CN111874897A - 一种高靶向性细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用 - Google Patents

一种高靶向性细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种高靶向性细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用，通过将细胞膜包覆在磁性氧化石墨烯表面，得到的细胞膜仿生磁性氧化石墨烯具有特异性配体识别位点，采用细胞膜通过静电作用和氢键作用包覆于磁性氧化石墨烯表面。反应条件温和，不会破坏石墨烯结构，同时得到的细胞膜涂层具有特异性识别位点，实现复杂中药样品中活性组分的分离和富集，通过细胞膜固相萃取方法，实现中药中活性成分的快速识别富集，对提高分析效率具有重要的意义。

Description

一种高靶向性细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于仿生材料技术领域，涉及一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用。
背景技术
石墨烯(G)因其独特的电子性能、光学性能和生物相容性等，在生物医学器件领域有广泛的应用，如生物传感器、生物显像剂、光热治疗试剂和药物运载工具等。近年来，生物***的复杂性对多任务处理的需求日益增长，要求G基纳米材料具有多功能性，包括主动靶向、细胞相容性、信号刺激等。人们开发了各种功能化方法对石墨烯进行改性。经过化学功能化修饰的G基纳米材料可以显著提高生物相容性和功能性，满足各种生物医学需求。然而，通常的化学修饰常会用到危险试剂，其微量残留物不适合生物医学应用。因此，开发新的简便、高效、低毒性、多生物功能的G基纳米材料功能化方法对生物应用的发展具有重要的技术意义。
除了化学方法，自然和生物***激发了许多新颖的仿生修饰方法。通过DNA、蛋白质、多糖、脂质等各种大分子的直接修饰，功能化G纳米复合材料被赋予优异的性能，广泛应用于药物输送、荧光探针、生物组织工程等。此外，功能化G基纳米复合材料还具有良好的靶向性，可以有效地结合复杂基质中的特异化合物。基于以上优点，功能化G基纳米材料用于药物先导物的发现。尽管上述功能化方法能赋予纳米体系靶向性，但简单的生物大分子功能化方法不足以模拟体内复杂生物界面，并且在制备过程中，相应分子的自然结构可能会发生变化。
近年来，传统的化学修饰已经广泛地应用于氧化石墨烯的结构改造和性能提升。然而，该修饰过程需要化学试剂，微量残留物影响生物医学的应用，同时化学修饰条件较为剧烈，会破坏石墨烯的结构，进而影响其性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、高效、低毒性、多生物功能的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料及制备方法和应用，目的是显著提高G基纳米材料的生物相容性和功能性，满足各种生物医学需求。
本发明为实现上述目的，采用如下的技术方案：
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
本发明进一步的改进在于，采用溶剂热法制备磁性石墨烯。
本发明进一步的改进在于，将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，超声，再加入NaAC搅拌均匀，最后进行水热反应，得到磁性石墨烯。
本发明进一步的改进在于，水热反应的温度180-220℃，时间为5-7 h；GO、EG与FeCl3·6H2O的比为80-90mg：60-70mL：0.3-0.4g：300mg。
本发明进一步的改进在于，细胞膜通过以下过程制得：
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
本发明进一步的改进在于，采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰的具体过程为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为8-12mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为(8-12)：5。
本发明进一步的改进在于，混合时采用超声进行，超声的功率为450W，时间为4-6min。
