれたＰＣＲ混合物の乾燥物と注入される核酸が反応してＰＣＲ反応が起こる。

高速のＰＣＲ反応を具現するためには、前記収容領域Ｗ１、Ｗ２の上部面でＰＣＲ反応を誘導できる温度条件を印加することができるように高温と低温のヒーティングブロックＨＢを交互に密着させる過程が必要になる。この際、熱伝達は、ヒーティングブロックＨＢと弾性フィルムＦとの密着がどれくらいうまくいくかによって決定される。

本発明の一実施例では、ＰＣＲプレート２００の収容領域Ｗ１、Ｗ２を形成する弾性フィルムが溶液の注入により凸状に伸びていて、熱ブロックを弾性フィルムの凸状の面に密着させたとき、均一にヒーティングブロックＨＢと密着して、迅速なＰＣＲ反応を行うことができる。

また、このように注入された溶液により凸状になった弾性フィルムＦを押圧すると、外部から注入される核酸溶液が動くことになって、収容空間の内部に配置されるプライマーまたはプライマー／プローブまたはプライモプローブが含まれたＰＣＲ混合乾燥物が均質に混合され得ることになって、均一にＰＣＲ反応が具現され得ることになる。

ところが、図２に示されたように、前記収容領域Ｗ１、Ｗ２の上部面で印加されるヒーティングブロックＨＢにより圧力が印加される場合、混合反応が起こる反応物がさらに流路部Ｊに乗って逆流する現象が発生する。これに伴い、本発明では、このような逆流反応を防止するために、前記弁部を設け、前記ヒーティングブロックにより押される溶液の逆流を防止する仕切弁（図１のＤ）または逆止弁（図２のＶ）がベース基板上に配置され得るようにする。

本発明の実施例において「仕切弁」の構成は、ベース基板上に流体の流れを遮断または印加する仕切機能を行う領域であって、図１０に示された構造でベース基板Ｓに流体の引き込みを具現する一対のホールｈｄ１、ｈｄ２と上部の弾性フィルム部材Ｆが具現する領域Ｄの概念と定義する。なお、逆止弁Ｖは、弾性フィルムとベース基板との間に具現される独立構造物であって、流体の流れを制御する構造物と定義する。

また、本発明の好ましい実施例では、反応部Ｗの注入口と連結される流路部Ｊと、前記反応部Ｗの間に配置される仕切弁Ｄまたは反応部Ｗの注入口と連結される流路部Ｊと、前記反応部Ｗに注入された溶液の逆流を防止する逆止弁Ｖを含む弁部のうち少なくともいずれか１つ以上を具備する構造を全部含む。

すなわち、本発明の実施例において上述した逆止弁Ｖは、図３で弁部領域に具現され得るようにし、反応部Ｗと連通する流路部Ｊの一端と連通する逆止弁溝Ｋと前記逆止弁溝の内部に離隔する構造で保持され得るようにする。

前記逆止弁Ｖは、前記弁部の内部に流入する流体流入ホールＨａを浮遊方式で密閉するように作動することができる。

本発明の逆止弁Ｖの機能を具体的に詳述すると、図２〜図４に示されたように、本発明によるＰＣＲ分析プレートの場合、反応部Ｗに注入される核酸の注入経路は、一端の注入ホールｈ１を通じて印加することになり、印加された核酸の場合、逆止弁溝Ｋを経由してさらに流路部を経由し、ＰＣＲプレートの下端まで移動して反応部Ｗに移動する。

「逆流」反応は、注入経路を逆に収容空間の内部の反応物質が外部に引き出される過程で進行される過程を意味する。このような「逆流」反応は、本発明において核酸溶液が流路に沿って注入されて流路にある空気が圧縮されることによって、弾性フィルムが凸状に伸びることによって正圧がかかり、また、収容領域の内部の乾燥物を溶液と混合するために収容部の凸状の弾性フィルムを押圧する場合や、ＰＣＲ反応のために収容部の凸状の弾性フィルムを高温と低温を交互に印加するヒーティングブロックにより収容空間の内部に追加的な正圧が形成される場合、これに伴い、さらにこのような注入経路を逆に収容空間の内部の反応物質が外部に引き出される現象が発生して、逆流反応が起こることができる。

