CN104885948B - 一种油茶子叶节直接再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶子叶节为外植体，通过器官发生途径直接再生植株的方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：(1)采用普通油茶的种子为材料培育无菌苗。(2)将子叶节切下接种到不定芽诱导培养基上，经过20‑25d出现不定芽。(3)将不定芽转接到继代增殖培养基中培养20‑30d，增殖系数可达7.0。(4)将增殖的不定芽转接到壮苗培养基中培养20‑25d，苗高可达3‑4cm。(5)将获得的不定芽移入生根培养基，获得完整的试管苗。通过本发明不仅为快速繁殖优良油茶植株提供了一条新途径，而且为油茶遗传转化和分子改良提供技术支撑，为我国油茶产业的健康生产具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，是一种以油茶子叶节直接再生植株的方法。
背景技术
油茶(Camellia Oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，是我国特有的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。茶油不饱和脂肪酸含量达90％以上，色佳味香，风味独特，营养丰富，耐贮藏，有降血压、血脂及软化血管的作用，对心血管疾病的预防有重要作用，是优质的食用油之一，被誉为“东方橄榄油”。同时，油茶副产物还是生产肥料、农药、栲胶的优质原料。目前，中国共有油茶林4531.2万亩，年产茶油20多万吨，平均亩产茶油5.8kg，油茶产业普遍存在着单位面积产量低和经济效益差两大问题。油茶低产低效的重要原因之一就是良种化程度低，品种混乱，大部分油茶林处于野生状态，产量较低，良种苗木短缺不能大面积推广种植。同时，油茶炭疽病Glomerella cingulata(Stonem.)Spauld et Schrenk是油茶的主要病害。在长江流域以南各省的大面积油茶栽培区，以及河南、陕西南部地区发生普遍。病害发生后，引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，严重影响了油茶产业的健康发展。通过组织培养可以快速繁殖油茶脱毒苗，在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株，在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。
组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。关于油茶组织培养的研究较多，张智俊等人利用油茶无性系子叶通过体细胞胚胎发生途径获得了再生植株，李泽等人利用油茶带芽茎段获得再生植株，但以上研究只能在油茶组织培养快繁方面有重要意义，不能应用到油茶遗传体系转化获得转基因植株。植物遗传体系转化最常用的方法是农杆菌介导法侵染植物叶片、下胚轴、叶柄、子叶节、胚根等器官，而油茶叶片诱导不定芽的诱导率仅为17.86％，目前还不能应用在油茶遗传体系转化方面，油茶转基因至今还未找到合适的外植体。子叶节具有较高的分化能力，目前，科研工作者已经在西瓜、黄瓜及大豆等植物中通过子叶节直接诱导不定芽获得了再生植株，并且通过农杆菌侵染大豆子叶节获得了转基因植株。油茶子叶节直接获得再生植株的研究还未见报道，本发明通过利用油茶子叶节直接诱导不定芽，旨在建立一个高效、简便、稳定的繁殖体系，为油茶快速繁殖及工厂化育苗奠定基础，也为油茶的转基因研究提供一种技术手段。
发明内容
本发明的目的是针对目前油茶采用叶盘法获得再生植株技术还未建立，在此基础上，提供了利用油茶子叶节通过器官发生途径获得再生植株的方法，该方法利用油茶子叶节直接诱导不定芽，其诱导率高，不定芽健壮，继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高，关键还在于能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化的可能性。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种油茶子叶节直接再生植株的方法，包括以下步骤：
1)诱导不定芽：在无菌条件下切取0.5cm2的小块油茶膨大的子叶节(子叶节即下胚轴连接子叶的部分)，接种到培养基为1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0-0.5mg/L IAA+2.0mg/L GA3诱导不定芽；
2)继代培养：将诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3的培养基中进行不定芽的继代增殖培养；
3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA3的培养基中进行壮苗培养；
4)生根培养；
5)炼苗、移栽。
上述方法中诱导不定芽时暗培养2d后，再到光照条件下培养20-25d。
上述方法中继代增殖培养时暗培养3d，再到光照条件下培养20-30d。
上述方法中壮苗培养时暗培养2d，再转到光照条件下培养20-25d。
上述方法中将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养；
上述方法中生根培养时暗培养5d，再转到光照下培养20d即生根。
上述方法中培养温度为26±1℃，光照培养时光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5.4-5.6。
上述方法中子叶节直接诱导不定芽使用的培养基优选为：1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+2.0mg/L GA3