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料在中药中靶向细胞膜受体的药物先导物发现中的应用。
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料在中药中活性成分的发现和富集中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
首先，本发明所采用磁性石墨烯作为生物材料，氧化石墨烯具有独特的电子性能、光学性能和生物相容性等，因此在生物医学领域有广泛的应用。本发明采用细胞膜通过静电作用和氢键作用包覆于磁性氧化石墨烯表面。反应条件温和，不会破坏石墨烯结构，同时得到的细胞膜涂层具有特异性识别位点，可用于中药复杂体系中活性成分的快速发现和识别，克服了现有技术中，于氧化石墨烯的结构改造和性能提升过程中，需要化学试剂，微量残留物影响生物医学的应用的问题。
进一步的，本发明所采用的磁性分离，具有高效、绿色等特点，可以在外加磁场下，快速地从复杂介质中分离目标分子。因此，将磁学性能引入到氧化石墨烯中，对提高分析效率具有重要的意义。然而，所引入的磁性纳米颗粒和细胞膜会竞争有限的氧化石墨烯位点，其制备条件和用量比例对于材料性能的实现具有重要的意义。因此，本发明对磁性氧化石墨烯的制备条件、磁性纳米颗粒和氧化石墨烯的比例、氧化石墨烯和细胞膜的比例等条件进行了考察和优化，使得制备得到的材料具有足够的磁学性能用于磁性分离，同时具有最大量的吸附位点，满足中药复杂体系中微量活性成分的发现，提高分析效率。
作为载体负载在氧化石墨烯上，可同时拥有氧化石墨烯与磁性纳米粒子的双重特性，萃取完成后，载有目标分析物的磁性氧化石墨烯同时具有磁响应性和表面功能性，可以在外加磁场下快速、高效地从介质中分离目标分子，简化了制备过程。
细胞膜作为一种重要的生物界面，其表面的特异性受体使其成为一种很有前景的药物发现工具。现代药理学研究表明，药物与细胞膜上的受体特异性结合是其在体内发挥作用的关键。因此，本发明通过将细胞膜包覆在磁性氧化石墨烯表面，得到的细胞膜仿生磁性氧化石墨烯具有特异性配体识别位点，能够克服传统药物筛选方法选择性低的缺点，实现复杂中药样品中活性组分的分离和富集，通过细胞膜固相萃取方法，实现中药中活性成分的快速识别富集，对提高分析效率具有重要的意义。
进一步的，本发明通过水热法制备磁性石墨烯，制备的磁性石墨烯纳米粒子不会发生团聚，石墨烯表面的磁性纳米粒子分散性较好。化学沉淀法制备的磁性石墨烯纳米粒子团聚严重。
附图说明
图1为本发明不同条件下制备的石墨烯对细胞膜的吸附量示意图，其中，(A)为CM的用量优化，即CM不同用量下吸附结果；(B)为制备时间优化，即不同制备时间下吸附结果。
图2为表征结果图，其中，(A)为GO透射电镜图，(B)为MGO透射电镜图，(C)为CMMGO透射电镜图。(D)为GO的扫描电镜图，(E)为MGO的扫描电镜图，(F)为CMMGO的扫描电镜图。
图3为激光共聚焦显微镜图，其中，(A)为GO在明场下的图，(B)为GO在549nm激发波长下的图，(C)为图A，B的重合图。(D)为CMMGO在明场下的图，(E)为CMMGO在549nm激发波长下的图，(F)为图D，E的重合图。
图4为Fe3O4、MGO、CMMGO的磁滞回线。
图5为性能考察结果，其中，(A)为静态吸附曲线；(B)为动态吸附曲线；(C)为吸附选择性结果。
图6为条件优化结果，其中，(A)为采用不同洗脱液时的解吸率，其中，a为水、b为PBS、c为水-甲醇(9:1,v/v,)、d为水-甲醇(5:5,v/v,)、e为水-异丙醇(9:1,v/v,)、f为水-异丙醇(5:5,v/v,)；(B)为洗脱液体积；(C)为洗脱时间。
图7为实际应用色谱图，其中，(A)为峰1的TOFMS结果和化学结构，(B)为CMMGO实际应用色谱图，(C)为峰2的TOFMS结果和化学结构；图B中，a为初始溶液，b为上样后溶液，c为淋洗液，d为洗脱液。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明。
本发明利用细胞膜(CM)作为多功能涂层的创新设计将解决将单个生物大分子整合到纳米复合材料中的局限性。这种仿生涂层可以保留天然膜结构，“模拟”细胞在体内的活动，同时最小化功能化过程中纳米材料表面结构的改变。近年来，已有大量研究表明，作为CM表面主要成分的受体在体内药物结合中起着关键作用。因此，CM功能化的G基纳米材料具有相当大的生物活性与靶向性，可用于完成高要求的药物先导物发现任务。