図５は、図４のＡ−Ａ’断面図であり、図１および図２は、本発明の実施例によるＰＣＲプレートの作用状態図を示す概念図である。

図３〜図５を参照して本発明の逆止弁が具備された構造の実施例で具現されるＰＣＲプレートの作用状態を説明することとする。

図５に示されたように、本発明の一実施例によるＰＣＲプレートは、逆止弁Ｖが配置される逆止弁溝Ｋの下部には、外部から流入する核酸流体が注入される流体流入ホールＨａが配置され、前記流体流入ホールＨａの下部には、流体移動経路を確保する経路形成ブロックＶａ構造物が具現され得る。

ＰＣＲプレートの場合、外部から流入する核酸が含まれた流体は、プレート下部を通じて注入ホールｈ１に注入され、注入された流体は、流入経路に沿って逆止弁溝Ｋに移動する。

図２を参照してこのような作用を詳細に説明すると、次の通りである。

図２は、ＰＣＲプレート構造物に核酸が含まれた流体が反応部Ｗに移動する過程を示す概念図である。

図２は、外部から核酸抽出物が含まれた流体が注入部ｈ１を通じて流入すると、経路に沿って移動（矢印の進行方向）し、流体流入ホールＨａの下部から逆止弁溝Ｋ側に移動し、逆止弁Ｖを若干浮遊させる（図２の（ａ））。

以後、前記逆止弁Ｖが、核酸抽出物が含まれた流体の注入圧力により弾性フィルムが若干伸びて浮遊すると、核酸抽出物が含まれた流体は、反応部Ｗに容易に移動し、移動後、反応部Ｗ、すなわち収容領域内にあらかじめ設けられたプライマーまたはプライマー／プローブまたはプライマープローブが含まれたＰＣＲ混合物乾燥物と反応してＰＣＲ反応が進行される（図２の（ｂ））。

この場合、収容領域の上部を密閉する弾性フィルムは、流体の注入で内部の圧力が増加し、図２（ｂ）のように表面が凸状に突出する。このように正圧がかかっている弾性フィルムの表面は、後述するＰＣＲ反応分析プレート反応部の溶液がヒーティングブロックＨＢと効率的な密着をもたらすことができて、精密な温度条件を確保することができる長所で具現され得る。

以後、ＰＣＲ反応を誘導するために、ＰＣＲ過程に必要な温度調節過程を熱変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程に必要な温度と結合過程（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）に必要な正確な温度を印加する加熱と加圧が可能な装備を通じて反応部（収容領域）内に温度制御を行い、加圧が周期的に印加されると、収容領域の内部に正圧（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＰＰ）が形成され、反応物質間の均質な混合が具現され得る。

同時に、正圧により混合された反応物質が逆に収容領域の外部に押されていこうとする逆流反応が発生する。

このような逆流反応が発生すると、図２（ｂ）に示されたように、逆止弁Ｖを下方に加圧することとなり、自然に前記逆止弁Ｖが流体流入ホールＨａを閉塞することとなる。このように流体流入ホールＨａを逆止弁Ｖが閉塞すると、収容領域の内部の反応物は、外部に逆流しないこととなり、収容領域の内部で反応する作用を継続することができる。

このために、本発明の実施例では、前記逆止弁Ｖの構造を凹凸を有する上部面と密着する構造の下部面を有する立体構造物で具現することができるようにする。

すなわち、逆止弁の下部面が注入口と密着して注入口を密封し、上部面は、突出部が弾性フィルムの内側と対向して逆止弁を押圧しており、溶液が突出部を除いた逆止弁の上部に加えられて正圧が加えられた場合、強く注入口の周辺を密封することを具現することができるようにする。

換言すると、反応部Ｗに流入する流体の引き込みによって逆止弁溝Ｋ内部の逆止弁Ｖが浮遊動作を通じて開弁する構造で配置されるように構造物を具現するものの、前記逆止弁Ｖの下部面は、流体の注入ホールを密閉するように具備し、前記逆止弁Ｖの上部面は、中心部のみが弾性フィルムと密着し、残りは溶液と接触することができるようにする。

