CN104940221A - 一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物，所述组合物由以下成分中的两种或三种组成：透明质酸、壳聚糖或硫酸软骨素。临床前动物实验表明，本发明涉及的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物能够明显修复由硫酸鱼精蛋白或环磷酰胺引起的膀胱上皮的损伤，显著减少膀胱上皮损伤范围和受损程度，减轻炎症浸润程度。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料领域，具体地说，涉及一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物及其临床适用范围。
背景技术
膀胱炎是一种发生在膀胱的炎症，是泌尿***最常见的疾病之一。膀胱炎主要分为急性和慢性两种，其中慢性膀胱炎由于其致病机理没有得到广泛的认知，导致其治疗手段的发展受到阻碍。慢性膀胱炎临床表现为间质性膀胱炎、腺性膀胱炎、化学性膀胱炎、放射性膀胱炎等，主要以尿急、尿频、慢性盆腔疼痛为主要表现。
慢性膀胱炎的致病原因目前仍不明确，但是许多研究认为上皮损伤是引起慢性膀胱炎的主要原因，而且间质性膀胱炎、化学性膀胱炎、放射性膀胱炎等都表现出膀胱粘膜损伤的症状。
膀胱上皮是抵抗尿液中代谢毒性废物和高渗透性尿液的重要屏障。在膀胱上皮的抵抗作用中，其上皮伞状细胞的葡萄糖胺聚糖层(GAGs)发挥了重要的作用。GAGs层在膀胱上皮形成一个亲水的保护层来抵抗尿液中毒素的侵害。GAGs主要包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、类肝素硫酸蛋白聚糖等。一旦GAGs层受到损害，膀胱上皮就很容易受到包括尿液中的钾离子、感染、抗肿瘤药物、放射等因素的侵害，从而引发膀胱的一系列炎症反应。
膀胱炎症严重影响患者的生活质量。在慢性膀胱炎中，以间质性膀胱炎对患者，尤其是女性患者的影响显著。虽然目前间质性膀胱炎的发病率在国内并无明确数据，但是国外已经有了相关数据统计，例如美国女性间质性膀胱炎的发病率为230/10万，且根据以往研究结果发现，间质性膀胱炎的发病率在逐年上升。但是，由于目前医患对于间质性膀胱炎并没有普遍 的认识，许多患者初期被诊断为其他疾病，延误的治疗时间，导致病症进一步加重，给患者的生理及心理造成了严重的影响。另外，目前国内没有一种可以完全去除患者病症的医疗产品，因此针对慢性膀胱炎缓解产品的研发显得尤为重要。
与膀胱炎相似，当尿道上皮细胞受到损伤后，在排尿时尿道粘膜内层细胞很容易受到尿液中的代谢废物，特别是钾离子的侵害，从而引发疼痛。修复尿道上皮细胞是缓解上述排尿疼痛的一种有效手段。
透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素均为天然高分子多糖。透明质酸是指由N-乙酰氨基葡萄糖-D-葡萄糖醛酸为双糖单位组成的直链高分子多糖。壳聚糖是天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物，是由N-乙酰-D-氨基葡糖单体通过β-1，4-糖苷键连接起来的直链状高分子化合物。硫酸软骨素的糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺二糖单位组成。
已经有研究表明透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素均有促进膀胱上皮损伤修复的作用，例如专利CN1758920A中公开了高剂量硫酸软骨素对由于GAGs损伤引起的膀胱和尿道疾病的疗效。
另外，CN201010502271.9(CN102441007A)公开了一种复合成分的膀胱灌注液，由浓度0.5-1％玻璃酸钠、浓度为0.1-0.8％的壳聚糖和生理盐水平衡液组成。玻璃酸钠可以参与修复，壳聚糖可抑菌止痛，从而达到既能参与原位组织又能抑菌止痛的治疗间质性膀胱炎的目的。
CN201310753152.4(公开号为CN103655601A)中公开了以壳聚糖、透明质酸和磷酸缓冲液组成的膀胱灌洗剂，其中透明质酸浓度为0.01-0.1％，壳聚糖0.005-0.2％，但是其中使用的有效成分浓度相对较低。
专利CN200610024263.1(公开号为CN101028280A)中，用透明质酸钠和水溶性几丁糖制备了灌洗液制剂。该手术灌洗液制剂结合了透明质酸钠和几丁糖的生物学特性，以不同的配比进行配制，能广泛适用于眼科、外科手术、腹腔化疗等手术，具有更好的临床效果。此专利主要是用于手术中使用，起到术后防粘连作用，其中透明质酸钠的浓度为0.01-0.6％，几丁糖0.1-2.0％。
未见到透明质酸、壳聚糖和硫酸软骨素其他配比及其在粘膜修复方面的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物。
本发明提供的一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物，其由以下成分中的两种或三种组成：透明质酸、壳聚糖和硫酸软骨素。
具体的，所述组合物由以下成分中的两种或三种组成：透明质酸1-250份、壳聚糖1-800份或硫酸软骨素1-1000份。
优选地，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸1-250份和壳聚糖1-800份。
