CN104892562A - 抑制环氧化酶-2的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

抑制环氧化酶-2的化合物，其结构式如下：通过毒理学、药效学实验表明，本发明抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠体重没有影响，毒副作用较小，与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠胃肠毒副作用较小，表明其安全性较高；另外，本发明抑制环氧化酶-2的化合物可以选择性抑制COX-2的表达，而且抗炎作用效果好，明显强于GEP和ASP，具有非常好的应用前景。

Description

抑制环氧化酶-2的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抑制环氧化酶-2的化合物及其制备方法和用途。
背景技术
炎症是机体对各种炎性刺激引起组织或微循环损害而产生的一种基本病理过程。炎症反应为多种介质所介导，其中***素(Prostaglandin，PG)在炎症反应中起重要作用。环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是一种双功能酶，是催化膜磷脂花生四烯酸(Arachidonicacid，AA)转化为PG类物质的限速酶。COX存在两种同工酶：COX-1和COX-2。功能型COX-1主要存在于正常细胞中，介导低水平的生理性PG的产生，主要作用是保护和调节胃肠道及血小板的正常生理功能；而诱导型COX-2主要存在炎症组织细胞中，在多种炎症模型和类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者的成纤维样滑膜组织(Fibroblastlike synovial tissue，FLST)中都有大量表达，通过代谢AA合成一些病理性的PG如PGE2，同时伴随有活性氧自由基的产生，导致炎症反应放大和增强，引起疼痛，发烧，红肿等症状[1]。在急性、亚急性和慢性炎症模型中，选择性抑制COX-2酶活性都有明显的抗炎症效果，表明诱导性COX-2在炎症中发挥重要作用，COX-2可能作为类风湿性关节炎治疗作用的潜在靶点[2]。
非甾体类抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是炎症治疗的传统药物。1971年，Vane等通过研究发现NSAIDs是通过抑制COX的活性，阻断AA转化为PGs从而发挥作用。目前，根据对两种COX同工酶作用的特异性，NSAIDs分为四大类：(1)COX-1选择性抑制剂，如阿司匹林(Aspirin，ASP)；(2)非选择性COX抑制剂(吲哚美辛)；(3)COX-2相对选择性抑制剂(美洛昔康)；(4)特异性COX-2选择性抑制剂(塞来昔布)。其中COX-1选择性抑制剂和非选择性抑制剂由于抑制固有表达的COX-1的活性，减少了生理性的PGs生成，因此，长期服用易导致较严重的胃肠道损伤等副作用。典型的，ASP长期服用引发胃出血，胃溃疡等严重不良反应已得到广泛认同。发病机制主要是通过抑制COX-1的活性，减少粘膜***素(PG)的生成，游离的羧基直接刺激胃肠道粘膜并穿透胃粘膜上皮细胞膜，影响了黏膜防御因子，黏膜细胞分泌粘蛋白和表面磷脂，进而打破胃黏膜屏障。同时也抑制胃、十二指肠上皮碳酸盐的分泌，减少了上皮的修复和更新。又因抑制血小板环氧化酶的合成，减少血栓素A2的合成，而降低血小板的聚集能力，诱发出血。因此，在未改变ASP发挥药效作用基团的前提下将游离的羧基进行修饰，减少对胃肠道的刺激将是很有研究必要。
以COX-2选择性抑制剂为代表的新一代NSAIDs，通过对诱导型的COX-2进行特异性抑制而不影响COX-1的活性，既能发挥显著的抗炎作用，又能减少传统NSAIDs所带来的毒副作用。目前，COX-2选择性NSAIDs主要用于RA，骨关节炎和急性疼痛等疾病的治疗。COX-2选择性NSAIDs的作用机理主要是通过抑制COX-2酶活性，从而抑制炎性介质PGE2的生成，减轻炎症反应并缓解各种症状。然而，2004年美国默克制药公司宣布在全世界自愿召回该公司研发的COX-2选择性NSAIDs罗非昔布(Rofecoxib)，原因是由于长期服用该药会导致心血管等方面的副作用。
京尼平(Genipin，GEP)为中药栀子的抗炎免疫活性成分栀子苷(Geniposide，GE)水解后苷元部分，属于环烯醚萜类。近年来，已有文献报道证实GE及GEP均具有抗炎，抗过敏及免疫抑制等多种药理活性[3]，此外由于GE具有一定程度的肝毒性，其中大多认为其毒性与GE的结构有关，并建议将其结构修饰为GEP或者其他代谢产物[4-6]。Akao T等通过酶解法对GE的肠道细菌代谢研究，发现GE在体内经过肠道β-D-葡萄糖苷酶被水解成GEP发挥药理作用[7]。GEP主要作用机制是抑制NF-κB/IKB-β的降解，减少炎症反应过程中COX-2介导的PGE2和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)介导的NO生成，显著改善RA患者的症状[8-9]。但是，最近研究发现，GEP口服后在正常大鼠体内生物利用度较低，考虑可能主要是其吡喃环上的半缩醛结构在酸性条件不稳定，经胃肠道酸性环境部分降解造成的。
因此，急需一种毒副作用小、抗炎作用好、能够选择性抑制环氧化酶-2的化合物用以治疗炎症。
参考文献：
[1]J.S.Lee,J.Y.Cho,H.Song,E.H.Hee,K.B.Hahm.Revaprazan,a novel acid pumpantagonist,exerts anti-inflammatory action against helicobacter pylori-induced COX-2expression by inactivating akt signaling.J Clin Biochem Nutr.51(2012)77-83.
