CN104927010B

CN104927010B - 含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104927010B
Application number: CN201510251569.XA
Authority: CN
Inventors: 汪长春; 章雨婷
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2035-05-18
Also published as: CN104927010A

Abstract

本发明属于功能纳米材料技术领域，具体为一种富含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用。本发明的磁性复合微球的核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇，内壳为交联的富含羟基的聚合物网络，外壳为表面RAFT聚合的一层PAA。该复合微球的制备方法包括：制备磁性纳米粒子团簇，在磁簇表面修饰乙烯基官能团，包覆含羟基聚合物的交联网络，修饰RAFT试剂，在RAFT试剂表面引发接一层PAA外壳等。本发明方法过程简单。制得的磁性复合微球可用于快速分离富集超大量的蛋白，如用于高通量去除血液中的高丰度蛋白及浓缩富集低丰度蛋白等。

Description

含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能纳米材料技术领域，具体涉及一种富含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是生物体各种生理功能的调控者，也是生命现象最直接的体现者。对蛋白质的结构、功能进行***的研究分析对于我们理解生物体系以及揭示生命体处于病理条件下的变化机制具有重要的意义，对于癌症等疾病的提早发现和诊治也具有至关重要的作用。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，这些蛋白极低的含量给后续的分析和检测带来了很大的困难。因此将这些低丰度蛋白从复杂生物体系中选择性富集出来，然后再进行分析和鉴定成为了目前的研究热点。

磁性复合微球由于具有独特的磁响应性，可以在外加磁场下对复杂的生物体系进行微操作从而特别适用于蛋白质组学的研究。通过对磁性微球表面进行各种修饰能达到富集各种各样特定蛋白的目的。传统的使用磁性复合微球分离生物活性物质的方法是通过抗体-抗原的相互作用，即把抗体固定在磁性复合微球表面，然后特异性分离相应的抗原。虽然抗体-抗原作用的特异性很好，但是抗体的价格十分昂贵，而且只能特异性识别某一蛋白。而对于蛋白组学来说，往往需要的是富集所有或者某一类的蛋白或多肽。因此抗体-抗原作用并不是很适合。目前富集目标蛋白或多肽按目的性可以大致分为两类：一种是选择性的富集某一类有特殊修饰的蛋白或多肽，例如选择性富集His-tag标记的重组蛋白、选择性富集磷酸蛋白或磷酸肽、选择性富集糖蛋白或糖肽等；另一种是没有选择性的富集体系中的所有蛋白或多肽，其主要目的是要去除体系中干扰分析和检测的盐分及其它成分。第一种特异性的富集特别适用于已知生物标志物的富集检测并引起了广泛的关注，但是近年来随着对于癌症等疾病检测对于未知标志物发现要求的提高，在不知道标志物蛋白类型的情况下，非特异性富集全血中所有可能的标志蛋白显得尤为重要。

没有选择性的富集体系中的所有蛋白或多肽一般利用的都是疏水相互作用。所以用于此类应用的磁性复合微球表面应该为较疏水的物质。目前报道的有C8、C60、PMMA等。在这类材料强疏水性的帮助下，复合微球对于蛋白质的富集有较好的效果。但是由于疏水-疏水相互作用对于蛋白种类还是有一定的选择性，如更适用于疏水蛋白，所以在富集低丰度标志物的时候难免会漏掉一些亲水蛋白。且该类材料富集得到的蛋白大部分都要用有机溶剂洗脱，条件相对苛刻且洗脱效率和回收率均不高。对于实际操作过程，该类疏水材料往往在富集溶液中的分散性并不好且容易黏在管壁，故而其操作较繁琐且材料利用率也不高。

