CN104928213B - 一种用于修复环境重金属污染的另类瓦氏菌及其应用 - Google Patents

一种用于修复环境重金属污染的另类瓦氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于修复环境重金属污染的另类瓦氏菌(Alishewanella sp.)WH16‑1，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015073。本发明所提供的菌株能将环境中的铅或镉从碳酸盐结合态和离子交换态转化成残渣态、有机结合态和铁锰氧化物结合态，或者将铬从六价态还原成三价态，从而大幅降低环境重金属的生物活性，降低作物中的重金属含量。

Description

一种用于修复环境重金属污染的另类瓦氏菌及其应用
技术领域
本发明属于重金属污染物处理和微生物技术领域，具体涉及一种另类瓦氏菌(Alishewanella sp.)及其在修复环境重金属污染中的应用。
技术背景
自然环境中含有一定浓度的铬镉铅，但随着矿区开发、电镀、印染、化工、电子等工业的迅猛发展，铬镉铅等重金属过量进入大气、水和土壤环境中，从而引起严重的污染，威胁着生态环境的安全。
铬镉铅具有很强的生物毒性。如铅及其化合物被吸收进入体内后，形成可溶性磷酸氢铅、甘油磷酸化合物或与蛋白质结合，在血液中进行循环。严重损害人的神经、消化、免疫和生殖***,对人类健康造成威胁；Cr(VI)进入细胞内可能造成染色体DNA断裂，引发细胞染色体畸变，具有引发癌症的危险。
铬镉铅的存在形态和氧化态不同，其生物毒性存在差异。目前应用较多的土壤重金属形态分类法(Tessie连续提取法)将土壤中的铅镉分为可交换态、碳酸盐结合态、铁锰结合态、有机结合态和残留态。在土壤-植物***中,各形态的生物活性从高到低依次排列的顺序为：可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残留态。可交换态重金属在土壤环境中最为活跃，生物活性高，毒性强，易被植物吸收，也容易被吸附、淋失或发生反应转化为其它形态，其通过生物链进入人体，危害人类健康的几率也相对较高；残留态重金属与土壤结合最牢固，活性最小，因而生物活性低，几乎不能被植物吸收，毒性也最小；碳酸盐结合态在弱酸性条件下，结合的重金属可被释放，其生物活性将会大幅提高；铁锰氧化物结合态重金属、有机结合态重金属的迁移转化能力介于碳酸盐结合态和残留态之间，在适当外界条件下可转化为高生物活性形态重金属。铬的毒性与其价态有关，Cr(VI)比Cr(III)的毒性高约100倍。因此，把Cr(VI)通过一定的方式转变成Cr(III)，或者将高生物毒性的重金属存在形态转化成低毒的形态，将有效的降低重金属的生态环境风险。
在自然环境中，微生物或通过将有毒形态转化为低毒的形态，或通过吸附将其固定等方式参与了重金属的转化，从而降低重金属的生态毒性。微生物的种类多，生长代谢快，对环境适应性强，无二次污染，因而，利用微生物对重金属解毒成为目前环境污染治理的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于修复环境重金属污染的另类瓦氏菌菌株，该菌株可用于环境重金属污染的修复。
本发明所提供的菌株，分类命名为另类瓦氏菌(Alishewanella sp.)WH16-1，于2015年1月29日保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015073。
该菌株分离自湖北大冶铜绿山铜铁矿土，经过鉴定为另类瓦氏菌属(Alishewanella sp.)。其形态和生理生化特征为：革兰氏阴性菌，菌落颜色为淡黄色，呈长杆状，有鞭毛，兼性好氧细菌，产硫化氢，具有利福平抗性。
另类瓦氏菌WH16-1对多种重金属具有高抗性，其对铬镉铅锌锰镍的最大致死浓度分别达Cr 2295mg/L，Cd 9mg/L，Pb 2070mg/L，Zn 1950mg/L，Mn 1100mg/L，Ni 293mg/L。