[2]J.C.Phillips.Fractals and self-organized criticality in anti-inflammatory drugs.Physica.Section A:Statistical Mechanics and its Applications.415(2014)538-543.
[3]M.M.Dai,H.Wu,H.Li,J.Chen,J.Y.Chen,S.L.Hu,C.Shen,Effects and mechanisms ofGeniposide on rats with adjuvant arthritis[J].Int.Immunopharmacol.1(2014)46-53.
[4]J.Chen,H.Wu,M.M.Dai,H.Li,J.Y.Chen,S.L.Hu.Identification and distribution of fourmetabolites of geniposide in rats with adjuvant arthritis.Fitoterapia.97(2014):111-121.
[5]J.Chen,H.Wu,G.B.Xu,M.M.Dai,S.L.Hu,L.L.Sun,W.Wang,S.P.Li,G.Q.Li.Determination of geniposide in adjuvant arthritis rat plasma by ultra-high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry method and its application to oralbioavailability and plasma protein binding ability studies.J Pharm Biomed Anal.108(2015):122-128.
[6]Q.H.Shi,J.J.Cao,F.Li,H.Y.Zhao,Z.X.Liu,J.H.Ran,X.C.Zheng,X.L.Li,Y.Zhou,D.Ge,H.M.Zhang,L.Wang,Y.Ran,J.F.Fu,Geniposide suppresses LPS-induced nitricoxide,PGE2and inflammatory cytokine by downregulating NF-κB,MAPK and AP-1signaling pathways in macrophages[J].Int.Immunopharmacol.2(2014)298-306.
[7]W.L.Chang,H.Y.Wang,L.Shian,J.H.Lai,H.C.Lin,Immunosuppressive iridoids from thefruits of Gardenia jasminoides[J].J.Nat.Prod.11(2005)1683-1685.
[8]H.J.Koo,K.H.Lim,H.J.Jung,Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract,geniposideand genipin[J].J Ethnopharmacol.3(2006)496-500.
