CN104926829A - 一种噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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方增军
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Abstract

本发明公开了一种噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法和应用，噻吩并嘧啶类衍生物是具有通式Ⅰ所示结构的化合物及其药学上可接受的盐、酯或前药，本发明还提供了化合物的制备方法，以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。

Description

一种噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种噻吩并嘧啶衍生物及其制备方法以及作为HIV-1抑制剂的应用。
背景技术
艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病，其主要病原体是人免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)。尽管高效抗逆转录疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)的实施显著延长患者的生存时间，但是耐药问题和药物毒副作用以及长期服用药物的费用等问题，迫使研究者研发高效低毒的新型HIV抑制剂。HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是HAART疗法的重要组成部分，该类药物具有高效低毒、特异性强的优点，然而易产生耐药性的缺陷使该类药物迅速丧失临床效价，因此新型、高效、低毒、广谱抗耐药性的NNRTIs的研发是目前抗HIV药物研究的热点之一。
二芳基嘧啶(diarylpyrimidine,DAPY)类是一类典型的HIV-1NNRTIs，具有较强的抗HIV活性，对耐药突变毒株也有很好的抑制作用。该类药物中依曲韦林(Etravirine)和利匹韦林(Rilpivirine)已经上市，但该类化合物水溶性较差，口服生物利用度较低，因此将该类化学结构进行进一步修饰，对发现广谱高效、生物利用度好且具有自主知识产权的新型抗HIV药物具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法，本发明还提供了噻吩并嘧啶类衍生物作为HIV-1抑制剂的应用。
本发明的技术方案如下：
1.噻吩并嘧啶类衍生物
一种噻吩并嘧啶类衍生物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有通式I所示的结构：
其中，虚线代表A与B之间为双键、B与D之间为双键、A与B之间为单键或者B与D之间为单键之中的一种；
A为：S或者C(U)；
B为：S或者C(V)；
D为：S或者C(W)；
并且A，B和D有且只有一个为S；
其中U，V和W各自独立的为：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，C3-C6环烷基，O C3-C6环烷基，苯基，苄基，三氟甲基，氨基，羟基，各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环；
Z为：F，F2，OH，COOH，CONH2，COOC2H5；
X为：O，NH或者S之中的一种；
R1，R2，R3各自独立的为：H，卤素，氰基，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，三氟甲基，氨基，羟基氰基乙烯基；
Ar为：取代苯环、取代萘环、各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环。
优选的，Ar为具有通式(a)或者通式(b)的取代苯环：
其中，R4为H，CH3，COCH3，COOCH3，COOC2H5，COOH，SO2CH3或SO2CF3；R5为Cl，Br，Me，NHCH3，NHCOCH3，NHSO2CH3或NHSO2CF3。
本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。
本发明中所述的“前药”是指药学上可接受的衍生物，以便这些衍生物所得的生物转换产物是如式I化合物所定义的活性药物。
本发明更为详细的，噻吩并嘧啶类化合物的结构式为下列之一：
其中，R，U，V，W，Z和Ar同上通式I所述。
进一步优选的，化合物IA-1，IA-2，IA-3，IA-4，IA-5，IB-1，IB-2，IB-3，IB-4，IB-5和IC-1，IC-2，IC-3，IC-4，IC-5中，Ar为通式(a)或通式(b)。
本发明更为详细的，噻吩并嘧啶类衍生物为如下具体化合物之一：
2.噻吩并嘧啶类衍生物的制备方法
噻吩并嘧啶衍生物的制备方法，步骤如下：以2,4-二氯取代的噻吩并嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与取代苯酚、苯硫醇或苯胺发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2在二甲基亚砜中与N-Boc-4-氨基哌啶反应并随后在三氟乙酸条件下脱Boc基团保护生成关键中间体4；或者中间体2发生布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)偶联反应生成中间体3然后脱BOC保护得到中间体4；最后此关键中间体4在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸钾做碱的条件下，与各种取代氯苄或溴苄反应生成目标产物；合成路线如下：