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，直接使用细胞膜作为天然生物材料对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
本发明可以完整保留膜结构，“模拟”体内受体-配体相互作用。这一策略将为基于石墨烯的生物激发纳米材料的开发和药物先导物的发现开辟新的途径。
由于细胞膜具有与活性配体进行多方面相互作用的固有特性，可以靶向捕获药物先导物。
本发明利用溶剂热法制备磁性氧化石墨烯(MGO)，同时培养EGFR高表达的HEK293细胞，并在对数期收集细胞以制备细胞膜材料。利用细胞膜磷脂与细胞膜材料表面羟基之间的静电作用和氢键，制备先进的功能化G基纳米材料(CMMGO)。具体方法为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀(具体为在功率为450W下超声时间为4-6min)，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为8-12mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为(8-12)：5。
将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，超声，再加入NaAC搅拌均匀，最后在180-220℃下进行水热反应5-7h，得到磁性石墨烯。GO、EG与FeCl3·6H2O的比为80-90mg：60-70mL：0.3-0.4g：300mg。
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
本发明中氧化石墨烯作为生物材料载体。将磁性分离技术应用于快速分离。细胞膜作为生物材料。细胞膜伪装方式为静电相互作用与氢键作用。
下面为具体实施例。
实施例1
一、材料与方法
1.实验材料
GO(江苏先丰纳米材料科技有限公司)；六水氯化铁(FeCl3·6H2O)、乙二醇(EG)、乙酸钠(NaAC)(广东光华科技有限公司)；RIPA裂解缓冲液(WB009，西安赫特生物科技有限公司)。DiI染料(上海碧云天生物科技有限公司)。木犀草素、咖啡酸(赫贝思生物科技有限公司)。吉非替尼、尼群地平、维拉帕米、坦索罗辛(南京安格医药化工有限公司)。蒲公英(陕西西安医药市场)。
2.CMMGO的制备
2.1CMMGO的制备
采用溶剂热法制备MGO：首先，85mg GO加入65mL EG超声1h。然后加入0.32gFeCl3·6H2O添加到上述溶液，进一步超声10min，然后加入300mg NaAC搅拌30min。随后转移转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，200℃反应6h。合成的MGO纳米复合材料用甲醇和水进行多次洗涤，磁性分离，60℃真空干燥。
在稳定高表达EGFR的HEK293细胞株基础上，通过细胞膜制备，得到EGFR/HEK293细胞膜制剂。具体方法如下：选取已贴满瓶壁的EGFR/HEK293细胞，对细胞计数，当细胞数目不低于107时，用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液。将细胞悬液于4℃、1000g离心10min，去除上清的培养液，沉淀即为EGFR/HEK293细胞。加入生理盐水洗去细胞表面残留的培养基，于4℃、1000g离心10min，弃上清。向得到的细胞沉淀中加入5mL预冷的Tris-HCl低渗缓冲溶液，放置于超声仪内，冰浴超声30min破碎细胞。然后将混悬液于4℃条件下2000g离心10min，此时细胞膜悬浮于上清液，吸取上清液转移到另外一只离心管中，4℃条件下12000g离心20min，得到的沉淀即为细胞膜，将沉淀用生理盐水重悬得到浓度为8mg/mL的高表达EGFR的细胞膜混悬液。
将MGO与细胞膜悬浮液在4℃真空下超声混合5min，即可制备CMMGO。细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为8：5。
以相同方法不加细胞膜制备NMMGO，包被无EGFR高表达的HEK293细胞膜制备HMMGO。
3.CMMGO的吸附性能考察
