CN104789491A - 地衣芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用，所述菌株为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)，于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCMCC NO.8865。所述地衣芽孢杆菌菌株的应用，包括：收集豆腐废水，调pH至7.0，置于121℃高压灭菌25min，将地衣芽孢杆菌菌株BL14以106cfu/mL的接种量接种于豆腐废水中，曝气，33℃培养3天，豆腐废水即发酵成复合酶液。地衣芽孢杆菌能以豆腐废水为唯一的营养物质发酵生长，并生产出内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶液，为内切葡聚糖酶和木聚糖酶制剂的生产提供了新的发酵菌源。

Description

地衣芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
为了充分利用资源、节约成本，纤维素及半纤维素含量高的物质如米糠、小麦次粉、棉籽粕、秸秆粉、牧草等常被用作原料替代价格高的玉米、大豆、小麦等物质。然高比例的粗纤维日粮不仅不能被畜禽直接吸收利用，还容易引起畜禽腹泻、生长缓慢等各种问题。为改善饲料品质，饲料厂和养殖场已经充分认识到饲料中添加酶类物质，特别是纤维素酶和半纤维素酶等动物自身不能合成的非消化酶的重要性。
植物细胞壁的主要成分由纤维素、半纤维素及木质素构成，纤维素与半纤维素相互交连，纤维素酶水解植物纤维素释放出游离糖后，使得纤维素与半纤维素交连体得到松驰，半纤维素暴露并被木聚糖酶迅速分解成木糖等物质。因为内切葡聚糖酶和木聚糖酶是降解纤维素和半纤维素的最主要水解酶类之一。因此通过内切葡聚糖酶与木聚糖酶的双重水解作用可将饲料中高含量的纤维素、半纤维素降解成易被动物吸收利用的可溶性小分子类碳水化合物，不仅增加饲料的适口性，更提高饲料的吸收利用率，极大促进畜禽的健康成长。
对于饲料加工业，添加单一的酶制剂不仅不能同时满足降解植物细胞壁中纤维素和半纤维素的需求，而且逐一添加各种酶制剂也大大增加了企业的生产成本，因此从应用效果和生产成本的角度出发各类复合酶制剂已越来越受到企业的青睐，大量的动物实验也表明添加复合酶制剂确实大大提高饲料的利用效率。目前选育出来的应用广泛的优良菌种多为木霉、青霉属、黑曲霉等真菌类，由于该类菌生产纤维素酶所用的生产周期长，产酶的同时也 产生大量的有毒物质，其代谢产生的粗酶并不能直接添加到饲料中，因此诸如膜过滤等除去有毒物质以提纯纤维素酶的技术程序基本上是生产工业纤维素酶制剂中必不可少的环节。且不说酶在这一过程中出现大量的损耗，这一生产程序的使用及生产周期之长也极大增加企业的生产成本。
豆腐废水，是豆腐在生产过程中形成的豆腐沥水，其产生量是大豆干重的3-5倍。豆腐水固形物含量约占1％，主要由可溶性蛋白质、低聚糖、维生素、脂类、微量元素等组成。我国是豆腐生产和消费的大国，其生产产生大量高浓度有机废水进入地面水，在环境中发酵引起附近水质的严重恶化，严重威胁人类生存环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种地衣芽孢杆菌菌株。
本发明是这样实现的：一种地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)，于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CCMCC NO.8865。
本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种所述的地衣芽孢杆菌菌株的应用。
本发明是这样实现的：一种所述的地衣芽孢杆菌菌株的应用，收集豆腐制作中废弃的豆腐废水，调豆腐废水的pH至7.0，置于发酵罐中121℃高压灭菌25min，将所述地衣芽孢杆菌菌株BL14以106cfu/mL的接种量接种于发酵罐内，曝气，33℃培养3天，豆腐废水即发酵成含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合酶液。
进一步地，所述内切葡聚糖酶活力的测定方法如下：
用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的羧甲基纤维素钠溶液1.7ml，再加入0.5mL所述复合酶液，0.3ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃反应5min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
进一步地，所述木聚糖酶活力的测定方法如下：用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的木聚糖溶液1.0ml，再加入0.5mL所述复合酶液，1.0ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃下反应10min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