因此，需要寻求新的方法用于无选择性的富集生物体系中的蛋白，于是本发明提供了一种反离子蒸发的方法去富集。主要分两步，首先用该类磁性材料去除复杂实际样本如血清中的高丰度蛋白，然后继续利用该材料富集浓缩该体系中剩下的低丰度蛋白。该类材料主要是磁性材料外包覆聚电解质（如PAA（聚丙烯酸）），在水溶液中能够形成大量的反离子（如正离子），蛋白质不管其等电点如何通常由正电荷和负电荷两部分组成，其中的正电荷段就能够去置换聚电解质中带正电的反离子从而使得蛋白质被吸附，这是一个熵增的过程，故而是一种非常通用的方法，适用于不同分子量不同等电点的几乎所有蛋白质的富集。

发明内容

本发明的目的在于提出一种制备过程简单，表面官能团密度高，能大量富集各种各样蛋白的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用。

本发明针对背景技术中所存在的问题，提出了能够高效富集和洗脱无论是高丰度还是低丰度蛋白的材料和方法。首先制备无机磁性纳米晶团簇，然后聚甲基丙烯酸羟乙酯作为内壳包覆到磁簇上去，接着在其外修饰一层RAFT试剂（S-1-十二烷基-S'-(α,α'-二甲基-α''-乙酸基)三硫酯），然后通过表面引发RAFT聚合方法制备得到核壳壳式磁性复合微球，记为Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA，由于该微球非常亲水且能在溶液中形成大量的正电荷反离子，蛋白都具有正电荷和负电荷部分，因而正电荷部分能够置换出之前提及的正电荷反离子，从而实现对于所有蛋白质的吸附。

本发明提出的富含聚电解质的核壳式磁性复合微球的制备方法，具体步骤为：

（1）首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和柠檬酸盐为原料制备柠檬酸盐稳定的磁性纳米粒子团簇（简称磁簇）；

（2）接着，使用溶胶凝胶法对磁簇表面进行修饰，使其表面带上活性的乙烯基官能团；

（3）然后，以表面含有乙烯基的磁簇为种子，通过回流沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一层致密的含羟基聚合物的交联网络，得到以磁簇为核、含羟基聚合物网络为壳的磁性聚合物复合微球；

（4）然后，利用酯化反应修饰上一步中的含羟基聚合物网络，在其表面接枝上RAFT试剂；

（5）最后，在该磁性复合微球表面引发RAFT聚合修饰上大量的PAA（聚丙烯酸）链，即得所需磁性复合微球。

用该表面富含PAA链的磁性复合微球，进行去除高丰度蛋白和浓缩富集低丰度蛋白的实验。

本发明方法各个步骤的具体操作过程如下：

步骤(1)：将1~30g六水合三氯化铁、1~60g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中，在100~200℃下机械搅拌0.5~5h，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于100~300℃的烘箱中10~50h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁铁分离出产物磁簇，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物磁簇分散在无水乙醇中，备用；

步骤(2)：将步骤(1)得到的0.1g~3g磁簇、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~10mL氨水以及0.2~10g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中，在反应温度为50~100℃下机械搅拌10~60 h，使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团；反应结束后，用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇，并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂；然后放入真空烘箱进行干燥；

步骤(3)：将步骤(2)得到的25~500mg表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~5mL侧链带羟基的烯类单体、2mg~2g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~80mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400mL乙腈加入50~1000mL单口烧瓶中，超声使其混合均匀；将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上；从室温升温到沸腾状态，然后控制反应在90~150℃保持1~5h；反应结束后用磁分离，并用无水乙醇进行洗涤，得到表面带羟基的磁性复合微球；

步骤(4)：将步骤(3)得到的表面带羟基磁性复合微球0.1~5g加入20~500mL乙腈中，然后加入0.1~3g DCC（N,N'-二环己基碳二亚胺）, 0.01~0.5g DMAP（4-二甲氨基吡啶）,0.1~3g RAFT试剂，超声分散，于20~120℃反应10~30 h。反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球。

步骤(5)：将步骤(4)得到的表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球0.1~5g加入10~500mL的二氧六环中，然后加入1~10mL侧链带羧基的烯类单体，1~50mg 2,2-偶氮二异丁腈，超声分散后通氮20-100 min，然后升温至60~100℃，反应进行5~50h。反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有大量PAA链的磁性复合微球，即得所需产品。