将得到的含有固定化CM的CMMGO进行配体捕获实验，评价其选择性。为了评价其选择性，选择了四种作用于不同受体的药物进行实验，包括已知的选择性EGFR拮抗剂(吉非替尼)和非结合剂(尼群地平、维拉帕米、坦索罗辛)。将5mg CMMGO、NMMGO或HMMGO分别加入100mg L-1吉非替尼、尼群地平、维拉帕米和坦索罗辛(阴性药物)溶液中超声分散后在4℃恒温摇床上孵育10min。上述吸附过程完成后，用外加磁场将吸附化合物的材料从混合物中分离出来，用水-异丙醇洗脱(9:1,v/v,1mL)，再用水-异丙醇洗脱(5:5,v/v,1mL)。采用高效液相色谱法对所有溶液进行检测。用式(1)计算吸附容量。
吸附容量(Q)根据下式计算可得：
Figure BDA0002567622710000081
其中Q(mg g-1)是吸附剂对吉非替尼的吸附量，Co,Ce(mg L-1)分别是吉非替尼初始浓度与吸附后上清液中残余浓度，V(mL)是初始溶液的体积，m(mg)是吸附剂质量。
为了评价CMMGO对目标化合物的吸附性能，通过静态、动态和选择性吸附实验研究其吸附特性。以下所有实验均分为一式三份进行。
静态吸附实验中，分别将5mg CMMGO、NMMGO、HMMGO加入不同浓度(4-1000mg L-1)的吉非替尼溶液(1mL)中。吸附过程结束后，对吸附剂进行磁分离，采用高效液相色谱法测定上清液中吉非替尼的残留量。
吸附动力学实验中，将吸附剂加入1mL吉非替尼溶液(100mg L-1)进行孵育。采用高效液相色谱法测定上清液中吉非替尼在吸附一定时间后(1s-30min)的残留量。
4.CMMGO的实际应用
为了筛选潜在的活性先导物，首先用20mL 5％甲酸甲醇溶液超声提取干燥蒲公英粉末20min。将1g干燥蒲公英磨成粉末，用20mL 5％甲酸甲醇溶液超声提取20min，浓缩成深棕色浸膏。以CMMGO为吸附剂进行潜在活性组分筛选。将浓缩后的提取物溶解于1mL蒸馏水中，与5mg CMMGO在摇床中孵育10min，然后在外加磁场下快速分离洗脱，收集洗脱液。蒸发干燥后，用甲醇溶解，采用高效液相色谱法进行分析。
二、实验结果
1.CMMGO的制备
CM涂层可以保留整个细胞表面的成分，使纳米材料具有源细胞的固有特性和功能。CM涂层利用EGFR/HEK293细胞表面的靶蛋白EGFR，成为一种提高纳米材料特异性识别和结合的新方法。
作为一种生物活性化合物筛选材料，CMMGO应该具有优异的选择性。对CM的用量、吸附率、制备时间等几个关键的制备因素进行了***的优化。如图1中A所示，当CM的量从1mg增加到12mg时，CM对MGO的结合量有明显的增加。同时，随着CM的增加，CM的吸附率从99.4％下降到59.0％。此外，对制备时间进行了考察，从图1中B可以看出，随着孵育时间的延长，CM的结合量增加，并在5min达到平衡。因此，细胞膜的最佳用量为8mg，最佳制备时间5min。
2.CMCNTs@ephrinb2的表征
用透射电子显微镜和扫描电子显微镜对GO、MGO和CMMGO的表面结构进行了表征。如图2中(A)、(B)与(C)所示，GO呈现出褶皱的薄片，是其特有的结构。此外，MGO中磁球均匀地接枝在GO表面，表明MGO制备成功。在CM涂层后，CMMGO的透明度低于MGO纳米片，说明CM成功地包覆在MGO表面。从SEM图(图2中(D)、(E)与(F))可以看出，CM涂层后，CMMGO膜表面粗糙，这与TEM结果一致。此外，为了验证CM在MGO表面的包覆，用DiI标记CM，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)进行表征。结果如图3所示，图3中，(A)与(D)分别为MGO与CMMGO在明场下的图，(B)和(E)为分别为MGO与CMMGO在549nm激发光波长下的荧光图，(C)与(F)分别是(A)与(B)以及(D)与(E)的重合图。可以看出CMMGO存在明显的红色膜磷脂，而MGO中几乎没有检测到红色荧光，说明细胞膜在MGO表面成功包覆。
接下来通过振动样品磁强计(VSM)对Fe3O4、MGO和CMMGO的磁性进行了表征。结果如图4所示，MGO改性和CM涂层后，CMMGO的饱和磁化强度值降低。结果表明，CMMGO材料具有良好的磁性能，为CMMGO的快速隔离提供了条件。
3.吸附性能考察
为了评价CMMGO的吸附能力，进行了等温线吸附实验。如图5中A所示，随着吉非替尼浓度的增加，CMMGO的吸附量迅速增加，并在88.8mg mL-1达到饱和。此外，CMMGO的吸附能力明显高于NMMGO和HMMGO，说明CMMGO的特异性受体数量较多，而NMMGO和HMMGO的非特异性吸附占主导地位。
通过吸附动力学实验对CMMGO的吸附效率进行了评价。如图5中B所示，CMMGO吸附速率在10min内较快，随后逐渐减慢，直至达到平衡。虽然NMMGO和HMMGO的动力学吸附曲线相似，但它们的吸附量远远低于CMMGO。说明吉非替尼在CMMGO上吸附速度快，有利于在实际应用中快速捕获活性化合物
