CN101017141A - 诊断人类***状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒 - Google Patents

诊断人类***状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断高危型人类***状病毒(HPV)感染的聚合酶链式反应(PCR)荧光检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样品中HPV基因型以诊断一组高危型HPV感染。属于生命科学和生物技术领域。本发明的试剂盒包括一个以荧光定量PCR技术为基础的多重聚合酶链式反应(PCR)，包含针对多种HPV型的正向引物、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可在一个反应管中同时检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82等18种HPV型的DNA。由于本发明的试剂盒可以简便快速地在临床样品中诊断HPV感染，准确地检测鉴别高危型HPV的基因型，所以本发明的基因型试剂盒可应用于子***的早期诊断。

Description

诊断人类***状病毒（HPV）感染的荧光聚合酶链式反应（PCR）的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种在临床样品中诊断人***状病毒(HPV)感染并区别出一组高危型HPV的聚合酶链式反应(PCR)及荧光检测方法，属于生命科学领域和生物技术领域。本方法特别涉及一种利用多重聚合酶链式反应(PCR)荧光检测方法，以及利用所述方法在单一管PCR反应管中同时检测多种高危HPV基因型的荧光检测试剂盒。
背景技术
研究表明，人***状病毒(HPV)与***有着密切关系，是重要的致癌因子，同时也是引发***的必要条件之一。分子流行病学已经清楚证明一定类型的HPV(被称之为高危型HPV)是引起***的主要原因。***已成为世界上女性癌症的第二号杀手。据世界卫生组织(WTO)报告，全球每年***造成28.8万妇女死亡(http://www.who.int/vaccine_research/diseases/hpv/)，全球每年新增加发病例约51万，其中80％发生在发展中国家(非洲6.8万人，拉丁美洲7.7万人，亚洲24.5万人)。我国***的发病率占世界的1/4(约13.5万)，每年新发病例数超过13万，约2万人因此而死亡。所以，预防、诊断和治疗***对维护妇女健康具有十分重要的意义。
***的发生经历一系列的癌前病变过程，即宫颈上皮不典型增生(病理上称宫颈上皮内瘤变(CIN))，根据严重程度分成三级：宫颈上皮内轻度瘤变(CIN I)、宫颈上皮内中度瘤变(CIN II)和宫颈上皮内高度瘤变(CIN III)，这些癌前病变均有可能发展为宫颈***。CIN被认为主要由HPV感染引起，并不是所有的HPV感染者和CIN都会进展为癌，进展的几率与感染的HPV型别和细胞病变程度有关，特定类型的HPV感染能提高侵染性疾病的发生机率。已鉴别有90多种HPV基因型中，有40多种可感生殖腔(de VilliersE-M.Taxonomic classification of papillomaviruses.Papillomavirus Rep 2001；12：57-63)。目前将能感染生殖腔的HPV分为两类：与***低相关(低危)型和高度相关(高危)型。低危型HPV主要在生殖器官表面疣中发现，高危型常与浸润性肿瘤伴生。据近期的研究结果揭示，高危型HPV有13到19个型，其中只有11个型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56和58型)已被一致确定为高危型。Nubia
Figure A20061003361800031
等人2003年发表的研究结果认为有15种高危型(新增加的为59，68，73，82型)及三种可能的致癌型(26，53和66型)(Nubia
Figure A20061003361800032
，et al，Epidemiologic Classification of Human PapillomavirusTypes Associated with Cervical Cancer，The new england journal of medicine 2003，5t8-527)。其它几种也被认为是高危型并加以检测HPV基因型有HPV67(Martin Moberg，et al，Real-Time PCR-BasedSystem for Simultaneous Quantification of Human Papillomavirus Types Associated with High Riskof Cervical Cancer JOURNAL 0F CLINICAL MICROBIOLOGY，July 2003，p.3221-3228 Vol.41，No.7)、HPV69(Bosch FX，et al，Prevalence of Human papillomavirus in cervical cancer：a worldwideperspectlve.International Biological Study on Cervical Cancer(IBSCC)Study Group.J Natl CancerInst 1995，87：796-802)、HPV70(Eileen M.Burd，Human Papillomavirus and Cervical CancerCLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS，2003，1-17.)等。HPV-16主要在***细胞癌中发现，而HPV-18主要见于***。研究资料表明，HPVl6型就与50％以上的***相关，最常见的高危型HPV16、HPV18只占可导致***HPV的50-70％，而已知的13种型别高危型HPV(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等)，HPV单独及合并感染可导致98％以上的***。基于以上研究，通过鉴别HPV感染的分子生物学特征，发明能够快速、准确的全面检测包含13种以上高危型HPV的方法，对于诊断和预防***具有重要意义。
为在***发病的早期进行诊断，应用最广泛的是传统宫颈细胞学检查法-巴氏涂片(thePapanicolaou-stained(Pap)smear)。该法是最早的宫颈细胞学检查法，1949年由病理学家GeorgePapanicolaou发明，方法是：收集子宫颈表面的最外层细胞，涂抹在载玻片上，经过染色处理后，在显微镜下观察包括中空细胞、上皮细胞内核周孔环的形成在内的组织病理学特征并作出诊断。巴氏涂片法的优点是方法简便，患者无痛苦，成本较低，是广泛使用的常规***筛查方法。自20世纪40年代开始用于***筛查，通过巴氏涂片的筛查，已使***的发病率及死亡率降低了1/2甚至2/3之多。该方法的缺点是取材、制片、染色、阅片等受人为主观因素的影响很大，假阴性率大于10％-20％甚至更高(20％-30％)。由于这些缺点的限制，应用其它的更为可靠的诊断方法如***镜检查是很必要的。
为了减少传统巴氏涂片法人取材、制片、染色、阅片等为因素的影响，先后衍生出改进的细胞学检查法：电脑辅助宫颈细胞学检测***(X Song，1998)是美国人研制的一种被称为“脑神经网络模拟***”，用于扫描传统的巴氏涂片，简称CCT检查。但统计研究表明，该***初筛的敏感性反而低于有经验的专业人员，所以美国食品和药物管理局(FDA)只批准它用于实验室的质量控制。膜式液基薄层细胞学技术(TCT)是目前最先进的宫颈细胞学检测技术，中国已有多家大医院引入该***，方法是医生将采集到的细胞放入装有细胞保存液的标本瓶中送达实验室，制片过程由计算机程序控制。其优点是清除了杂质，形成一个清晰的细胞单层涂片，病理医生可以一目了然。该法使***尤其是癌前病变的诊断率显著提高，因费用较高，通常只在高危人群中使用。
***镜检查法：***镜是一种内窥镜，可直接观察宫颈和下生殖道上皮的病变，放大倍数可达10-40倍，是早期诊断***及癌前病变的重要辅助方法之一。当临床可疑或细胞学检查异常时往往建议进行***镜检查，***镜与细胞学合用可以减少假阴性的发生。***镜检查对HPV感染的检出率高达70％，尽管***镜检查在欧洲作为筛查方法被较多的使用，但大多数发达国家认为其特异性较低而不宜作筛查方法，在发展中国家则因其设备消费和成本较高，***镜检查的准确性通常受其自身及检查者的经验和技术水平影响，又需要一定经验的专门技术人员，而无法作为筛查方法广泛应用。
上述几种方法的共同缺点是需要技术熟练的操作人员，并且不能鉴别HPV脱氧核糖核酸(DNA)的存在，更不能识别高风险和低风险的HPV感染基因型。所以一直以来努力发展可以检出HPV并且鉴定HPV基因型的各种技术，以对巴氏涂片法和***镜检查进行很好的补充。
