CN102144557A - 通过植物组织培养黄金宝树进行优良植物体的诱导、继代增殖培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过植物组织培养黄金宝树进行优良植物体的诱导、继代增殖培养的方法，诱导培养和大规模培养两个阶段采用了两种不同的培养基，诱导培养基为：MS培养基+蔗糖10-50g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，pH值为5.0-7.0；大规模培养的培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L，pH值为5.0-7.0。本发明的方法易操作，生产成本低，适合工厂化育苗，产量高，品质好，不污染环境，可以实现批量生产。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种通过植物组织培养生产，组织培养生产黄金宝树诱导和继代增殖培养的方法。
背景技术
黄金宝树(Melaleuca bracteata)又称千层金，系桃金娘科白干层属常绿乔木。是一种以观叶为主的彩叶树种主干直立，侧枝横展至下垂，嫩枝红色，老枝变灰，叶四季黄色，韧性很好，抗风力强，在海边生长势非常好。适合做行道树，分离岛景观，住宅区情景景观等。黄金宝树叶片经过摩擦还散发一种令人感觉非常舒服的清香，经专家验证其含有降低精神压力的元素，有一定药用价值。这种芳香油是目前世界上珍贵的化妆品香料之一。黄金宝树适应土质的范围也非常广，从酸性到石灰岩土质甚至盐碱地都能适应。抗病虫能力强，既抗旱又抗涝，适宜水边生长，还能抗盐碱、抗强风。是沿海地区不可多得的优良的景观造林树种，目前最快捷有效且经济的方法是建立黄金宝树优良无性系组培快繁技术体系，以迅速提高黄金宝树生产力。
利用现代组织培养生物技术和先进的栽培技术，开展黄金宝树组培和规范化栽培技术研究，建立黄金宝树生产基地，不仅能大大加快繁殖速度，使种苗的质量均衡一致，更适合规范化管理，促进我国林业绿化产业逐步走向国际化和规范化，促进福建及我林业绿化事业的发展，具有显著的生态效益、经济效益和社会效益。因此，本研究具有良好的应用价值、广阔的市场前景、重他要理论价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种保持植物体本身优良药效，繁殖速度快，增殖倍数高的通过植物组织培养黄金宝树进行优良植物体的诱导、继代增殖培养的方法。
本发明的目的是这样实现的：通过植物组织培养对黄金宝树进行优良植物体的诱导和继代增殖培养的方法，它包括如下步骤：
A、植物体的选择及无菌处理：
选择6-10月份生长的黄金宝树枝条，除去叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的黄金宝树小段组织。
B.丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的黄金宝树小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10-40天，培养温度：15-30℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：1000～2000lux lx；所述的诱导培养基为为MS培养基+蔗糖10-50g/L g/L+琼脂6-8g/L+活性炭1.0-3.0g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
C.大规模培养
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10-40天，培养温度：15-35℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：1000～2000lux；所述的大规模培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
作为本发明通过组织培养生产黄金宝树的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。
所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20-40天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：1500～2000lux；所述的诱导培养基为：为MS培养基+蔗糖10-50g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
所述的大规模培养：培养周期：20-50天，培养温度：20-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：1500～2000lux；所述的大规模培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0
mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L+，PH值为5.0-7.0。
植物体的无菌处理是本发明的重要技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤：
A)将选取的健壮无病虫害的黄金宝树植株，用自来水冲洗3-5小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内。
B)将除去了叶的茎段植物体用70-80％的酒精浸泡20-40秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净
C)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3-0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-6分钟，用无菌水冲洗4-5次，再转入0.1-0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D)无菌条件下将次氯酸钠消毒的茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的小段。