进一步优选地，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸10-50份和壳聚糖80-800份。
更进一步优选，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸20份和壳聚糖85份。
或作为另一技术方案，优选地，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸1-250份和硫酸软骨素1-1000份。
进一步优选，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸8-100份和硫酸软骨素10-800份。
或作为另一技术方案，优选地，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：壳聚糖1-800份和硫酸软骨素1-1000份。
进一步优选，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：壳聚糖10-800份和硫酸软骨素50-500份。
或作为另一技术方案，优选地，所述组合物由以下重量份的三种成分组成：透明质酸1-250份，壳聚糖1-800份和硫酸软骨素1-1000份。
进一步优选，所述组合物由以下重量份的三种成分成分组成：透明质酸8-100份，壳聚糖10-800份和硫酸软骨素50-500份。
上述组合物中：
所述透明质酸是透明质酸盐，优选为透明质酸钠或透明质酸镁；
所述壳聚糖是可溶性壳聚糖，优选为羧甲基壳聚糖；
所述硫酸软骨素是硫酸软骨素盐，优选为硫酸软骨素钠或硫酸软骨素钙。
本发明还提供了含上述组合物的制剂，所述制剂中组合物的所占比例为0.02-20.5％(w/v)。
所述制剂为凝胶、水溶液。
所述制剂由组合物和含水载体组成。
其中含水载体为无菌液体，优选注射用水、生理盐水和磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
本发明还提供上述组合物或制剂应用于膀胱和尿道上皮损伤的修复。膀胱和尿道上皮损伤为GAGs-缺乏性疾病，优选为间质性膀胱炎，膀胱疼痛综合征、化学性膀胱炎或放射性膀胱炎，临床表现为以尿频、尿急、慢性膀胱疼痛为症状的膀胱病症，尿道上皮损伤而引起的排尿疼痛。
本发明提供的组合物及其制剂具有以下优点：
1、所述的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物，具有良好理化性能。其主要技术要求见表1。
表1膀胱和尿道上皮损伤修复组合物主要技术要求
| 项目 | 技术要求 |
| 透光率 | 660nm处透光率≥99.0％ |
| pH值 | 溶液的pH值应为6.0～8.0 |
| 蛋白质含量 | ≤0.1％(质量分数) |
| 重金属含量 | ≤10μg/g |
| 乙醇残留量 | ≤400μg/g |
| 细菌内毒素限量 | ≤0.5EU/mg |
| 无菌 | 应无菌 |
| 紫外吸收 | 280nm处OD值≤1.0；260nm处OD值≤1.0 |
2、本发明涉及的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物还具有可靠的生物安全性和有效性。依据GB 16886系列标准，本发明方法生产的组合物的细胞毒性为1级，无致敏性和皮内刺激，无遗传毒性，且与血液相容性好。
3、临床前动物实验表明，本发明涉及的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物能够明显修复由硫酸鱼精蛋白或环磷酰胺模型引起的膀胱上皮的损伤，显著减少膀胱上皮损伤范围和受损程度，减轻炎症浸润程度。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
所述重量体积比为g：mL。
实施例1：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸0.2％、壳聚糖0.85％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.4％(w/v)的溶液，备用；
(3)将壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为1.7％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和壳聚糖两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例2：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸0.01％、壳聚糖8％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(3)将壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为16％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和壳聚糖两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例3：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸2.5％、壳聚糖0.01％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为5％(w/v)的溶液，备用；