增殖培养使用的培养基优选为：1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1.0mg/L GA3。
上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下：
将生根后的油茶试管苗先在室内进行移栽前炼苗3-5d，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即逐步进行正常管理。
上述方法中油茶无菌苗的获得过程如下：
选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡10-15h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡20-30s无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒3-6min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带胚乳和子叶的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3d后转到光照条件下培养20-25d即可获得无菌苗；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。
本发明主要过程包括：油茶种胚无菌苗的获得，子叶节直接诱导不定芽、不定芽的继代增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽。该方法对油茶子叶节不定芽诱导率高，不定芽健壮，继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高；不仅为快速繁殖油茶植株提供了一条新途径，而且为以后通过基因工程的方法改良油茶抗性、培育抗病植株，提高油茶产量及油茶遗传体系的建立打下基础。这为油茶从传统的育种方式向分子育种方向迈进提供了可行性，为以后缓解我国粮油安全方面有着重要意义。
此外，油茶离体组织培养的研究比较多，但大部分是通过体细胞胚胎发生途径获得再生植株。本发明的详细优势总结如下：
1、本发明通过利用油茶成熟的种仁消毒后切去胚乳，把种胚及子叶接种到萌发培养基上生长，等子叶膨大变绿后切下子叶节接种到不定芽诱导的培养基，通过器官发生途径直接诱导不定芽，不定芽无论从长势、芽体长度、叶片数量、叶片颜色、芽的粗度及质地等方面均较好(图1-2)。此外，本发明操作简单，周期短，不定芽生长快，试管苗变异较小，更有利于油茶遗传体系转化。
2、张智俊、范晓明等人用优良油茶无性系的子叶通过体细胞胚胎发生途径获得再生植株，虽然胚性愈伤组织诱导率高达90％以上，但此方法从子叶接种到不定芽产生需要3个月以上的周期才能诱导出不定芽，在培养过程中容易变异，通过农杆菌介导法无法实现油茶遗产体系的建立。本发明通过培养基及激素浓度的调节反复试验，1个月即可诱导出不定芽，高效快速地建立了油茶子叶节直接再生体系，为油茶遗传改了奠定基础。
附图说明
图1为本发明油茶子叶节诱导的不定芽的照片；
图2为本发明油茶子叶节诱导的不定芽的照片；
图3为本发明不定芽继代培养的照片；
图4为本发明不定芽增殖培养的照片；
图5为本发明不定芽壮苗培养的照片；
图6为本发明不定芽壮苗培养的照片；
图7为本发明不定芽生根培养的照片；
图8为本发明不定芽生根培养的照片；
图9为本发明生根后移栽的组培苗的照片；
图10为本发明移栽后成活的组培苗的照片。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
依次进行以下操作：
1、选取成熟的当年生油茶种子，取除种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡10-15h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡20-30s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒3-5min，用无菌水冲洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附带胚乳的种胚接种在WPM基本培养基中，暗培养2-3d后转到光照条件下培养20-25d即可获得无菌苗；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。
表1 不同消毒处理方式对油茶种胚的消毒效果影响
2、切取油茶膨大的子叶，在无菌条件下切成长为0.5cm2的小块子叶节，接种到表2所示的A1-A12培养基配方中进行诱导不定芽，优选培养基为1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0-0.5mg/L IAA+2.0mg/L GA3，暗培养2d后，再到光照条件下培养20-25d，最高诱导率可达87.28％。附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.4。培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图1-2)
表2 不同激素配比对油茶子叶节不定芽诱导的效果影响
3、将诱导的不定芽切下接种到表3所示的B1-B12培养基配方中进行不定芽的继代增殖培养，优选1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA3，暗培养3d，再到光照条件下培养20-30d，增殖系数最高可达7.0；附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.4-5.8；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图3-4)
表3 不同激素配比对油茶不定芽增殖系数的影响
