CN104911126B - 解淀粉芽孢杆菌z16-1 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌z16-1 Download PDF

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Abstract

解淀粉芽孢杆菌Z16‑1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10727。该解淀粉芽孢杆菌Z16‑1的发酵酶液应用于水酶法提取樟树籽仁油工艺中，可使得樟树籽仁油的得率达到95％，比空白组樟树籽仁油得率提高15％，而酸价提高幅度小于1，在水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂领域有较强的应用价值。

Description

解淀粉芽孢杆菌Z16-1
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Z16-1。
背景技术
樟树籽仁油的中碳链甘油三酯含量高于94％，不仅可作为优良的功能食用油，同时也是生产新一代肠外营养剂、中碳链食品添加剂、化妆品乳化剂等的优良原料。我国樟树资源十分丰富，在黄河以南地区有大量种植，目前我国樟树籽年产量近3万吨，樟树籽仁油年产量可达1万吨以上，然而这些资源至今仍未得到合理的开发利用。
到目前为止，国内外生产提取植物油脂的工艺技术仍以压榨法和有机溶剂浸出法为主。压榨法提取植物油脂得率低于90％，粕中含油率达7％以上，同时植物油料蛋白变性严重难以被提取利用。有机溶剂浸出法提取植物油脂需要使用正己烷、石油醚等有毒、易燃有机溶剂，生产过程中存在易燃易爆等安全隐患，产品存在有机溶剂残留等问题。
水酶法提取植物油脂是将油料经过机械破碎后，加入蛋白酶等生物酶充分破坏油料细胞组织释放油脂，最后经离心分离植物油脂和水解蛋白质。该法不仅提油品质好、提取条件温和、能耗低、过程安全，而且油脂得率较高(大于90％)，能同时能获得植物蛋白，体现了油脂生产和研发领域的发展方向。然而该法也存在油脂易被水解、使用的生物酶成本过高等缺点，至今无法应用于工业化生产中。水酶法提取油脂中使用的中性蛋白酶基本上是枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3942、放线菌166等菌株所生产的。研究发现，采用这些菌株所产中性蛋白酶液的水酶法提取樟树籽仁油，樟树籽仁油的得率小于83％、酸价大于5mgKOH/g。造成樟树籽仁油得率低、酸价高的原因是樟树籽仁油中的中碳链脂肪酸甘油酯对枯草芽孢杆菌AS1.398等革兰氏阳性菌、霉菌及生物酶具有较强的抑制作用，枯草芽孢杆菌AS1.398产脂肪酶活力较高(产脂肪酶活力在2U/mL以上)。
筛选耐中碳链脂肪酸(Medium Chain Fatty Acids，MCFA)、产中性蛋白酶能力强、产脂肪酶能力很弱的菌株，是提高水酶法提取樟树籽仁油得率，大幅降低水酶法提取植物油脂技术的生产成本，实现水酶法提取植物油脂技术的工业化生产应用的关键。国内现无相关的针对该问题的菌株筛选技术及实例报道，本发明使用樟树籽仁粕粉平板富集，脱脂奶平板法、油脂平板法初筛，福林酚法、樟树籽仁培养基摇瓶复筛等方法，自樟树籽仁油生产废渣中筛选出耐MCFA、产中性蛋白酶活力较高、无脂肪酶活力、适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z16-1CGMCC No.10727，它能耐MCFA、产中性蛋白酶活力较高且不产脂肪酶，适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂。
本发明是通过以下技术方案实现的。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z16-1，已于2015年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10727。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1在营养琼脂培养基上培养24h后，菌落呈圆形、大小5.0～10.0mm、厚度约2mm，表面为浅黄色、有不规则波状突起，边缘平滑。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态为杆状，0.7～0.9μm×3～5μm，内生芽孢，无伴孢晶体，芽孢常见于细胞中部，孢子囊无明显膨胀。该菌株的菌落形态和细胞形态示于图1和图2中。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1接触酶实验、V.P实验、葡萄糖产酸实验、明胶液化实验、淀粉水解实验为阳性，氧化酶实验、吲哚实验、葡萄糖产气、亚硝酸盐还原为阴性，能利用木糖、L-***糖、甘露醇，不能利用柠檬酸。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1的种子培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。种子培养条件为：37℃，220r/min，摇瓶培养24h。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1的发酵产酶培养基优化配方为：玉米粉45g，麸皮25g，豆粕40g，CaCl23g，KH2PO40.3g，Na2HPO4·12H2O 4g，水1000mL，pH 7.5，接种量2％。发酵产酶培养的优化条件为：37℃，220r/min摇瓶培养。