本发明的优点在于：地衣芽孢杆菌菌株BL14能以豆腐废水为唯一的营养物质发酵生长，并生产出内切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶液，从而为豆腐废水的回收利用及饲料加工业中内切葡聚糖酶和木聚糖酶制剂的生产提供了新的发酵菌源。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中地衣芽孢杆菌菌株BL14的菌落形态图。
图2是本发明中地衣芽孢杆菌菌株BL14的革兰氏染色图。
图3是本发明中地衣芽孢杆菌菌株BL14的JSM-6380LV扫描电镜菌体形态观察图。
图4是本发明中地衣芽孢杆菌菌株BL14的PCR扩增片段凝胶电泳图谱。
图5是本发明中地衣芽孢杆菌菌株BL14基于16S rRNA基因序列的***发育树的示意图。
菌株保藏
本发明中的菌株为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)，于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCMCC NO.8865。
具体实施方式
一种地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)，于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CCMCC NO.8865。
所述地衣芽孢杆菌菌株能够应用在豆腐废水治理，同时还产生内切葡聚糖酶及木聚糖酶复合酶制剂，具体方如下：收集豆腐制作中废弃的豆腐废水，调豆腐废水的pH至7.0，置于发酵罐中121℃高压灭菌25min，将所述地衣芽孢杆菌菌株BL14以106cfu/mL的接种量接种于发酵罐内，曝气，33℃培养3天，豆腐废水即发酵成含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合酶液。
所述内切葡聚糖酶活力的测定方法如下：
用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的羧甲基纤维素钠溶液1.7ml，再加入0.5mL所述复合酶液，0.3ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃反应5min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
所述木聚糖酶活力的测定方法如下：用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的木聚糖溶液1.0ml，再加入0.5mL所述复合酶液，1.0ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃下反应10min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
本发明的地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)是从福建省南平市芒砀山周边农田中含腐烂稻草土壤分离获得的。
1、地衣芽孢杆菌菌株BL14的驯化筛选分离：
从福建省南平市芒砀山周边农田采集含有腐烂稻草的土壤，在室温下自然干燥7天，称5g土壤于装有195ml富集驯化培养液的三角瓶中，160r/min条件下30℃恒温培养驯化5d，取1g驯化菌液分别稀释10-5、10-6、10-7次方后，涂布于刚果红固体培养基中，挑出能在刚果红固体培养基中生长且能产生透明圈的菌落，平板画线纯化培养，将纯化的菌接种于分离培养基中发酵培养后，吸取菌液0.1ml于用打孔器处理过的刚果红固体培养基的孔中培养，观察孔边透明圈的形成情况，选取透明圈形成明显的菌种，保存并命名为地衣芽孢杆菌菌株BL14。
其中各培养基的配方如下：
(1)富集驯化培养液：(NH4)2SO42g/L,KH2PO43g/L,MgSO4·7H203g/L,CaCl23g/L,MnSO4·H2O 0.16g/L,ZnSO4·7H2O 0.14g/L,CoCL20.2/L,稻草粉150g/L，豆渣粉：5g/L。
(2)分离培养基：(NH4)2S041.5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO40.3g/L，CaC120.3g/L，FeSO40.1g/L，ZnSO40.1g/L，CMC-Na 10g/L，山毛榉木聚糖10g/L，pH调至7.4。
(3)刚果红固体培养基：(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H203g/L,KH2PO41g/L，NaCl 0.5g/L,CMC-Na 10g/L,木聚糖10g/L，刚果红0.2g/L，pH 7.0，琼脂20g/L。
2、菌种的鉴定 
2.1菌的形态观察：对地衣芽孢杆菌菌株BL14进行菌落形态观察(见图1)，电子显微镜观察菌体的革兰氏染色形态(见图2)，JSM-6380LV扫描电镜观察菌体形态(见图3)。地衣芽孢杆菌菌株BL14，菌落裂叶状，不透明，宽：0.6-0.8μm，长：1.5-3μm，孢子中生、椭圆，革兰氏阳性，排成链状。
2.2生理生化特征的鉴定：
