CN104931482A - 基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸败程度以灵芝孢子油的酸值、过氧化值作为评价指标，所述的检测方法包括：首先，以标准样品拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标，酸值或过氧化值为横坐标作图，建立灵芝孢子油的酸值、过氧化值评价标准图；然后，检测供试样品的拉曼光谱，将1655cm^-1拉曼峰积分强度结果分别与酸值、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值，进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果；本发明方法检测时间快，样品消耗量少，操作简单便捷，可现场快速检测，从而使该检测方法具有相当大的实际应用前景。

Description

基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，具体涉及一种基于拉曼光谱的快速检测灵芝孢子油氧化酸败程度的方法。

(二)背景技术

灵芝又称灵芝草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，自古以来就被推崇为中药上品，在《神农本草经》等中医药典籍就早有记载。灵芝孢子是灵芝的有性生殖细胞，一般呈淡褐色至黄褐色，卵形，大小一般在(长×宽)(8.5～11.2)μm×(5.2～6.9)μm之间，内含灵芝孢子油。灵芝孢子油集中了灵芝有效成分的精华，富含三萜类灵芝酸、灵芝多糖、核苷、氨基酸、饱和与不饱和脂肪酸、有机锗以及其它微量元素等多种活性成分。众多研究已经表明，灵芝孢子油具有增强细胞免疫、增强NK细胞活性、降血脂、免疫调节等功能，能直接抑杀肿瘤干细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，抗氧化和减轻膀胱堵塞，以及抗艾滋病毒活性的功能。同时由于其不饱和脂肪酸含量很高，更具有改善心脑血管疾病、抗动脉硬化、降血脂、降胆固醇的作用。

由于灵芝孢子油功效显著，价格昂贵，因此市场上相关产品质量参差不齐，严重影响消费者利益。灵芝孢子油富含不饱和双键，孢子油在储存、运输过程中，尤其在高温、高湿的条件下极易氧化，主要发生由活性氧自由基攻击双键引起降解，产生多种醛、酮、醇、酸及羟酸等有害氧化物、过氧化物，生成强烈的刺激性气味(氧化酸败)会破坏机体正常的生理生化功能(如引起机体氧化应激反应，降低机体免疫功能、导致小肠、肝脏等器官肥大等)，严重损害身体健康。

目前，业内通常采用食用油的质量监控指标即过氧化值、酸值作为孢子油的主要质量监控指标。而国内测定灵芝孢子油酸值、过氧化值的方法主要是滴定法，包括标准酸碱滴定和氧化还原滴定，但滴定法多少存在以下缺陷：如操作繁杂，需专业人员在实验室进行分析；耗时长，检测需数小时完成；不便携，难以户外现场检测；灵敏度不够高，消耗样品量多(5～10g)，检测成本高。

近年来随着现代化检测技术的发展，一些新技术不断被用到食品检测领域，如HPLC、NMR、色质联用(GC-MS)、荧光光谱等。这些方法与传统方法相比都有一定的优势，但在进行检测时，尤其是对灵芝孢子油这类较为昂贵的物质，皆有一定的局限性。如高效液相色谱法(HPLC)，与传统方法比，有高速、样品不被破坏、易回收等优点，但其不易携带，难以户外检测，与拉曼光谱相比，其灵敏度仍不如拉曼光谱，耗时也较长。色谱法(GC)检测时，虽然其分辨效率高，定量分析简便，但其定性能力较差。而质谱法(MS)，与色谱法相对应，它的定性能力较强，灵敏度高，但在检测过程中要求进样要纯，进行定量分析较为复杂。

(三)发明内容

本发明目的在于利用拉曼光谱技术建立一种灵芝孢子油氧化酸败的动态监测方法以及灵芝孢子油酸值、过氧化值的快速检测新技术，并利用该方法测定灵芝孢子油氧化酸败的动力学参数，筛选出高效的灵芝孢子油抗氧化剂。

为达到发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸败程度以灵芝孢子油的酸值(AV)、过氧化值(POV)作为评价指标，灵芝孢子油的氧化酸败程度随着酸值、过氧化值的升高而增加，所述的检测方法包括如下步骤：

(1)建立灵芝孢子油酸值、过氧化值评价标准图

取灵芝孢子油，置于70℃恒温器中避光敞口保存，每隔24～36h搅拌一次混匀，在5天内，以每隔24小时的时间梯度取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法分别测定灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，获得一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图；

所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取20～200μL灵芝孢子油样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度(拉曼峰积分强度是用分析软件Grams里的峰面积的积分功能计算的，软件自动计算，然后拷贝或输出数据即可)；

以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的酸值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过氧化值评价标准图；

(2)供试样品的检测

取20～200μL灵芝孢子油供试样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油供试样品的拉曼光谱图；计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655cm^-1拉曼峰积分强度结果分别与步骤(1)得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值，进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果。

本发明所述的基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，步骤(1)中，所述灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值的标准滴定法记载于：国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2010.附录54-55.和附录56-57.