[9]H.Li,H.Wu,C.Shen,J.Y.Chen,S.L.Hu,H.Wu.Comparative Pharmacokinetics Studyafter Oral Administration of Geniposide in Normal Rats and Adjuvant-induced ArthritisRats by UPLC-MS/MS.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.113(2013)294-299.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种毒性低、抗炎作用好、能够选择性抑制环氧化酶-2的化合物。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：抑制环氧化酶-2的化合物，其结构式如下：
本发明还提供所述的抑制环氧化酶-2的化合物及其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用，尤其是在抗关节炎药物中的应用。
“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐及类似的盐；以及与有机酸形成的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和链烷酸盐如乙酸盐及类似的盐。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。
本发明还提供所述的抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)京尼平甲基化中间体a的合成
将1重量份的京尼平溶解于40—60重量份的无水甲醇中，冷却后加入三氟化硼***，然后在室温下进行搅拌反应，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相用无水Na2SO4进行干燥处理，再蒸除有机溶剂，制得无色油状液体，即得京尼平甲基化中间体a；
(2)抑制环氧化酶-2的化合物的合成
取1重量份的京尼平甲基化中间体a，加入三乙胺将pH值调节至8—9，冷却后缓慢加入3重量份的乙酰水杨酰氯，然后在冰浴条件下进行反应，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相进行硅胶柱层析处理，制得白色固体，即为抑制环氧化酶-2的化合物。
其中三氟化硼***作为催化剂，三乙胺作为缚酸剂。
本发明的有益效果体现在：
1.通过毒理学、药效学实验表明，本发明抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠体重没有影响，毒副作用较小，与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠胃肠毒副作用较小，表明其安全性较高；另外，本发明抑制环氧化酶-2的化合物可以选择性抑制COX-2的表达，而且抗炎作用效果好，明显强于GEP和ASP，具有非常好的应用前景。
2.本发明抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法工艺简单、条件温和、产率较高，适合工业化生产。
附图说明
图1-1是抑制环氧化酶-2的化合物的高分辨质谱图。
图1-2是抑制环氧化酶-2的化合物的1H-NRM图。
图1-3是抑制环氧化酶-2的化合物的13C-NRM图。
图2-1是正常小鼠小肠组织副皮质区光学显微镜图。
图2-2是ASP给药剂量组(550mg/kg)小鼠小肠组织副皮质区光学显微镜图。
图2-3是抑制环氧化酶-2的化合物第六组(1142mg/kg)小鼠小肠组织副皮质区光学显微镜图。
图3是抑制环氧化酶-2的化合物治疗给药对CIA大鼠关节炎指数的影响线性图。
图4是抑制环氧化酶-2的化合物治疗给药对CIA大鼠关节肿胀度的影响线性图。
图5-1是正常大鼠MLNs副皮质区光学显微镜图。
图5-2是CIA大鼠MLNs副皮质区光学显微镜图。
图5-3是抑制环氧化酶-2的化合物中剂量组(70mg/kg)大鼠MLNs副皮质区光学显微镜图。
图5-4是抑制环氧化酶-2的化合物高剂量组(140mg/kg)大鼠MLNs副皮质区光学显微镜图。
图6-1是正常大鼠膝关节滑膜层光学显微镜图。
图6-2是CIA大鼠膝关节滑膜层光学显微镜图。
图6-3是抑制环氧化酶-2的化合物中剂量组(70mg/kg)大鼠膝关节滑膜层光学显微镜图。
图6-4是抑制环氧化酶-2的化合物高剂量组(140mg/kg)大鼠膝关节滑膜层光学显微镜图。
图7是ConA不同时间不同浓度对PBL增殖能力的影响柱形图。
图8是抑制环氧化酶-2的化合物对CIA大鼠PBL增殖能力的影响柱形图。
图9是抑制环氧化酶-2的化合物对CIA大鼠血清，胸腺和脾脏淋巴细胞上清液PGE2的影响柱形图。
图10是抑制环氧化酶-2的化合物整体给药对CIA大鼠PBL中COX-2蛋白相对表达水平的影响柱形图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。为简洁描述，本发明“抑制环氧化酶-2的化合物”在附图中描述为“抑制COX-2的化合物”。
实施例1
抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法
1.1 京尼平甲基化中间体a的合成
将3g京尼平溶解于180g无水甲醇中，于冰浴槽中冷却到0℃后迅速加入1.68g三氟化硼***，然后在室温下进行搅拌(220r·min-1)反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相用无水Na2SO4进行干燥处理，再蒸除有机溶剂，制得无色油状液体，即得京尼平甲基化中间体a；
1.2 抑制环氧化酶-2的化合物的合成
取1g京尼平甲基化中间体a，加入三乙胺将pH值调节至9，于冰浴槽中冷却到0℃后缓慢加入3g乙酰水杨酰氯，然后在冰浴条件下进行反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相进行硅胶柱层析处理，制得白色固体1.84g，即为抑制环氧化酶-2的化合物，产率46％。
参见图1-1、图1-2和图1-3：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝7.2Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.41(s,1H),7.08(d,J＝7.8Hz,2H),5.98(s,1H),5.07(d,J＝3.4Hz,1H),4.95(s,2H),3.70(s,3H),3.53(s,3H),3.22～3.18(m,1H),3.11～3.07(m,1H),2.30(s,3H),2.08(d,J＝8.2Hz,2H).