HPV已被确认为***的主要致病因子，HPV病毒特别难于在体外培养，不是所有的感染者有可检测的抗体反应。因此，DNA检测是的非介入式测定HPV感染存在的具有最高灵敏度的检测方法。美国FDA已批准细胞学检查与HPV检测联合使用作为***筛查方法，表明检测HPV作为预防***的方法已得到公认。HPV DNA的检测方法主要有HPV的DNA检测方法基于使用核酸探针的分子生物学技术。HPV的DNA检测方法主要分为三类(Roger A.Hubbard，Human Papillomavirus Testing Methods ARCH PATHOL LAB MED2003127，940-945)：
第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Sourthern印迹和点印迹，原位杂交过滤(FISH)等法，由于其低灵敏度、操作繁琐费时及需要大量纯化的HPV探针，而且这些方法不能检测所有的致癌HPV基因型，现已很少采用，所以并没有广泛的推广。
第二类是信号放大法，如杂交捕获(Hybrid Capture kit，Digene Diagnostics，Silver Spring，MD，USA，http://www.digene.com)法(Digene公司)和bDNA法(Bayer公司)。杂交捕获(Hybrid Capture)法是美国Digene公司的检测HPV DNA的技术，是目前美国唯一获得FDA批准可在临床使用的一种检测HPV DNA的检测技术，HC2可以检测从高危型到低危型的各种HPV，该试剂盒用的是一套核酸杂交信号扩增***杂交捕获二代试验(HC2)HPV DNA检测试剂，能同时检测13种高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。在上述方法中，利用Hybrid Capture的液体杂交和普通引物PCR之后线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。商业化的Hybrid Capture试剂盒无须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV DNA，并且可区别出高危型和低危型。但是，使用RNA探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除交叉反应的可能。
第三类方法是基于PCR的靶序列片段扩增技术(文献3-13)，应用PCR对特异型HPV靶序列片段进行扩增，用型特异性的寡核苷酸探针鉴别HPV型别。
HPV DNA检测法的优点是：取样简便，检测及结果报告人为因素影响极少，适合在***高危人群中进行大规模的初筛。该类目前主要检测方法有：
型特异性PCR(Type-specific PCR)法：该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在10-200个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。但这一方法目前主要局限于研究领域，因为每份样本都需要同时作多份PCR限制了高通量的使用。
简并/通用引物PCR 通过针对高保守的L1基因设计引物(Kleter等1999，Gravitt PE，2000)，可以在一管反应中同时检出多个HPV型别，随后使用型特异性探针杂交确切分型，可区分大约40种型别。常用的引物包括简并引物MY09/11(Bosch，1995)及其改进型PGMY09/11(Gravitt PE，1998)，SPF1/2(Reesink-Peters N，2001)，通用引物GP5/6(De Roda Husman AM，1995)和GP5+/6+(Hutchinson，1994)，SPF1/2的灵敏度达到0.5-10fg(10-200个拷贝)，PCR产物还可通过多种手段进行进一步分析：例如序列分析，限制性长度多态性分析(RFLP，Wang TS，1999)，以及使用特异性的探针进行斑点杂交(LaconiS，2001)等。
Amplicor微孔板检测(Microtiter Well Plate)是Roche公司的代表产品，该产品使用非简并的系列引物混合物特异性扩增13种高危型L1区长度为170bp的片段，产物被固定在微孔板上的相应捕获分子所捕获，随后通过底物与酶的显色使产物得以检测。这一方法使用了TaqGold DNA聚合酶，减少了非特异性扩增并使反应的灵敏度大为提高。由于其针对的片段更短，这一检测手段对于检测保存不善的样本尤为有效，据报道(Thomas Iftner，2003)相对PGMY09/11(针对450bp的片段)其对宫颈涂片的检出率可提高13％。
HPV分型诊断芯片 由韩国的生物医学实验室有限公司(Biomedlab)公司研制(TS Hwang，2003)，目前可以检测22种HPV，方法是，将型特异性探针及对照探针(Beta球蛋白)固定在芯片上，引物包含针对Beta球蛋白的引物及针对HPV L1区的引物(在GP5/6基础上作进一步修改)，PCR体系中含荧光素标记的核苷Cy3或Cy5，经PCR扩增的靶序列DNA产物，与芯片杂交，最后可通过激光扫描仪获得结果。对于多重感染的样本，可以检测到多个杂交信号，尽管这一方法的灵敏度和特异性均很高，但其实用性还有待进一步论证。
以上检测HPV基因的几种杂交法方法利用GP5/6或MY11/9通用引物或其改进引物，加上多态区的特异型探针序列，都有几个缺点，例如，进行PCR反应后还需要作进一步实验才能鉴别HPV不同的亚型；而且，如样品中存在不同的型HPV的混合感染，不同的HPV型有不同的扩增反应效率，导致某些型相对于其它型有不均衡的扩增，不均衡的扩增使反应平衡趋向于样品中的高拷贝型，消耗了PCR反应的组份，使拷贝数少的型不易被检测出。
TaqMan探针荧光PCR技术(fluoresence PCR，F-PCR)，是由美国PE公司首先研制成功的(美国专利1994 U.S.Patent No.5538848；Holland等PNAS USA 88：7276-7280(1991))。TaqMan探针是一条两端分别标记荧光基团的特异性寡核苷酸单链，在5′端标记荧光报告基团，在3′端标记荧光淬灭基团。在PCR反应开始时，引物与靶序列特异性结合，Taq酶沿模板自5′端向3′端开始合成，此时探针保持完整，荧光报告基团的荧光被荧光淬灭基团淬灭，不产生荧光信号；当Taq酶沿双链DNA模板合成至遇到探针时，将探针5′端剪切掉，游离下来的荧光报告基团会发出报告荧光；荧光的强度随PCR循环次数增加而增强，且与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化，因此荧光PCR检测能实现闭管实时监测PCR过程的变化，PCR产物无需后续检测和处理。它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，操作快速，结果直观，能直接探测PCR过程中的变化，其产物检测不需要做PCR后处理，无需进行凝胶电泳，完全闭管操作，有效的降低了PCR产物污染，进一步降低假阳性率。
荧光PCR技术的荧光探针现已发展成多种类型，如TaqManMGB探针，Beacon探针，Fret探针，Scorpion(蝎子)探针等。Taq-Man探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。TaqManMGB探针方法是在TaqMan方法之后产生的更新的方法，MGB的全称为Minor GrooveBinder，它在2001年才被推出。与TaqMan探针相比，其原理是TaqManMGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记，可以大大降低本底信号的强度，同时MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，大大增加了探针的杂交稳定性，也使得探针设计的成功率大为提高。该方法具有如下优点：1、容易设计；2、探针短；3、提高配对与非配对模板间的Tm值差异；4、高特异性和高精确性；5、杂交的稳定性好；6、低背景，改进了信噪比；7、结果重现性好。
Taq-Man探针荧光PCR技术已被用于检测HPV型，Swan等(Journal of Clinicai Microbiology 35(4)：886-891，(1997))用型特异性的引物和多重PCR扩增HPV16，18，31，33，35五个型HPV的L1区DNA片断，用型特异荧光探针检测一定PCR循环反应后终点的反应信号，但是该法不是实时-PCR(real-time)。Josefsson等(Journal of Clinical Microbiology 37(3)：490-496，(1999))报道了用型特异性的引物PCR扩增HPV16，18，31，33，3五型HPV的E1区DNA片断，用不同荧光标记的型特异探针实时检测这五种HPV亚型，与Swan等的方法不同，该法应用了Real-time PCR原理。Tucker等(Molecular Diagnosis 6(1)：39-47(2001))报道了用型特异性的引物和多重PCR扩增HPV DNAE6/E7连接区的保守区，用不同荧光标记的型特异探针实时检测HPV。HART等(Journal of Clinical Microbiology，39(9)：3204-3212(Vol.39，No.2001))报道用Scorpions荧光探针分三管检测HPV6，11，16，18，31，33，39，45，51，56十种型别。