本发明的优点在于：通过植物组织培养，保持植物体的优良性状，保持植物优良的药物疗效，该方法易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现工厂化育苗。选用配方合理的诱导培养基，诱导出的丛生芽比例达到68％以上，通过两段培养的方式再生植株产量大幅度提高，和增殖倍数达到4倍以上。通过本发明方法生产黄金宝树，保持母株的优良性状，药效显著，不变异，产量高，成本低，周期短，极具市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明做进一步的说明。
实施例1：一种通过植物组织培养黄金宝树进行优良植物体的诱导、继代增殖培养的方法，包括如下步骤：
A.植物体的选择及无菌处理：
A)选择12月份生长的黄金宝树枝条，用自来水冲洗2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置操净工作台内；
B)将除去了叶的茎段植物体用70％的酒精浸泡30秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
C)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3％次氯酸钠溶液浸泡消毒10分钟，用无菌水冲洗5次，再转入0.1％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D)无菌条件下将消毒的茎段剪成1-1.5CM左右带茎节的黄金宝树小段；
b.丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的黄金宝树小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：35天，培养温度：28℃，光照培养时间：16小时/天，光照强度：1500-2000lux；所述的诱导培养基为为：MS培养基+蔗糖10-50g/L g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.5。
c.大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：60天，培养温度：28℃，光照培养时间：16小时/天，光照强度：1500-2000lux所述的大规模培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
实施例2：一种通过组织培养生产黄金宝树的方法，它包括如下步骤：
a.植物体的选择及无菌处理：
A.)选择9月份生长的黄金宝树枝条，用自来水冲2-3小时，用毛刷清洗干净，除去根和叶，再用蒸馏水冲洗，置操净工作台内；
B)将除去叶的茎段植物体用70％的酒精浸泡25秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；
C)将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.6％次氯酸钠溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗4次，再转入0.2％升汞溶液中灭菌4分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水；
D)无菌条件下将消毒的茎段剪成1CM左右带茎节的黄金宝树小段；
E)采用不同培养基并附加不同种类和浓度的细胞***素对诱导不定芽和萌芽率的影响
以MS、White、和B5为基本培养基，添加的糖和琼脂、和诱导的培养基一样分别附加不同种类和浓度的细胞***素(6-BA、NAA)；采用4因素3水平的正交设计L9(34)(见表1)，共9个处理，每处理接种10瓶，每瓶接1株苗，每处理重复3次，调查并统计不定芽数及萌芽率。
表1黄金宝树初代培养试验
试验过程中发现，高6-BA和高NAA的培养基上容易分化不定芽，平均不定芽数随着6-BA的浓度的升高而增加，适当增加NAA浓度，分化的不定芽增多，叶片伸展，生长茂盛。从表1的9种组合中可以看出，不定芽数和萌芽率均最高的为处理3，平均不定芽数为3.8个，平均萌芽率为72％；其次是处理6，其不定芽数达3.6个，但萌芽率为62％，低于处理2的68％；处理3和处理6的6-BA浓度均为3.0mg/L，高于处理2，但是处理3的NAA浓度高于处理6和处理2。
综合来看，可初步认为处理3为本试验的优选组合，利于不定芽的诱导生长。下面对平均不定芽数和萌芽率(反正弦变换)进行方差分析(见表2)。
由表2可知，基本培养基、6-BA、NAA对黄金宝树不定芽数、萌芽率的影响都是极显著的。由于培养基、6-BA、NAA呈显著差异，故对这三个因素进行LSD多重比较，结果表明，诱导不定芽分化基本培养基以水平1(即MS培养基)、6-BA和NAA以水平3为最佳。因此，黄金宝树初代培养诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L，能获得分化能力较强的不定芽。
表2方差分析表
B.丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的黄金宝树小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：40天，培养温度：25℃，光照培养时间：15小时/天，光照强度1500lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖10-50g/L g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.5。
C.大规模培养：
将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：30天，培养温度：25℃，光照培养时间：16小时/天，光照强度：1500lux所述的大规模培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/LL+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/LL+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L+，PH值为5.0-7.0。
实施例3：
采用MS培养基、改良MS培养基分别对经过无菌处理后的黄金宝树小段组织进行诱导丛生芽的培养试验，本实验重复三次，培养条件和实施例2相同，试验调查其黄金宝树的分化数、分化率、生长势。试验结果如下：
不同培养基和不同浓度激数对丛生芽的试验比较
注：+示颜色发黄，++示颜色略黄，+++示较好，++++示很好苗绿。
