CN104931699A - 骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法 - Google Patents

骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括：装有Polymer Helper试剂的试剂管、装有PBS磷酸盐缓冲液的试剂管、装有抗原修复液的试剂管、装有过氧化氢溶液的试剂管、装有二氨基联苯胺染色液的试剂管、装有苏木素染色液的试剂管、装有1％酸酒精的试剂管、装有1％氨水的试剂管、装有二甲苯的试剂管、装有酒精的试剂管、装有CD3单克隆抗体的试剂管、装有Pax-5单克隆抗体的试剂管、装有通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体的试剂管，分隔并集中包装这些试剂管的包装盒。本发明使骨髓涂片也能进行淋巴细胞的分类，极大提高了骨髓涂片淋巴瘤诊断的价值，且技术相对简单，易于推广，可用于病理诊断及治疗结果评判。

Description

骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及骨髓涂片染色技术，尤其涉及一种用CD3与PAX5抗体联合标记的骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法。
背景技术
恶性淋巴瘤(以下简称淋巴瘤)是一组起源于***或结外组织、器官的恶性肿瘤，根据组织病理检查、分子生物学行为及临床特点分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'sLymphoma，HD)及非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma，NHL)。在西方国家，淋巴瘤的发病率占整个肿瘤疾病的第8位。在我国，分别占男性恶性肿瘤的第9位和女性恶性肿瘤的第11位。骨髓受累是淋巴瘤的常见表现，因此准确检测淋巴瘤有无骨髓受累，对确定淋巴瘤的临床分期具有重要意义。骨髓检查在淋巴瘤的病理诊断、分期、治疗和预后评价起重要作用，其阳性结果是淋巴瘤全身播散的重要依据，往往会直接影响疾病的分期。淋巴瘤的诊断和分型依赖于病理组织学，骨髓检查至今仍是判断淋巴瘤髓内侵犯的可靠途径，因此检测淋巴瘤骨髓受累的具体方法显得尤为重要。
骨髓涂片和活检作为经典可靠且安全的方法，具有重要的应用价值。骨髓活检因组织可以加做免疫组织化学染色，在淋巴瘤累及骨髓中一直起到非常关键的作用，但因技术复杂，诊断难度高，一直较难推广，只有少数三级甲医院的一些资深病理科才能开展。骨髓涂片技术相对简单，在国内推广较广泛，很多二级甲医院都开展了该项目，但因骨髓涂片一直不能做免疫组织化学染色，只能分出急性与慢性淋巴细胞白血病，而不能分出T\B类型，骨髓涂片诊断较活检诊断价值不足。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用CD3与PAX5抗体联合标记的骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒，本发明还公开了该试剂盒的使用方法。
本申请的发明人运用免疫组化染色原理设计了骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒，通过合理的CD3与PAX5抗体组合联合标记，使骨髓涂片也能进行淋巴细胞的分类，极大提高了骨髓涂片淋巴瘤诊断的价值。
根据本发明的实施例，提供了用CD3与PAX5抗体联合标记的骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒，其主要包括：装有Polymer Helper试剂的试剂管、装有PBS磷酸盐缓冲液的试剂管、装有抗原修复液的试剂管、装有过氧化氢溶液的试剂管、装有二氨基联苯胺染色液的试剂管、装有苏木素染色液的试剂管、装有1％酸酒精的试剂管、装有1％氨水的试剂管、装有二甲苯的试剂管、装有酒精的试剂管、装有CD3单克隆抗体的试剂管、装有Pax-5单克隆抗体的试剂管、装有通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体的试剂管；分隔并集中包装这些试剂管的包装盒。
其中，所述Polymer Helper试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司的Polymer Helper试剂。
其中，所述酸酒精为盐酸酒精。
其中，PBS磷酸缓冲液浓度为0.01M，pH值为7.2～7.4。
其中，过氧化氢溶液浓度为3～3.5％，进一步地，所述过氧化氢溶液浓度为3％。
本发明的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)使用抗原修复液对骨髓涂片进行抗原修复后，使用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
2)使用过氧化氢溶液对骨髓涂片进行封闭，然后使用PBS磷酸盐缓冲液洗涤骨髓涂片；
3)滴加第一抗体，室温孵育25～35分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加Polymer Helper试剂，室温孵育15～25分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加第二抗体，室温孵育15～25分钟，再用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；
4)使用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液显色，再用苏木素染色，使用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
5)在1％酸酒精中涮2次，用蒸馏水洗涤玻片，然后再用1％氨水涮2次，用蒸馏水洗涤玻片；
6)在梯度稀释的酒精(75％～100％)中(各30s)脱水并在二甲苯中(2min)做透明处理后，就可以通过显微镜判读结果。
其中，步骤3)所述的第一抗体为CD3单克隆抗体和Pax-5单克隆抗体；第二抗体为通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体。
其中，步骤3)中，滴加第一抗体后孵育30分钟，滴加Polymer Helper试剂后孵育20分钟，滴加第二抗体后孵育20分钟。