试剂及条件:(i)取代苯酚、苯胺或者苯基硫醇，二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)N-Boc-4-氨基哌啶，二甲基亚砜，碳酸钾，120℃；(iii)N-Boc-4-氨基哌啶，醋酸钯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽，碳酸铯，90℃，二氧六环；(iv)二氯甲烷，三氟乙酸，室温；(v)取代氯苄或溴苄，二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温。
所述的取代苯酚、苯硫醇或苯胺为均三甲基苯酚，2,6-二甲基-4-氰基苯酚，2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯酚，均三甲基苯基硫醇，2,6-二甲基-4-氰基苯基硫醇，2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯基硫醇，均三甲基苯胺，2,6-二甲基-4-氰基苯胺，2,6-二甲基-4-(E)-氰基乙烯基苯胺；
取代氯苄或溴苄为邻氯氯苄、间氯氯苄、对氯氯苄、邻溴溴苄、间溴溴苄、对溴溴苄、邻氟氯苄、间氟氯苄、对氟氯苄、2,4-二氟溴苄、3,4-二氟溴苄、邻氰基氯苄、间氰基氯苄、对氰基氯苄、邻硝基氯苄、间硝基氯苄、对硝基氯苄、邻甲氧基氯苄、间甲氧基氯苄、对甲氧基氯苄、对甲磺酰基溴苄、对磺酰胺基溴苄、对甲酰胺基溴苄、4-(溴甲基)苯甲酸甲酯。
本发明所述的室温为20-30℃。
3.噻吩并嘧啶类衍生物的抗HIV-1野生株及突变株活性及应用
对按照上述方法合成的部分噻吩并嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(IIIB)，单耐药突变株K103N、Y181C、Y188L以及双耐药突变株RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，以奈韦拉平(NVP)、依法韦伦(EFV)、依曲韦林(ETV)和齐多夫定(AZT)为阳性对照。它们的抗HIV-1活性和毒性数据分别列于表1和表2中。
由表1可以看出，本发明的噻吩并嘧啶衍生物是一系列结构新颖的非核苷类HIV-1抑制剂，表现出了极强的抗HIV-1野生株和突变株活性。绝大部分化合物抑制野生株和突变株的EC50值达到了纳摩尔级别，其中，化合物IA-1-2的活性尤为突出，其对HIV-1野生株的EC50值是第一代抗艾滋病药物奈韦拉平(NVP)的150倍以上，是最新一代药物依曲韦林(ETV)的2倍以上。化合物IA-1-2亦表现出了极高的安全性，其对HIV-1野生株的选择性指数大于100000，远远高于上市药物。对单突变株K103N和Y181C,化合物IA-1-2表现出了与依曲韦林相当的抑制活性，对于单突变株Y188L,其抑制活性远远高出依曲韦林，为其抑制活性的3倍以上。另外，化合物IA-1-2的细胞毒性远小于阳性药物(表2)，导致该化合物表现出非常高的选择性。因此该类噻吩并嘧啶类化合物具有进一步研究与开发的价值，可作为抗HIV的先导化合物加以利用。
本发明的噻吩并嘧啶衍生物可作为非核苷类HIV-1抑制剂应用。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的噻吩并嘧啶衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明提供了结构全新的噻吩并嘧啶类衍生物、其制备方法、其抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的噻吩并嘧啶类衍生物可作为HIV-1抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
具体实施方式
通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
实施例中所涉及的合成路线如下：
合成路线一：
合成路线二：
实施例1：4-((2-(哌啶-4-胺)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(10)的制备
称取4-羟基-3,5-二甲基苯腈(0.15g,1mmol)和碳酸钾(0.17g,1.2mmol)于5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(0.21g,1mmol)继续室温搅拌2h(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入25mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，得到白色固体即为化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈，收率93.8％，熔点258-260℃。