此外，CMMGO的高选择性对配体捕获的应用具有重要意义。图5中C为CMMGO、NMMGO、HMMGO的选择性吸附结果。结果表明NMMGO和HMMGO对不同的药物吸附能力无显著差异，而CMMGO对吉非替尼的吸附量远远高于其他药物。这些结果表明CMMGO对与EGFR能够相互作用的药物具有较好的选择性。
4.萃取条件优化
为了获得最佳萃取效果，对配体捕获过程中合适的洗脱剂、洗脱量和洗脱时间进行了优化。所有实验均为一式三份。
在捕获过程中，淋洗液的选择至关重要。为了得到最佳的效率，对水(a)、PBS(b)、水-甲醇(9:1,v/v,c)、水-甲醇(5:5,v/v,d)、水-异丙醇(9:1,v/v,e)、水-异丙醇(5:5,v/v,f)5种溶液进行了研究。根据溶液类型的不同，吉非替尼的解吸率存在显著差异。从图6中A可以看出，水-异丙醇(9:1,v/v)仅对NMMGO具有良好的解吸能力，但水-异丙醇(5:5,v/v)对CMMGO与NMMGO均具有较高的解吸能力。因此，选择水-异丙醇(9:1,v/v)和水-异丙醇(5:5,v/v)分别作为淋洗液和洗脱液。
此外，洗脱体积和时间也会影响捕获效率。体积优化结果如图6中B所示，当洗脱体积在0.5-5mL内增加时，回收率增加。当洗脱量超过2mL时，回收率达到稳定值。进一步通过考察不同时间的回收率，确定最佳洗脱时间。从图6中C可以看出，当洗脱时间超过5min时，回收率最大，且几乎保持不变。因此，选择洗脱体积2mL和洗脱时间5min进行后续实验。
5.实际应用
尽管过去几十年在药物筛选方法方面做出了前所未有的努力并取得了进展，但筛选有前途的药物先导物仍然是一个复杂、昂贵和耗时的过程。在此背景下，CM仿生技术通过模拟体内环境和快速分离检测，成为一种很有前途的特异筛选潜在化合物方法。
以蒲公英为例，用CMMGO对其提取物进行提取，如图7中(B)所示，洗脱色谱(曲线d)中出现两个强峰，可能是CMMGO富集的潜在活性成分。经TOFMS分析，确定峰1为木犀草素(图7中(A)),FENG峰2为咖啡酸(图7中(C))。这些结果得到了相应标准溶液的进一步证实。
实施例2
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法为：采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
其中，采用溶剂热法制备磁性石墨烯；将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，450W下超声4min，再加入NaAC搅拌均匀，最后在180℃下进行水热反应7h，得到磁性石墨烯；GO、EG与FeCl3·6H2O的比为90mg：60mL：0.3g：300mg。
细胞膜通过以下过程制得：
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰的具体过程为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为10mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为8：5。
实施例3
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法为：采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
其中，采用溶剂热法制备磁性石墨烯；将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，450W下超声5min，再加入NaAC搅拌均匀，最后在200℃下进行水热反应6h，得到磁性石墨烯；GO、EG与FeCl3·6H2O的比为85mg：65mL：0.3g：300mg。
细胞膜通过以下过程制得：
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰的具体过程为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为12mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为9：5。
实施例4
一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法为：采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