(3)将壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和壳聚糖两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例4：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸0.08％、硫酸软骨素4％。
2、制备方法
(1)将透明质酸溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为0.16％(w/v)的 溶液，备用；
(2)将硫酸软骨素溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为8％(w/v)的溶液，备用；
(3)将步骤(1)(2)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(4)将步骤(3)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例5：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸0.01％、硫酸软骨素10％。
2、制备方法
(1)将透明质酸溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(2)将硫酸软骨素溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为20％(w/v)的溶液，备用；
(3)将步骤(1)(2)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(4)将步骤(3)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例6：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：透明质酸2.5％、硫酸软骨素0.01％。
2、制备方法
(1)将透明质酸溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为5％(w/v)的溶液，备用；
(2)将硫酸软骨素溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(3)将步骤(1)(2)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均 匀。
(4)将步骤(3)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有透明质酸和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例7：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：壳聚糖1％、硫酸软骨素3％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为2％(w/v)的溶液，备用；
(3)将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为6％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液进行放置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌15min，得到含有壳聚糖和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例8：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：壳聚糖0.01％、硫酸软骨素10％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(3)将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓 度为20％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液进行放置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌15min，得到含有壳聚糖和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例9：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：壳聚糖8％、硫酸软骨素0.01％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为16％(w/v)的溶液，备用；
(3)将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.02％(w/v)的溶液，备用；
(4)将步骤(2)(3)的溶液按照体积比1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(5)将步骤(4)得到的组合物溶液进行放置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌15min，得到含有壳聚糖和硫酸软骨素两种组分的膀胱和尿道上皮损伤修复组合物。