称取化合物4-((2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(0.32g,1.0mmol)，N-Boc-4-氨基哌啶(0.24g,1.2mmol)与碳酸钾(0.28g,2mmol)于5mL的二甲基亚砜中，然后加热回流12小时。待反应冷却到室温以后，慢慢地将反应液滴加到20mL水溶液中，搅拌，有大量的黄色固体生成。过滤，干燥得粗品4-((2-(1-Boc-哌啶-4-胺)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈。称取该粗品(0.60g,1.21mmol)溶于4mL二氯甲烷中，然后慢慢地向其中加入三氟乙酸(0.74mL,10mmol)，室温条件下搅拌6小时(TLC检测反应完毕)。向反应液中加入10mL水，用饱和的碳酸氢钠水溶液调PH为9，二氯甲烷萃取(3×5mL)，饱和食盐水水洗，分取有机层，无水硫酸钠干燥。然后进行快速柱层析分离得到白色固体即为化合物4-((2-(哌啶-4-胺)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈。收率84.2％，熔点114-116℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.20(d,1H,J＝5.4Hz,),7.72(s,1H),7.26(s,1H),6.92(s,br,1H),3.78(s,br,1H),2.89(s,br,2H),2.12(s.6H),1.74(m,2H),1.23(m,4H).ESI-MS:m/z 380.5(M+1)C20H21N5OS(379.15).
实施例2：2-(哌啶-4-胺)-4-(2,4,6-三甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶(13)的制备
操作步骤同实施例1，所不同的是起始原料用的是2,4,6-三甲基苯酚。
产物为白色固体。收率87.5％，178-180℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.73(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.19(d,1H,J＝5.3Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),4.89(d,1H,J＝7.4Hz,NH),3.77(s,1H,NH),3.20(d,2H,J＝12.6Hz),2.74-2.76(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),2.04-2.09(m,9H),1.46-1.54(m,2H).ESI-MS:m/z 369.5(M+1)C20H24N4OS(368.17)
实施例3：化合物IA-1的制备
称取化合物4-((2-(哌啶-4-胺)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(10)(0.5mmol)于10mLDMF中，室温条件下搅拌溶解后加入无水碳酸钾(0.14g,1.0mmol)与取代的氯苄或溴苄(0.6mmol)，室温条件下搅拌12h(TLC检测反应完毕)。减压蒸出溶剂，然后向残留底物中加入30ml乙酸乙酯，饱和食盐水溶液洗涤3次，每次10mL，分取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。快速柱层析分离得到目标化合物，进而在乙酸乙酯-石油醚体系中重结晶得到目标化合物IA-1。
以不同的取代苄基和4-((2-(哌啶-4-胺)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基苯腈(10)用上述方法分别制得化合物IA-1-1～IA-1-12的目标产物，部分结果如下：
操作同上，所不同的是使用4-甲砜基溴苄。
产物为白色固体，收率：52.4％，熔点＞300℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.18(d,1H,J＝5.3Hz),7.86(d,2H,J＝8.2Hz),7.71(s,2H),7.54(d,2H,J＝8.2Hz),7.24(s,1H),6.88(s,1H),4.02(d,1H,J＝7.2Hz),3.17-3.19(m,7H),2.71(s,2H),2.10(s,6H),1.38-1.44(m,2H),1.14-1.19(m,2H).ESI-MS:m/z 548.4(M+1),570.5(M+Na).C28H29N5O3S2(547.69)。
操作同上，所不同的是使用对溴甲基苯磺酰胺。
产物为白色固体，收率：50.3％，熔点223-225℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.18(d,1H,J＝5.3Hz),7.76(d,2H,J＝8.3Hz),7.72(s,2H),7.45(d,2H,J＝8.2Hz),7.29(s,2H),7.25(s,1H),6.87(s,1H),4.02(d,1H,J＝7.2Hz),3.48(s,2H),2.72(s,2H),2.10(s,6H),1.69-1.79(m,2H),1.39-1.44(m,2H),1.16-1.19(m,2H).ESI-MS:m/z 549.5(M+1),C27H28N6O3S2(548.50)。
操作同上，所不同的是使用对氟溴苄。
产物为白色固体，收率：61.8％，熔点＞300℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.34(d,1H,J＝5.3Hz),8.20(d,2H,J＝8.3Hz),7.72(s,1H),7.35(d,2H,J＝8.2Hz),7.28(s,2H),4.03(d,1H,J＝7.2Hz),3.47(s,2H),2.72(s,2H),2.12(s,6H),1.72-1.76(m,2H),1.39-1.43(m,2H),1.15-1.18(m,2H).ESI-MS:m/z 488.5(M+1),C27H26FN5OS(487.59)。