室内模拟试验结果表明：96小时内，另类瓦氏菌WH16-1可以使铅离子浓度为100mg/L的LB液体培养基中铅的浓度减少84.13％，使镉离子浓度为9mg/L的LB液体培养基中镉的浓度减少62.87％，使Cr(VI)浓度为2mM的LB液体培养基中的Cr(VI)全部转化成成Cr(III)。
土壤模拟试验结果表明：另类瓦氏菌WH16-1能将环境中的铅或镉从碳酸盐结合态和离子交换态转化成有机结合态和铁锰氧化物结合态，或者将铬从六价态还原成三价态，从而大幅降低重金属的生物活性。
田间种植试验结果表明：本发明所提供的菌株能将土壤中的铅或镉从碳酸盐结合态和离子交换态转化成残渣态、有机结合态和铁锰氧化物结合态，从而降低作物中的重金属含量。
因此本发明具有很好的实用价值和应用前景。
附图说明
图1是本发明分离的另类瓦氏菌WH16-1在***发育树的进化地位图。
图2是WH16-1菌株在不加添重金属(A)、添加9mg/L镉离子(B)及添加100mg/L铅离子(C)的LB中培养后的透射电镜图。
图3是土壤模拟实验中WH16-1对镉的形态转化的效果。
图4是土壤模拟实验中WH16-1对铅的形态转化的效果。
图5是水稻盆栽实验中WH16-1对镉的形态转化的效果。
图6是水稻盆栽实验中WH16-1对稻谷中镉含量的影响。
图7是水稻盆栽实验中WH16-1对铅的形态转化的效果。
图8是水稻盆栽实验中WH16-1对稻谷中铅含量的影响。
具体实施方式
实施例1菌株的分离与鉴定
1)样品采取：2009年7月从湖北大冶铜绿山铜铁矿采集到本发明所用的矿土样品。
2)样品富集：称取20g土样于200ml灭菌三角瓶中，添加1ml 0.1M Cr(VI)母液混匀，使土壤中Cr(VI)浓度为0.5mM。然后将三角瓶口用培养皿盖封好，放置37℃培养箱中富集一周左右，在富集过程中每两天补加一次无菌水，确保样品不干。
3)Cr(VI)抗性菌的分离：称取10g Cr(VI)富集土壤样品于装有100ml无菌生理盐水(0.85％)的三角瓶中，37℃振荡20min，取1mL土壤悬液于9mL无菌生理盐水中逐步稀释成10-2，10-3，10-4，10-5，分别取10-3，10-4，10-5三个稀释度菌液0.1mL，涂布在Cr(VI)浓度为1mM的LB培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置37℃培养箱中培养4天。待平板上长出菌落后，挑取不同颜色、大小、形状的菌落划线，确保得到单菌落，然后将这些单菌落用液体LB活化，用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱。
4)铬抗性菌的分类鉴定：用牙签挑取各菌株的单菌落于50μL无菌双蒸水中，混匀。用菌落PCR方法获得PCR扩增模板，扩增体系为50μL体系，通用引物27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')。扩增条件为：预变性，95℃，5min；变性，94℃，45sec；退火，49℃，45sec；延伸，72℃，1.5min变性-延伸35个循环；延伸：72℃，10min。得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1173bp。用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物。送至测序公司(武汉擎科创新生物科技有限公司)进行测序。将得到的16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO：1所示的序列)与GenBank文库中已有序列进行比对，发现与本发明分离的WH16-1菌株相似度最高的菌为Alishewanellasp.620，相似度96％，覆盖度为95％，申请人鉴定该菌为另类瓦氏菌属。通过N-J算法分析了该菌在相似菌株中***发育树的进化地位，结果如图1所示。