本发明中，步骤(1)中所述的醋酸盐可为醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾、醋酸锂或醋酸镁中的一种，所述的柠檬酸盐可为柠檬酸或柠檬酸钠中的一种。

本发明中，步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570，乙烯基三乙氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷中的一种，或其中的几种。

本发明中，步骤(3)中所述的侧链带羟基的烯类单体为甲基丙烯酸羟乙酯，甲基丙烯酸羟丙酯或N-羟甲基丙烯酰胺单体中的一种，或其中的几种。

本发明中，步骤(3)中所述侧链带羟基的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。

本发明中，步骤(3)中所述的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量，与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带羟基的烯类单体用量总和的百分比值为10 wt %到50 wt %。

本发明中，步骤(4)中所述的侧链带羧基的烯类单体为丙烯酸或甲基丙烯酸中的一种。

本发明方法制备的富含聚电解质的核壳壳式磁性复合微球，其核为磁性四氧化三铁纳米粒子团簇，内壳为交联的富含羟基的聚合物网络，外壳为表面RAFT聚合的一层聚电解质PAA链。通过用蛋白表面的正电荷段置换PAA链产生的正电荷反离子，可以实现几乎所有蛋白的富集。

本发明制备方法获得的磁性复合微球，粒径分布均一，结构规整，并且表面官能团密度很高，分离高丰度蛋白能力极强，可用于快速分离富集超大量的蛋白，如用于高通量去除血液中的高丰度蛋白及浓缩富集低丰度蛋白等，效果优良。富集容量＞1100 mg蛋白/g材料，具体为1498 mg BSA（牛血清白蛋白）/g材料，1178 mg HRP（辣根过氧化物酶）/g材料，1555 mg MYO（肌红蛋白）/g 材料，1233 mg LYS（溶菌酶）/g 材料。因此，该磁性核壳式复合微球是一种非常有应用前景的生物分离材料。

目前磁性复合微球主要存在粒径分布不均一、表面官能团密度不高等问题。本发明通过RAFT聚合制备得到表面具有高官能团密度，粒径均一的核壳结构磁性复合微球，具有以下特点：(1) 粒径分布均一，结构规整；(2) 核壳式磁性复合微球的表面富含大量线性羧基官能团；(3) 核壳式磁性复合微球的制备过程高效；(4) 该微球亲水性很好并可用于分离各种各样的蛋白质且分离效果极好，原理独特。

附图说明

图1为实施例1中壳层厚度为100 nm的核壳式Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA微球的透射电镜照片。

图2为实施例2磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA富集标准蛋白前后跑出的电泳图。其中，泳道1为标准分子量的条带，2为富集前混合蛋白（BSA+HRP+MYO+LYS），3为富集后的上清液，4为洗脱液。

图3为实施例3磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA浓缩标准蛋白前后跑出的电泳图。其中，泳道5为标准分子量的条带，6为稀释前的混合蛋白，7为稀释至6ng/μL时的混合蛋白，8-12为蛋白分别稀释到6, 3, 2, 1.2, 0.6 ng/μL时富集后的洗脱液。

图4为实施例4磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA或Fe₃O₄/PHEMA-RAFT去除复杂实际样本（a：人血浆，b：兔血）中高丰度蛋白前后跑出的电泳图。其中，泳道13或19为标准分子量的条带，14或20为富集前人血浆或兔血, 15或21为用Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA富集后的人血浆或兔血上清液，16或22为0.5%TFA洗脱后的洗脱液，17或23为用Fe₃O₄/PHEMA-RAFT富集后的人血浆或兔血上清液，18或24为0.5%TFA洗脱后的洗脱液。

图5为实施例5磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA对(a)BSA, (b)MYO在不同时间的富集容量。

图6为实施例6磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA对(a)BSA, (b)MYO在不同蛋白投料量时对应的富集容量。

图7为实施例7磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA对(a)BSA, (b)MYO在不同pH时对应的富集容量。