HPV基因检测的世界及欧洲专利有：
1.Fluorescent multiplex hpv pcr assays using multiple fluorophores CA2457888，EP 1421200(2001)，WO03019143(2003)，US2005175987(2005)(real-time PCR)，采用三位点法检测HPV的E6/E7基因和L1，采用四种taqman探针检测HPV6，11，16，18，31，33，45等七种HPV型。
2.Virus detection method，primers therefor and screening kit.CA 2450164，WO 02103050(2002)(real-time PCR)每型采用一种Scorpion探针检测HPV6，11，16，18四种HPV型。
上述国际专利和荧光PCR技术，但是这些方法只可同时检测较少的HPV型，而且还没有将TaqManMGB探针的实时荧光PCR检测方法应用于HPV DNA的检测的报道和专利申请。
基于以上所述，尽管HPV DNA的检测已发展了许多种技术，开发研制一种简单、精确、重复性好的用于检出多种型HPV感染且并区别出高危型HPV的方法是非常必要的。
发明内容
已知与***高度相关的高危型HPV约有20个型，临床诊断需要一种简单、精确、重复性好的方法，能够同时对一系列的多种HPV进行检测，特别是检出HPV感染且并区别出高危型HPV的方法。荧光实时PCR(Fluorescent real-time PCR)技术结合PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量等优点，具有操作简单、结果判断直观以及无污染等特点，在临床诊断中已被广泛用于多种病毒病原体DNA检测。
本方法特别涉及一种利用多重PCR检测方法，以及利用所述方法在单一管PCR反应管中快速、平行地同时检测多种常见的高危HPV基因型的荧光检测试剂盒。本发明的主要目的是提供一种诊断HPV感染的基因型试剂盒，简便地诊断HPV感染，准确地测定高危HPV的基因型。
一般PCR仅采用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。本发明则采用多重PCR法(multiplexPCR)即多重核酸扩增法，在同一PCR反应体系里加上二对以上的引物、各对引物针对各自特异的靶序列进行PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。采用多重PCR的原因有多种优势：多重PCR具有高效性***性经济简便性等特点，能在同一反应管内同时检出多种高危HPV型，可大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息，更贴近临床检验需求。本发明中强调针对每个HPV型的寡核苷酸序列引物和探针与对应的HPV型特异结合，反应体系中关键是含一组探针、一组特异性正向引物和反向引物，分别针对18种高危HPV型，能与相应的高危HPV型靶序列特异性结合。通过本法制备的HPV基因型检测试剂盒即可简便、准确的检测HPV感染，鉴定感染的HPV属于高危基因型。
本发明的方法步骤包括：(1)在聚合酶和一组针对HPV各型的特异性引物存在下PCR进行扩增靶序列，产生靶序列扩增产物，针对每个HPV型的引物序列对包含有：一个首先与对应HPV型的靶序列上游第一个结合部位结合的正向引物，一个与对应HPV型靶序列的下游第二个结合部位结合的反向引物，正向引物和反向引物可以是本说明书序列表列明的序列。(2)一个针对对应HPV型靶序列在正向引物和反向引物之间序列的TaqMan荧光标记探针；TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。本发明的方法可以采用普通的TaqMan探针和TaqManMGB探针。TaqManMGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。探针可以是本说明书序列表列明的序列。(3)在PCR反应开始时，针对每个型HPV的引物寡核苷酸序列与临床样品中的PCR扩增的DNA片段特异性结合杂交，引物与靶序列特异性结合，Taq酶沿模板自5’端向3’端开始合成，此时未与靶序列结合的探针保持完整，荧光报告基团的荧光被荧光淬灭基团淬灭，不产生荧光信号；当Taq酶合成双链DNA沿DNA模板移动遇到探针时，将探针5′端剪切除，游离下来的荧光报告基团发出报告荧光；荧光的强度随PCR循环次数增加而增强，且与PCR产物的数量呈比例增长。荧光探针可以是双标记探针(double-labeled probe)、分子信标(molecular beacon)、能量传递荧光探针(Fluorescent resonance energy transfer)中的一种或一种以上，用于标记探针的荧光可以是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROX TAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red 640、Texas Red中的一种或二种以上。探针的3’端可以是带有DNA小沟复合物(MGB，Minor Groove Bingding)标记。采用一个或多个不同的荧光对一个或多个不同的探针进行标记。(4)荧光检测仪器透过PCR管壁直接检测到在特定波长下一个或多个不同荧光信号，荧光强度变化代表对应HPV型的靶序列扩增产物的数量增加，在样本中对应HPV型呈阳性。
本发明的特征在于，采用一步法或两步法将HPV DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增样品中病毒特异片段，同时进行HPV的定量或定性荧光检测。所述提取的样品为子宫颈部获得的样品。本专利是一种多重引物的PCR方法，由2对以上至自18对多重引物，针对18种HPV基因型，各产物通过荧光信号在一个样品管中同时检测2种以上至18种HPV型别的DNA(包含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82型)。
本发明的制备过程在下述步骤中详细描述。本发明在以下实施例中作了进一步说明，但本发明的范围并不受实施例的限制。特别是尽管实施例中制备的试剂盒带有18对引物和一个简并探针及其组合，但并不能理解为本发明就局限于探针的类型和数量，凡是使用HPV DNA衍生核苷酸序列的多重聚合酶链式反应(PCR)荧光PCR检测方法和检测试剂盒以及任何使用所述DNA荧光PCR检测试剂盒的类似方法及试剂盒均属于本发明保护范围。
附图说明
图1.HPV16型重组质粒标准品梯度稀释的荧光PCR扩增曲线，曲线从左到右对应的起始拷贝数分别为(1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101)
图2.HPV16型重组质粒标准品梯度稀释的标准曲线，R2＝0.994，说明线性关系非常好；斜率＝-3.35，PCR扩增效率为98.8％(理想情况下斜率＝-3.32，PCR效率为100％)
图3.宫颈细胞样本HPV的荧光PCR检测曲线示意图
具体实施方式
实施例1：引物和探针设计
研究表明，HPV各型基因组的L1区序列之间，既有一定的同源性即HPV保守性序列，又具有一定的多态性即型特异性，根据型特异性序列可以设计型特异性引物。本实施例检测18种高危HPV型的引物与探针设计原理是：在HPV基因组的L1区(靶序列位置约为L1区bp800-bp1200)选择相邻的多态性序列设计特异性正向引物和反向引物，以及探针序列，在一个反应管进行多重PCR，同时用针对18高危型HPV的通用TAQMAN-MGB探针检测18种高危型HPV。模板变性温度在92-97℃；引物退火温度在50-65℃；DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链，延伸合成互补DNA链的温度在56-65℃；进行扩增反应的循环数为30-45个。表1列明了靶序列扩增产物的位置和最大长度。正向引物可以是序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.90对应18种HPV型的引物及其组合，反向引物可以是序列表SEQ ID NO.91-SEQ ID NO.180对应18种HPV型的引物及其组合，探针可以是序列表中SEQ ID NO.181-SEQ ID NO.270对应18种HPV型的探针序列及其组合。上述引物和探针也可以是本专利权力要求1所述正向引物及反向引物之间的适合序列作为引物和探针的序列，不仅限于序列表中列明的序列。
表1.HPV靶序列扩增产物所依据的基因库编号和位置
    HPV型别   基因库编号   靶序列位置   最大扩增产物长度
    HPV16   NC_001526   6538-6745   120-208
    HPV18   NC_001357   6514-6724   120-211
    HPV31   NC_001527   6456-6663   120-208
    HPV33   NC_001528   6495-6699   120-205
    HPV35   M74117   6478-6685   120-208