13C-NRM(151MHz,CDCl3)δ169.91,167.95,164.49,152.38,150.92,150.76,138.10,136.21,131.22,126.24,124.04,124.43,111.59,111.01,77.23,63.30,57.34,56.53,51.46,35.54,33.88,21.25,0.19.
MS:C21H21O8Na,[M+Na]+425.1202.
实施例2
抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法
2.1京尼平甲基化中间体a的合成
将3g京尼平溶解于120g无水甲醇中，于冰浴槽中冷却到0℃后迅速加入1.68g三氟化硼***，然后在室温下进行搅拌(220r·min-1)反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相用无水Na2SO4进行干燥处理，再蒸除有机溶剂，制得无色油状液体，即得京尼平甲基化中间体a；
2.2 抑制环氧化酶-2的化合物的合成
取1g京尼平甲基化中间体a，加入三乙胺将pH值调节至8，于冰浴槽中冷却到0℃后缓慢加入3g乙酰水杨酰氯，然后在冰浴条件下进行反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相进行硅胶柱层析处理，制得白色固体2.08g，即为抑制环氧化酶-2的化合物，产率52％。
参见图1-1、图1-2和图1-3：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝7.2Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.41(s,1H),7.08(d,J＝7.8Hz,2H),5.98(s,1H),5.07(d,J＝3.4Hz,1H),4.95(s,2H),3.70(s,3H),3.53(s,3H),3.22～3.18(m,1H),3.11～3.07(m,1H),2.30(s,3H),2.08(d,J＝8.2Hz,2H).
13C-NRM(151MHz,CDCl3)δ169.91,167.95,164.49,152.38,150.92,150.76,138.10,136.21,131.22,126.24,124.04,124.43,111.59,111.01,77.23,63.30,57.34,56.53,51.46,35.54,33.88,21.25,0.19.
MS:C21H21O8Na,[M+Na]+425.1202.
实施例3
抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法
3.1 京尼平甲基化中间体a的合成
将3g京尼平溶解于150g无水甲醇中，于冰浴槽中冷却到0℃后迅速加入1.68g三氟化硼***，然后在室温下进行搅拌(220r·min-1)反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相用无水Na2SO4进行干燥处理，再蒸除有机溶剂，制得无色油状液体，即得京尼平甲基化中间体a；
3.2 抑制环氧化酶-2的化合物的合成
取1g京尼平甲基化中间体a，加入三乙胺将pH值调节至9，于冰浴槽中冷却到0℃后缓慢加入3g乙酰水杨酰氯，然后在冰浴条件下进行反应，TLC检测反应进程，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相进行硅胶柱层析处理，制得白色固体2.32g，即为抑制环氧化酶-2的化合物，产率58％。
参见图1-1、图1-2和图1-3：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝7.2Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.41(s,1H),7.08(d,J＝7.8Hz,2H),5.98(s,1H),5.07(d,J＝3.4Hz,1H),4.95(s,2H),3.70(s,3H),3.53(s,3H),3.22～3.18(m,1H),3.11～3.07(m,1H),2.30(s,3H),2.08(d,J＝8.2Hz,2H).
13C-NRM(151MHz,CDCl3)δ169.91,167.95,164.49,152.38,150.92,150.76,138.10,136.21,131.22,126.24,124.04,124.43,111.59,111.01,77.23,63.30,57.34,56.53,51.46,35.54,33.88,21.25,0.19.
MS:C21H21O8Na,[M+Na]+425.1202.