操作同上，所不同的是使用4-氯甲基吡啶盐酸盐。
产物为白色固体，收率：51.3％，熔点154-156℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.48(d,1H,J＝5.3Hz),8.20(d,2H,J＝8.3Hz),7.72(s,1H),7.57(d,2H,J＝8.2Hz),7.28(s,2H),4.02(d,1H,J＝7.2Hz),3.48(s,2H),2.73(s,2H),2.12(s,6H),1.70-1.76(m,2H),1.37-1.43(m,2H),1.17-1.18(m,2H).ESI-MS:m/z 471.5(M+1),C26H26N6OS(470.59)。
操作同上，所不同的是使用2,4-二氟溴苄。
产物为白色固体，收率：55.7％，熔点＞300℃。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.20(d,1H,J＝5.4Hz),7.67-7.70(m,2H),7.39(d,1H,J＝6.4Hz),7.24(m,1H),7.14(td,1H,J＝10.2,2.5Hz),7.02(td,1H,J＝8.4,2.1Hz),6.89(s,1H),4.13-4.15(m,1H),3.45(s,2H),2.74(s,2H),2.11(s,6H),1.33-1.84(m,2H),1.35-1.42(m,4H).ESI-MS:m/z 506.3(M+1),C27H25F2N5OS(505.17)。
操作同上，所不同的是使用对甲磺酰基氯苄。
产物为白色固体，收率：57.4％，熔点92-95℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.87(d,2H,J＝8.3Hz,C3,C5-Ph’-H),7.70(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.53(d,2H,J＝8.1Hz,C2,C6-Ph’-H),7.16(d,1H,J＝5.4Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),5.02(s,1H,NH),3.58(s,2H,N-CH2),3.06(s,3H,SO2-CH3),2.74-2.76(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),1.93-2.09(m,11H),1.42-1.51(m,2H).ESI-MS:m/z 537.6(M+1),559.5(M+Na),C28H32N4O3S2(536.19)。
操作同上，所不同的是使用对溴甲基苯甲酸甲酯。
产物为白色固体，收率：52.7％，熔点97-100℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.97(d,2H,J＝8.2Hz,C3,C5-Ph’-H),7.70(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.39(d,2H,J＝8.1Hz,C2,C6-Ph’-H),7.17(d,1H,J＝5.6Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),5.10(s,1H,NH),3.53(s,2H,N-CH2),2.73-2.76(m,2H),2.31(s,3H,CO2-CH3),1.91-2.09(m,14H),1.41-1.49(m,2H).ESI-MS:m/z517.6(M+1),533.5(M+Na),C29H32N4O3S(516.22)
操作同上，所不同的是使用4-氟溴苄。
产物为白色固体，收率：65.3％，熔点133-136℃
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.71(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.29(m,2H),7.17(d,1H,J＝5.4Hz,C7-thienopyrimidine-H),7.02(t,2H,J＝8.6Hz),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),4.86(s,1H,NH),3.50(s,2H,N-CH2),2.73-2.78(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),1.94-2.09(m,11H),1.40-1.51(m,2H).ESI-MS:m/z 477.5(M+1),C27H29FN4OS(476.20)。
操作同上，所不同的是使用3-氟溴苄。
产物为白色固体，收率：63.1％，熔点140-142℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.68(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.37(t,1H,J＝6.1Hz,C5-Ph’-H),7.22(t,1H,J＝6.0Hz,C4-Ph’-H),7.17(d,1H,J＝5.3Hz,C7-thienopyrimidine-H),7.10(t,1H,J＝7.4Hz,C6-Ph’-H),7.03(t,1H,J＝9.5Hz,C2-Ph’-H),6.88(s,2H,C3,C5-Ph”-H),5.05(s,1H,NH),3.57(s,2H,N-CH2),2.78-2.80(m,2H),2.31(s,3H,C4-Ph”-CH3),1.92-2.08(m,11H),1.41-1.48(m,2H).ESI-MS:m/z 477.5(M+1),C27H29FN4OS(476.20)。