    HPV39   NC_001535   6541-6751   120-211
    HPV45   NC_001590   6518-6728   120-211
    HPV51   NC_001533   6422-6629   120-208
    HPV52   NC_001592   6559-6763   120-205
    HPV56   NC_001594   6495-6699   120-205
    HPB58   NC_001443   6544-6748   120-205
    HPB59   NC_001635   6507-6717   120-211
    HPV66   U31794   6545-6749   120-205
    HPV67   D21208   6520-6724   120-205
    HPV68   M73258   2518-2728   120-211
    HPV69   NC_002171   6445-6655   120-211
    HPV73   NC_006165   6389-6602   120-214
    HPV82   NC_002172   6472-6682   120-211
实施例2：样品制备
为检测人类妇女子宫颈化验标本的HPV感染，从所述样品中提取出DNA，并纯化。为测试样品DNA量是否足够，所述的纯化DNA通过检测人基因组特有的基因进行PCR扩增，选出那些显示人基因组特有的基因DNA扩增的DNA样品，用于下一步HPV DNA的分析。人基因组特有的基因可以选择珠beta-珠蛋白基因和HMBS基因引物进行PCR扩增。
阳性对照质粒和阴性对照质粒的制备
从表1所列来源获得的HPV序列，于本实验室构建的含有HPV L1区靶序列的重组质粒DNA作为阳性对照标准品，使用PromegapGEM-T easy vector system连接试剂盒，将经过纯化的PCR产物连接到pGEM-Teasy载体上，然后转化进入大肠杆菌JM109感受态细胞中，构建18种HPV型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)重组质粒DNA作为阳性对照品标准品，以及构建5种HPV型(HPV6、11、42、43、44)重组质粒DNA作为阴性对照标准品。构建的HPV重组质粒经测序鉴定。另外，从下列细胞系分离纯化的DNA作为阳性对照：SiHa cell line(HPV 16)和Hila cell line。上述选择出的样品DNA使用序列表中的一组引物组进行PCR扩增。
实施例3优化多重PCR荧光检测反应
对引物和探针浓度进行优化使得在一管PCR反应中可以同时检测18种高危型HPV，使用ABI PRISM7000对10-1000000个拷贝的18种高危型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)阳性对照质粒评估Ct值和Rn值，随引物和探针的变化来优化引物和探针浓度，用5种低危型(HPV型6、11、42、43、44)阴性对照质粒检测特异性，即10-10000000个拷贝的18种高危型阳性对照质粒可被检测出，而阴性对照质粒不能被检测出。PCR反应在40微升发应混和液中进行，反应混合液包含有1-2单位的TAQ聚合酶，20-200nM的针对各高危型HPV的引物，探针的浓度为0.02-0.6pM。
实施例4使用本试剂盒检测临床样品中HPV感染
实施例4-1使用本试剂盒检测阳性对照质粒和性对照质粒
使用本试剂盒检测包括18种高危型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82)照阳性对照质粒和5种低危型(HPV型6、11、42、43、44)阴性对照质粒，结果完全符合预期。对HPV16标准品具有良好的检测动力学范围和线性关系(10-1000000拷贝)(图1-2)。
实施例4-2使用本试剂盒检测临床样品中HPV感染
为检测本发明试剂盒诊断HPV感染的准确性和有效性，对102例临床样品进行PCR扩增和荧光检测，以检出HPV感染以及确定高危险型HPV感染。102例在子宫颈部获得的样品通过实施例2中所述方法制备DNA膜板，然后再用实施例3中所述的本发明优化的DNA扩增和分析方法检测HPV感染(部分检测结果见图3)，与DIGENE HC2方法的比较，并进行DNA序列分析鉴定HPV型别，以鉴定本发明的检测方法临床诊断的有效性(结果见表2)。
表2.采用本发明的试剂盒和对比临床诊断和DIGENE HC2方法的结果DNA序列测定方法获得的检测/鉴定基因型结果比较。
    样品编号   Digene HC2结果  本发明荧光PCR检测结果     HPV型
    1026   -  +     HPV45
    1038   -  +     HPV31
    1049   -  +     HPV58
    11   +  +     HPV58
    18   +  +     HPV59
    19   -  +     HPV16
    32   -  +     HPV68
    43   +  +     HPV68
    23521   +  +     HPV18
    1026   +  +     HPV45
    1038   -  +     HPV31
    1149   -  +     HPV58
    1137   +  +     HPV18
    7272   +  +     HPV18
    7295   +  +     HPV68
    7326   +  +     HPV16
    7297   +  +     HPV16
    7425   +  +     HPV16
    7416   +  +     HPV16
    7417   +  +     HPV16
    7328   +  +     HPV18
    7354   +  +     HPV18
    7277     +     +     HPV18
    7289     +     +     HPV18
    7404     +     +     HPV31
    7308     +     +     HPV33
    7431     +     +     HPV39
    7444     +     +     HPV45
    7392     +     +     HPV45
    7437     +     +     HPV45
    7443     +     +     HPV52
    7403     +     +     HPV56
    7326     +     +     HPV16
    7297     +     +     HPV16
    7425     +     +     HPV16
    7416     +     +     HPV16
    7417     +     +     HPV16
    7364     +     +     HPV16
    7390     +     +     HPV16
    7272     +     +     HPV18
    7328     +     +     HPV18
    7354     +     +     HPV18
    7277     +     +     HPV18
    7289     +     +     HPV18
    7404     +     +     HPV31
    7308     +     +     HPV33
    7431     +     +     HPV39
    7444     +     +     HPV45
    7392     +     +     HPV45
    7437     +     +     HPV45
    7434     +     -     HPV45
    7295     +     +     HPV68
    7314     +     +     HPV68
    7318     +     +     HPV52
    7333     +     +     HPV58
    7336     +     +     HPV51
    7343     +     +     HPV68
    7278     +     +     HPV68
    7298     +     +     HPV59
    7368     +     +     HPV45
    7408     +     +     HPV18
    7410     +     +     HPV31
    7415     +     +     HPV58
    7441     +     +     HPV68
    7445     +     +     HPV45
    7449     +     +     HPV52
    7366     +     +     HPV58
    7372     +     +     HPV52