实施例4
抑制环氧化酶-2的化合物的急性毒理实验初步评价
采用改良寇氏法测定抑制环氧化酶-2的化合物对健康小鼠LD50，将小鼠随机分为8组，每组10只，饲养2周。以苦味酸为染料(黄色)。根据预实验结果得到环氧化酶-2的化合物的每组全部致死的最小给药剂量为1300mg/kg，以及每组未出现死亡的最大给药剂量为400mg/kg，组距为r＝1.3。将抑制环氧化酶-2的化合物分为400mg/kg、520mg/kg、676mg/kg、878.8mg/kg、1142mg/kg、1485.17mg/kg 6个组和ASP组550mg/kg，溶剂组。用药组于每日以0.2ml/10g灌胃给药2次早晚各一次。连续灌胃给药14天，观察植物神经***(畏光、皮毛竖起等)、自发运动、肌肉运动及张力、对外界刺激反应、死亡，尸体解剖。
4.1 不同剂量药物对小鼠急性毒性试验
给药饲养连续14天内小鼠共死亡7只。分别为抑制环氧化酶-2的化合物的878.8mg/kg剂量组的小鼠第8天死亡1只；抑制环氧化酶-2的化合物的1142mg/kg剂量组的小鼠第8天死亡1只，第13天死亡1只。抑制环氧化酶-2的化合物1485.17mg/kg剂量组小鼠第5天，第6天，第7天，第8天各死1只。其中，ASP组和溶剂组未出现异常，在饲养期间小鼠的饮食和活动状况均正常，具体见表1。
表1 不同剂量药物对小鼠急性毒性试验结果
根据给药后小鼠一般情况的观察结果，采用改良寇式法测得小鼠LD50(公式1)和95％的置信区间(公式2)
LD50＝lg-1[Xm–i(∑p-0.5)])               (公式1)
95％可信限区间＝log-1(logLD50±1.96×Slog LD50)(公式2)
经计算：以组距r＝1.3计算得抑制环氧化酶-2的化合物的半数致死量(LD50)为1409.9mg/kg，95％可信区间为422.4443mg/kg～1278.2124mg/kg。查得阿司匹林小鼠LD50为1100mg/kg。结果表明：与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物毒副作用有所改善。
4.2 抑制环氧化酶-2的化合物多剂量给药对小鼠体重的影响
在连续给药14天后，记录灌胃前后小鼠体重，比较给药前后体重的变化情况。
抑制环氧化酶-2的化合物给药前后小鼠体重稍有增加，但差异无显著性。如表2所示。
表2 抑制环氧化酶-2的化合物多剂量给药小鼠体重的影响
给药前与给药后比较：P＞0.01
结果表明：抑制环氧化酶-2的化合物多剂量给药对小鼠体重没有影响。
4.3 胃黏膜组织评价
连续用药14d天后，末次给药2h后，取出完整胃组织浸泡在***中，之后用生理盐水清洗，将胃黏膜面向上，平铺在玻璃平皿中生理盐水纱布上，肉眼观察胃黏膜变化胃粘膜损伤评分标准:0＝正常，0.5＝局部轻度发红，1＝全部胃黏膜发红或出血(<1mm)，2＝大的出血(>1mm)，3＝小溃疡(<2mm)，4＝大溃疡(2mm)，5＝穿孔性溃疡。
肉眼观察胃黏膜组织后，正常小鼠胃黏膜组织无损伤，未见异常变化；ASP组小鼠胃黏膜组织全部发红，并见少许出血。和ASP组相比，抑制环氧化酶-2的化合物对胃黏膜组织损伤并未异常明显，其中，第六组胃黏膜组织出现局部发红。肉眼观察胃黏膜损伤评分表各剂量组连续给药后与ASP组比较具有明显的改善。如表3所示。
表3 抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠胃黏膜损伤指数的影响(n＝10)
与溶剂组相比，##P<0.01；与ASP组相比，**P<0.01
结果表明：与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠胃黏膜损伤有明显的改善。
4.4肠组织病理学变化
小鼠小肠组织用10％甲醛固定、不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色光学显微镜下观察小鼠小肠组织病理组织学变化。
由图2-1，正常小肠组织HE染色显示，肠壁绒毛结构整齐，上皮细胞呈柱状，排列整齐，固有层腺体大小一致；由图2-2，ASP小鼠黏膜上皮层部分细胞坏死(核溶解)，粘膜固有层炎细胞浸润较明显，固有层腺体部分坏死并萎缩；由图2-3，和ASP组相比，抑制环氧化酶-2的化合物各给药组对肠粘膜损伤作用并不大，其中，第6组对小鼠黏膜上皮细胞坏死不明显，仅见部分细胞变性，粘膜固有层炎细胞浸润仍然明显，固有层腺体未见明显坏死及萎缩，提示抑制环氧化酶-2的化合物相对于ASP可以减少对肠黏膜的刺激。