具体为：

(a)灵芝孢子油样品酸值的检测

用氢氧化钠标准滴定法测灵芝孢子油酸值：在250mL锥形瓶中事先加入乙醇、***各25.0mL混合，精确称取灵芝孢子油样品0.500g加入锥形瓶中，振荡使其完全溶解。用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至粉红色并连续30s不褪色，读取消耗氢氧化钠滴定液体积(mL)。

酸值的计算公式：

AV＝(A×5.61)/W    (1)

式中：AV为酸值；A为消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的体积(mL)；W为试样取样量(g)；5.61为每毫升氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于氢氧化钠的毫克数，可根据标定后氢氧化钠滴定液的准确浓度进行校正。

***和乙醇的混合物配制：取乙醇、***各25.0mL于250mL锥形瓶混匀，临用前先加0.5％的酚酞指示液1mL，摇匀，滴加氢氧化钠滴定液适量，调至微显粉红色。

0.1mol/L氢氧化钠滴定液的配制：先配制氢氧化钠饱和溶液，称取过量氢氧化钠固体溶于蒸馏水中，其中氢氧化钠固体溶解度为111g(20℃)，移液管准确移取上清液1.4mL于250mL容量瓶中用新煮沸冷却的无二氧化碳蒸馏水定容。

氢氧化钠滴定液的标定：精确称取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.600g，加新沸过的冷水50.0mL振摇，使其尽量溶解；加0.5％酚酞指示液2滴，用本液滴定至溶液显粉红色。每1mL的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。标定结果的计算公式为：

$C=\frac{W\×{10}^3\×0.1}{20.42\×V}(mol/L)---\left(2\right)$

式中：W为邻苯二甲酸氢钾的称样量(g)；V为标定时消耗氢氧化钠滴定液的体积(mL)。

0.5％酚酞溶液的配制：称取0.50g酚酞，溶解于100mL95％的乙醇中，无需加水。试验重复三次并计算其平均值。

(b)灵芝孢子油样品过氧化值的检测

在250mL干燥碘瓶中加入1.500g的灵芝孢子油，之后混入1:1调制的氯仿-冰醋酸的混合液30.0mL，通过不断震荡摇匀样品。待充分摇匀后加入约1.0mL新配制的碘化钾饱和溶液，加入后轻轻摇动半分钟时间，待摇匀后放置于暗处静置5分钟。随后向碘瓶内加水80.0mL，使之混匀，然后用标准硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，先滴定至溶液呈现浅黄色，然后加入淀粉溶液，作为反应指示剂，滴定至蓝色消失，此时达到的即为滴定终点。以硫代硫酸钠溶液的体积消耗数，计算油脂的过氧化值(POV)。计算公式：

POV＝(V1-V2)×0.001296M^-1×100   (3)

式中：V1为样品消耗的标准硫代硫酸钠体积(mL)；V2为空白试验消耗的标准硫代硫酸钠体积(mL)；M为样品质量(g)。

试验重复三次并计算其平均值。

硫代硫酸钠标准滴定液的配制：称取硫代硫酸钠26.0g，与无水碳酸钠0.20g，加新沸过的冷水溶解成1000mL，摇匀，放置1个月，过滤后备用。

硫代硫酸钠标准滴定液的标定：精确称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0.150g，置碘量瓶中。加水50mL溶解，加碘化钾2.0g，轻轻振摇溶解，加稀硫酸40mL，摇匀，在暗处放置10分钟，加水250mL稀释，用本液滴定近终点时，加淀粉指示液3mL，继续滴定到蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于4.903mg的重铬酸钾。根据本液消耗量与重铬酸钾的用量，算出本液的准确浓度。计算公式：

$F=\frac{Ms}{(V-Vo)\×0.004903}---\left(4\right)$

式中：Ms为重铬酸钾的质量(g)；V为滴定所耗硫代硫酸钠滴定液的体积(mL)；V₀为空白试验所耗硫代硫酸钠滴定液的体积(mL)。

本发明所述的基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，步骤(1)中，所述以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的酸值为横坐标作图时，1655cm^-1的拉曼峰积分强度与其对应样品的酸值具有十分良好的线性关系，表明可以利用拉曼光谱法对灵芝孢子油氧化酸败过程中产生的酸值进行快速定量检测(如图6所示)。