图8为实施例8-11不同交联度的Fe₃O₄/PAA的透射电镜图，其中(a) 2%，(b) 5%，(c)10%，(d) 20%。

图9为实施例9磁性材料Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA和不同交联度Fe₃O₄/PAA对(a)BSA,(b)MYO的富集容量比较（按整个球计算或者按壳层计算），其中(i-iv)分别为Fe₃O₄/PAA (交联度依次为2%, 5%, 10%和20%)，v为Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA。

具体实施方式

实施例1：壳层厚度为100 nm的核壳式Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA微球的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备

将1.3g六水合三氯化铁（FeCl₃•6H₂O），3.8g醋酸铵（NH₄Ac），0.4g柠檬酸钠溶解在70mL乙二醇中后，加入150mL三口烧瓶中，然后升温到170℃，搅拌反应1h后，将烧瓶中液体转入容量为100mL的含有聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，再将反应釜放入200℃的烘箱反应16h后取出，用自来水使其冷却至室温。用磁分离分离出产物，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物分散在无水乙醇中备用。

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰

将以上得到的磁簇、40 ml无水乙醇、10 ml去离子水、1.5 ml氨水以及0.6 g硅烷偶联剂KH 570加入150ml三口烧瓶中，升温到70℃，反应24 h后，磁分离得到产物并用无水乙醇洗涤除去过量的硅烷偶联剂。然后放入真空烘箱进行干燥。

3、Fe₃O₄/PHEMA的制备

将以上干燥后得到的产物取约100 mg和80 ml乙腈一起加入200 ml单口烧瓶中分散，再加入400 μL 甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）、100 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、10mg 2,2-偶氮二异丁腈（AIBN），使其溶解在反应体系中。然后将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上。从室温升温到沸腾状态，控制在110℃反应1 h。反应结束后磁分离得到产物，并用无水乙醇进行洗涤，最终得到壳层厚度为10 nm左右的Fe₃O₄/PHEMA微球。

4、Fe₃O₄/PHEMA-RAFT的制备

将步骤(3)得到的表面带羟基磁性复合微球0.2 g加入100mL乙腈中，然后加入0.1g DCC, 0.01 g DMAP, 0.1 g RAFT试剂，超声分散，于25 ℃反应10 h。反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球。

5、Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA的制备

将步骤(4)得到的表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球0.1 g加入30 mL的二氧六环中，然后加入3 mL丙烯酸，2 mg 2,2-偶氮二异丁腈，超声分散后通氮30 min，然后升温至70℃，反应进行20 h。反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有大量PAA链的磁性复合微球，即为所需产品（见图1）。

实施例2：利用上述壳层厚度为100 nm的Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA进行分离不同蛋白

1、首先称取0.1 mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次，磁分离去除水。

2、接着加入BSA, HRP, MYO 和溶菌酶各5 μg，加去离子水至100 μL，在室温下孵育5分钟。

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL 去离子水洗涤两次。

4、最后用50 μL 溶液 (0.5 % TFA) 进行洗脱，真空烘干所有的原液，上清液和洗脱液，分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer变性，跑电泳（见图2）。

实施例3：利用上述壳层厚度为100 nm的Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA进行浓缩富集不同浓度不同蛋白

2、接着将五组BSA, HRP, MYO 和溶菌酶各6 μg的混合蛋白（共24 μg）分别稀释至各蛋白浓度为6, 3, 2, 1.2 and 0.6 ng/µL的五组样品，对应体积分别为1 mL, 2 mL, 3mL, 5 mL和10 mL，将0.1 mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA磁性粒子分别加入上述五组样品中，在室温下孵育5分钟。

3、然后磁分离收集上清液，各加入100 μL 去离子水洗涤两次。

4、最后用50 μL 溶液 (0.5 % TFA) 进行洗脱，真空烘干原液，50 μL上清液和富集不同浓度蛋白时的洗脱液，分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer变性，跑电泳（见图3）。