结果表明：与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠肠组织刺激明显减少。
综合实施例“4.1”“4.2”“4.3”“4.4”结果，抑制环氧化酶-2的化合物毒副作用较小，与ASP相比，抑制环氧化酶-2的化合物对小鼠体重没有影响。
实施例5
抑制环氧化酶-2的化合物药效学的初步评价
5.1 大鼠CIA模型的建立
新购进的SD大鼠在恒温(24±2℃)、光照周期12h:12h环境中饲养1周，实验前18h禁食，自由饮水。于d0，每只大鼠足趾皮下注射100μg鸡C Ⅱ和弗氏完全佐剂[FCA，含卡介苗(1mg·ml-1)，共0.1ml]。d21，大鼠足趾皮下注射同等剂量的该乳剂作为激发。正常组大鼠注射等量生理盐水(N.S)。以首次注射记为d0。
5.2 分组及给药
新购进的SD大鼠随机分为8组：正常组；CIA模型组；ASP(55mg/kg)组；GEP(40mg/kg)组；抑制环氧化酶-2的化合物低、中、高剂量组(根据急性毒性指导原则，低剂量为中剂量为高剂量为)和塞来昔布(celecoxib，IB)(70mg/kg)阳性药组，每组10只；d26继发侧足爪出现红肿、炎症后开始给药，各给药组分别连续灌胃给药ASP，GEP，抑制环氧化酶-2的化合物，IB和CIA模型组以等量的0.5％的生理盐水灌胃，每天一次，用药14天。d40处死大鼠，观察疗效评价指标。
5.3抑制环氧化酶-2的化合物治疗给药对CIA大鼠关节炎指数评分
致炎后d17，各模型大鼠均出现全身症状，表现为未注射FCA的其余3个肢体关节红肿，变性，耳部及尾部结节，行走不便；由图3可知，与正常组相比较，d18后大鼠继发性关节病变，造模成功。与模型组相比较，经d21和d24各给药剂量组治疗后均能抑制CIA大鼠继发性关节病变(P<0.01)。d24各给药组与模型组比较，关节炎指数明显降低(P＜0.01)，此外，抑制环氧化酶-2的化合物中、高剂量组与GEP组和ASP组相比较关节炎指数明显降低，有显著性的差异，提示抑制环氧化酶-2的化合物中、高剂量组的抗炎效果强于GEP和ASP。
致炎前及炎症出现后每隔3d用足容积测量仪测定大鼠足爪容积，求出肿胀度(Δ＝致炎后足容积—致炎前足容积)；每只足爪计1个踝关节和5个指(趾)关节，每只大鼠最多24个关节肿胀。从致炎后d8起，每隔3天(d8、d12、d16、d20、d24)，给药后每隔2天(d26、d29、d32、d35、d38、d40)进行关节炎指数评分，观察每组大鼠的继发病变。每只足爪的关节炎指数评分标准：0＝正常；1＝踝关节出现红斑和轻微肿胀；2＝踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3＝踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4＝踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。每只大鼠最多评12分。
大鼠在注射FCA后的前3天表现为急性局部炎症，然后逐渐减轻，即急性炎症缓解期(d7-d12)，继而因迟发型超敏反应，表现为对策和前肢足爪肿胀，耳、尾部出现炎症结节和红斑。由图4可知，模型组在致炎后d17、d21、d24继发侧足肿胀度与正常组比较显著增加(P<0.01)，各给药组在给药前d17继发侧足肿胀度与正常组比较显著增加(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各治疗给药组在d21、d24能显著抑制CIA大鼠的足爪肿胀(P<0.05或P<0.01)。此外，抑制环氧化酶-2的化合物中、高剂量组与GEP组和ASP组相比较，大鼠足肿胀度明显减低，有显著性的差异，提示抑制环氧化酶-2的化合物中、高剂量组的抗炎效果强于GEP和ASP。
5.4抑制环氧化酶-2的化合物治疗给药对CIA大鼠MLNs和FLST病理形态学情况