其中，步骤6)中，稀释的酒精梯度为75％→85％→100％。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明进行技术创新，克服了以往只能对组织切片进行免疫染色检测的技术限制，通过骨髓涂片标本特色处理，运用免疫组化染色原理，通过合理的CD3与PAX5抗体组合联合标记，使骨髓涂片也能进行淋巴细胞的分类，极大提高了骨髓涂片淋巴瘤诊断的价值，且技术相对简单，易于推广，可用于病理诊断及治疗结果评判。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例用CD3与PAX5抗体联合标记的骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法
1.该试剂盒中装有：
装有Polymer Helper试剂的试剂管、装有PBS磷酸盐缓冲液的试剂管、装有抗原修复液的试剂管、装有过氧化氢溶液的试剂管、装有二氨基联苯胺染色液的试剂管、装有苏木素染色液的试剂管、装有1％酸酒精的试剂管、装有1％氨水的试剂管、装有二甲苯的试剂管、装有酒精的试剂管、装有CD3单克隆抗体的试剂管、装有Pax-5单克隆抗体的试剂管、装有通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体的试剂管；分隔并集中包装这些试剂管的包装盒。
上述Polymer Helper试剂、抗原修复液、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液、PBS磷酸盐缓冲液等试剂均购买自北京中杉金桥生物技术有限公司。它们的产品目录号分别为：Polymer Helper试剂(PV-6000)、抗原修复液(TA-999-DHBH)、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液(ZLI-9032)、PBS磷酸盐缓冲液(ZLI-9062)。
2.试剂盒的使用方法如下：
(1)准备好待检测的骨髓涂片，使用抗原修复液对骨髓涂片进行抗原修复后，使用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
(2)使用过氧化氢溶液对骨髓涂片进行封闭，然后使用PBS磷酸盐缓冲液洗涤骨髓涂片；
(3)滴加第一抗体(CD3单克隆抗体和Pax-5单克隆抗体)，室温孵育30分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加Polymer Helper试剂，室温孵育20分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加第二抗体(通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体)，室温孵育20分钟，再用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；
(4)使用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液显色，再用苏木素染色，使用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
(5)在1％盐酸酒精中涮2次，用蒸馏水洗涤玻片，然后再用1％氨水涮2次，用蒸馏水洗涤玻片；
(6)在梯度稀释的酒精(75％→85％→100％)中(各30s)脱水并在二甲苯中(2min)做透明处理后，就可以通过显微镜判读结果。
本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用CD3与PAX5抗体联合标记的骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
装有Polymer Helper试剂的试剂管、装有PBS磷酸盐缓冲液的试剂管、装有抗原修复液的试剂管、装有过氧化氢溶液的试剂管、装有二氨基联苯胺染色液的试剂管、装有苏木素染色液的试剂管、装有1％酸酒精的试剂管、装有1％氨水的试剂管、装有二甲苯的试剂管、装有酒精的试剂管、装有CD3单克隆抗体的试剂管、装有Pax-5单克隆抗体的试剂管、装有通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体的试剂管；
分隔并集中包装这些试剂管的包装盒。
2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Polymer Helper试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司的Polymer Helper试剂。
3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酸酒精为盐酸酒精。
4.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PBS磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.2～7.4。
5.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述过氧化氢溶液的浓度为3～3.5％。
6.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、使用抗原修复液对骨髓涂片进行抗原修复后，再用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
步骤2、使用过氧化氢溶液对骨髓涂片进行封闭，然后使用PBS磷酸盐缓冲液洗涤骨髓涂片；
步骤3、滴加第一抗体，室温孵育25～35分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加Polymer Helper试剂，室温孵育15～25分钟，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后，再滴加第二抗体，室温孵育15～25分钟，再用PBS磷酸盐缓冲液洗涤；
步骤4、使用二氨基联苯胺染色液显色，再用苏木素染色，使用蒸馏水洗涤骨髓涂片；
步骤5、在1％酸酒精中涮2次，用蒸馏水洗涤玻片，然后再用1％氨水涮2次，用蒸馏水洗涤玻片；
步骤6、将骨髓涂片在75％～100％梯度稀释的酒精中脱水，每个梯度脱水30s，再在二甲苯中做2min透明处理后，通过显微镜判读结果。
7.按照权利要求6所述的使用方法，其特征在于：步骤3所述的第一抗体为CD3单克隆抗体和Pax-5单克隆抗体；第二抗体为通用型CD3和Pax-5免疫组化抗体。
8.按照权利要求6所述的使用方法，其特征在于：步骤3中，滴加第一抗体后孵育30分钟，滴加Polymer Helper试剂后孵育20分钟，滴加第二抗体后孵育20分钟。
9.按照权利要求6所述的使用方法，其特征在于：步骤6中，酒精稀释的梯度为75％→85％→100％。
10.按照权利要求1～5任一所述的试剂盒在骨髓涂片异常淋巴细胞染色检测中的应用。
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