    7385     +     +     HPV58
    7393     +     +     HPV18，42
    7397     +     +     HPV51
    7402     +     +     HPV18
    7405     +     +     HPV45
    7426     +     +     HPV58
    7363     +     +     HPV30，16
    1029     -     +     HPV66
    1035     -     +     HPV66
    23087     -     +     HPV53
    1029     -     +     HPV66
    1035     -     +     HPV66
7352 - + HPV66
    7283     -     +     HPV66
    7317     -     +     HPV66
    7414     -     +     HPV66
    7442     -     +     HPV66
    7401     -     +     HPV66
    7352     -     +     HPV66
    7283     -     +     HPV66
    7317     -     +     HPV66
    7414     -     +     HPV66
    7435     -     +     HPV67
    7442     -     +     HPV66
    7401     -     +     HPV66
    2010     -     +     HPV67
    80054     -     +     HPV66
    47192     -     +     HPV16
    98600     -     +     -
    81196     -     +     -
    75962     -     +     -
    77770     +     +     HPV45
    90611     +     -     HPV45
    90746     +     -     HPV45
表2中，与DigeneHC2试剂比较，本发明可检测出DigeneHC2报告的13种高危HPV型以外的高危型HPV。对102例样品的序列测定结果，与本试剂盒检出结果比较，本发明准确率为95.1％。本发明的诊断人类***状病毒(HPV)感染的荧光聚合酶链式反应(PCR)试剂盒，检测过程的简单、快速，能够方便地检测出多种基因型，比现有型特异性PCR和其它相关方法有利得多。可进行完善更大规模病例研究。FDA(Food andDrug Administration)证实：用于快速诊断HPV感染的Hybrid Capture试剂盒近来使用率上升。据报道：对于检测和区分高或低风险HPV感染。其准确率为98％，本发明的分析方法与Hybrid Capture试剂盒相比具有竞争性的效率及额外鉴定基因型的优点。以上所述显示：使用本发明的HPV荧光检测试剂盒在诊断HPV感染方法在许多方面优于传统诊断HPV的方法.
以上已清楚解释说明：本发明所述一种用于诊断高危型人类***状病毒(HPV)感染的聚合酶链式反应(PCR)荧光检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样品中HPV基因型，以诊断一组高危型HPV感染。本发明试剂盒是一种能够简便，准确检测HPV感染以及鉴定HPV感染类型的工具，对于子***的早期诊断，预防和治疗很有作用。
序列表检测高危HPV的引物和TAQMAN-MGB探针寡核苷酸序列表
    序列编号   序列名称   寡核苷酸序列(5’-3’)
    SEQ ID NO.1   HPV16正向引物1   CCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCT
    SEQ ID NO.2   HPV16正向引物2   CCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACC
    SEQ ID NO.3   HPV16正向引物3   CCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAAC
    SEQ ID NO.4   HPV16正向引物4   CCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAA
    SEQ ID NO.5   HPV16正向引物5   CCTCTGATGCCCAAATATTCAATAA
    SEQ ID NO.6   HPV18正向引物1   CCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCA
    SEQ ID NO.7   HPV18正向引物2   CCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACC
    SEQ ID NO.8   HPV18正向引物3   CCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAAC
    SEQ ID NO.9   HPV18正向引物4   CCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAA
    SEQ ID NO.10   HPV18正向引物5   CCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAA
    SEQ ID NO.11   HPV31正向引物1   CTTCAGATGCACAAATTTTTAATAAACCA
    SEQ ID NO.12   HPV31正向引物2   CTTCAGATGCACAAATTTTTAATAAACC
    SEQ ID NO.13   HPV31正向引物3   CTTCAGATGCACAAATTTTTAATAAAC
    SEQ ID NO.14   HPV31正向引物4   CTTCAGATGCACAAATTTTTAATAAA
    SEQ ID NO.15   HPV31正向引物5   CTTCAGATGCACAAATTTTTAATAA
    SEQ ID NO.16   HPV33正向引物1   CTTCCGAATCTCAGTTATTTAATAAGCCA
    SEQ ID NO.17   HPV33正向引物2   CTTCCGAATCTCAGTTATTTAATAAGCC
    SEQ ID NO.18   HPV33正向引物3   CTTCCGAATCTCAGTTATTTAATAAGC
    SEQ ID NO.19   HPV33正向引物4   CTTCCGAATCTCAGTTATTTAATAAG
    SEQ ID NO.20   HPV33正向引物5   CTTCCGAATCTCAGTTATTTAATAA
    SEQ ID NO.21   HPV35正向引物1   CCTCCGATGCACAAATATTTAATAAACCT
    SEQ ID NO.22   HPV35正向引物2   CCTCCGATGCACAAATATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.23   HPV35正向引物3   CCTCCGATGCACAAATATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.24   HPV35正向引物4   CCTCCGATGCACAAATATTTAATAAA
    SEQ ID NO.25   HPV35正向引物5   CCTCCGATGCACAAATATTTAATAA
    SEQ ID NO.26   HPV39正向引物1   CCTCTGATTCCCAGTTATTTAATAAGCCT
    SEQ ID NO.27   HPV39正向引物2   CCTCTGATTCCCAGTTATTTAATAAGCC
    SEQ ID NO.28   HPV39正向引物3   CCTCTGATTCCCAGTTATTTAATAAGC
    SEQ ID NO.29   HPV39正向引物4   CCTCTGATTCCCAGTTATTTAATAAG
    SEQ ID NO.30   HPV39正向引物5   CCTCTGATTCCCAGTTATTTAATAA
    SEQ ID NO.31   HPV45正向引物1   CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAGCCA
    SEQ ID NO.32   HPV45正向引物2   CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAGCC
    SEQ ID NO.33   HPV45正向引物3   CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAGC
    SEQ ID NO.34   HPV45正向引物4   CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAG
    SEQ ID NO.35   HPV45正向引物5   CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.36   HPV51正向引物1   CATCTGATTCTCAAATTTTTAATAAGCCT
    SEQ ID NO.37   HPV51正向引物2   CATCTGATTCTCAAATTTTTAATAAGCC
    SEQ ID NO.38   HPV51正向引物3   CATCTGATTCTCAAATTTTTAATAAGC
    SEQ ID NO.39   HPV51正向引物4   CATCTGATTCTCAAATTTTTAATAAG
    SEQ ID NO.40   HPV51正向引物5   CATCTGATTCTCAAATTTTTAATAA
    SEQ ID NO.41   HPV52正向引物1   CCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCG
    SEQ ID NO.42     HPV52正向引物2  CCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.43     HPV52正向引物3  CCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.44     HPV52正向引物4  CCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAA
    SEQ ID NO.45     HPV52正向引物5  CCTCAGAATCCCAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.46     HPV56正向引物1  CGTCTGAGGCACAGTTATTTAATAAACCT
    SEQ ID NO.47     HPV56正向引物2  CGTCTGAGGCACAGTTATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.48     HPV56正向引物3  CGTCTGAGGCACAGTTATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.49     HPV56正向引物4  CGTCTGAGGCACAGTTATTTAATAAA
    SEQ ID NO.50     HPV56正向引物5  CGTCTGAGGCACAGTTATTTAATAA
    SEQ ID NO.51     HPB58正向引物1  CCTCAGAATCACAATTATTTAATAAGCCT
    SEQ ID NO.52     HPB58正向引物2  CCTCAGAATCACAATTATTTAATAAGCC
    SEQ ID NO.53     HPB58正向引物3  CCTCAGAATCACAATTATTTAATAAGC
    SEQ ID NO.54     HPB58正向引物4  CCTCAGAATCACAATTATTTAATAAG
    SEQ ID NO.55     HPB58正向引物5  CCTCAGAATCACAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.56     HPB59正向引物1  CTTCTGATTCACAATTATTTAATAAACCA
    SEQ ID NO.57     HPB59正向引物2  CTTCTGATTCACAATTATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.58     HPB59正向引物3  CTTCTGATTCACAATTATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.59     HPB59正向引物4  CTTCTGATTCACAATTATTTAATAAA
    SEQ ID NO.60     HPB59正向引物5  CTTCTGATTCACAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.61     HPV66正向引物1  CCTCTGAGGCCCAATTATTTAATAAACCT
    SEQ ID NO.62     HPV66正向引物2  CCTCTGAGGCCCAATTATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.63     HPV66正向引物3  CCTCTGAGGCCCAATTATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.64     HPV66正向引物4  CCTCTGAGGCCCAATTATTTAATAAA
    SEQ ID NO.65     HPV66正向引物5  CCTCTGAGGCCCAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.66     HPV67正向引物1  CCTCAGAATCTCAATTATTTAATAAACCA
    SEQ ID NO.67     HPV67正向引物2  CCTCAGAATCTCAATTATTTAATAAACC
    SEQ ID NO.68     HPV67正向引物3  CCTCAGAATCTCAATTATTTAATAAAC
    SEQ ID NO.69     HPV67正向引物4  CCTCAGAATCTCAATTATTTAATAAA
    SEQ ID NO.70     HPV67正向引物5  CCTCAGAATCTCAATTATTTAATAA
    SEQ ID NO.71     HPV68正向引物1  CCTCAGACTCCCAGTTATTTAACAAGCCC
    SEQ ID NO.72     HPV68正向引物2  CCTCAGACTCCCAGTTATTTAACAAGCC
    SEQ ID NO.73     HPV68正向引物3  CCTCAGACTCCCAGTTATTTAACAAGC
    SEQ ID NO.74     HPV68正向引物4  CCTCAGACTCCCAGTTATTTAACAAG
    SEQ ID NO.75     HPV68正向引物5  CCTCAGACTCCCAGTTATTTAACAA
    SEQ ID NO.76     HPV69正向引物1  CCTCTGATGCTCAATTGTTTAATAAACCT
    SEQ ID NO.77     HPV69正向引物2  CCTCTGATGCTCAATTGTTTAATAAACC
    SEQ ID NO.78     HPV69正向引物3  CCTCTGATGCTCAATTGTTTAATAAAC
    SEQ ID NO.79     HPV69正向引物4  CCTCTGATGCTCAATTGTTTAATAAA
    SEQ ID NO.80     HPV69正向引物5  CCTCTGATGCTCAATTGTTTAATAA
    SEQ ID NO.81     HPV73正向引物1  CTTCAGATGCACAGTTGTTTAATAAACCT
    SEQ ID NO.82     HPV73正向引物2  CTTCAGATGCACAGTTGTTTAATAAACC
    SEQ ID NO.83     HPV73正向引物3  CTTCAGATGCACAGTTGTTTAATAAAC
    SEQ ID NO.84     HPV73正向引物4  CTTCAGATGCACAGTTGTTTAATAAA
    SEQ ID NO.85     HPV73正向引物5  CTTCAGATGCACAGTTGTTTAATAA
  SEQ ID NO.86   HPV82正向引物1  CCTCTGATTCTCAGATTTTTAATAAGCCT
  SEQ ID NO.87   HPV82正向引物2  CCTCTGATTCTCAGATTTTTAATAAGCC
  SEQ ID NO.88   HPV82正向引物3  CCTCTGATTCTCAGATTTTTAATAAGC
  SEQ ID NO.89   HPV82正向引物4  CCTCTGATTCTCAGATTTTTAATAAG
  SEQ ID NO.90   HPV82正向引物5  CCTCTGATTCTCAGATTTTTAATAA
  SEQ ID NO.91   HPV16反向引物1  TATTCCTCCCCATGTCGTAGGTACTCC
  SEQ ID NO.92   HPV16反向引物2  TATTCCTCCCCATGTCGTAGGTACTC