处死大鼠，取后足炎性踝关节组织和肠系膜***置于4％多聚甲醛中固定，足爪组织脱钙，脱水，常规石蜡包埋，切片，HE染色在光学显微镜下观察病理组织学变化。在光学显微镜下观察，MLNs的病理形态特点是：正常大鼠MLNs副皮质区没有明显扩大，淋巴滤泡较小，数目较少，散在分布，巨噬细胞不明显(图5-1)；CIA大鼠MLNs副皮质区明显扩大，髓质内炎性细胞浸润，***呈特异性滤泡增生(图5-2)；抑制环氧化酶-2的化合物中，高剂量组(70mg/kg，140mg/kg)均不同程度地改善以上病理变化，使扩大的副皮质区明显减少，髓质炎性细胞浸润和淋巴滤泡增生减少，数目变少(图5-3，5-4)。
在光学显微镜下观察，正常大鼠膝关节滑膜层由1-3层滑膜细胞组成，滑膜下层数量减少(图6-1)；CIA大鼠膝关节FLS细胞层增多，可见大量炎性细胞增生，滑膜下层细胞数量增多，见疏松***和大量血管增生，纤维组织增生程度明显增加(图6-2)；抑制环氧化酶-2的化合物中，高剂量组(70mg/kg，140mg/kg)均不同程度地改善以上病理变化，使FLS细胞层减少，炎性细胞减少，疏松***和大量血管增生，纤维组织增生程度明显减弱(图6-3，6-4)。
实施例6
抑制环氧化酶-2的化合物整体给药对CIA大鼠PBL的增殖活性
6.1 Con A诱导的CIA大鼠PBL增殖反应的量效、时效关系
取96孔板，每孔加入CIA大鼠100μL PBL悬液(终浓度1×106/mL)加入100μL含Con A(终浓度5μg/mL)和各浓度抑制环氧化酶-2的化合物(终浓度2.5,5,10,20,40,80,160μM)的DMEM培养液，另设单加培养液组为对照组。终容积为200μL，每个浓度设3个复孔，37℃，5％CO2培养箱培养24，36,48,60,72h,MTT法检测吸光度，确定最佳量效、时效。结果，本实验用不同浓度(0.2,1,5,25,125μg/mL)体外作用CIA-PBL不同时间(24,36,48,60,72h)诱导PBL增殖，MTT法检测细胞增殖水平。结果如图7所示，ConA诱导PBL的适宜浓度为5μg/mL,最适时间48h。
6.2 抑制环氧化酶-2的化合物整体给药对CIA大鼠PBL增殖能力的影响
取96孔板，共设置8组，每组6孔，每孔加入CIA大鼠100μL淋巴细胞悬液(终浓度1×106/mL)，空白对照组加入100μL空白DMEM培养液；模型组加含ConA(终浓度5μg/mL)的DMEM培养液；抑制环氧化酶-2的化合物组分别加入100μL含ConA(终浓度5μg/mL)和抑制环氧化酶-2的化合物(终浓度2.5、5、10、20、40μM)的DMEM培养液；给组终容积均为200μL，37℃,5％CO2培养箱培养48h，MTT法检测吸光度。结果如图8所示，与正常组相比，模型CIA大鼠体外分离提取的PBL增殖亢进(p＜0.01)。与模型组相比，抑制环氧化酶-2的化合物给药组大鼠PBL增长能力反应呈抑制趋势，且具有抑制相关性，但各抑制环氧化酶-2的化合物给药组间未见显著性差异。阳性药组的增殖反应也受到抑制(P＜0.01)。
实施例7
抑制环氧化酶-2的化合物整体给药对CIA大鼠血清、胸腺、和脾脏淋巴细胞培养上清中PGE2水平的影响
处死大鼠后，将取出的血液静置1h，离心15min(3000r·min-1,4℃)分离出血清，置于-80℃冰箱保存备用。将取出的胸腺和脾脏置于含5％小牛血清的PBS溶液中洗涤，取适量胸腺和脾脏组织，放入含有10％小牛血清的DMEM溶液中，过滤后制成细胞悬液(终浓度1×10-7mg·L-1)。于24孔培养板中，每孔加入细胞悬液500μL(终浓度为5mg·L-1)。置37℃，5％CO2培养箱内培养48h，2000rpm低温离心15min，吸取的上清液置于-80℃冰箱冷冻保存备用。采用ELASA法检测PGE2的水平，具体步骤参照试剂盒说明说步骤进行。由图9可知，与正常大鼠相比，CIA大鼠细胞因子的PGE2在血清、胸腺T细胞上清液、脾脏T淋巴细胞上清液的分泌表现的明显的失衡。与CIA模型大鼠相比，抑制环氧化酶-2的化合物(35、70、140mg·kg-1)组能明显调节失衡，明显抑制PGE2的分泌水平。比较抑制环氧化酶-2的化合物各给药组对PGE2的调节作用，发现抑制环氧化酶-2的化合物各给药组大鼠血清、胸腺淋巴细胞和脾脏淋巴细胞的PGE2含量水平成一种剂量依耐性的抑制，并且抑制环氧化酶-2的化合物同等剂量组PGE2(70mg·kg-1)与IB组基本上相持平。
实施例8
抑制环氧化酶-2的化合物的选择性抑制试验