地衣芽孢杆菌菌株BL14菌株生理生化特征见表1，由表可知：VP、淀粉水解和过氧化氢实验显示阳性，说明该菌株可以分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇，能产生淀粉酶将淀粉水解为糖类物质；不能利用明胶，产氨实验、MR实验呈阴性；能发酵利用D-果糖产酸、产气，发酵利用蔗糖、葡萄糖产酸、不产气。
表1生理生化特征
注：生理学特征：(“+”表示阳性；“-”表示阴性)；糖类发酵实验结果记录表：(“+，+”表示产酸，产气；“-，-”表示不产酸，不产气；“w–”表示弱阳性产酸，不产气。)
2.3地衣芽孢杆菌菌株BL14的分子生物学鉴定
(1)细菌基因组DNA的提取:采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。
(2)16S rDNA序列的PCR扩增及测序：扩增16SrDNA基因V6-V8可变区，所用引物为F968:5’-AAC GCG AAG CTT AC-3’(SEQ ID NO：2)；L1401:5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’(SEQ ID NO：3)。
PCR反应体系:2*Taq PCR MasterMix:12.5ul，引物及DNA各1.0ul,ddH20:9.5ul。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
(3)PCR产物检测及测序分析：取5ul的PCR产物，在加入EB的1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到目的片段长约400bp左右(见图4)，将含有目标片段的产物委托上海生物工程有限公司完成测序，得到的实际核苷酸序列为397bp(序列见SEQ ID NO：1)。
(4)***发育分析：在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Bacillus licheniformis的序列同源性大于99％，采用MEGA 4.1中的Maximum Parsimony进行发育树的构建分析同，结果见图5。
(5)细菌登入号的获得：将基因序列提交NCBI数据库中，进行细菌登入号的申请，申请得到的登录号为KJ627224。
结合菌株的形态观察和生理生化实验，以及***发育树中的同源性分析，菌株确定为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)菌种。
3、地衣芽孢杆菌菌株BL14的特性研究 
制备菌种母液，接种环挑取1环该地衣芽孢杆菌菌株BL14于100mL基础培养基中，150r/min，33℃培养24h，得到菌种母液；
分别取0.1mL上述菌种母液接种于数瓶含有100mL豆腐废水培养基的三角瓶中，于150r/min，33℃培养1d至20d，以基础培养基为对照组，分别在发酵的第1d、2d至20d取该地衣芽孢杆菌菌株BL14发酵液并分别测定内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性，同时测定所述发酵液中葡萄糖和木糖的含量变化情况。
所述基础培养基(g/L)为：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，PH：7.6。
豆腐废水培养基：黄豆与水质量比为1:10，按传统豆腐制作工艺法制作豆腐后，收集最后压豆腐程序中流出的豆腐废水，调pH 7.0，置于121℃高压灭菌25min，即为豆腐废水培养基。
(1)复合酶液制备：分别在培养1d至20d不同培养时间取所述发酵液于4℃，5000r/min离心15min，取上清液即为粗酶液。以煮沸15min的复合酶液为对照。
(2)内切葡聚糖酶活力(CMCase)的测定：用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1.7ml，再加入0.5mL所述复合酶液，0.3ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃反应5min后，加入1mL DNS试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，适当比例稀释后于540nm比色。
(3)木聚糖酶活力的测定：用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的木聚糖溶液1.0ml，再加入0.5mL所述复合酶液，1.0ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃下反应10min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，适当稀释后于540nm比色。
以上酶活力均扣除发酵液和底物的糖含量，以葡萄糖/木糖作标准溶液，以每毫升酶液每分钟生成1ug葡萄糖/木糖作为一个酶活单位(U)。
(4)发酵液中葡萄糖/木糖含量的测定：取复合酶液0.5ml(以0.5ml的无菌水为对照)，加入2ml的0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液,加入1mL DNS试剂沸水浴中煮沸5min，适当稀释后于540nm比色。
3.1内切葡聚糖酶及发酵液中葡萄糖的变化