实施例10用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物及其制备
1、活性成分含量：壳聚糖0.01％、硫酸软骨素5％、透明质酸0.5％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成 浓度为0.03％(w/v)的溶液，备用；
(3)将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为15％(w/v)的溶液，备用；
(4)将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为1.5％(w/v)的溶液。
(5)将步骤(2)(3)(4)的溶液按照体积比1：1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(6)将步骤(5)得到的组合物溶液用已灭菌的0.22μm滤膜在高压下进行除菌过滤。过滤后的溶液进行灌装，得到含有壳聚糖、硫酸软骨素和透明质酸三种组分的膀胱和尿道上皮伤修复组合物。
实施例11：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：壳聚糖4％、硫酸软骨素5％、透明质酸0.01％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)在百级洁净环境下，将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为12％(w/v)的溶液，备用；
(3)在百级洁净环境下，将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为15％(w/v)的溶液，备用；
(4)在百级洁净环境下，将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.03％(w/v)的溶液。
(5)将步骤(2)(3)(4)的溶液按照体积比1：1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(6)将步骤(5)得到的组合物溶液在无菌条件下进行灌装，得到含有壳聚糖、硫酸软骨素和透明质酸三种组分的膀胱和尿道上皮伤修复组合物。
实施例12：用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物
1、活性成分含量：壳聚糖4％、硫酸软骨素0.01％、透明质酸0.5％。
2、制备方法
(1)配制含有0.85％(w/v)的氯化钠、0.22％(w/v)的磷酸氢二钠和0.02％(w/v)的磷酸二氢钠的磷酸缓冲液，并置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃、0.11MPa条件下灭菌30min，既得无菌磷酸缓冲液，备用；
(2)将水溶性壳聚糖溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为12％(w/v)的溶液，备用；
(3)在百级洁净环境下，将硫酸软骨素溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为0.03％(w/v)的溶液，备用；
(4)在百级洁净环境下，将透明质酸溶解于步骤1)得到的无菌磷酸缓冲液中，配制成浓度为1.5％(w/v)的溶液，备用；
(5)将步骤(2)(3)(4)的溶液按照体积比1：1：1混合，并充分搅拌使其混合均匀。
(6)将步骤(5)得到的组合物溶液进行灌装后，在121℃、0.11MPa条件下灭菌15min，得到含有壳聚糖、硫酸软骨素和透明质酸三种组分的膀胱和尿道上皮伤修复组合物。
实验例1：理化性能检测
1、对实施例1-12提供的组合物进行检测，具体检测方法为：
透光率：按照《中国人民共和国药典》附录IV A的方法测定。
pH值：按照《中华人民共和国药典》二部附录ⅥH规定的方法测定。
蛋白质含量：采用库马斯亮蓝法测定。
重金属含量：按照《中华人民共和国药典》二部附录ⅧH第一法测定。
乙醇残留量：采用顶空气相色谱法使乙醇与其他组分分开，用氢火焰离子化检测器检测，并将得到的乙醇色谱峰与实施例1-5得到的色谱峰相比较，计算得出乙醇残留量。
细菌内毒素限量：按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录XI E规定的方法测定
无菌：按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录XI H规定的方法测定
紫外吸收：取实施例提供的组合物，以生理盐水为空白对照，按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录ⅣA的方法测定
2、检测结果：见表2-1、2-2
表2-1实施例1-6检测结果
表2-2实施例7-12检测结果
表2-1、2-2结果显示，实施例1-12具有良好的理化性能。具体来看，实施例的透光率与生理盐水相近，且紫外吸收值符合其技术要求，证明了实施例制备的膀胱和尿道上皮伤修复组合物溶解性能良好，杂质含量低。中性的pH值以及较低的蛋白、重金属和乙醇残留量，证明了实施例制备的膀胱和尿道上皮伤修复组合物的引起免疫排斥或刺激的可能性较低，适用于人体使用。另外，无菌性以及较低的细菌内毒素限值，证明了膀胱和尿道上皮伤修复组合物在应用过程中不会引起感染现象以及热源反应。