步骤(1)中，所述以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的过氧化值为横坐标作图时，虽然1655cm^-1拉曼峰积分强度与其对应样品的过氧化值不呈现线性关系，但仍然可以通过非线性拟合(软件：Origin 8.0，S拟合，图7虚线所示)或者内插值的方式(该方法为已有现成的数学方法)对灵芝孢子油的过氧化值进行快速测定。

步骤(2)在对灵芝孢子油供试样品进行检测时，由于拉曼光谱仪可以自动连续测定样品，从而可以实现对样品的动态监测。影响灵芝孢子油AV和POV的重要因素是温度、光线、空气，且温度的影响大于空气和光线的影响。

根据本发明基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，可进行灵芝孢子油抗氧化剂的筛选，所述筛选的方法为：

将不同的若干种抗氧化剂一一分别添加到灵芝孢子油样品中，得到若干种添加了不同抗氧化剂的灵芝孢子油样品，将所得若干样品一一分别置于70℃恒温器中避光敞口保存，每隔24～36h搅拌一次混匀，在5天内，以每隔24h的时间梯度对每种样品进行取样，并用拉曼光谱仪进行检测，所述检测的方法为：取20～200μL样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次进行平均，得到拉曼光谱图，并且随着时间梯度的推移，每种样品均得到一系列拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655cm^-1拉曼峰积分强度结果与所述的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，每种样品获得随着时间梯度推移的一系列酸值和过氧化值，根据得到的酸值和过氧化值对不同样品中灵芝孢子油的氧化酸败程度进行评价，在相同的时间范围内，若酸值和过氧化值的升高程度越小，说明灵芝孢子油的氧化酸败程度越低，则相应的抗氧化剂的效果越优，从而得出若干种不同抗氧化剂的优劣次序。

所述的抗氧化剂选自下列几种：TBHQ、VE、茶多酚；所述抗氧化剂的添加质量是灵芝孢子油样品质量的0.01％～0.02％。

与已有的技术相比较，本发明的有益效果如下：

(1)在拉曼光谱中，碳-碳双键通常以很强的特征峰出现，在一定浓度范围(样品中灵芝孢子油含量≥10ug/ml)内，峰的强度与双键的浓度成正比，当双键发生氧化降解酸败时，峰的强度下降，从而可以通过测定碳-碳双键的特征拉曼峰强度来直接检测碳-碳双键的降解程度，这样可以对灵芝孢子油的氧化酸败进行直接定量分析，如图1所示。

(2)灵芝孢子油拉曼光谱图中，位于1655cm^-1的双键伸缩振动峰的强度在一定浓度范围内(样品中灵芝孢子油含量≥10ug/ml)与双键的浓度成正比，所以可以通过检测1655cm^-1的双键峰强度来动态监测孢子油的氧化酸败过程。相比于其它监测孢子油氧化酸败的技术手段(如核磁、高效液相色谱、质谱等)，拉曼光谱技术更具有简单、直接、快捷，受氧化中间产物(如醛、酮)的影响小，样品无需复杂预处理等优点，如图2所示。

(3)通过拉曼光谱图中双键峰的积分强度对时间作图可以得到灵芝孢子油随时间变化的酸败曲线，由酸败曲线的斜率可求出初始反应速率常数，根据阿伦尼乌斯定律，以反应速率常数对温度的倒数作图，可计算得到氧化酸败反应的表观活化能为ΔE＝44.35kJ/mol，如图3、图4所示。

(4)由于采用拉曼光谱技术可以简单、快捷、直接地监测灵芝孢子油氧化酸败过程，从而可以通过高温加速实验进行灵芝孢子油抗氧化剂的快速筛选。并且，可根据得到的活化能数据(ΔE＝44.35kJ/mol)，计算出在室温下(20℃)灵芝孢子油的货架期，如图5所示。

(5)以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测得的灵芝孢子油酸值作图可知，无论添加抗氧化剂与否，双键拉曼峰的积分强度与其酸值都具有十分良好的线性关系，表明可以利用拉曼光谱法对孢子油氧化酸败过程中产生的酸值进行快速定量检测，如图6所示。以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测得的灵芝孢子油过氧化值作图，虽然拉曼峰强度与过氧化值不呈现线性关系，但仍然可以通过非线性拟合(软件：Origin8.0，S拟合，图7虚线所示)或者内插值的方式(该方法为已有现成的数学方法)对灵芝孢子油的过氧化值进行快速测定。