实施例2室内模拟试验
1)液体LB培养基的制备：用天平称取酵母粉提取物(OXOID公司，英国)15g，胰蛋白胨(OXOID公司，英国)30g，NaCl 30g，溶解在3L的双蒸水中，并使其完全溶解后，置于灭菌锅中121℃，灭菌30min。
2)挑取WH16-1单菌落于10ml LB液体培养基中，置37℃摇床培养至细胞密度OD600为1左右。在液体LB培养基中加入Pb(NO3)2使含Pb2+浓度为100mg/L，然后按照1％的接种量接种于100mL上述液体LB培养基中，37℃，150r/min摇床中培养，每隔一段时间后取样2mL，离心过滤，测定滤液中Pb2+浓度。发现96小时后，溶液中Pb2+去除率为84.13％。
3)挑取WH16-1单菌落于10ml LB液体培养基中，置37℃摇床培养至细胞密度OD600为1左右。在液体LB培养基中加入CdCl2·2.5H2O使含Cd2+浓度为9mg/L，然后按照1％的接种量接种于100mL上述液体LB培养基中，37℃，150r/min摇床中培养，每隔一段时间后取样2mL，离心过滤，测定滤液中Cd2+浓度。发现96小时后，溶液中Cd2+去除率为62.87％。
4)挑取WH16-1单菌落于10ml LB液体培养基中，置37℃摇床培养至细胞密度OD600为0.6左右。然后按照1％的接种量，接种于Cr(VI)浓度为2mM的100mL液体LB培养基中，37℃，170r/min摇床中培养，每隔一段时间后取样2mL，离心过滤，用二苯碳酰二肼(DPC)分光光度法(GB7467-87)测定滤液中Cr(VI)含量，发现96小时后，滤液中Cr(VI)已经全部被还原。
图2是WH16-1菌株在不加添重金属(A)、添加9mg/L镉离子(B)及添加100mg/L铅离子(C)的LB中培养后的透射电镜图。从图中可以看出，WH16-1菌株上吸附了重金属。
实施例3土壤模拟试验
1.修复土壤镉污染的应用
1)选取水稻田土壤，去除表层杂草，然后进行风干，碾磨，过40目筛，收集起来留用；土壤的pH6.05，有机质含量7.5g·kg-1，速效磷2.75mg·kg-1，含水率分别为24.65％。
2)准备6个250mL大小黑色盒子，每个盒子称入100g风干土，然后加入0.001gCdCl2·2.5H2O，拌匀，然后在每盒中加入20mL去离子水，平衡三天，并控制含水量20-30％。
3)平衡完后，在其中的三个盒子里均匀地向土表层喷洒WH16-1菌液，菌液量根据1.0×108cfu/g(土)来换算；不加菌的处理用等量去离子水代替，拌匀后，称取重量并记录，然后置于28℃恒温室培养2个月，期间根据称重来计算加水量，保持土壤恒定的含水率。
4)培养完成后，将培养的土在70℃(温度不能太高)烘箱烘干，碾磨，过100目的筛，收集得到待测的土样。
5)土壤中镉的形态分级采用Tessie连续提取法，用原子吸收测定土壤镉的含量。
6)测试的结果表明加菌的镉污染土壤中残渣态，有机结合态和铁锰结合态的百分含量均大于不加菌的对照组，而碳酸盐结合态和离子交换态的百分含量低于不加菌的对照组，如图3所示。
2.修复土壤铅污染的应用
1)选取水稻田土壤，去除表层杂草，然后进行风干，碾磨，过40目筛，收集起来留用；土壤的pH 6.05，有机质含量7.5g·kg-1，速效磷2.75mg·kg-1，含水率分别为24.65％。
2)准备6个250mL大小黑色盒子，每个盒子称入100g风干土，然后加入0.08g Pb(NO3)2，拌匀，然后在每盒中加入20mL去离子水，平衡三天，并控制含水量20-30％。
3)平衡完后，在其中的三个盒子里均匀地向土表层喷洒WH16-1菌液，菌液量根据1.0×108cfu/g(土)来换算；不加菌的处理用等量去离子水代替，拌匀后，称取重量并记录，然后置于28℃恒温室培养2个月，期间根据称重来计算加水量，保持土壤恒定的含水率。