この場合、逆止弁は、多様な構造の材料と形状を具現することができるが、一例として円錐型または上部の直径が１／２以下である２段円筒形または上部面に突起が形成されている円筒形で多様に変形され得、その代わりに、逆止弁の下部面Ｖ２は、全部流体流入ホールＨａを効率的に密閉することができるように、シリコーンゴム等のような弾性体で具現することが好ましい。

図６は、図２および図５の図示されたことを実施した後、具現した実際写真イメージを示すものであって、（ａ）は、核酸流体の注入前のイメージであり、（ｂ）は、核酸溶液の注入後に収容領域で反応液が注入されて弾性フィルムが正圧がかかっていて、凸状になった状態を示している。図６（ｂ）のように、弾性フィルムが上部に凸状の構造で具現される表面に、温度が一定に維持される高温と低温のヒーティングブロックを交互に加圧すると、収容領域で弾性フィルムの凸状の面が伸びて、熱伝達が行われ、また、反応溶液が動いてＰＣＲ反応溶液が均一に混合される。接触時に発生する追加的な圧力による逆流を逆止弁を通じて制御することができる。

前記ＰＣＲ反応分析プレートは、リアルタイムＰＣＲ増幅分析に使用され得るが、リアルタイムＰＣＲを行うためには、毎サイクルごとにＰＣＲ反応部から出る蛍光値を検出して臨界蛍光値以上で蛍光が増加するサイクルを測定して、ターゲットの濃度を検出することができる。

このような目的を達成するために、本発明の好ましい実施例では、前記ベース基板は、透明な合成樹脂材質を使用することができる。透明合成樹脂材質の一例としては、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）系のプラスチックを使用することができる。また、リアルタイム定量ＰＣＲに使用される多様な蛍光物質を測定するために、蛍光物質を含まないプラスチックを使用しなければならない。

以上で、本発明の基本となるＰＣＲ反応分析プレートの最も簡単な例の詳細な作動原理を説明した。

前記の発明は、１つのＰＣＲ反応を行う形態の例であり、本発明は、このような基本原理を用いて高度な性能が要求される追加的な発明をした。

次は、１つの例として、複雑な塩基配列の核酸物質が含まれている試料から極少量のターゲットを増幅するために最も効率的な方法として知られているネスティッドＰＣＲを行う本発明の応用実施例に関するものである。

図８は、ネスティッドＰＣＲを行うことができる本発明のＰＣＲ反応分析プレートに対する概念図であって、逆止弁と第１のＰＣＲ反応部および第２のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートの作用状態を示す概念図である。図９は、ネスティッドＰＣＲを行うことができる本発明のＰＣＲ分析プレートであって、逆止弁と第１のＰＣＲ反応部および第２のＰＣＲ反応部を具備するＰＣＲ分析プレートの図８の平面図である。

図１０は、図８、図９の組立図を示す分解斜視図である。

まず図９および図１０を参照すると、本実施例によるＰＣＲ分析プレートは、ベース基板Ｓ上に一対の反応領域を相互離隔するように具現する。すなわち、第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と第２のＰＣＲ反応部Ｗ２が具備される。特に、前記第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と第２のＰＣＲ反応部Ｗ２は、弾性を有する弾性シーリングフィルムの融着で空間部を形成する構造で具現され、第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と第２のＰＣＲ反応部Ｗ２との間には、第１のＰＣＲ反応部Ｗの排出口と第２のＰＣＲ反応部Ｗ２の注入口を連結する第２流路部Ｊ２に起こる流体の流れを仕切る仕切弁Ｄが配置される。

すなわち、本発明の実施例では、図２〜図４に上述した逆止弁を具備する構造の実施例と差異が、図３と同じ構造に追加的に第２のＰＣＲ反応部を具備し、これに第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と連結される流路Ｊ２を形成し、流路の中間に溶液の流れを仕切る仕切弁Ｄを具備している。