操作同上，所不同的是使用3-氰基溴苄。
产物为白色固体，收率：63.1％，熔点99-102℃
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.72(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.64(s,1H,C2-Ph’-H),7.58(t,2H,J＝9.0Hz,C4-Ph’-H),7.44(t,1H,J＝7.7Hz,C5-Ph’-H),7.17(d,1H,J＝5.3Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),5.14(s,1H,NH),3.51(s,2H,N-CH2),2.72-2.75(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),2.09(s,9H),2.93(s,2H),1.42-1.50(m,2H).ESI-MS:m/z 484.6(M+1),506.5(M+Na),C28H29N5OS(483.21)。
操作同上，所不同的是使用4-氯甲基吡啶盐酸盐。
产物为白色固体，收率：50.7％，熔点135-137℃
1H NMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:8.54(d,2H,J＝5.9Hz,C2,C6-pyridine-H),7.71(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.28(d,2H,J＝6.6Hz,C3,C5-pyridine-H),7.18(d,1H,J＝5.4Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),4.86(s,1H,NH),3.50(s,2H,N-CH2),2.74-2.77(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),1.95-2.09(m,11H),1.44-1.52(m,2H).ESI-MS:m/z 460.6(M+1),482.6(M+Na),C26H29N5OS(459.21)。
操作同上，所不同的是使用2,4-二氟溴苄。
产物为白色固体，收率：59.6％，熔点110-112℃.
1HNMR(400MHz,CDCl3-d6,ppm)δ:7.70(d,1H,J＝5.4Hz,C6-thienopyrimidine-H),7.36(dd,1H,J1＝15.1Hz,J2＝8.3Hz C5-Ph’-H),7.17(d,1H,J＝5.3Hz,C7-thienopyrimidine-H),6.90(s,2H,C3,C5-Ph”-H),6.75-6.85(m,2H),4.89(d,1H,J＝7.3Hz,NH),3.52(s,2H,N-CH2),2.75-2.78(m,2H),2.32(s,3H,C4-Ph”-CH3),2.09-2.17(m,9H),1.93-1.95(m,2H),1.39-1.47(m,2H).ESI-MS:m/z 495.5(M+1),517.6(M+Na),C27H28F2N4OS(494.20)。
实施例4：目标化合物的体外抗HIV活性测试
测试原理
化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑蓝),可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度(A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC50)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC50),计算出选择系数(selectivity index，SI＝CC50/EC50)。
测试材料和方法
(1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)毒株、各种HIV-1耐药株：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究所提供。
(2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究院提供。
(3)MTT：购自美国Sigma公司。
(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
(5)阳性对照药：奈韦拉平(NVP)、依法韦仑(EFV)、依曲韦林(TMC125)、齐多夫定(AZT)。
(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度(A)值,计算出EC50，CC50以及SI。
(7)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液(5mg/ML)20μL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶标仪中测定590nm下的吸光度(A)值。
实验方法