实施例4：利用上述壳层厚度为100 nm的Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA去除复杂实际样本（兔血液和人血浆）中的高丰度蛋白

1、首先称取0.1 mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA或0.1 mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次，磁分离去除水。

2、接着加入1 µL 人血浆或1µL 兔血，加去离子水至100 μL，在室温下孵育5分钟。

3、然后磁分离收集上清液，加入100 μL 去离子水洗涤两次。

4、最后用50 μL 溶液 (0.5 % TFA) 进行洗脱。将原液，上清液和洗脱液烘干后分别加入10 μL溴酚蓝loading buffer变性，跑电泳（见图4）。

实施例5：磁性粒子对蛋白富集动力学研究

1、首先称取1 mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次，磁分离去除水。

2、接着分别加入1.8 mg MYO或1.8 mg BSA（各900 μL水溶液，即2 mg/mL），在室温下孵育不同时间，然后分别用酶标仪测紫外。

3、通过紫外比较反应前后蛋白浓度差异，结合之前测定的标准曲线可以计算出不同时间对应的富集量（做曲线如图5）。

实施例6：磁性粒子富集容量随着蛋白投入量的变化

1、首先称取1mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次，磁分离去除水。

2、接着分别加入不同量的MYO或BSA，在室温下孵育5 min，然后分别用酶标仪测紫外。

3、通过紫外比较反应前后蛋白浓度差异，结合之前测定的标准曲线可以计算出不同蛋白投料量与最终富集量的关系（做曲线如图6）。

实施例7：磁性粒子富集容量随着pH的变化

2、接着分别加入1.8 mg MYO或1.8 mg BSA，用HCl或NaOH分别调至不同pH，在室温下孵育5 min，然后分别用酶标仪测紫外。

3、通过紫外比较反应前后蛋白浓度差异，结合之前测定的标准曲线可以计算出不同pH与最终富集量的关系（做曲线如图7）。

实施例8：交联度为2 %的Fe₃O₄/PAA的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述。

3、核壳式Fe₃O₄/PAA（交联度为2 %）的制备

将以上干燥后得到的产物取约100 mg和80 ml乙腈一起加入150 ml单口烧瓶中分散，再加入 490 μL丙烯酸、10 mg N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、10 mg 2,2-偶氮二异丁腈，使其溶解在反应体系中。然后将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上。从室温升温到沸腾状态，控制在110℃反应1 h。反应结束后磁分离得到产物，并用无水乙醇进行洗涤，最终得到壳层厚度为10 nm左右的Fe₃O₄/PAA微球（如图8a）。

实施例9：交联度为5%的Fe₃O₄/PAA的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述。

3、核壳式Fe₃O₄/PAA（交联度为5 %）的制备同实施例8-3中所述。所不同的是丙烯酸、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为475 μL、25 mg、10 mg（如图8b）。

实施例10：交联度为10%的Fe₃O₄/PAA的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述。

3、核壳式Fe₃O₄/PAA（交联度为10 %）的制备同实施例8-3中所述。所不同的是丙烯酸、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为450 μL、50 mg、10 mg（如图8c）。

实施例11：交联度为20%的Fe₃O₄/PAA的制备

1、柠檬酸钠稳定的磁簇的制备同实施例1-1中所述。

2、对磁簇表面进行活性乙烯基修饰同实施例1-2中所述。

3、核壳式Fe₃O₄/PAA（交联度为20 %）的制备同实施例8-3中所述。所不同的是丙烯酸、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、2,2-偶氮二异丁腈的用量分别为400 μL、100 mg、10 mg（如图8d）。

实施例12：比较Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA与不同交联度的Fe₃O₄/PAA对蛋白的富集容量

1、首先称取1mg Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA或1 mg不同交联度的Fe₃O₄/PAA磁性粒子，用100 μL去离子水洗涤两次，磁分离去除水。