より効率的な２次ネスティッドＰＣＲ反応のためには、１次ＰＣＲ反応で生成されたプライマー、ピロホスフェートなど２次ネスティッドＰＣＲ反応を阻害する阻害物質を除去する吸着剤を具備する精製部ＦＴを第２のＰＣＲ反応部Ｗ２前の流路に追加することができる。第２のＰＣＲ反応部Ｗ２は、第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と同じ方式で製造される。注入口を含む閉鎖線形態でベース基板に弾性フィルムが融着して製造されるが、弾性フィルムを融着させる前に、ネスティッドＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）に必要な追加的なプライマーとプローブ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ乾燥物をベース基板に追加した後に密封させる。

図１０は、ネスティッドＰＣＲ反応分析プレートの全体組立図を示している。図１１は、図１０の下部組立図である。

本発明のネスティッドＰＣＲ反応分析プレートを製造するためには、ベース基板Ｓの下部面に形成される流路と吸着剤を含む精製部ＦＴを形成するために、ベース基板Ｓの下部面を上部に向かうようにひっくり返して精製部ＦＴに吸着剤を入れ、フィルムＦ３で密封して、一度に流路と精製部を形成させる。

引き続いて、ベース基板Ｓの上部面が上方になるようにした後、逆止弁Ｖと第１のＰＣＲ反応乾燥物と第２のＰＣＲ反応乾燥物を第１のＰＣＲ反応部Ｗ１と第２のＰＣＲ反応部Ｗ２それぞれの位置に入れた後、弾性フィルムＦで融着して、本発明のネスティッドＰＣＲ分析プレートを製造することができる。

前記吸着剤は、分子のサイズによって浸透が可能な多孔性粒子であって、ＰＣＲ反応産物である増幅された大きい分子のＤＮＡは入ることができず、プライマー、ピロホスフェートのような小さい分子は入ることができる特徴を有している多孔性粒子であって、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｇ−５０）、多孔性セラミック等を組み合わせて使用することができる。

図１０の構造を中心として図８の断面概念図を参照して本発明の１次ＰＣＲ作動原理を説明すると、次の通りである。

図８の（ａ）のように、１次ＰＣＲが完了する前までは、仕切弁は、常に閉弁した状態に維持しなければならない。１次ＰＣＲ反応は、注入ホールｈ１を通じて注入される核酸抽出物等が逆止弁Ｖを経由して第１のＰＣＲ反応部Ｗ１で行われる。１次ＰＣＲ反応が行われる間、図８の（ｂ）のように、前記逆止弁Ｖは、閉弁した状態になって反応物の逆流を防止できるようにする。１次ＰＣＲ反応の場合、第１のＰＣＲ反応部Ｗ１の弾性フィルムが膨らんだ部分をヒーティングブロックＨＢ１を通じて交互に押圧する動作を通じて行われ得るようにする。

以後、図８（ｃ）のように、流入した反応物の１次ＰＣＲ反応が終結すると、仕切弁Ｄを押圧しているピストンＰＧを上に持ち上げて、正圧で満たされていた第１次ＰＣＲ反応部Ｗ１の溶液が流路に沿って仕切弁Ｄを通過して精製部ＦＴを過ぎて第２のＰＣＲ反応部Ｗ２に移動する。

この際、最大限溶液を全部移動させるために、後方のヒーティングブロックＨＢ２を持ち上げ、前面のヒーティングブロックＨＢ１で押圧して、溶液を完全に移動させた後、仕切弁Ｄのピストンを押圧して流路を遮断する。

以後、高温と低温のヒーティングブロックＨＢ２を交互に押圧してＰＣＲサイクルを進行して、１次ＰＣＲで増幅されたＰＣＲを行う。この際、リアルタイムＰＣＲを行うためには、毎サイクルごとにＰＣＲ反応部から出る蛍光値を検出して、臨界蛍光値以上で増加するサイクルを測定してターゲットの濃度を検出することができる。このためには、前記に記述した透明な材質のプラスチックを使用してＰＣＲ反応分析プレートを製造しなければならない。

図１２は、本発明によるＰＣＲ分析プレートのさらに他の実施例を示すものである。

図１２を参照すると、図１２に示された構造物は、多数のターゲットを対象として多重ネスティッドＰＣＲを行うことができる本発明のＰＣＲ分析プレートの例示図である。

すなわち、本発明の多様な実施例では、１次ＰＣＲ以後、２次に多数のリアルタイムＰＣＲを行うことができる構造を具現することができる。

図１２の構造は、このような本発明の要旨を具現した例示図であり、１次に多重ＰＣＲを行い、２次に８個の２次反応部でリアルタイムＰＣＲを行うことができるＰＣＲ分析プレートを例示した平面図である。