经发酵培养后，取发酵液，8000r/min离心10min，所得上清液即为粗酶液。
采用GB/T 23527-2009蛋白酶制剂酶活力测方法，测定粗酶液的蛋白酶活力。蛋白酶活力的定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。
采用轻工业标准QB1502-92中规定的碘量法，测定粗酶液的果胶酶活力。果胶酶活力定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个果胶酶酶活力单位。
采用国标GB 8276-2006中规定的碘量法，测定粗酶液的糖化酶活力。糖化酶活力定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个糖化酶活力单位。
采用国标GB 23881-2009中规定的滤纸片法，测定粗酶液的纤维素酶活力。纤维素酶活力定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，每分钟水解滤纸片，产生1.0μg的葡萄糖，即为1个纤维素酶活单位。
采用国标GB 24401-2009中规定的碘比色法，测定粗酶液的淀粉酶活力。淀粉酶活力定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个淀粉酶活力单位。
采用国标GB 23535-2009中规定的酸碱滴定法，测定粗酶液的脂肪酶活力。脂肪酶活力定义：1mL酶液，在40℃、pH为7.0条件下，1min水解底物产生1μmol可滴定脂肪酸，即为1个酶活力单位。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养40h时，所产中性蛋白酶活力为5734±2％U/mL；所产果胶酶活力为1411±2％U/mL；所产糖化酶活力为10727±2％U/mL；所产淀粉酶活力为；29±2％U/mL；所产纤维素酶活力为6±2％U/mL；脂肪酶活力未能检测出。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养44h时，所产中性蛋白酶活力为6984±2％U/mL；所产果胶酶活力为1506±2％U/mL；所产糖化酶活力为8535±2％U/mL；所产淀粉酶活力为；15±2％U/mL；所产纤维素酶活力为3±2％U/mL；脂肪酶活力未能检测出。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养48h时，所产中性蛋白酶活力为6765±2％U/mL；所产果胶酶活力为580±2％U/mL；所产糖化酶活力为6066±2％U/mL；所产淀粉酶活力为；13±2％U/mL；所产纤维素酶活力为3±2％U/mL；脂肪酶活力未能检测出。
采用优化培养基与优化条件，所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵产中性蛋白酶曲线如图3所示。
所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1所产的中性蛋白酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为7.0，Mn2+对其酶活力有明显的激活作用，加入终浓度为0.01mol/mL的MnCl2可使所述的解淀粉芽孢杆菌Z16-1所产的中性蛋白酶活力提高46.5％。
本发明的有益效果是：使用解淀粉芽孢杆菌Z16-1的发酵酶液应用于水酶法提取樟树籽仁油工艺中，可使得樟树籽仁油的得率达到95％，比空白组(未添加任何酶液)樟树籽仁油得率提高15％，而酸价提高幅度小于1，在水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂领域有较强的应用价值。
附图说明
图1为本发明解淀粉芽孢杆菌Z16-1的菌落形态图。
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌Z16-1的细胞形态图(放大200倍)。
图3为本发明解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵产中性蛋白酶曲线。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步说明。
实施例1。解淀粉芽孢杆菌Z16-1的筛选方法。
(一)实验材料准备。
1、分离源取自樟树籽仁油生产废渣(南昌市香樟林高科技有限公司)。
2、培养基。
肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，pH 7.0–7.2，121℃灭菌20min。
营养琼脂培养基：在肉汤培养基的基础上添加终质量浓度为2％的琼脂。
蛋白酶初筛培养基：在肉汤培养基中添加1.5％脱脂奶粉，肉汤培养基与脱脂奶粉分开灭菌，115℃灭菌25min。
脂肪酶初筛培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，樟树籽仁油1％，1.6％中性红水溶液0.1％，琼脂2％，pH 7.2，121℃灭菌20min。
樟树籽仁粕粉的制备：取一定量的干燥的樟树籽仁，经粉碎机粉碎后，以料液比1:4加水混合，并加入到胶体磨中湿法粉碎4min，将得到白的色乳状液4000r/min离心分离25min，取底层渣相，干燥后粉碎即为樟树籽仁粕粉。