实验例2：对由硫酸鱼精蛋白引起的膀胱上皮损伤的影响
1、实验动物：成年雌性SD大鼠，鼠龄6-8周，体重180-260克,
2、实验分组：将50只大鼠随机分成5组，分别为对照1组、对照2组、透明质酸组、壳聚糖组和实施例1-3组。其中每组样品每次灌注1ml。
对照1组：给予实施例1提供的无菌磷酸缓冲液；
对照2组：参照专利CN201310753152.4(CN103655601A)实施例制备的0.05％透明质酸和0.05％壳聚糖溶液，溶剂为本发明实施例1提供的的磷酸缓冲液；
透明质酸组、壳聚糖组：分别给予含有0.2％透明质酸、0.8％壳聚糖的溶液，溶剂是实施例1提供的无菌磷酸缓冲液；
实施例1-3组：分别给予实施例1-3的组合物。
3、实验方法：
通过膀胱灌注50mg/ml硫酸鱼精蛋白构建膀胱上皮损伤动物模型。
模型建立成功后，分别按照分组给予灌注，并保留30分钟。连续灌注5天。
大鼠处死后，通过HE染色观察组织炎症浸润状况及单核细胞计数，并通过甲苯胺蓝染色进行肥大细胞计数。
4、实验结果：见表3
表3.动物实验各组的单核细胞、肥大细胞数量
| 单核细胞计数 | 肥大细胞计数 | |
| 对照1组 | 20.4±3.5 | 11.3±1.2 |
| 透明质酸组 | 7.0±1.5 | 3.4±1.0 |
| 壳聚糖组 | 12.2±2.4 | 6.7±1.4 |
| 对照2组 | 5.4±1.7 | 3.2±1.2 |
| 实施例1组 | 4.2±1.2 | 2.5±0.5 |
| 实施例2组 | 3.5±0.9 | 2.3±1.1 |
| 实施例3组 | 4.9±1.3 | 2.5±1.4 |
表3结果显示：对照1组膀胱上皮表现出水肿和充血，膀胱上皮纤维组织增多，细胞增生明显，炎性细胞浸润严重。对照2组、透明质酸、壳聚糖组和实施例1-3组的大鼠膀胱组织的水肿和充血程度较轻，且实施例1-3的组合物修复效果优于透明质酸、壳聚糖以及对照2组的修复效果。在实施例1-3中， 实施例2的修复效果相对较好。数据统计显示，实施例2的单核细胞数量与对照、透明纸酸组和壳聚糖组有显著性差异(P<0.05)，实施例1-3组之间无显著性差异(P>0.05)。
实验例3：对由环磷酰胺引起的膀胱上皮的损伤的影响
1、实验动物：成年雌性SD大鼠，鼠龄6-8周，体重180-260克,
2、实验分组：将40只大鼠随机分成4组，分别为对照组、透明质酸组、硫酸软骨素组和实施例4-6组，其中每组样品每次灌注1ml。
对照组：给予无菌生理盐水。
透明质酸组、硫酸软骨素组：分别给予含有0.08％透明质酸、4％硫酸软骨素的溶液，其溶剂为无菌生理盐水；
实施例4-6组：给予实施例4-6制备的组合物。
3、实验方法：
通过腹腔注射环磷酰胺，注射剂量为200mg/kg(环磷酰胺用量/大鼠重量)构建膀胱上皮损伤动物模型。
模型建立成功后，分别按照分组给予灌注，并保留30分钟。连续灌注5天。
大鼠处死后，通过HE染色观察组织炎症浸润状况及单症细胞计数。
4、实验结果：见表4
表4.动物实验各组的单核细胞、肥大细胞数量
| 单核细胞计数 | |
| 对照组 | 50.4±3.5 |
| 透明质酸组 | 27.8±1.3 |
| 硫酸软骨素组 | 21.9±1.0 |
| 实施例4组 | 15.2±0.8 |
| 实施例5组 | 17.7±1.1 |
| 实施例6组 | 13.4±0.9 |
表4结果显示：对照组膀胱上皮表现出水肿和充血，膀胱上皮纤维组织增多，细胞增生明显，炎性细胞浸润严重。透明质酸、硫酸软骨素组和实施例4-6组的大鼠膀胱组织的水肿和充血程度较轻，且实施例4-6的组合物修复效果优于透明质酸和硫酸软骨素单独使用时的修复效果。在实施例4-6中， 以实施例6的单核细胞数最少，炎症反应最轻，修复效果最好。数据统计显示，实施例4-6组的单核细胞数量与对照组、透明质酸组和硫酸软骨素组有显著差异(P<0.05)，实施例4-6组之间无显著性差异(P>0.05)。
实验例4：对由硫酸鱼精蛋白引起的膀胱上皮损伤的影响
1、实验动物：成年雌性SD大鼠,鼠龄6-8周,体重180-260克,
2、实验分组：将40只大鼠随机分成4组，分别为对照组、壳聚糖组、硫酸软骨素组和实施例7-9组。其中每组样品每次灌注1ml。
对照组：给予磷酸缓冲液。
壳聚糖组、硫酸软骨素组：分别给予含有1％壳聚糖、3％硫酸软骨素溶液，溶剂是实施例7的磷酸缓冲液。
实施例7-9组：给予实施例7-9制备的组合物。
3、实验方法：
通过膀胱灌注100mg/ml硫酸鱼精蛋白构建膀胱上皮损伤动物模型。
模型建立成功后，分别按照分组给予灌注，并保留30分钟。连续灌注5天。
大鼠处死后，通过HE染色观察组织炎症浸润状况及单核细胞计数，并通过甲苯胺蓝染色进行肥大细胞计数。
4、实验结果：见表5
表5动物实验各组的单核细胞、肥大细胞数量
| 单核细胞计数 | 肥大细胞计数 | |
| 对照组 | 30.4±3.5 | 17.3±1.2 |
| 壳聚糖组 | 19.9±2.3 | 8.6±2.9 |
| 硫酸软骨素组 | 12.7±1.0 | 5.3±1.0 |
| 实施例7组 | 7.2±0.8 | 2.5±0.3 |
| 实施例8组 | 8.5±1.7 | 3.4±1.1 |
| 实施例9组 | 9.7±0.6 | 3.9±0.4 |
表5结果显示：对照组膀胱上皮表现出水肿和充血，膀胱上皮纤维组织增多，细胞增生明显，炎性细胞浸润严重。壳聚糖组、硫酸软骨素组和实施例7-9组的大鼠膀胱组织的水肿和充血程度较轻，且实施例7-9的组合物修复效果优于其他3组。实施例7-9三组对比来看，实施例7的修复效果最好。 数据统计显示，实施例7-9组的单核细胞和肥大细胞数量与其他三组有显著性差异(P<0.05)，实施例7-9组之间无显著性差异(P>0.05)。