すなわち、基本的な構造として注入ホールと逆止弁Ｖ、第１のＰＣＲ反応部Ｗ１の構成および仕切弁Ｄが配置される構造は、図９および図１０の構造と同一である。ただし、第２のＰＣＲ反応部の構成を単一で具現する構造でなく、多数で具現するという点から差異がある。したがって、図１２の実施例の構造は、前記図９と図１０と同じ原理で作動し、精製部ＦＴ以後に８個の２次ＰＣＲ反応部Ｗ８に並列で連結されるように流路が形成されているという点から差異がある。これは、前記のようなプロセスで作動し、同時に多数のターゲットをリアルタイムＰＣＲで分析できる長所を有している。

図１３は、本発明のさらに他の実施例によるＰＣＲ反応後にラテラルフロー分析を行うことができるＰＣＲ反応プレートの構造を示す図である。図１４は、図１３の平面図である。

図１３および図１４を参照すると、本実施例においてＰＣＲ反応分析プレートは、プラスチックからなるベース基板Ｓに上下面にフィルムＦを融着させて密封されたシステム内で短時間に増幅できるので、ＰＣＲ後に核酸プローブがそれぞれのバンドに固定されているペーパーを通過させて混成化されたバンドを分析するＰＣＲ反応一体型ラテラルフロー分析に理想的なＰＣＲ反応分析プレートを図示している。

具体的に、ＰＣＲ反応後に増幅されたＰＣＲ産物を用いてラテラルフロー分析のためには、最終的に単一らせん形のＤＮＡが製作されなければならない。このためには、前記のＰＣＲ反応乾燥物を製造時に1つのプライマーが過量で入った乾燥物を製造する。このＰＣＲ乾燥物を用いて非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）を行って、最終的に片方の鎖だけが過量で存在するＰＣＲ産物を製作することができる（Ｗｏｏｄｄｅｌｌ，Ｃ Ｉ；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｒ Ｒ（１９９６）．“Ｕｓｅ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｌｏｎｇ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｆｏｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ Ａｎａｌｏｇｓ ｉｎｔｏ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ”（ＰＤＦ）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（６）：８８６−８９２）。

本発明のＰＣＲ反応後にラテラルフロー分析プレートを製造するためには、逆止弁と第１のＰＣＲ反応部Ｗ１および仕切弁Ｄを具備する構造および作用は、図９および図１０と同一である。ただし、ベース基板の下部流路をシーリング剤で完成した後、上部面に逆止弁、前記非対称ＰＣＲ反応乾燥物とラテラルフロー分析モジュール（ＬＳＭ）をそれぞれの位置に入れた後、弾性フィルムで融着して製造される。

これに使用されるラテラルフロー分析モジュール（ＬＳＭ）は、始端にローディングパッドＬ１が付着されており、末端部に吸着パッドＬ３が付着されており、ペーパー中間部に多数のプローブが固定化されたバンドＬ２を有しているペーパーモジュールである。

この場合、前記ベース基板Ｓは、前記のラテラルフロー分析モジュールが保持され得るように溝が形成されるように具現することが好ましい。本発明は、このように簡単なプロセスで密閉された空間で迅速にＰＣＲを行い、ラテラルフロープローブ混成化分析を行うことができるＰＣＲラテラルフロー分析プレートを製造することができる。