传统酸碱滴定法检测油脂酸值具有如下局限性：(1)酸碱滴定的终点依赖于指示剂颜色的微弱变化，不同个体间终点判断差异较大，特别当油脂带有颜色时误差更大；(2)所需油脂样品消耗量大(5～10g)，溶液配制、标定、滴定耗费时间长(需几小时)；(3)传统方法所需化学试剂与药品多，需要繁琐配制标定溶液，难以实现现场快速检测的要求。而拉曼光谱法无需人工终点判定与溶液配制标定，检测时间快(只需几分钟)，样品消耗量少成本低廉(普通样品管：0.2mL，毛细样品管：0.02mL)，操作简单便捷，可现场快速检测，从而使该检测方法具有相当大的实际应用前景。

(四)附图说明

图1：灵芝孢子油的拉曼光谱图。1745.6cm^-1对应于分子中羰基C＝O的伸缩振动峰，1654.5cm^-1对应于不饱和双键的伸缩振动峰，1439.2cm^-1对应于烃基碳氢键CH剪式振动峰，1300.9cm^-1对应于烃基的变形振动峰。在拉曼光谱中，碳-碳双键通常以很强的特征峰出现，峰的强度在一定浓度范围内与双键的浓度成正比，当双键发生氧化降解酸败时，峰的强度下降，从而可以通过测定碳-碳双键的特征拉曼峰强度来直接检测碳-碳双键的降解程度，这样可以对灵芝孢子油的氧化酸败进行直接定量分析。

图2：实施例2中在50℃恒温下，灵芝孢子油暴露在空气中，于5天，7天，14天，21天，28天，35天取样时的拉曼光谱图如图2所示。

图3：实施例2中反应温度对灵芝孢子油氧化酸败反应的影响。以拉曼光谱图中双键峰的积分强度对时间作图得到灵芝孢子油随时间变化的酸败曲线，将不同反应温度下(10℃，35℃，50℃，70℃)得到酸败曲线绘于图3。

图4：实施例2中灵芝孢子油氧化酸败反应的lnk对温度倒数作图。由酸败曲线的斜率求出初始反应速率常数，根据阿伦尼乌斯定律，以反应速率常数对温度的倒数作图。

图5：实施例3中添加不同抗氧化剂的灵芝孢子油氧化酸败随时间变化曲线。

图6：实施例3中灵芝孢子油氧化酸败后产生的酸值与双键拉曼峰的积分强度关系。无论添加抗氧化剂与否，双键拉曼峰的积分强度与其酸值都有十分良好的线性关系。

图7：实施例3中灵芝孢子油氧化酸败后产生的过氧化值与双键拉曼峰的积分强度关系。虽然拉曼强度与过氧化值不呈现线性关系，但仍然可以通过非线性拟合(软件：Origin 8.0，S拟合，图7虚线所示)或者内插值的方式(该方法为已有现成的数学方法)对灵芝孢子油的过氧化值进行快速测定。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：建立灵芝孢子油酸值、过氧化值评价标准图

取灵芝孢子油，置于70℃恒温器中避光敞口保存，每隔30h搅拌一次混匀，于24h、48h、72h、96h、120h分别取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法(国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2010.附录54-55.和附录56-57.)分别测定灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，获得一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图；

所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取40μL灵芝孢子油样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪(Advantage 785型近红外拉曼光谱仪，DeltaNu公司，美国，波长785nm，激光功率120mW，分辨率4cm^-1，带NuScope数字显微镜和XYZ三维载物台)样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图；

以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度(拉曼峰积分强度是用分析软件Grams里的峰面积的积分功能计算的，软件自动计算，然后拷贝或输出数据即可)为纵坐标、样品的酸值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过氧化值评价标准图；

实施例2：灵芝孢子油酸值、过氧化值的拉曼光谱快速检测及氧化酸败过程的动态检测

在50℃恒温下，灵芝孢子油暴露在空气中，于5天、7天、14天、21天、28天、35天分别取样。每次取样后对样品进行检测，检测方法：取20μL灵芝孢子油样品置于20μL毛细管中，放入拉曼光谱仪(Advantage 785型近红外拉曼光谱仪，DeltaNu公司，美国，波长785nm，激光功率120mW，分辨率4cm^-1，带NuScope数字显微镜和XYZ三维载物台)样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正。每个样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655cm^-1拉曼峰积分强度结果分别与实施例1得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得样品的酸值和过氧化值，进而得出灵芝孢子油样品的氧化酸败程度评价结果。