实验例5：对由硫酸鱼精蛋白引起的膀胱上皮损伤的影响
1、实验动物：成年雌性SD大鼠，鼠龄6-8周，体重180-260克,
2、实验分组：将50只大鼠随机分成5组，分别为对照组、壳聚糖组、透明质酸组、硫酸软骨素组和实施例10-12组。其中每组样品每次灌注1ml。
对照组：给予磷酸缓冲液。
壳聚糖组、透明质酸组、硫酸软骨素组：分别给予含有0.1％壳聚糖、0.5％透明质酸和0.01％硫酸软骨素的溶液，溶剂是实施例12的磷酸缓冲液。
实施例10-12组：给予实施例10-12制备的组合物。
3、实验方法：
通过膀胱灌注50mg/ml硫酸鱼精蛋白构建膀胱上皮损伤动物模型。
模型建立成功后，分别按照分组给予灌注，并保留30分钟。连续灌注5天。
大鼠处死后，通过HE染色观察组织炎症浸润状况及单症细胞计数，并通过甲苯胺蓝染色进行肥大细胞计数。
4、实验结果：见表6
表6.动物实验各组的单核细胞、肥大细胞数量
| 单核细胞计数 | 肥大细胞计数 | |
| 对照组 | 20.4±3.5 | 11.3±1.2 |
| 壳聚糖组 | 16.7±2.5 | 8.2±2.3 |
| 透明质酸组 | 8.3±1.3 | 4.3±1.1 |
| 硫酸软骨素组 | 8.0±1.5 | 5.0±1.9 |
| 实施例10组 | 4.4±0.7 | 2.1±1.1 |
| 实施例11组 | 5.6±1.2 | 2.9±0.3 |
| 实施例12组 | 3..0±0.5 | 1.7±0.4 |
表6结果显示：对照组膀胱上皮表现出水肿和充血，膀胱上皮纤维组织增多，细胞增生明显，炎性细胞浸润严重。壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素组和实施例10-12组的大鼠膀胱组织的水肿程度较轻，且实施例10-12的组合物修复效果优于其他实验组，在实施例10-12中，以实施例12的膀胱上皮 损伤修复的效果最好。数据统计显示，实施例12组的单核细胞和肥大细胞数量与对照组、壳聚糖组、透明质酸组和硫酸软骨素组有显著性差异(P<0.05)，实施例10-12组之间没有显著性差异(P>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于膀胱和尿道上皮损伤修复的组合物，其特征在于，其由以下成分中的两种或三种组成：透明质酸、壳聚糖和硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下成分中的两种或三种组成：透明质酸1-250份、壳聚糖1-800份或硫酸软骨素1-1000份。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸1-250份和壳聚糖1-800份；
优选地，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸10-50份和壳聚糖80-800份；
进一步优选，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸20份和壳聚糖85份。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：透明质酸1-250份和硫酸软骨素1-1000份；
优选地，所述组合物由以下两种成分组成：透明质酸8-100份和硫酸软骨素10-800份。
5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份的两种成分组成：壳聚糖1-800份和硫酸软骨素1-1000份；
优选地，所述组合物由以下两种成分组成：壳聚糖10-800份和硫酸软骨素50-500份。
6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份的三种成分组成：透明质酸1-250份，壳聚糖1-800份和硫酸软骨素1-1000份。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份的三种成分组成：透明质酸8-100份，壳聚糖10-800份和硫酸软骨素50-500份。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其特征在于，所述透明质酸是透明质酸盐，优选为透明质酸钠或透明质酸镁；
所述壳聚糖是可溶性壳聚糖，优选为羧甲基壳聚糖；
所述硫酸软骨素是硫酸软骨素盐，优选为硫酸软骨素钠或硫酸软骨素钙。
9.含权利要求1-8任一项所述组合物的制剂，其特征在于，所述制剂中组合物的所占比例为0.02-20.5％。
10.权利要求1-8任一项提供的组合物或权利要求9所述的制剂应用于膀胱和尿道上皮损伤的修复，所述膀胱和尿道上皮损伤为GAGs-缺乏性疾病，优选为间质性膀胱炎，膀胱疼痛综合征、化学性膀胱炎或放射性膀胱炎。
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| CN103655601A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-03-26 | 上海建华精细生物制品有限公司 | 一种用于膀胱灌洗的组合物 |
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