図１３に示されたように、本発明のＰＣＲ作動原理は、基本的に１つのＰＣＲ反応部を有するプレートと同じである。ただし、ＰＣＲが完了する前までは、仕切弁Ｄは、常に閉弁した状態に維持しなければならない。ＰＣＲが終結すると、仕切弁Ｄを押圧しているピストンＰＧを上に持ち上げて正圧で満たされていたＰＣＲ反応部の溶液が流路に沿って仕切弁Ｄを通過してラテラルフロー分析部ＬＳに入る。この際、最大限溶液を全部移動させるために、ヒーティングブロックＨＢで凸状の反応部を押圧して溶液を移動させる。以後に、溶液は、ローディングパッドＬ１に吸収されて徐々にプローブがバンドＬ２形態で固定化されたペーパーに沿って最終吸収パッドＬ３まで移動しながらターゲットに相補的なプローブに会ったとき、混成化されて移動が停止して、蛍光ラベルや金ナノ粒子の色を呈することとなる。これを検出して多様なターゲットを定性的に検出することができる。この際、正確な混成化のために、ＰＣＲ反応プレートの温度を一定に維持しなければならない。このためにＰＣＲ反応プレートが載置される金属板の温度を一定に調節できなければならず、ヒーティングブロックＨＢも、同じ温度で調節して押圧し、仕切弁ピストンも押圧して、ＰＣＲ反応プレートの温度を一定に維持することができる。

図１５は、本発明のＰＣＲ反応とネスティッドプライマーを用いた延長反応またはネスティッド非対称ＰＣＲ反応を順次に行い、引き続いてラテラルフロー分析を行うことができるＰＣＲ分析プレートの順次的な作用状態を示す概念図である。図１６は、図１５によるＰＣＲ分析プレートの平面図である。

本発明の派生した構造は、最も複雑な形態であって、１次ＰＣＲを行い、２次に非対称 ネスティッドＰＣＲを行い、引き続いてラテラルフロー分析を実施する形態である。このためには、１次ＰＣＲ反応物を２次ＰＣＲ反応に溶液を渡すための第１仕切弁Ｄ１と、２次ＰＣＲ反応溶液をラテラルフロー分析部ＬＳに移動させるための第２仕切弁Ｄ２が設置されている。

また、１次ＰＣＲ反応物から２次ＰＣＲ反応を妨害する物質を除去する精製部ＦＴが１次仕切弁の次に流路上に具備されている。

２次ＰＣＲは、ネスティッド非対称ＰＣＲやネスティッドプライマー延長反応等を使用することができるが、この際、単一らせんを形成させるプライマーは、必ず蛍光等でラベリングされたプライマーを使用しなければならず、これを含む乾燥物が第２反応部に入らなければならない。

本発明のＰＣＲ反応分析プレートを製造するためには、ベース基板の下部面に形成される流路と吸着剤を含む精製部ＦＴを形成するために、ベース基板の下部面を上部に向かうようにひっくり返して精製部に吸着剤を入れ、フィルムで密封して、一度に流路と精製部を形成させる。引き続いて、ベース基板の上部面が上方になるようにした後、逆止弁、第１のＰＣＲ反応乾燥物、第２のＰＣＲ反応乾燥物、ラテラルフローモジュールをそれぞれの位置に入れた後、弾性フィルムで融着して、本発明のネスティッドＰＣＲラテラルフロー分析プレートを製造することができる。前記吸着剤は、前記に記述した多孔性粒子としてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｇ−５０）、多孔性セラミック等を組み合わせて使用することができる。

図１５および図１６を参照すると、本発明の１次ＰＣＲ作動原理は、前記と同じである。

（ａ）１次ＰＣＲが完了する前までは、第１仕切弁Ｄ１および第２仕切弁Ｄ２は、常に閉弁した状態に維持しなければならない。
（ｂ）１次ＰＣＲが進行される過程は、図９の実施例で上述したように、逆止弁Ｖの動作により反応部上でＰＣＲ反応が行われる。
（ｃ）以後、１次ＰＣＲが終結すると、１次仕切弁Ｄ１を押圧しているピストンＰＧ１を上に持ち上げて正圧で満たされていた１次ＰＣＲ反応部の溶液が流路に沿って第１仕切弁Ｄ１を通過して精製部ＦＴを過ぎて第２のＰＣＲ反応部Ｗ２に移動する。この際、最大限溶液を全部移動させるために、後方ヒーティングブロックＨＢ２を持ち上げ、前方ヒーティングブロック１ ＨＢ１で押圧して溶液を完全に移動させた後、１次仕切弁Ｄ１のピストンＰＧ１を押圧して流路を遮断する。以後、高温と低温のヒーティングブロックＨＢ２を交互に押圧して２次ＰＣＲサイクルを進行して２次ＰＣＲを行う。この際、第１仕切弁Ｄ１および第２仕切弁Ｄ２は、全部閉弁していなければならない。
（ｄ）２次ＰＣＲが終結した後、第２仕切弁Ｄ２を開放してラテラルフロー分析部ＬＳのローディングパッドに２次ＰＣＲ溶液が流れるようにする。これを通じて、２次ＰＣＲ反応で生成された単一らせん鎖のＤＮＡがターゲットプローブ核酸に会って移動を止めると、各バンドのラベルを検出してターゲットを検出することができる。