4、将增殖的不定芽进行壮苗培养，将增殖的芽转接到表4所示的C1-C12培养基配方中进行不定芽的壮苗培养，优选WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA3，暗培养2d，再转到光照条件下培养20-25d，苗高为3-4cm，叶片数为3-6个。附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.5，培养温度为(26±1)℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；(见附图5-6)
表4 不同激素配比对油茶不定芽壮苗的影响
5、待试管苗长到3-4cm时接到表5所示的D1-D10培养基配方中进行不定芽的生根培养，优选生根培养基1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+35g/L珍珠岩，暗培养5d后转到光照培养下20d后统计生根率达91.02％，附加蔗糖20g/L，琼脂(sigma)2.5g/L，pH5.5。培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。(见附图7-8)
表5 不同激素配比对油茶不定芽生根的影响
| 编号 | IBA(mg/L) | NAA(mg/L) | 珍珠岩(g/L) | 生根率/％ | 生根数/条 |
| D1 | 0 | 1.0 | 35 | 0 | 0 |
| D2 | 0.5 | 1.0 | 35 | 60.10 | 2.2 |
| D3 | 1.0 | 1.0 | 35 | 87.26 | 4.0 |
| D4 | 2.0 | 1.0 | 35 | 89.05 | 3.8 |
| D5 | 0.5 | 2.0 | 35 | 72.14 | 4.1 |
| D6 | 1.0 | 2.0 | 35 | 91.02 | 5.2 |
| D7 | 2.0 | 2.0 | 35 | 85.33 | 3.3 |
| D8 | 0.5 | 3.0 | 35 | 70.20 | 3.1 |
| D9 | 1.0 | 3.0 | 35 | 76.29 | 3.0 |
| D10 | 2.0 | 3.0 | 35 | 70.18 | 2.2 |
6、将生根后的试管苗先在室内进行移栽前炼苗，约3-5d，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即可逐步进行正常管理，移栽成活率可达86％以上。(见附图9-10)。
Claims (6)
1.一种油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)诱导不定芽：在无菌条件下切取0.5cm2的小块油茶膨大的子叶节，接种到培养基为1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0-0.5mg/L IAA+2.0mg/L GA3诱导不定芽；
2)继代培养：将诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/LIBA+0-1.0mg/L GA3的培养基中进行不定芽的继代增殖培养；
3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/LGA3的培养基中进行壮苗培养；
4)生根培养：将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/LIBA+1.0-2.0mg/LNAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养；
5)炼苗、移栽：将生根后的油茶试管苗先在室内进行移栽前炼苗3-5d，然后从培养瓶中取出，附带珍珠岩直接移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：黄土＝2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即逐步进行正常管理；
培养温度为26±1℃，光照培养时光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d；所述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5.4-5.6。
2.根据权利要求1所述的油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，
诱导不定芽时暗培养2d后，再到光照条件下培养20-25d。
3.根据权利要求1所述的油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，
继代增殖培养时暗培养3d，再到光照条件下培养20-30d。
4.根据权利要求1所述的油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，
壮苗培养时暗培养2d，再转到光照条件下培养20-25d。
5.根据权利要求1所述的油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，
生根培养时暗培养5d，再转到光照下培养20d即生根。
6.根据权利要求1所述的油茶子叶节直接再生植株的方法，其特征在于，
子叶节直接诱导不定芽使用的培养基为：1/2MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+2.0mg/L GA3，
增殖培养使用的培养基为：1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+1.0mg/L GA3。
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