在96孔细胞培养板上，加入50μL含1×104MT-4细胞培养液，再分别加入20μL感染HIV-1(IIIB或者RES056)或HIV-2(ROD)的MT-4细胞混悬液(每毫升含100倍CCID50)或者空白培养基(毒性测定)，然后加入不同浓度的待测化合物溶液或者阳性对照药物，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5％CO2氛围，37℃下培养5天，向每个孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2小时，然后加入DMSO，使用酶标仪测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P％。同时设空白和药物对照组和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度(EC50)。选择指数的计算：SI＝CC50/EC50。
按照上述实验方法对合成的部分噻吩并嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗HIV-1(IIIB)，单突变株K103N、Y181C、Y188L以及双突变株RES056(K103N/Y181C)的活性筛选，活性结果如表1所示。
表1部分IA系列化合物和参考药物的结构及其抗HIV-1活性(MT-4细胞)
注：aEC50:保护50％感染HIV-1的MT-4细胞免于细胞病变的化合物浓度；A代表化合物EC50<10nM，B代表化合物EC50值为10-100nM，C代表化合物EC50>100nM；NVP、EFV、ETV、AZT分别代表上市药物奈韦拉平、依法韦伦、依曲韦林和齐多夫定。
表2部分IA系列化合物及参考药物的细胞毒性及选择指数(MT-4细胞)
注：aCC50:使得50％的MTT细胞发生病变时的药物浓度；A代表化合物SI>10000，B代表化合物SI值为1000-10000，C代表化合物SI<1000；X1：SI≥1或者<1；NVP、EFV、ETV、AZT分别代表上市药物奈韦拉平、依法韦伦、依曲韦林和齐多夫定。

Claims (7)

1.一种噻吩并嘧啶类衍生物，或其药学上可接受的盐、酯或前药，其特征在于，具有通式I所示的结构：
其中，虚线代表A与B之间为双键、B与D之间为双键、A与B之间为单键或者B与D之间为单键之中的一种；
A为：S或者C(U)；
B为：S或者C(V)；
D为：S或者C(W)；
并且A，B和D有且只有一个为S；
其中U，V和W各自独立的为：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，C3-C6环烷基，O C3-C6环烷基，苯基，苄基，三氟甲基，氨基，羟基，各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环；
Z为：F，F2，OH，COOH，CONH2，COOC2H5；
X为：O，NH或者S之中的一种；
R1，R2，R3各自独立的为：H，卤素，氰基，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，三氟甲基，氨基，羟基氰基乙烯基；
Ar为：取代苯环、取代萘环、各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环。
2.权利要求1所述的化合物，其特征在于，通式I中的Ar为具有通式(a)或者通式(b)的取代苯环：
其中，R4为H，CH3，COCH3，COOCH3，COOC2H5，COOH，SO2CH3或SO2CF3；R5为Cl，Br，Me，NHCH3，NHCOCH3，NHSO2CH3或NHSO2CF3。
3.权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，结构式为下列之一：
其中，R，U，V，W，Z和Ar同上通式I所述。
4.权利要求3所述的化合物，其特征在于，为如下具体化合物之一：
5.权利要求1所述的化合物的制备方法，步骤如下：以2,4-二氯取代的噻吩并嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与取代苯酚、苯硫醇或苯胺发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2在二甲基亚砜中与N-Boc-4-氨基哌啶反应并随后在三氟乙酸条件下脱Boc基团保护生成关键中间体4；或者中间体2发生布赫瓦尔德-哈特维希偶联反应生成中间体3然后脱BOC保护得到中间体4；最后此关键中间体4在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸钾做碱的条件下，与各种取代氯苄或溴苄反应生成目标产物；合成路线如下：
试剂及条件:(i)取代苯酚、苯胺或者苯基硫醇，二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；(ii)N-Boc-4-氨基哌啶，二甲基亚砜，碳酸钾，120℃；(iii)N-Boc-4-氨基哌啶，醋酸钯，4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽，碳酸铯，90℃，二氧六环；(iv)二氯甲烷，三氟乙酸，室温；(v)取代氯苄或溴苄，二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温。
6.一种如权利要求1-4任一项所述化合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒药物中的应用。
7.一种药物组合物，包含权利要求1-4任一项所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
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