以上では、本発明を好ましい実施例に基づいて説明したが、本発明の技術的思想は、これに限定されず、請求項に記載された範囲内で変形や変更実施が可能であることは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明白なことであり、そのような変形や変更は、添付の特許請求範囲に属すると言える。

Ｓ ベース基板
Ｗ 反応部
Ｆ 弾性フィルム
Ｗ１ 第１のＰＣＲ反応部
Ｗ２ 第２のＰＣＲ反応部
Ｗ３ 第３のＰＣＲ反応部
Ｊ 流路部
Ｊ２ 第２流路部
Ｊ３ 第３流路部
Ｖ 逆止弁
Ｖａ 経路形成ブロック
Ｋ 逆止弁溝
Ｈａ 流入溝
Ｄ、Ｄ１、Ｄ２ 仕切弁
ＬＳ ラテラルフロー分析部
ＨＢ、ＨＢ１、ＨＢ２ ヒーティングブロック
ＦＴ 精製部
ｈ１ 注入ホール
ｈｄ１、ｈｄ２ ホール
Ｌ１ ローディングパッド
Ｌ２ プローブ固定バンド
Ｌ３ 吸着パッド

Claims (16)

1. 注入口が形成されたベース基板（Ｓ）；
   前記ベース基板（Ｓ）上に、前記注入口を含む閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して密閉された構造で具現される反応部（Ｗ）；および
   前記反応部（Ｗ）の注入口と連結される流路部（Ｊ）と、前記反応部（Ｗ）との間に形成される仕切弁（Ｄ）；
   を含む高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
2. 注入口が形成されたベース基板（Ｓ）；
   前記ベース基板（Ｓ）上に注入口を含む閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して密閉された反応部（Ｗ）；および
   前記反応部（Ｗ）の前記注入口と連結される流路部（Ｊ）と、前記反応部（Ｗ）に注入された溶液の逆流を防止する逆止弁（Ｖ）とを含む弁部；
   を含む高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
3. 前記ベース基板上の前記反応部（Ｗ）は、
   閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して密閉された第１のＰＣＲ反応部（Ｗ１）から離隔する第２のＰＣＲ反応部（Ｗ２）；をさらに含み、
   第１のＰＣＲ反応部（Ｗ１）と第２のＰＣＲ反応部（Ｗ２）は、前記ベース基板の下部に具現される第２流路部（Ｊ２）を媒介として連通し、
   前記反応部（Ｗ）と前記第２反応部（Ｗ２）との間の第２流路を通した流体の流れを仕切制御する仕切弁（Ｄ）；
   をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
4. 前記第２のＰＣＲ反応部は、
   複数個の第２のＰＣＲ反応部が第２注入口を含む閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して形成され；
   前記第１のＰＣＲ反応部の排出口から始まって分岐点で複数個の流路に分岐して複数の第２のＰＣＲ反応部の注入口に並列連結される第２流路部；
   をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
5. 前記ベース基板の反応部（Ｗ）の一端に排出口が形成され、
   前記排出口と連結される第２流路部を通じて連通するラテラルフロー分析部（ＬＳ）；
   前記ラテラルフロー分析部（ＬＳ）は、核酸プローブが固定されたラテラルフロー分析モジュールと第２注入口を含み、閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して形成され、反応部の排出口とラテラルフロー分析部の注入口を連結する第２流路部の溶液の流れを仕切る仕切弁（Ｄ）；
   をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
6. 前記第２のＰＣＲ反応部（Ｗ２）から離隔して配置され、第２排出口が形成され、第３注入口と核酸プローブが固定されたラテラルフロー分析モジュールを含むラテラルフロー分析部（ＬＳ）が閉鎖線形態で弾性を有するシーリングフィルムが融着して形成され、
   前記第２のＰＣＲ反応部（Ｗ２）の第２排出口とラテラルフロー分析部の第３注入口を連結する第３流路部；および
   前記第３流路部の溶液の流れを仕切る第２仕切弁（Ｄ２）；
   をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
7. 前記逆止弁（Ｖ）は、弾性体として流路に注入される溶液の圧力により開放される形態であり、