  SEQ ID NO.93   HPV16反向引物3  TATTCCTCCCCATGTCGTAGGTACT
  SEQ ID NO.94   HPV16反向引物4  TATTCCTCCCCATGTCGTAGGTAC
  SEQ ID NO.95   HPV16反向引物5  TATTCCTCCCCATGTCGTAGGTA
  SEQ ID NO.96   HPV18反向引物1  TATTCCTCAACATGTCTGCTATACTGC
  SEQ ID NO.97   HPV18反向引物2  TATTCCTCAACATGTCTGCTATACTG
  SEQ ID NO.98   HPV18反向引物3  TATTCCTCAACATGTCTGCTATACT
  SEQ ID NO.99   HPV18反向引物4  TATTCCTCAACATGTCTGCTATAC
  SEQ ID NO.100   HPV18反向引物5  TATTCCTCAACATGTCTGCTATAC
  SEQ ID NO.101   HPV31反向引物1  AATTCCTCACCATGTCTTAAATACTCT
  SEQ ID NO.102   HPV31反向引物2  AATTCCTCACCATGTCTTAAATACTC
  SEQ ID NO.103   HPV31反向引物3  AATTCCTCACCATGTCTTAAATACT
  SEQ ID NO.104   HPV31反向引物4  AATTCCTCACCATGTCTTAAATAC
  SEQ ID NO.105   HPV31反向引物5  AATTCCTCACCATGTCTTAAATA
  SEQ ID NO.106   HPV33反向引物1  TATTCTTCAACATGTCTTATATATTCT
  SEQ ID NO.107   HPV33反向引物2  TATTCTTCAACATGTCTTATATATTC
  SEQ ID NO.108   HPV33反向引物3  TATTCTTCAACATGTCTTATATATT
  SEQ ID NO.109   HPV33反向引物4  TATTCTTCAACATGTCTTATATAT
  SEQ ID NO.110   HPV33反向引物5  TATTCTTCAACATGTCTTATATA
  SEQ ID NO.111   HPV35反向引物1  TATTCTTCACCATGCCTTAAATATTCC
  SEQ ID NO.112   HPV35反向引物2  TATTCTTCACCATGCCTTAAATATTC
  SEQ ID NO.113   HPV35反向引物3  TATTCTTCACCATGCCTTAAATATT
  SEQ ID NO.114   HPV35反向引物4  TATTCTTCACCATGCCTTAAATAT
  SEQ ID NO.115   HPV35反向引物5  TATTCTTCACCATGCCTTAAATA
  SEQ ID NO.116   HPV39反向引物1  TACTCCTCCACGTGCCTGGTATATTCC
  SEQ ID NO.117   HPV39反向引物2  TACTCCTCCACGTGCCTGGTATATTC
  SEQ ID NO.118   HPV39反向引物3  TACTCCTCCACGTGCCTGGTATATT
  SEQ ID NO.119   HPV39反向引物4  TACTCCTCCACGTGCCTGGTATAT
  SEQ ID NO.120   HPV39反向引物5  TACTCCTCCACGTGCCTGGTATA
  SEQ ID NO.121   HPV45反向引物1  TATTCCTCCACATGTCTACTATACTGC
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  SEQ ID NO.270     HPV82探针5  TTTATTACTTGTGTTGACACTAC

Claims (5)

1.一种诊断人类***状病毒(HPV)感染的荧光聚合酶链式反应(PCR)的方法，包括以下步骤：
(1)与HPV DNA互补的寡核苷酸序列用于PCR扩增临床样品中获得DNA的引物；包含一组针对HPV各个型别的引物序列和聚合酶存在靶序列(目标基因片断)的扩增产物，在这里，每一个型别的引物序列包含：(a)一个能与一种HPV型基因对应的靶序列上游第一个位点杂交的正向引物，(b)一个能与位于一种HPV型对应的靶序列下游的第二个位点杂交的反向引物。正向引物和反向引物可以是本说明书序列表列明的序列。
(2)用于检测HPV的荧光标记一组寡核苷酸序列探针，该探针能与位于靶序列中上述第一和第二个位点杂交之间的HPV序列杂交。探针可以是本说明书序列表列明的序列。
(3)对取得的样品进行PCR扩增，其特征在于以HPV DNA作为模板，一个反应体系中扩增一个或多个HPV DNA目标靶序列片段。
(4)采用一个或多个不同的荧光对一个或多个不同的探针进行标记，通过检测PCR反应体系中一个或多个不同荧光信号的变化，确定样品中是否感染HPV，以及HPV的含量。
2.根据权利要求1所述的荧光检测，其特征在于所述用于复合检测的荧光探针可以是双标记探针(double-labeled probe)、分子信标(molecular beacon)、  能量传递荧光探针(Fluorescent resonance energytransfer)中的一种或一种以上，用于标记探针的荧光可以是FAM、TET、JOE、ViC、HEX、ROXTAMPA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red 640、Texas Red中的一种或二种以上。探针的3’端可以是带有DNA小沟复合物(MGB，Minor Groove Bingding)标记。
3.根据权利要求1、2所述的HPV病毒荧光检测，其特征在于，采用一步法或两步法将HPV DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增样品中病毒特异片段，同时进行HPV的定量或定性荧光检测。所述提取的样品为子宫颈部获得的样品。
4.根据权利要求3，本专利是一种多重引物的聚合酶链式反应方法，由2对以上引物同时针对模板DNA链进行如下反应：
(1)模板变性，其特征在于，模板变性温度在92-97℃；
(2)引物退火，其特征在于，引物退火温度在50-65℃；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链，其特征在于，延伸合成互补DNA链的温度在56-65℃；
(4)按步骤(1)一(3)循环进行扩增反应，其特征在于，循环进行扩增反应的循环数为30-45个。
5.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于反应中引物对为2-18对多重引物，针对18种HPV基因型，以及在HPV基因型检测试剂盒中的应用，其特征在于，各产物通过荧光信号在一个样品管中同时检测2种以上至18种HPV型别的DNA(包含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、69、73、82型)。
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Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942440A (zh) * 2010-09-28 2011-01-12 深圳华大基因科技有限公司 检测和定型食管hpv病毒的引物和方法
CN102229930A (zh) * 2011-06-10 2011-11-02 亚能生物技术（深圳）有限公司 Pcr组以及人***瘤病毒检测方法与试剂盒
CN101613764B (zh) * 2009-08-03 2012-05-23 广州锐达生物科技有限公司 一种高危型hpv荧光pcr筛查方法及引物、探针和试剂盒
CN102803516A (zh) * 2009-06-19 2012-11-28 联邦科学与工业研究机构 病毒试验
CN102985565A (zh) * 2010-04-29 2013-03-20 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN102994651A (zh) * 2012-11-28 2013-03-27 英科新创(厦门)科技有限公司 用于18种高危型人***瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒
CN103114132A (zh) * 2012-12-20 2013-05-22 张鹭鹭 一种用于检测***致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法
CN103409560A (zh) * 2013-08-19 2013-11-27 潘晓静 一种广谱、高效、经济的高危人***状瘤病毒的pcr检测方法
CN103409552A (zh) * 2013-02-01 2013-11-27 港龙生物技术（深圳）有限公司 同步检测多种高危型hpv基因型的引物组、探针组、方法及试剂盒