4)培养完成后，将培养的土在70℃(温度不能太高)烘箱烘干，碾磨，过100目的筛，收集得到待测的土样。
5)土壤中铅的形态分级采用Tessie连续提取法，用原子吸收测定土壤铅的含量。
6)测试的结果表明加菌的铅污染土壤中残渣态，有机结合态和铁锰结合态的百分含量均大于不加菌的对照组，而碳酸盐结合态和离子交换态的百分含量低于不加菌的对照组，如图4所示。
实施例4水稻盆栽试验
1.降低作物镉含量的应用
1)选取水稻田土壤，风干后挑掉大块石子和水稻秸秆，收集起来留用。将上述风干土加入大小型号相同的6个桶中使其达盆高60％，再加入水，使水的高度达到盆高80％。浸泡一天。用木棍将泥土捣碎，使泥土细腻均匀，然后在桶中加入0.01mol/L CdCl2·2.5H2O0.067L(5mg/kg(土))和40g/盆的复合肥做基肥(复合肥N2O：P2O5：K2O＝10：10：20)，拌匀，平衡3天。
2)平衡完后，向其中的三个桶中加WH16-1的菌液并使土壤中菌体终浓度为1×108cfu/g，不加菌液的加入同等离子的水，然后拌匀，平衡7天，并保持含水量为50％。
3)平衡完后，移栽已经培育好的水稻苗(中花11)(培育时间10天左右)，每盆三株，大棚培养。
4)移栽后使其在相同的阳光和水分条件下生长。
5)60天后，添加追肥追菌(追肥为40g/盆上述复合肥，追菌量按106cfu/盆追加到每盆当中)。
6)培养一段时间后，取土样，采用Tessie连续提取法提取各种形态的镉，用原子吸收测定土壤镉的含量。测试的结果表明加菌的镉污染土壤中残渣态，有机结合态和铁锰结合态的百分含量均大于不加菌的对照组，而碳酸盐结合态和离子交换态的百分含量低于不加菌的对照组，如图5所示。
7)110天后收获水稻。将稻谷放在太阳底下晒干，按干灰法消解稻谷，用原子吸收测定大米镉的含量。测试的结果表明加菌的镉污染土壤中得到的大米比不加菌的镉减少了19.38％，如图6所示。
2.降低作物铅含量的应用
1)选取水稻田土壤，风干后挑掉大块石子和水稻秸秆，收集起来留用。将上述风干土加入大小型号相同的6个桶中使其达盆高60％，再加入水，使水的高度达到盆高80％。浸泡一天。用木棍将泥土捣碎，使泥土细腻均匀。然后在桶中加入1mol/L Pb(NO3)20.036L(500mg/kg(土))和40g/盆的复合肥做基肥(复合肥N2O：P2O5：K2O 10：10：20)，拌匀，平衡3d。
2)平衡完后，向其中的三个桶中加WH16-1的菌液并使土壤中菌体终浓度为1×108cfu/g，不加菌液的加入同等离子的水，然后拌匀，平衡7d，并保持含水量为50％。
3)平衡完后，移栽已经培育好的水稻苗(中花11)(培育时间10d左右)，每盆三株，大棚培养。
4)移栽后使其在相同的阳光和水分条件下生长。
5)60天后，添加追肥追菌(追肥为40g/盆上述化肥，追菌量按>106cfu/盆追加到每盆当中)。
6)培养一段时间后，取土样，采用Tessie连续提取法提取各种形态的铅，用原子吸收测定土壤铅的含量。测试的结果表明加菌的铅污染土壤中残渣态，有机结合态和铁锰结合态的百分含量均大于不加菌的对照组，而碳酸盐结合态和离子交换态的百分含量低于不加菌的对照组，如图7所示。
7)110天后收获水稻。将稻谷放在太阳底下晒干，按干灰法消解稻谷，用原子吸收测定大米铅的含量。测试的结果表明加菌的铅污染土壤中得到的大米比不加菌的铅减少了26.16％，如图8所示。

Claims (1)

1.另类瓦氏菌(Alishewanella sp.)WH16-1在修复土壤重金属污染中的应用，所述另类瓦氏菌(Alishewanella sp.)WH16-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015073，所述重金属为铬、镉、铅。
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