试验结果证明，本发明采用两种不同基本培养基和添加不同浓度的生长素进行的诱导培养基对无菌处理后的黄金宝树小段进行培养，通过三因素二水平方差分析认为：NAA对黄金宝树的腋芽诱导极显著6-BA×NAA的交付作用对腋芽的诱导存在显著性差异。6-BA的4个浓度水平中腋芽的诱导率较高，当6-BA浓度达到6.0时，NAA浓度的浓度达到2.0时，有利于腋芽的诱导，MS培养基苗的生长势较差，大部分苗的叶片发黄。在处理号5号的试验中黄金宝树腋芽的诱导有较好的效果。各处理诱导所得的芽在培养前20天仅见单芽，30天之后有丛芽出现。我们还发现，在改良的MS中硝酸钙对黄金宝树腋芽有促进生长的作用。最好增殖率达到4倍。生长势良好，叶片舒展苗绿。
实施例4：黄金宝树的生根和移栽
采用1/2ms为基本培养基，添加IAA、IBA、NAA三种激素进行生根诱导试验。培养条件跟实施例2相同，本试验接种20瓶，每瓶接10根苗，处理重复3次，调查统计每瓶有效生根数、生根情况。
从表4可见，在添加IAA、IBA、NAA三种类型激素的1号培养基中生根效果不理想，基部很多愈伤。而在2、3、4号的培养基中，分别添加IAA、IBA、NAA三种类型激素中的两种，发现NAA和IBA的组合生根效果较为理想，生根率较高，且根系较为粗壮；其中添加的IAA的培养基1、2号产生大量的愈伤，根系很细弱，不能进行正常的疏导营养物质的工作。结果不利于移栽成活。因此我们去除了IAA、单用IBA和NAA对生根培养基作了进一步的筛选，发现三种培养基的1、5、6号中，生根效果都比较好，但相对于低浓度的
移栽
将生根完整的试管苗放在自然光条件下培养一周左右，打开瓶盖，炼苗3天，然后取出幼苗，洗净基部，移入泥炭土：蛭石(1∶1)配置的营养土中，盖上薄膜进行保温保湿，15天后成活率为90％。
Claims (3)
1.通过植物组织培养对黄金宝树进行优良植物体的诱导和继代增殖培养的方法，它包括如下步骤：
1.1植物体的选择及无菌处理：
选择5-12月份生长的健壮无病虫害的黄金宝树枝条，除去叶进行数小时的流水清洗和无菌处理，将茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的小段组织；
1.2丛生芽诱导培养：
将经过无菌处理后的黄金宝树小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：10-60天，培养温度：15-30℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：0～2000lux；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖10-50g/Lg/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0；
1.3大规模培养：
将诱导的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：10-70天，培养温度：10-3℃，光照培养时间：0-24小时/天，光照强度：0～2000lux；所述的培养基为改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
2.如权利要求1所述的通过植物组织培养对黄金宝树进行优良植物体的诱导和继代增殖培养的方法，其特征在于：所述的丛生芽诱导培养：培养周期：20-50天，培养温度：15-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：1000～3000lux，所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖10-50g/L g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸0.1-5.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.01-5.0mg/L，PH值为5.0-7.0。所述的大规模培养条件：培养周期：20-50天，培养温度：15-30℃，光照培养时间：8-16小时/天，光照强度：1000～3000lux；所述的大规模培养基为：改良MS基本养基+硝酸钙600mg/L++蔗糖20-40g/L+琼脂6-8g/L+萘乙酸1.0-3.0mg/L、+6-苄氨基腺嘌呤1.0-4.0mg/L，PH值为5.0-7.0。
3.如权利要求1或2所述的通过植物组织培养对黄金宝树进行优良植物体的诱导和继代增殖培养的方法，其特征在于植物体的选择和无菌处理方法包括如下步骤：
A、将选取黄金宝树枝条，用自来水冲洗2-3小时，用毛刷清洗干净，除去叶，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；
B、将除去了叶的茎段植物用70-80％的酒精浸泡20-40秒进行表面灭菌，再用无菌水
清洗干净。
C、将经过酒精灭菌的茎段植物体用0.3-0.8％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-6分钟，用无菌水冲洗4-5次，再转入0.15％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用事先准备好的无菌水冲洗4-5次，再用滤纸吸干无菌水：
D、在无菌条件下将消毒好的茎段剪成0.5-1.5CM带茎节的小段。
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|---|---|
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN102893861A (zh) * | 2012-02-21 | 2013-01-30 | 张子学 | 一种被杂菌污染的植物组织培养基再生利用技术 |
| CN102960248A (zh) * | 2012-11-28 | 2013-03-13 | 巴中市光雾山植物研究所 | 千层金组培快繁工艺 |
| CN103222426A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-07-31 | 贵州大学 | 千层金再生体系建立的方法 |
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2011
- 2011-01-29 CN CN2011100357034A patent/CN102144557A/zh active Pending
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