CN103540682A (zh) * 2012-07-13 2014-01-29 钟建 用于人***瘤病毒16基因检测的生物试剂
CN103725792A (zh) * 2012-10-12 2014-04-16 江苏默乐生物科技有限公司 人类***瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法
CN101809170B (zh) * 2007-09-28 2014-08-20 3M创新有限公司 用于检测核酸的双寡核苷酸方法
CN104928399A (zh) * 2015-04-24 2015-09-23 深圳华大基因科技有限公司 引物组、试剂盒及其在hpv全基因组检测中的用途
CN105112564A (zh) * 2015-09-02 2015-12-02 广州和实生物技术有限公司 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN105950788A (zh) * 2016-06-15 2016-09-21 亚能生物技术（深圳）有限公司 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN107267663A (zh) * 2017-05-08 2017-10-20 常州金麦格生物技术有限公司 Hpv检测方法和试剂盒
CN105087827B (zh) * 2015-08-21 2018-03-02 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒
CN108026592A (zh) * 2015-06-30 2018-05-11 塞尔考有限公司 Hpv检测方法
CN109402297A (zh) * 2018-11-05 2019-03-01 泰普生物科学（中国）有限公司 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法
CN110938712A (zh) * 2019-12-27 2020-03-31 苏州药明检测检验有限责任公司 基于实时荧光定量pcr技术检测人***瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法
CN112961938A (zh) * 2019-12-13 2021-06-15 浙江我武生物科技股份有限公司 检测人类***瘤病毒的方法和试剂盒

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101809170B (zh) * 2007-09-28 2014-08-20 3M创新有限公司 用于检测核酸的双寡核苷酸方法
CN102803516A (zh) * 2009-06-19 2012-11-28 联邦科学与工业研究机构 病毒试验
CN101613764B (zh) * 2009-08-03 2012-05-23 广州锐达生物科技有限公司 一种高危型hpv荧光pcr筛查方法及引物、探针和试剂盒
CN104017908B (zh) * 2010-04-29 2016-08-17 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN102985565A (zh) * 2010-04-29 2013-03-20 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN104046703B (zh) * 2010-04-29 2016-04-13 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
US8980555B2 (en) 2010-04-29 2015-03-17 Diagcor Bioscience Incorporation Limited Rapid genotyping analysis and devices thereof
CN102985565B (zh) * 2010-04-29 2014-08-06 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN104017908A (zh) * 2010-04-29 2014-09-03 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN104046703A (zh) * 2010-04-29 2014-09-17 达雅高生物科技有限公司 人***状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置
CN101942440A (zh) * 2010-09-28 2011-01-12 深圳华大基因科技有限公司 检测和定型食管hpv病毒的引物和方法
CN102229930B (zh) * 2011-06-10 2012-12-12 亚能生物技术（深圳）有限公司 人***瘤病毒检测试剂盒
CN102229930A (zh) * 2011-06-10 2011-11-02 亚能生物技术（深圳）有限公司 Pcr组以及人***瘤病毒检测方法与试剂盒
CN103540682A (zh) * 2012-07-13 2014-01-29 钟建 用于人***瘤病毒16基因检测的生物试剂
CN103725792A (zh) * 2012-10-12 2014-04-16 江苏默乐生物科技有限公司 人类***瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法
CN102994651A (zh) * 2012-11-28 2013-03-27 英科新创(厦门)科技有限公司 用于18种高危型人***瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒
CN103114132B (zh) * 2012-12-20 2014-10-29 张鹭鹭 一种用于检测***致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法
CN103114132A (zh) * 2012-12-20 2013-05-22 张鹭鹭 一种用于检测***致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法
CN103409552A (zh) * 2013-02-01 2013-11-27 港龙生物技术（深圳）有限公司 同步检测多种高危型hpv基因型的引物组、探针组、方法及试剂盒
CN103409560A (zh) * 2013-08-19 2013-11-27 潘晓静 一种广谱、高效、经济的高危人***状瘤病毒的pcr检测方法
CN104928399A (zh) * 2015-04-24 2015-09-23 深圳华大基因科技有限公司 引物组、试剂盒及其在hpv全基因组检测中的用途
CN108026592A (zh) * 2015-06-30 2018-05-11 塞尔考有限公司 Hpv检测方法
CN105087827B (zh) * 2015-08-21 2018-03-02 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒
CN105112564A (zh) * 2015-09-02 2015-12-02 广州和实生物技术有限公司 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN105950788B (zh) * 2016-06-15 2019-07-30 亚能生物技术（深圳）有限公司 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN105950788A (zh) * 2016-06-15 2016-09-21 亚能生物技术（深圳）有限公司 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN107267663A (zh) * 2017-05-08 2017-10-20 常州金麦格生物技术有限公司 Hpv检测方法和试剂盒
CN109402297A (zh) * 2018-11-05 2019-03-01 泰普生物科学（中国）有限公司 单管检测15种hpv基因型的试剂盒及方法
CN112961938A (zh) * 2019-12-13 2021-06-15 浙江我武生物科技股份有限公司 检测人类***瘤病毒的方法和试剂盒
CN112961938B (zh) * 2019-12-13 2022-06-07 浙江我武生物科技股份有限公司 检测人类***瘤病毒的方法和试剂盒
CN110938712A (zh) * 2019-12-27 2020-03-31 苏州药明检测检验有限责任公司 基于实时荧光定量pcr技术检测人***瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法

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