樟树籽仁粕粉初筛培养基：樟树籽仁粕粉2％，葡萄糖0.7％，KH2PO40.03％，Na2HPO412H2O 0.4％，琼脂2％，pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
发酵培养基：玉米粉4.5％，麸皮2.5％，豆粕4％，CaCl20.2％，KH2PO40.03％，Na2HPO4·12H2O 0.4％，pH 7.5，121℃灭菌20min。
樟树籽仁粕粉复筛培养基：樟树籽仁粕粉5％，葡萄糖0.7％，酵母粉0.3％，KH2PO40.03％，Na2HPO412H2O 0.4％，pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
3、实验设备。
恒温振荡器、生化培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、pH计、胶体磨、721型紫外分光光度计。
(二)菌株筛选。
(1)耐中碳链脂肪酸型菌株富集：称取1g左右分离源样品，用无菌生理盐水和10倍稀释法，制备不同稀释度(10-1～10-7)的稀释液，从三个合适稀释度中吸取100uL稀释液均匀涂布到樟树籽仁培养基A平板上。37℃恒温培养24h，选取长有10个左右菌落的平板备用。
(2)高产蛋白酶菌株初筛：采用点种法，用无菌牙签沾取上一步中得到的菌落点种到脱脂奶培养基平板上，37℃恒温培养24h，根据培养基中菌落透明圈直径与菌落直径比(H/C)大小进行产蛋白酶菌株初筛，选取H/C较大的菌株备用。
(3)低产脂肪酶菌株初筛：采用点种法，将上一步骤中H/C较大的菌株点种到樟树籽仁油培养基平板上，37℃恒温培养24h，观察菌落周围是否产生红色水解圈。选取无红色油脂水解圈的菌株进行摇瓶复筛。
(4)高产中性蛋白酶、低产脂肪酶菌株复筛。
将初筛得到的菌株接种到肉汤培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养24h，制成种子液。以2％的接种量将种子液加入到发酵培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养44h，取发酵液，8000r/min离心分离10min，上清液即为粗酶液。分别采用国标GB/T23527-2009《蛋白酶制剂酶活力测定方法》中规定的福林酚法和国标GB/T 23535-2009《脂肪酶制剂酶活测定方法》中规定的酸碱滴定法测定粗酶液的蛋白酶活力和脂肪酶活力，选取产蛋白酶活力高、脂肪酶活力低的菌株。
(5)用于水酶法提取中碳链油脂的菌株筛选。
将上一步中复筛得到的菌株接种到肉汤培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养24h，制成种子液。以6％的接种量将种子液加入到樟树籽仁培养基B中，37℃、220r/min摇瓶培养40h后，90℃保温10min灭活，胶体磨湿法粉碎乳化4min，将得到的白色乳状液4000r/min离心分离25min，收集底层渣相，干燥后得到樟树籽仁残渣，称重并采用索氏提取法测定其含油量。选取最能使樟树籽仁残渣量少、含油量低的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌Z16-1。
(三)菌株菌落形态特征及生理生化特征。
菌株Z16-1在营养琼脂培养基上培养24h后，菌落呈圆形、大小5.0～10.0mm、厚度约2mm，表面为浅黄色、有不规则波状突起，边缘平滑。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态为杆状，0.7～0.9μm×3～5μm，内生芽孢，无伴孢晶体，芽孢常见于细胞中部，孢子囊无明显膨胀。接触酶实验、V.P实验、葡萄糖产酸实验、明胶液化实验、淀粉水解实验为阳性，氧化酶实验、吲哚实验、葡萄糖产气、亚硝酸盐还原为阴性，能利用木糖、L-***糖、甘露醇，不能利用柠檬酸。
菌株Z16-1的16S rDNA基因序列见“说明书核苷酸和氨基酸序列表”。
采用BLAST法对菌株Z16-1的16S rDNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株Z16-1与解淀粉芽孢杆菌的同源性高达99％。
综合菌株的生理生化及分子鉴定结果，菌株Z16-1命名为解淀粉芽孢杆菌Z16-1(Bacillus amyloliquefaciens Z16-1)。
查阅相关文献资料，尚无高产蛋白酶、低产脂肪酶且耐中碳链脂肪酸型解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用方面的报道。解淀粉芽孢杆菌Z16-1为新的菌株，已于2015年4月21日交送于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，保藏号为10727。
本发明筛选与分离出的解淀粉芽孢杆菌Z16-1产中性蛋白酶活力很高达到6984U/mL，无脂肪酶活力且耐中碳链脂肪酸，其发酵酶液能显著提高水酶法提取樟树籽仁油油脂和水解蛋白得率。为水酶法提取植物油脂提供了用于的菌源与技术，具有较强的实际应用价值。

Claims (1)

1.一种用于提取樟树籽仁油的解淀粉芽孢杆菌Z16-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10727。
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