5天、7天、14天、21天、28天、35天取样时的拉曼光谱图如图2所示。可以看出，50℃时灵芝孢子油从第7天起就发生了明显的氧化酸败，14天后大约2/3的不饱和双键酸已经破坏，说明50℃温度下灵芝孢子油氧化酸败的速度很快。

以拉曼光谱图中双键峰的积分强度对时间作图得到灵芝孢子油随时间变化的酸败曲线，将不同反应温度下(10℃，35℃，50℃，70℃)得到酸败曲线绘于图3中，可以看出，温度对孢子油氧化酸败的速度影响十分明显，10℃时灵芝孢子油经过二十天氧化酸败也很少，而70℃时经过数小时大部分孢子油即发生了酸败。由酸败曲线的斜率求出初始反应速率常数，根据阿伦尼乌斯定律，以反应速率常数对温度的倒数作图(图4)，计算得到氧化酸败反应的表观活化能为ΔE＝44.35kJ/mol。

实施例3：利用基于拉曼光谱的检测方法选择最适合灵芝孢子油的抗氧化剂

选择TBHQ、VE、茶多酚3种抗氧化剂，分别按0.02wt％的剂量添加。准确称取4份灵芝孢子油，一份不添加抗氧剂做为对照样，其它三份分别添加TBHQ、VE和茶多酚，置于70℃恒温器中避光敞口保存，每隔30h搅拌一次混匀，定期取样，用拉曼光谱仪测定灵芝孢子油的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655cm^-1拉曼峰积分强度结果分别与实施例1得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得样品的酸值和过氧化值，进而得出氧化酸败程度评价结果

如图5所示，在70℃下，监测添加0.02wt％抗氧剂和不加抗氧剂孢子油的氧化酸败速率，很显然，不加抗氧剂的孢子油数小时内很快被氧化，抗氧化效果：维生素E>茶多酚>TBHQ，添加维生素E的孢子油6天后(双键峰强度下降5％)才出现轻微氧化酸败。根据前面得到的活化能数据(ΔE＝44.35kJ/mol)，可以计算出在室温下(20℃)灵芝孢子油货架期可达90天左右。在密闭低温的环境中，增加维生素E用量，可进一步显著延长孢子油的货架期。

灵芝孢子油货架期计算方法：已知在70℃下货架期是6天(根据酸败曲线，添加维生素E的孢子油6天后，双键峰强度下降约5％)，根据阿伦尼乌斯公式，lnk＝ΔE/RTln(k₇₀/k₂₀)＝ΔE/R*[1/(70+273)-1/(20+273)]，计算出两个温度下的反应速率常数之比k₇₀/k₂₀＝15，于是20℃下的保质期为6天乘以15等于90天。

以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测出的灵芝孢子油酸值作图，如图6所示，可以看出，无论添加抗氧化剂与否，双键拉曼峰的积分强度与其酸值都有十分良好的线性关系，表明可以利用拉曼光谱法对灵芝孢子油氧化酸败过程中产生的酸值进行快速定量检测。相比于传统酸碱滴定法，拉曼光谱法简单、方便、快捷，用样量少，成本低廉，从而使该方法具有相当大的实际应用前景。

用同样的方法，以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测出的灵芝孢子油过氧化值作图，如图7所示。虽然拉曼强度与过氧化值不呈现线性关系，但仍然可以通过非线性拟合(软件：Origin 8.0，S拟合，图7虚线所示)或者内插值的方式(该方法为已有现成的数学方法)对灵芝孢子油的过氧化值进行快速测定。

Claims (1)

1.一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸败程度以灵芝孢子油的酸值、过氧化值作为评价指标，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：

(1)建立灵芝孢子油酸值、过氧化值评价标准图

取灵芝孢子油，置于70℃恒温器中避光敞口保存，每隔24～36h搅拌一次混匀，在5天内，以每隔24小时的时间梯度取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法分别测定灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，获得一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图；

所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取20～200μL灵芝孢子油样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度；

以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的酸值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过氧化值评价标准图；

(2)供试样品的检测

取20～200μL灵芝孢子油供试样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油供试样品的拉曼光谱图；计算拉曼光谱图中1655cm^-1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655cm^-1拉曼峰积分强度结果分别与步骤(1)得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值，进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果。