应用体外酶反应体系采用EIASA方法进行。参照试剂盒说明书，96孔酶标板设试剂空白对照孔、S1-S8对照品(实验室自制，纯度达98％以上)孔、COX-1、COX-2空白对照孔、COX-1、COX-2100％酶活性孔、样品孔等，每孔设两个复孔。样品孔中加入950μL反应缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH 8.0)含5mM EDTA和2mM苯酚]、10μL亚铁血红素、10μL COX-1或COX-2、20μL倍比稀释的不同浓度的1b；100％酶活性孔除不加1b，其余同样品孔；COX-1或COX-2空白对照孔加970μL反应缓冲液、10μL亚铁血红素和灭活的COX-1或COX-210μL。各孔37℃预孵10分钟后，加入花生四烯酸(100μmol/L)混匀后37℃，水浴2分钟后，加入50μL1MHCl终止酶反应取出后各管加入100μL SnCl2溶液混匀置室温避光反应5分种。标准对照孔加倍比稀释的不同浓度的PGE2，以EIASA法检测***PGE2，以PGE2的生成量计算酶的活性。计算半抑制浓度IC50和选择性指数,分析其对酶活性的抑制强度及选择性。结果见表4。
表4.抑制环氧化酶-2的化合物，IB以及双氯酚酸(diclofenac)与COX-1,COX-2的半抑制浓度IC50和选择性指数
由表4可知，抑制环氧化酶-2的化合物对COX-1、COX-2的IC50分别为99μM/L、0.5μM/L，具有一定的抑制作用。相对于IB，抑制环氧化酶-2的化合物并未呈现显著性的差异。抑制环氧化酶-2的化合物与IB的选择性指数分别为198和367，远大于diclofenac的选择性指数，与COX-2具有较高的选择性。
实施例9
抑制环氧化酶-2的化合物整体给药对CIA大鼠PBL中COX-2蛋白水平的影响
将PBL以1×106/ml接种于6孔板上，加入含ConA(终浓度5μg/ml)的4％DMEM培养液培养48h。提取蛋白，western bloting检测COX-2的表达。结果如图10所示：正常对照组仅可检测少量COX-2，与正常对照组比较，模型组COX-2水平显著升高(P＜0.01)；各给药浓度抑制环氧化酶-2的化合物水平均较模型组低(P＜0.01，P＜0.05)且各组间存在显著性差异；并且COX-2水平下调作用呈明显的剂量依耐性关系；阳性对照药IB组亦可显著性降低COX-2蛋白水平(P＜0.01)，这些结果表明抑制环氧化酶-2的化合物与IB的作用相似，通过整体给药可抑制CIA大鼠PBL中COX-2蛋白的表达。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，在不脱离本发明精神实质的情况下，都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.抑制环氧化酶-2的化合物，其结构式如下：
2.如权利要求1所述的抑制环氧化酶-2的化合物及其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。
3.如权利要求2所述的抑制环氧化酶-2的化合物及其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用，其特征在于：所述抗炎药物为抗关节炎药物。
4.如权利要求1所述的抑制环氧化酶-2的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)京尼平甲基化中间体a的合成
将1重量份的京尼平溶解于40—60重量份的无水甲醇中，冷却后加入三氟化硼***，然后在室温下进行搅拌反应，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相用无水Na2SO4进行干燥处理，再蒸除有机溶剂，制得无色油状液体，即得京尼平甲基化中间体a；
(2)抑制环氧化酶-2的化合物的合成
取1重量份的京尼平甲基化中间体a，加入三乙胺将pH值调节至8—9，冷却后缓慢加入3重量份的乙酰水杨酰氯，然后在冰浴条件下进行反应，反应完全后加入饱和NaHCO3进行猝灭，然后用有机溶剂对反应液进行萃取并分离收集有机相，最后对有机相进行硅胶柱层析处理，制得白色固体，即为抑制环氧化酶-2的化合物。
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