其中，采用溶剂热法制备磁性石墨烯；将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，450W下超声6min，再加入NaAC搅拌均匀，最后在220℃下进行水热反应5h，得到磁性石墨烯；GO、EG与FeCl3·6H2O的比为80mg：70mL：0.4g：300mg。
细胞膜通过以下过程制得：
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰的具体过程为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为8mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为12：5。
本发明利用EGFR高表达HEK293细胞膜成功地制备了一种多功能的石墨烯基生物复合材料。与传统的功能化方法相比，这种方法避免了繁琐的步骤，并保留了源细胞的完整表面性能。吸附实验表明，所得的CMMGO具有良好的结合能力和选择性，对药物先导物的捕获具有重要意义。最后，利用表面包覆的CM的特异性，从蒲公英中筛选得到两种潜在活性组分木犀草素和咖啡因。综上所述，细胞膜仿生策略有望使基于石墨烯的生物复合材料实现多方面的、有效的、选择性的配体结合。

Claims (10)

1.一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
2.根据权利要求1所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，采用溶剂热法制备磁性石墨烯。
3.根据权利要求1或2所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，将GO加入到EG中进行超声，然后加入FeCl3·6H2O，超声，再加入NaAC搅拌均匀，最后进行水热反应，得到磁性石墨烯。
4.根据权利要求3所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，水热反应的温度180-220℃，时间为5-7h；GO、EG与FeCl3·6H2O的比为80-90mg：60-70mL：0.3-0.4g：300mg。
5.根据权利要求1所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，细胞膜通过以下过程制得：
对EGFR/HEK293细胞计数，当细胞数目不低于107时，采用胰蛋白酶消化液消化，得到细胞悬液；将细胞悬液于4℃下离心，沉淀即为EGFR/HEK293细胞；向得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲溶液，然后破碎细胞，得到混悬液；然后将混悬液于4℃条件下离心，吸取上清液转移到离心管中，4℃条件下离心，得到的沉淀为细胞膜。
6.根据权利要求1所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，采用细胞膜对磁性石墨烯进行仿生修饰的具体过程为：将细胞膜用生理盐水重悬得到高表达EGFR的细胞膜混悬液，将磁性石墨烯与细胞膜混悬液在4℃下混合均匀，得到细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料；其中，高表达EGFR的细胞膜混悬液的浓度为8-12mg/mL，细胞膜混悬液中细胞膜与磁性石墨烯的质量比为(8-12)：5。
7.根据权利要求1所述的一种细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料的制备方法，其特征在于，混合时采用超声进行，超声的功率为450W，时间为4-6min。
8.一种根据权利要求1-7中任意一项所述方法制备的细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料。
9.一种如权利要求8所述的细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料在中药中靶向细胞膜受体的药物先导物发现中的应用。
10.一种如权利要求8所述的细胞膜磁性石墨烯药物筛选材料在中药中活性成分的发现和富集中的应用。
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