2、接着分别各加入1.8 mg MYO或1.8 mg BSA，在室温下孵育5 min，然后分别用酶标仪测紫外。

3、通过紫外比较反应前后蛋白浓度差异，结合之前测定的标准曲线可以计算出富集容量，比较不同材料对不同蛋白的富集容量（如图9）。Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA对于BSA或MYO的富集容量要比不同交联度的Fe₃O₄/PAA均高很多。

Claims

1.一种含聚电解质的核壳式磁性复合微球的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和柠檬酸盐为原料制备柠檬酸盐稳定的磁性纳米粒子团簇，简称磁簇；

（5）最后，在该磁性复合微球表面引发RAFT聚合修饰上PAA链，即得所需磁性复合微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各个步骤的具体操作过程为：

步骤(1) 操作过程：将1~30g六水合三氯化铁、1~60g醋酸盐和0.1~20g柠檬酸盐溶解在20~500mL乙二醇中，在100~200℃下机械搅拌0.5~5h，然后置于含有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置于100~300℃的烘箱中10~50h，取出，用自来水使其冷却至室温；用磁铁分离出产物磁簇，并用无水乙醇洗涤除去未反应的反应物，最后将产物磁簇分散在无水乙醇中，备用；

步骤(2) 操作过程：将步骤(1)得到的0.1g~3g磁簇、20~400mL无水乙醇、5~100mL去离子水、0.5~10mL氨水以及0.2~10g带双键的硅烷偶联剂加入三口烧瓶中，在50~100℃温度下机械搅拌10~60 h，使磁簇表面修饰上活性的乙烯基官能团；反应结束后，用磁分离得到表面修饰有乙烯基的磁簇，并用无水乙醇除去过量的硅烷偶联剂；然后放入真空烘箱进行干燥；

步骤(3) 操作过程：将步骤(2)得到的25~500mg表面修饰有乙烯基的磁簇、0.1~5mL侧链带羟基的烯类单体、2mg~2g N, N’-亚甲基双丙烯酰胺、1~80mg 2,2-偶氮二异丁腈以及溶剂20~400mL乙腈加入单口烧瓶中，超声使其混合均匀；将烧瓶连接到装有精馏柱的回流装置上；从室温升温到沸腾状态，然后控制反应在90~150℃保持1~5h；反应结束后用磁分离，并用无水乙醇进行洗涤，得到表面带羟基的磁性复合微球；

步骤(4) 操作过程：将步骤(3)得到的表面带羟基磁性复合微球0.1~5g加入20~500mL乙腈中，然后加入0.1~3g DCC, 0.01~0.5g DMAP, 0.1~3g RAFT试剂，超声分散，于20~120℃反应10~30 h；反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球；

步骤(5) 操作过程：将步骤(4)得到的表面修饰有RAFT试剂的磁性复合微球0.1~5g加入10~500mL的二氧六环中，然后加入1~10mL侧链带羧基的烯类单体，1~50mg 2,2-偶氮二异丁腈，超声分散后通氮20-100 min，然后升温至60~100℃，反应进行5~50h；反应结束后用磁分离，并用去离子水进行洗涤，得到表面修饰有PAA链的磁性复合微球，即得所需产品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的醋酸盐为醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾、醋酸锂或醋酸镁中的一种，所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述带双键的硅烷偶联剂为KH570、乙烯基三乙氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷中的一种，或其中的几种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的侧链带羟基的烯类单体为甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯或N-羟甲基丙烯酰胺单体中的一种，或其中的几种。

6. 根据权利要求2制备所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述侧链带羟基的烯类单体及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的浓度之和为0.001 wt%到10 wt%。

7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的N, N’-亚甲基双丙烯酰胺的用量，与N, N’-亚甲基双丙烯酰胺用量和侧链带羟基的烯类单体用量总和的百分比值为10 wt %到50 wt %。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的侧链带羧基的烯类单体为丙烯酸或甲基丙烯酸中的一种。

9.一种如权利要求1或2所述制备方法获得的含聚电解质的核壳式磁性复合微球。

10.如权利要求9所述的含聚电解质的核壳式磁性复合微球，在分离富集各种各样蛋白中的应用。