   シーリングフィルムの内側と接触する表面は、溶液が染み込むことができるように円錐型または上部の直径が１／２以下である２段円筒形または上部面に突起が形成されている円筒形で具現され、
   前記逆止弁の下部面（Ｖ２）は、前記ベース基板（Ｓ）上に注入される面と密着するようになめらかな鏡面で具現されることを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
8. 前記仕切弁（Ｄ）は、
   前記仕切弁の入口と出口を含む閉鎖線形態で前記弾性を有するシーリングフィルムにより融着して形成され、前記入口から入る溶液の圧力によりシーリングフィルムが伸びて前記出口に排出されて開通し、
   前記シーリングフィルムの上部を弁圧着部が押して弾性を有するシーリングフィルムとベース基板を密着させて前記仕切弁の内側空間のすべての溶液が排出されることによって入口と出口が閉鎖されることを特徴とする、請求項１に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
9. 前記ベース基板と弾性を有するシーリングフィルムが融着される閉鎖線は、０．５ｍｍ〜２ｍｍの線幅で融着することを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
10. 前記ベース基板は、
    弾性を有するシーリングフィルムが融着する閉鎖線がベース基板（Ｓ）から２ｍｍ以下の高さで突出して形成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
11. 前記のラテラルフロー分析モジュールは、核酸プローブが固定されたラテラルフローペーパー構造であって、始端にローディングパッド、末端に吸収パッドがそれぞれ付着しており、溶液の流れと垂直方向に多数の線形アレイ形態で1つ以上の核酸プローブが固定されていることを特徴とする、請求項５に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
12. 前記反応部の注入口に隣接して、一対以上のプライマー、またはプライマー／プローブ乾燥物がコーティングされており、ポリメラーゼが含まれたターゲット核酸溶液の注入により流路部と反応器内部の空気が圧縮されてターゲット核酸溶液と前記乾燥物とが混ざり、前記弾性を有するシーリングフィルムが凸状に伸び、
    前記弾性を有するシーリングフィルムの凸状のフィルム面を圧着ブロックで押圧する操作を繰り返すことによって、注入された溶液が反応部内で動いて前記ＰＣＲ反応水溶液を均一にすることを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
13. 前記反応部の注入口と隣接して、1つ以上のプライマー、またはプライマー／プローブが含まれたＰＣＲ混合乾燥物がコーティングされており、ターゲット核酸溶液の注入によって流路部と反応器内部の空気が圧縮されて溶液と乾燥物とが混ざり、前記弾性を有するシーリングフィルムが凸状に伸び、前記弾性を有するシーリングフィルムの前記弾性を有するシーリングフィルムの凸状のフィルム面を圧着ブロックで押圧する操作を繰り返すことによって、注入された溶液を移動させて前記ＰＣＲ反応水溶液を均一にすることを特徴とする、請求項１または２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
14. 前記第２反応部にネスティッドＰＣＲのためのプライマー／プローブ、またはプライマーとＤＮＡ検出用蛍光染料が含まれたＰＣＲ混合乾燥物がコーティングされていることを特徴とする、請求項３に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
15. 前記第２反応部（Ｗ）に増幅されたＤＮＡの片方の鎖に相補的な５’位置にラベリングされたプライマーとＤＮＡポリメラーゼ反応のための混合物が乾燥されており、混成化分析モジュールのプローブは、前記ラベリングされたプライマーにより合成される単一らせんＤＮＡと相補的な塩基配列を有して固相に固定されていることを特徴とする、請求項５に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。
16. ラベリングされたネスティッドプライマーは、
    蛍光、化学発光、金ナノ粒子でラベリングされたことを特徴とする、請求項１２に記載の高速ポリメラーゼ連鎖反応分析プレート。

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