以基础培养基培养地衣芽孢杆菌菌株BL14，产生的最大内切葡聚酶活力出现在发酵的第3天，活力为64.73±7.45(U/ml)，而后迅速下降，发酵到第6d时检测不到酶活力。以豆腐废水为培养基时，最大酶活出现在发酵的第3d，活力为213.80±9.74，相较于基础培养基提高了2.30倍，在发酵到第4d时酶活为112.63±24.03(U/ml),而后开始迅速下降(见表2)，说明地衣芽孢杆菌菌株BL14不仅可以以豆腐废水为直接营养物质进行生长，而且与基础培养基相比，豆腐废水中营养物质的诱导作用使其产内切葡聚糖酶能力达到明显的提高，内切葡聚糖酶活力的保持时间也从基础培养基的4d延长到10d，即采用豆腐废水培养该菌产生的内切葡聚糖更容易保存。
同时检测培养基中葡萄糖含量变化情况，从表2可知：在基础培养基中，总体趋势上，从发酵前的263.836±7.31(μg/ml)下降到192.84±7.68(μg/ml)，出现小幅的消耗下降的情况。在豆腐废水培养基中，与发酵前相比，在发酵1d葡萄糖含量由发酵前的1283.06±31.54(μg/ml)上升到3204.68±39.61，说明该地衣芽孢杆菌菌株BL14被诱导分泌的大量内切葡聚糖酶将豆腐废水中的大分子碳水化合物分解成葡萄糖。随着发酵时间延长，发酵液中葡萄糖的含量开始逐渐下降，发酵至20d时，下降到303.00±9.15(μg/ml)，说明该地衣芽孢杆菌菌株BL14可以利用葡萄糖作为能源及营养物质进行生长。
表2内切葡聚糖酶活力及发酵液中葡萄糖的变化
注：ND为未检出
3.2木聚糖酶及发酵液中木糖的变化
由表3可知，以基础培养基和豆腐废水培养基培养地衣芽孢杆菌菌株BL14，产生最高木聚糖酶活力值均出现在发酵的第3天，活力分别为424.48±9.24、487.13±11.06(U/ml)，其后逐渐下降，发酵到第20d时还均可检测到酶活力，分别为93.31±10.76、199.540±25.32(U/ml)。由表3可知，总体上地衣芽孢杆菌菌株BL14在豆腐废水中产生的木聚糖酶的活力均明显高于基础培养基，最高酶活提高了15％。
同时检测培养基中木糖含量变化情况：基础培养基中木糖的含量基本呈现直线下降的趋势，从发酵前的5519.64±223.96(μg/ml)逐渐下降到发酵20d的1074.64±94.70(μg/ml)；而豆腐废水培养基中，木糖在发酵1d时小幅上升，由发酵前的8169.84±194.02(μg/ml)上升到9330.02±276.72(μg/ml)，说明该地衣芽孢杆菌菌株BL14产生的木聚糖酶对豆腐废水中的大分子半纤维素类物质进行了降解，之后逐渐下降，发酵到第20天下降到2215.73±105.95(μg/ml)，说明该地衣芽孢杆菌菌株BL14对木糖进行了代谢作用。
表3木糖酶活力及发酵液中木糖的变化
综上所述，所述地衣芽孢杆菌菌株BL14经过筛选驯化后，能以豆腐废水为唯一营养物质，同时高产内切葡聚糖酶和木聚糖酶，产生的两种酶的活力相较于基础培养基明显提高，说明地衣芽孢杆菌菌株BL14更适合在豆腐废水培养中生长，以豆腐废水为培养基生产内切葡聚糖酶和木聚糖酶的最适发酵时间为发酵3d。

Claims (4)

1.一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌菌株BL14(Bacillus licheniformis)，于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCMCC NO.8865。
2.一种如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：收集豆腐制作中废弃的豆腐废水，调豆腐废水的pH至7.0，置于发酵罐中121℃高压灭菌25min，将所述地衣芽孢杆菌菌株BL14以106cfu/mL的接种量接种于发酵罐内，曝气，33℃培养3天，豆腐废水即发酵成含有内切葡聚糖酶和木聚糖酶的复合酶液。
3.如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：所述内切葡聚糖酶活力的测定方法如下：
用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的羧甲基纤维素钠溶液1.7ml，再加入0.5mL所述复合酶液，0.3ml 0.05mol/L pH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃反应5min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
4.如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：所述木聚糖酶活力的测定方法如下：用0.05mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为l％的木聚糖溶液1.0ml，再加入0.5mL所述复合酶液，1.0ml 0.05mol/LpH 5.5的磷酸盐缓冲液，于50℃下反应10min后，加入1mL 3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应，然后沸水浴中煮沸5min，稀释后于540nm比色。
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